CN110464833A - 铜蓝蛋白的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物药品应用领域，具体涉及铜蓝蛋白在制备预防或/和改善或/和治疗阿尔茨海默症的药物中的应用；或/和铜蓝蛋白在制备益智类补充剂或药物方面的应用。本发明中，铜蓝蛋白可以起到增强记忆力、提高认知功能的作用。发明人发现铜蓝蛋白能够显著促进神经细胞的生长，并且能够显著改善痴呆动物模型的学习记忆能力。细胞实验结果表明铜蓝蛋白可以有效抑制Aβ对神经元造成的损伤，对神经元具有保护作用。筑巢实验结果表明铜蓝蛋白能够提高痴呆动物模型的筑巢能力，提示痴呆动物的自理能力提高。水迷宫实验结果表明铜蓝蛋白能够提高痴呆动物模型的学习记忆能力。
Description
技术领域
本发明属于生物药品应用领域，具体涉及铜蓝蛋白在制备预防或/和改善或/和治疗阿尔茨海默症的药物中的应用；或/和铜蓝蛋白在制备益智类补充剂或药物方面的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)又称老年性痴呆，是一种由神经元丢失导致的脑中枢神经***退行性疾病，在老年人群中该病的发病率约为4％-8％。1906年，德国神经病理学家阿尔茨海默首次报告了一例具有进行性记忆力下降表现的51岁女性患者。1910年，以命名和分类大脑疾病著称的精神病学家Emil Kraepelin提议将此病命名为阿尔茨海默病。该病常见的临床表现为进行性记忆力和认知力减退、语言障碍、精神运动异常等，对患者的正常生活造成严重影响，同时也给家庭和社会带来沉重的负担。2010年，WHO报道全球痴呆患者为3500万，中国为540万。自2010年起，全世界痴呆总人口每20年将翻一倍。《世界阿尔茨海默病2015报告》指出，到2050年，全球AD的患病人数将增加至1.3亿。AD的发病机制复杂，包括淀粉样蛋白沉淀，脑内金属离子动态失衡，线粒体功能障碍等引起的神经递质减少以及神经元凋亡，涉及多种分子信号通路，目前已上市的治疗药物仅4种(多奈哌齐，加兰他敏，卡巴拉汀以及美金刚)，均以延缓AD中早期病状进展和改善早期AD临床病状为主，迄今尚无逆转或阻止病情进展的有效药物。
近年来有研究把来自于年轻小鼠的血浆重复的注射进老年小鼠，发现血浆可以通过调节参与海马认知的经典分子通路而提高记忆功能。而血浆组成极其复杂，包括蛋白质、脂类、无机盐、糖、氨基酸、代谢废物以及大量的水。
因此，目前的科研和实践中，需要找出血浆中具有改善学习记忆能力以及治疗老年性痴呆的成分。
发明内容
本发明的目的在于提供一种铜蓝蛋白的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
铜蓝蛋白在制备预防或/和改善或/和治疗痴呆和/或认知功能障碍的药物中的应用；或/和铜蓝蛋白在制备益智类补充剂或药物方面的应用。
在优选的实施方式中，所述铜蓝蛋白来自哺乳动物。
在优选的实施方式中，所述铜蓝蛋白来自健康人。
在优选的实施方式中，所述铜蓝蛋白的制备原料包括健康人血清。
在优选的实施方式中，所述痴呆和/或认知功能障碍为阿尔茨海默症或轻度认知障碍。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明中，铜蓝蛋白可以起到增强记忆力、提高认知功能的作用。发明人发现铜蓝蛋白能够显著促进神经细胞的生长，并且能够显著改善痴呆动物模型的学习记忆能力。细胞实验结果表明铜蓝蛋白可以有效抑制Aβ对神经元造成的损伤，对神经元具有保护作用。筑巢实验结果表明铜蓝蛋白能够提高痴呆动物模型的筑巢能力，提示痴呆动物的自理能力提高。水迷宫实验结果表明铜蓝蛋白能够提高痴呆动物模型的学习记忆能力。
附图说明
图1：检测1中光镜检测不同浓度的铜蓝蛋白处理原代培养海马神经元作用图，A部分为海马神经元数量柱状图，B部分为海马神经元突起长度柱状图。
图2：检测2中MTT法检测不同浓度的铜蓝蛋白处理原代培养海马神经元后改善Aβ25-35对原代培养海马神经元的损伤。
图3：检测3中筑巢行为学实验检测铜蓝蛋白处理小鼠前后筑巢行为得分。
图4：检测4中水迷宫行为学实验检测铜蓝蛋白处理小鼠的记忆改善情况。其中，A部分为小鼠在隐藏平台训练阶段上台时间，B部分为小鼠在测试阶段在目标象限所处时间百分比。
具体实施方式
为了更好地对本发明的技术特征和效果进行说明，下面采用具体实施方式对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。
本发明提供铜蓝蛋白(英文名ceruloplasmin或covelline albumen，简写为CP)在制备痴呆和/或认知功能障碍的药物中的应用；或/和铜蓝蛋白在制备益智类补充剂或药物方面的应用。
本发明所述铜蓝蛋白来自哺乳动物；优选为来自健康人的血浆。
所述痴呆和/或认知功能障碍为阿尔茨海默症或轻度认知障碍。
阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经***退行性疾病。
轻度认知障碍(MCI)是介于正常衰老和痴呆之间的一种中间状态，是一种认知障碍症候群。
本发明在细胞水平验证了不同浓度铜蓝蛋白对原代培养海马神经元生长的影响，并通过MTT法检测不同浓度的铜蓝蛋白处理原代培养海马神经元后改善Aβ25-35对原代培养海马神经元的损伤，试验结果表明，在0.5-2mg/ml的浓度范围内，铜蓝蛋白促进海马突起长度增长的作用明显；在1-4mg/ml的浓度范围内，铜蓝蛋白可以显著改善Aβ25-35对原代培养海马神经元的毒性损伤。另外，发明人从动物试验水平检测了铜蓝蛋白对5×FAD转基因(APP)小鼠的记忆力改善情况，结果表明，铜蓝蛋白明显改善痴呆模型小鼠的记忆力。
本发明所用铜蓝蛋白由健康人血清为原料，根据论文《铜蓝蛋白的分离纯化及其性质与功能基团研究》(褚波，2006)中描述的方法所得。所得铜蓝蛋白活性为1.02unit/mg。
下面通过实施例对本发明铜蓝蛋白的制备、鉴定和应用进行说明。以下实施例中涉及的分子生物学操作如未注明具体试验条件和方法，请参照SambrookJ等主编，科学出版社，2017，分子克隆实验指南(第四版)或相应产品的说明书。以下实施例中使用的原代海马细胞是按照如下参考文献培养的：Guo,W.,Y.Ji,et al.(2014)."Neuronal activityalters BDNF-TrkB signaling kinetics and downstream functions."J Cell Sci 127(Pt 10):2249-2260。
实施例1
本实施例的铜蓝蛋白是参考上述论文第17-32页的方法得到，将3.1.5.1的猪血清替换为健康人的血清，得到透析液；再将透析液经过DEAE-Sepharose(方法如3.1.5.2所述)、羟基磷灰石吸附层析(方法如3.1.5.3所述)、Superdex-200凝胶过滤层析(方法如3.1.5.4所述)后获得的比活性最高的组分作为铜蓝蛋白纯品。再将该铜蓝蛋白纯品采用过滤除菌，滤膜为0.22μm低蛋白吸附的PVDF膜，压力为5bar，得到灭菌后的铜蓝蛋白。
灭菌后的铜蓝蛋白(CP溶液)对原代培养海马神经元生长的作用检测，对铜蓝蛋白处理原代培养海马神经元后改善Aβ25-35对原代培养海马神经元的损伤的检测，以及对铜蓝蛋白治疗后5xFAD模型鼠筑巢能力和学习记忆能力的检测。
检测1：原代海马神经元培养及铜蓝蛋白处理。
(1)利用0.1％(W/V)的poly-L-lysine包被48孔培养板，放入37℃培养箱中包被2小时以上。
(2)在冰的HBSS-buffer中解剖0天初生小鼠，取出海马体。用1×PBS清洗3次。加0.25％trypsin，37℃消化15分钟。
(3)用完全DMEM终止消化，并用1ml枪轻吹吸海马细胞16-20次，没有明显组织块即可，再用40mM滤网过滤，1000rpm，离心3min。
(4)离心后弃上清保留沉淀，加完全DMEM重悬细胞。并将神经元种植在细胞培养板中，种植密度为3×104cells/cm2。
(5)第二天无血清Neurobasal培养基全换液；第三天处理：将灭菌后的铜蓝蛋白加入到不同的培养板孔内，终浓度为0.25mg/ml(其活性为1.02unit/mg)、0.5
mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml，5种终浓度的试验组，各组设置24孔/6板/3批的重复(即：共3批，每批细胞有2板，每个板有4个孔)，并采用1×PBS作为对照；第五天：利用cell-IQ相差显微镜进行拍照。
检测结果参见图1，以下数据均为统计分析后数据：其中，A部分为海马神经元数量柱状图，B部分为海马神经元突起长度柱状图；左至右各个柱分别为：PBS,0.25mg/ml,0.5mg/ml,1mg/ml,2mg/ml,4mg/ml。A部分中，PBS处理：1.00±0.06AU(arbitrary unit)，0.25mg/ml处理：1.07±0.07AU(p>0.05vs.PBS处理)，0.5mg/ml处理：1.23±0.11AU(p>0.05vs.PBS处理)，1mg/ml处理：1.29±0.08AU(p<0.01vs.PBS处理)，2mg/ml处理：1.32±0.09AU(p<0.01vs.PBS处理)，4mg/ml处理：1.15±0.11AU(p>0.05vs.PBS处理)。B部分中，PBS处理：1.00±0.06AU，0.25mg/ml处理：1.10±0.06AU(p>0.05vs.PBS处理)，0.5mg/ml处理：1.48±0.07AU(p<0.0001vs.PBS处理)，1mg/ml处理：1.67±0.11AU(p<0.0001vs.PBS处理)，2mg/ml处理：1.84±0.09AU(p<0.0001vs.PBS处理)，4mg/ml处理：1.27±0.13AU(p>0.05vs.PBS处理)。
以上说明在1-2mg/ml的浓度范围内，铜蓝蛋白对促进海马神经元生长作用明显；在0.5-2mg/ml的浓度范围内，铜蓝蛋白促进海马神经元突起生长作用明显。
检测2：铜蓝蛋白对Aβ引起的原代海马神经元损伤的保护作用，其可以显著改善Aβ25-35对原代培养海马神经元的毒性损伤。淀粉样肽Aβ具有细胞毒作用，如果能拮抗Aβ神经毒，即可望达到抗AD的目的。
(1)Aβ25-35溶解于灭菌的双蒸水中，使其终浓度为1mg/ml，在37℃放置7天进行老化，老化的Aβ25-35分装后于-20℃冻存。
(2)利用0.1％的poly-L-lysine包被96孔培养板，放入37℃培养箱中包被2小时以上。
(3)在冰的HBSS-buffer中解剖0天初生小鼠，取出海马体。用1×PBS清洗3次。加0.25％trypsin，37℃消化15分钟。
(4)用完全DMEM终止消化，并用1ml枪轻吹吸海马细胞16-20次，没有明显组织块即可，再用40mM滤网过滤，1000rpm，离心3min。
(5)离心后弃上清，加完全DMEM重悬细胞。并将神经元种植在细胞培养板中，种植密度为2×105cells/cm2。
(6)第二天无血清Neurobasal培养基(含10μM阿糖胞苷)全换液；第五天、第八天无血清Neurobasal培养基半换液。
(7)第八天换液后，将灭菌后的铜蓝蛋白(活性为1.02unit/mg)加入到不同的培养板孔内，终浓度为0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml，每种浓度设置18孔/3板/3批的重复(即：共3批，每批细胞有1板，每个板6个孔)。
图2中，最左边的Control为不加Aβ而加入1×PBS的对照(阴性对照)，左起第二个柱为加入Aβ和1×PBS的对照(模型对照)，这两个对比是检测AD细胞模型是否造模成功；左起3-7的5个柱是加入Aβ和不同浓度(分别为0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml)的铜蓝蛋白组，用来研究在AD细胞模型中药物的作用。
(8)37℃孵育24小时后，加入老化的Aβ25-35，终浓度为30μM。
(9)37℃孵育24小时后，加10μl 5mg/ml的MTT。
(10)37℃孵育4小时后，去除上清，加入150μl DMSO于酶联免疫测定仪上以测定波长570nm，参比波长630nm测定吸光值。
检测结果参见图2：图中从左至右，第1-7柱分别编号为Bar1-7，Bar2表明30μM老化的Aβ25-35与原代海马神经元孵育24小时后，与Bar1相比细胞MTT还原明显降低，细胞存活率降低到67.3±7.2％(p＝0.001)，而Bar5-7用1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml的铜蓝蛋白预处理24小时可以明显改善Aβ25-35对细胞的毒性损伤，并且随着药物剂量的增加，这种改善作用越明显，其中4mg/ml的铜蓝蛋白最显著(细胞存活率分别为92.3±5.4％，p<0.01vs.模型对照组，104.7±11.3％，p<0.01vs.模型对照组，111.1±10.9％，p<0.01vs.模型对照组)。Bar3-4用0.25mg/ml、0.5mg/ml的铜蓝蛋白预处理24小时不能显著改善Aβ25-35对细胞的毒性损伤(细胞存活率分别为68.4±7.5％，p>0.05vs.模型对照组，72.2±11.2％，p>0.05vs.模型对照组)。以上说明在1-4mg/ml的浓度范围内，铜蓝蛋白可以显著改善Aβ25-35对原代培养海马神经元的毒性损伤。
检测3：筑巢行为学实验检测：
(1)厨房纸剪成细的长条后揉皱，空笼中加入1cm左右高的木屑垫料，在垫料上均匀撒入3-4g剪碎的厨房纸，放入一只5×FAD转基因(APP)小鼠或野生型(WT)对照小鼠。
(2)48小时后观察筑巢情况并评分。评分标准如下：
0分：小鼠没有动过筑巢材料，筑巢材料保持放入时原样。
1分：虽然筑巢材料被小鼠动过，但在笼中没有明显形成巢的位置，筑巢材料分散在笼中。
2分：有明显巢的位置，巢扁平，中间没有明显凹陷。
3分：有明显巢的位置，巢中间稍有凹陷，高度低于小鼠背部弓起后1/2。
4分：有明显巢的位置，巢中间有凹陷，高度为小鼠背部弓起后1/2。
5分：有明显巢的位置，巢中间有凹陷，高度高于小鼠背部弓起后1/2。
(3)将小鼠分为以下5组，每组15只小鼠。
第一组(WT_PBS)：野生型(WT)对照小鼠，其尾静脉均注射20mmol/L PBS(pH7.2)100μl；本组为空白对照；
第二组(TG_PBS)：5×FAD转基因(APP)小鼠，该组5×FAD转基因小鼠的尾静脉均注射20mmol/L PBS(pH7.2)100μl；本组为模型对照；
第三组(TG_CP低剂量)：5×FAD转基因小鼠，该组5×FAD转基因小鼠的尾静脉均注射灭菌后的铜蓝蛋白(3mg/kg CP)；
第四组(TG_CP中剂量)：5×FAD转基因小鼠，该组5×FAD转基因小鼠的尾静脉均注射灭菌后的铜蓝蛋白(15mg/kg CP)；
第五组(TG_CP高剂量)：5×FAD转基因小鼠，该组5×FAD转基因小鼠的尾静脉均注射灭菌后的铜蓝蛋白(30mg/kg CP)；
上述5组每隔两天注射一次，共注射8次；之后再按照(1)和(2)步骤进行筑巢行为实验。
测试结果见图3，左至右的柱分别为WT_PBS，TG_PBS,TG-CP3 mg/kg，TG-CP15mg/kg，TG-CP30 mg/kg。第一组(WT_PBS)得分为4.21±0.18，第二组(TG_PBS)得分为0.67±0.33，第三组(TG_CP低剂量)得分为1.02±0.31，第四组(TG_CP中剂量)得分为1.78±0.43，第五组(TG_CP高剂量)得分为3.14±0.17，可见对于阿尔茨海默症模型小鼠来说，注射铜蓝蛋白能够明显提高筑巢行为。
小鼠的筑巢能力转化到人类指人类对日常生活的自理能力，由此可见，注射铜蓝蛋白可以明显改善阿尔茨海默症模型小鼠日常生活的自理能力。
检测4：Morris水迷宫测试(水迷宫行为学实验检测)。
(1)将小鼠分为以下5组，每组15只小鼠。
第一组(WT_PBS)：野生型(WT)小鼠，作为对照，小鼠尾静脉注射PBS；本组为空白对照；
第二组(TG_PBS)：5×FAD转基因小鼠，各小鼠尾静脉注射20mmol/L PBS(pH7.2)；本组为模型对照；
第三组(TG_CP低剂量)：5×FAD转基因小鼠，各小鼠尾静脉注射注射灭菌后的铜蓝蛋白(3mg/kg CP)；
第四组(TG_CP中剂量)：5×FAD转基因小鼠，各小鼠尾静脉注射注射灭菌后的铜蓝蛋白(15mg/kg CP)；
第五组(TG_CP高剂量)：5×FAD转基因小鼠，各小鼠尾静脉注射注射灭菌后的铜蓝蛋白(30mg/kg CP)；
上述5组每隔两天注射一次，共注射8次；之后进行Morris水迷宫训练。
(2)水迷宫实验记录潜伏期的长短测定小鼠的空间辨别能力。水迷宫装置由直径120cm、高50cm的圆形水池和可移动的直径10cm的平台组成，水池的上方装有摄像头并与电脑自动记录仪连接，水温保持(22±3)℃。
(3)第1-5天训练为隐藏平台训练，平台放置于固定位置并低于水面1cm，加入钛白粉使平台不可见，将小鼠头朝池壁轻轻随机放入水池中4个象限之一，每次试验每只小鼠游泳60s，让其找到水中平台，让其停留5s；若小鼠入水后未能找到平台，则将时间记录为60s，并且将其人为放置在平台上20s，每只小鼠每天重复4次试验。
(4)最后一次定位航行实验结束后24h，撤出平台，将小鼠放入水中追踪器运动轨迹60s，测试小鼠60s内的运动轨迹、潜伏期及穿过原先放置平台位置象限次数及时间作为空间记忆形成指标，并进行组间对比。
注意：整个测试过程中保持实验室内灯光、物品摆放等室内环境一致，以排除环境的干扰。
测试结果见图4。其中，A部分为小鼠在隐藏平台训练阶段上台时间，B部分(左至右的柱分别为WT_PBS，TG_PBS,TG-CP3 mg/kg，TG-CP15 mg/kg，TG-CP30 mg/kg)为小鼠在测试阶段在目标象限所处时间百分比。
A部分中，在隐藏平台训练阶段，对比WT_PBS组，TG_PBS和TG-CP低剂量组组学***台的位置。
B部分中，各组在目标象限所处时间百分比依次为：第一组(WT_PBS):32.1±2.9,第二组(TG_PBS):23.7±4.3(p<0.05vs.WT_PBS),第三组(TG_CP低剂量组):26.1±3.2,第四组(TG_CP中剂量组):28.7±3.1,第五组(TG_CP高剂量组):31.1±2.7(p<0.05vs.TG_PBS)，可见对于阿尔茨海默症模型小鼠来说，注射铜蓝蛋白能够提高5×FAD转基因(APP)小鼠在目标象限所处时间。
由此可见，注射铜蓝蛋白可以明显改善阿尔茨海默症模型小鼠的认知水平。
Claims (5)
1.铜蓝蛋白在制备预防或/和改善或/和治疗痴呆和/或认知功能障碍的药物中的应用；或/和铜蓝蛋白在制备益智类补充剂或药物方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述铜蓝蛋白来自哺乳动物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述铜蓝蛋白来自健康人。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于：所述铜蓝蛋白的制备原料包括健康人血清。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述痴呆和/或认知功能障碍为阿尔茨海默症或轻度认知障碍。
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