CN110462065A - 检测肿瘤复发的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测肿瘤复发的对象特异性方法，该方法以对该对象的肿瘤的克隆/亚克隆突变图谱的认识以及在其无细胞DNA（cfDNA）中的突变的检测为基础，通常通过多重PCR检测肿瘤突变（例如单核苷酸变异（SNV））。

Description

检测肿瘤复发的方法
技术领域
本发明涉及用于在对象中检测肿瘤的复发的对象特异性方法。
背景技术
癌症是全球死亡的主要原因，其中肺癌是与癌症相关的死亡率的主要原因。非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的组织学亚型，占肺癌病例的85％至90％。大多数患有NSCLC的患者存在局部进展期疾病或转移性疾病，并且具有不良的预后。即使在可切除的阶段被确诊，仍有高达30％至50％的患者将在术后阶段经历疾病复发。
高达40％的经受非小细胞肺癌的手术切除的患者，经历其癌症的复发。目前一些经受手术的患者被提供术后(辅助)化疗或放射治疗，以将肺癌回归的风险降低5-10％。基于患者是否具有与侵袭性肿瘤(即，大肿瘤、***参与)一致的病理特征以及患者是否足够适合来接受化疗治疗，来提供这样的治疗。
化疗后的患者接受“监视”。他们每3-6个月回到诊所，来临床评估肺癌复发的体征，并且他们还接受胸部X-射线或CT扫描。如果存在与其肺癌的复发一致的影像学或临床特征，则他们将被正式调查复发。如果复发的肺癌被确认，则治疗将取决于该复发的肺癌已经扩散至何处。如果肺癌已经在单一位点复发，那么可以实施使用放射疗法或手术的“根治性”治疗来试图实现患者的治愈。如果该癌症在多个位点复发，那么通常提供使用化疗的治疗，并且患者不可能被治愈。如果是这种情况，那么预后通常被限制在1年到18个月。
在患有进展期癌症的患者的血浆和血清中可以检测到无细胞DNA(cfDNA)。多种cfDNA图谱的方法正在被构建为临床诊断工具。然而，在早期肺癌中，cfDNA图谱的方法不太成功，并且通常使用通用基因试验组(gene panel)来询问血浆样品。
发明内容
本发明描述了通过在来自患者血浆的cfDNA中检测患者特异性的克隆和/或亚克隆突变，以非侵入性方式追踪肿瘤复发和转移性亚克隆的特性的“定制”方法。通过进行患者的肿瘤“***进化树(phylogenetic tree)”的模拟，该方法生成了为个体患者所独有的定制的生物标记物图谱。克隆突变本质上存在于肿瘤内的每一个细胞中。通过将克隆突变整合到试验组(panel)中，该方法增加了血浆变异检测的灵敏度。追踪患者的肿瘤“***进化树”的血浆图谱，能够识别作为/负责对复发疾病进行播种(seed)的在肿瘤内的克隆/亚克隆，开启了这样的机会，即在宏观疾病在影像学上变得明显之前有机会进行介入治疗，并且通过追踪克隆和亚克隆变异的减少来监测对这种治疗的反应。
因此，通过追踪患者特异性变异以及通过从患者的***进化树的躯干中选择代表克隆变异的变异，而不是依赖于可能存在或可能不存在于任何个体患者中的通用标记物的试验组，该方法有利地增加了鉴定血浆变异的灵敏度和特异性。
因此，本发明涉及在肿瘤(例如肺癌)中进行cfDNA分析的方法，包含追踪患者的疾病进展和/或复发以辅助稳健的治疗方案。该方法尤其适用于在辅助环境中追踪手术切除后的肺癌(非小细胞肺癌)的复发。使用该方法的复发的早期检测，可以促使治疗(包括免疫治疗)的开始或改变治疗，使用相同的方法来追踪这种残留疾病对治疗的反应。该方法还可用于除肺部之外的癌症和/或已经以其他方式被移除的癌症。
因此，在本发明的第一方面，提供了用于在对象中检测肿瘤复发的对象特异性方法，包括：
(a)对对象的肿瘤的基因组或外显子组的全部或一部分进行测序，以定义所述肿瘤中的克隆和/或亚克隆突变；
(b)定义一组试剂，其将通过所述克隆和/或亚克隆突变的存在，检测来自所述肿瘤的DNA的存在；
使用所述一组试剂，分析在肿瘤移除之后从对象中获得的包含来自所述肿瘤的DNA的样品，以通过检测该样品中的所述克隆和/或亚克隆突变来确定所述肿瘤是否已经复发。
在本发明的另一方面，提供了对象特异性的方法，其定义一组试剂以在该对象中检测肿瘤的复发，包含：
(a)对该对象的肿瘤的基因组或外显子组的全部或一部分进行测序；
(b)定义在所述肿瘤中的克隆和/或亚克隆突变；以及
定义一组试剂，其将检测在来自所述对象的样品中的所述克隆和/或亚克隆突变的存在。
在本发明的另一方面，提供了用于在对象中检测肿瘤复发的对象特异性方法，其包含：使用将检测来自所述肿瘤的克隆和/或亚克隆突变的存在的对象特异性的一组试剂，分析在移除肿瘤后从该对象中获得的样品中的DNA，以通过检测在该样品中来自该肿瘤的所述克隆和/或亚克隆突变，确定所述肿瘤是否已经复发。
在本发明的另一方面，提供了对象特异性的一组检测试剂，用于在该对象的cfDNA中检测来自肿瘤的克隆和/或亚克隆突变，其通过本发明的方法获得或能够通过本发明的方法获得。
在本发明的另一方面，提供了治疗对象的方法，其包含执行本发明的方法，其中基于在来自对象的样品中检测到的克隆和/或亚克隆突变，为患者选择治疗。
附图说明
图1.显示靶标选择、试验设计和血浆PCR的工作流程图。
图2.所测量的cfDNA浓度、肿瘤阶段。每个数据点代表一个血浆样品。
图3.使用来自患者肿瘤样品的DNA的多重PCR反应的验证。样品示出了在组织VAF测量之间良好的相关性。在单独的方框中示出了每个样品，并且VAF数据点根据组织子部分着色。
图4.在每个样品的血浆中检测到的SNV和未检测到的SNV。
图5.根据肿瘤分期的在血浆中的SNV检测(左)和样品检测(右)。
图6.血浆VAF作为肿瘤分期和SNV克隆性的函数。
图7.通过组织学类型在血浆中检测到的SNV的数量。
图8.在来自每个样品的血浆中检测到的SNV数量作为cfDNA输入量的函数。
图9.血浆中的SNV的检测与其肿瘤中的VAF相关。
图10A.读出序列的深度(depth of read)作为所得调用的函数的直方图。
图10B.试验的估计的检测极限(limit of detection)作为所得调用的函数。在每个试验组中，左边组示出了未检测到预期血浆SNV的试验，右边组示出了检测到预期血浆SNV的试验。
图11A.评估血浆中检测到的SNV，用于从cfDNA数据中重现肿瘤***进化树。示出了具有超过10种血浆SNV的样品。具有有效估计的癌细胞分数的血浆中检测到的分支的数量。
图11B.评估血浆中检测到的SNV，用于从cfDNA数据中重现肿瘤***进化树。示出了具有超过10种血浆SNV的样品。SNV对的百分比，其中其血浆VAF值遵循肿瘤***进化树结构。
图12.上图——每个样品的被引物靶向的SNV总数，按驱动种类排序。下图——每个样本被引物靶向的SNV总数，按克隆性排序。
图13.表明了基于组织学亚型(鳞状细胞癌(LUSC)和腺癌(LUAD))分类的每位患者检测到的克隆和亚克隆变异的数量的柱状图。被填充的柱表明检测到的变异，未被填充的柱表明探测到的变异数量。
图14.与未检测到的肺腺癌(LUAD)相比，检测到的LUAD的有丝***活性更高(图14A和图14B)，并且基因组不稳定(图14C)。检测到的LUAD主要是实体组织学亚型(图14D)。
图15.克隆SNV具有比亚克隆SNV更高的血浆变异等位基因频率(图15A和15B)，平均克隆变异等位基因频率(每个患者)与肿瘤体积相关(图15C)(斯皮尔曼等级Rs(42)＝0.60，P<0.001)。来自图15C中的异常值的PET CT仅表明PET亲合肿瘤的边缘(图15D)。
图16.如通过全外显子组测序所确定的，被调用的突变的平均归一化的变异等位基因频率(variant allele frequency，VAF)与突变拷贝数相关，如通过多区域测序所鉴定的(亚克隆尺寸的推断)，被调用的突变的平均归一化的VAF与取自所有涉及区域的平均亚克隆簇癌细胞分数(Cancer Cell Fraction)相关。
图17.时间过程图表明在患有肺鳞状细胞癌(LUSC)和肺腺癌(LUAD)的患者中临床复发之前的克隆SNV的检测，该患者在该研究中遭遇了其疾病的复发。
图18.时间过程图表明在患有肺鳞状细胞癌(LUSC)和肺腺癌(LUAD)的患者中临床复发之前的克隆SNV的检测，该患者在此研究的时间过程之内没有遭受其疾病的复发(对照病例)。
图19.顶行的“树”代表从外显子组数据构建的***进化树。底行的树代表血浆***进化树。该图表明了血浆基因分型可以如何用于表示肿瘤的亚克隆结构。
图20.随时间追踪肿瘤的亚克隆结构。在LTX019中，特定的亚克隆簇在肺癌复发时被检测到。该亚克隆簇含有与转移微环境形成有关的CD44。在LTX038中，在复发时仅检测到一个***进化分支——表明该复发克隆由该分支引起。
图21.CONSORT图表明参与此cfDNA分析的患者，以及为何来自外显子组研究的4名患者从该cfDNA分析中被移除。
图22.LUAD和LUSC肿瘤中突变标记的患病率和不同突变类别的相关性。示出了斯皮尔曼等级的显著性。为了对此进行表示，可以将突变标记用于推断突变的克隆性。
发明的详细描述
对象特异性方法
本发明涉及用于在对象中检测肿瘤复发的对象特异性方法。在为患者定制的范围内，该方法是对象特异性的。该方法被实施用于已被诊断患有肿瘤的特定患者。对象特异性也可称为患者特异性。在肿瘤中鉴定出的克隆和/或亚克隆突变，其用于确定肿瘤是否在患者中已经复发，是先前被确定存在于从个体对象中切除或活检的肿瘤中的突变。
在本发明的优选的实施方式中，本文所述的对象是哺乳动物，优选为人类、猫、狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔或豚鼠。该对象最优选地是人类。
本发明的方法通过检测无细胞DNA(cfDNA)中作为患者的肿瘤的特征的克隆和/或亚克隆突变的存在和/或升高，来检测特定对象或患者中肿瘤的复发。将会理解的是，术语“克隆突变”可包括早期克隆突变和/或克隆突变。克隆和/或亚克隆突变是来自个体患者的特异性的肿瘤的特征。通过对来自肿瘤的全基因组和/或全外显子组中的全部或一部分进行测序(通常在已经从患者切除肿瘤之后)，来定义表示患者肿瘤特征的克隆和/或亚克隆突变。使用被设计或定义来通过被鉴定用于具体目标对象的特异性克隆和/或亚克隆突变的存在来检测来自肿瘤的DNA的存在的一组试剂，对获得自患者的cfDNA中的克隆和/或亚克隆突变的存在和/或升高进行分析。
在来自患者的cfDNA中的表示肿瘤特征的克隆和/或亚克隆突变的存在和/或升高，表明该肿瘤是否已经复发。在来自特定患者的cfDNA中的表示肿瘤特征的克隆突变的存在和/或升高，可能表明该肿瘤复发。
在优选的实施方式中，在来自患者的cfDNA中的表示肿瘤特征的克隆突变的存在和/或升高，表明该肿瘤是否已经复发。来自特定患者的cfDNA中的表示肿瘤特征的克隆突变的存在和/或升高，可能表明该肿瘤复发。
在优选的实施方式中，在来自患者的cfDNA中的表示肿瘤特征的早期克隆突变的存在和/或升高，表明该肿瘤是否已经复发。在来自特定患者的cfDNA中的表示肿瘤特征的早期克隆突变的存在和/或升高，可能表明该肿瘤复发。
在来自患者的cfDNA中的表示肿瘤特征的克隆和/或亚克隆突变的存在和/或升高，可用于确定该肿瘤的哪个或哪些部分在对患者中肿瘤的复发进行播种。cfDNA中的表示肿瘤特征的亚克隆突变的存在和/或升高，可确定对肿瘤的复发进行播种的肿瘤的部分。
在优选的实施方式中，在来自患者的cfDNA中的表示肿瘤特征的亚克隆突变的存在和/或升高，可用于确定肿瘤的哪个或哪些部分在对患者中肿瘤的复发进行播种。cfDNA中的表示肿瘤特征的亚克隆突变的存在和/或升高，可以确定对肿瘤的复发进行播种的肿瘤的部分。
肿瘤类型
本发明的对象特异性方法涉及检测肿瘤复发。该肿瘤可以是任何实体或非实体肿瘤。该肿瘤可以是，例如，膀胱癌、胃癌、食道癌、乳腺癌、结肠直肠癌、***、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞)、肺癌(小细胞、非小细胞和间皮瘤)、脑癌(如胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤)、黑色素瘤、淋巴瘤、小肠癌(十二指肠和空肠)、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、肝胆肿瘤、生殖细胞癌、***癌、头颈癌、甲状腺癌症和肉瘤。
在本发明的优选实施方式中，肿瘤类型是肺癌，优选为非小细胞肺癌。在本发明的另一方面，该非小细胞肺癌是鳞状细胞瘤、腺癌或大细胞癌。在优选的实施方式中，非小细胞肺癌是鳞状细胞癌。
可以通过本领域技术人员已知的许多不同技术，从患者中移除肿瘤。例如，可以通过手术切除、内窥镜切除、化学疗法和/或放射疗法，从患者中移除或消除肿瘤。
肿瘤DNA
本发明的方法包含确定在从肿瘤或肿瘤切片中分离的癌症细胞中存在的突变的步骤。从肿瘤中分离活检样品和样品是本领域中的常规实践，并且可以根据任何合适的方法执行，并且这样方法将对于本领域技术人员来说是已知的。
肿瘤样品可以是血液样品。例如，血液样品可包含cfDNA、循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞或包含肿瘤DNA的外泌体。
在优选的实施方式中，从一种或多种肿瘤子部分(subsection)中定义肿瘤中的早期克隆、克隆和/或亚克隆突变。可以从至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少八种、至少九种、至少或多达十种肿瘤子部分中，定义肿瘤中的早期克隆、克隆和/或亚克隆突变。
在进一步的实施方式中，从单个区域中定义肿瘤中的克隆和/或亚克隆突变。在更进一步实施方式中，从单个区域中定义早期克隆突变(即在基因组加倍之前发生的克隆改变)。
单个区域包括肿瘤活检、肿瘤的子部分、整个肿瘤、外显子组的选定区域或单个区域、或全基因组序列的选定区域或单个区域。可以在编码早期克隆突变的区域上选择外显子组或全基因组序列的单个区域，所述早期克隆突变发生在经历拷贝数量扩增的基因组加倍之前。可以在编码常见克隆体细胞和早期扩增事件(参见，例如表1)和/或克隆和/或亚克隆突变的可能的“突变标记(mutation signature)”(参见，例如表2)的区域上，选择外显子组或全基因组序列的单个区域。可以通过从与常见克隆体细胞和早期扩增事件(参见，例如表1)和/或克隆和/或亚克隆突变的可能的“突变标记”(参见，例如表2)相关的数据中，推断患者中的可能的表示肿瘤特征的克隆突变，来选择外显子组或全基因组序列的单个区域。
克隆和亚克隆突变
“突变”是指与来自相同个体的健康细胞相比，肿瘤细胞中的核苷酸序列(例如DNA或RNA)中的差异。核苷酸序列中的差异可导致不被来自相同个体的健康细胞表达的蛋白质的表达。
本文中对“基本上所有”的提及旨在包括对象中的肿瘤细胞的大多数。例如，这可以包含对象中的细胞的60-100％，例如肿瘤细胞的60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、88、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。
肿瘤的不同区域在形态上可以是不同的。此外，肿瘤内突变异质性可能出现，并且可能与肿瘤预后中的差异和肿瘤细胞逃避靶向在所有或大多数肿瘤细胞中不存在的突变的免疫疗法的潜在能力相关。
内异质性导致肿瘤的不同区域中和肿瘤的不同细胞之间的肿瘤突变的表达。在肿瘤内，某些突变在肿瘤的所有区域和基本上所有细胞中表达，而其他突变仅在肿瘤区域和细胞的子集中表达。
“躯干”或“克隆”突变是在整个肿瘤中被有效地表达并基本上在每个肿瘤细胞内被编码的突变。“分支”或“亚克隆”突变是在肿瘤中的细胞或区域中的子集或一部分中被表达的突变。
“存在于整个肿瘤中”、“在整个肿瘤中被有效地表达”和“基本上在每个肿瘤细胞内被编码”可意味着躯干突变在肿瘤的所有区域中被表达，其中来自该肿瘤的样品被分析。
将理解的是，突变“基本上在每个肿瘤细胞内被编码”的确定是指统计学计算，因此其受限于统计学分析和阈值。
躯干突变“在整个肿瘤中被有效地表达”的确定是指统计学计算，因此其受限于统计学分析和阈值。
“基本上在每个肿瘤细胞中或基本上在所有肿瘤细胞中被有效地表达”意味着根据使用适当的统计学方法所确定的，突变存在于样品中被分析的所有肿瘤细胞中。
举例来说，描述具有突变的癌细胞的比例的癌细胞分数(CCF)，可用于确定突变是躯干的还是分支的。例如，如Landau等人所述，可以通过将变异等位基因频率与拷贝数和估计纯度进行整合来确定癌细胞分数(Cell.2013 Feb 14；152(4):714-26)。
简而言之，计算在所分析的每个肿瘤区域内鉴定出的所有突变的CCF值。如果仅使用一个区域(即仅单个样本)，则将仅获得一组CCF值。这将提供关于哪个突变存在于该肿瘤区域内的所有肿瘤细胞中的信息，并将由此提供突变是躯干的还是分支的指示。肿瘤区域中的所有亚克隆突变(即CCF<1)被确定为分支的，而CCF＝1的克隆突变被确定为躯干的。
如上所述，确定躯干突变受限于统计学分析和阈值。因此，如果确定突变的CCF95％置信区间≥0.75(例如0.80、0.85、0.90、0.95、1.00或>1.00)，则可将该突变识别为躯干的。相反，如果在所分析的任何样品中确定突变的CCF 95％置信区间<＝0.75(例如0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.01)，则可以将该突变鉴定为分支的。将会理解的是，通过鉴定从肿瘤中分离的多于一个样品的克隆突变，可以提高用于鉴定躯干突变的方法的准确性。
突变可以是导致氨基酸序列的改变(编码突变)的单核苷酸变异(SNV)、多核苷酸变异、缺失突变、***突变、易位、错义突变或剪接位点突变。
在优选的实施方式中，克隆和/或亚克隆突变是单核苷酸变异(SNV)。
在本发明的一些实施方式中，克隆突变是早期克隆突变。
已知基因组加倍可以在癌症细胞中发生。因此，在基因组加倍事件之前发生的突变将以该加倍事件之后发生的突变的相对拷贝数的两倍存在于癌症细胞中。早期克隆突变是在基因组加倍之前出现在肿瘤中的突变。早期克隆突变包括在基因组加倍事件之前发生的突变，并且以加倍事件之后发生的突变的相对拷贝数的两倍存在于癌症细胞中，即发生在基因组加倍之前并且经历了拷贝数扩增的突变。将会应理解的是，术语“克隆”可包括早期克隆突变和/或克隆突变。早期克隆突变可能存在于染色体区域或特定基因中。早期克隆突变可以是被分类为高可信度的基因组加倍前事件的基因中的体细胞SNV，和/或被分类为涉及高置信度早期(基因组加倍前)扩增事件的染色体区域中的体细胞SNV。可以在表1的基因和/或染色体区域中的一个或多个中检测到早期克隆突变。
特定患者中的cfDNA中的表示肿瘤特征的早期克隆突变和/或克隆突变的存在和/或升高，表明肿瘤复发。因此，检测cfDNA中这些克隆和/或早期克隆突变的存在，可检测肿瘤是否已经复发。早期克隆突变包括发生在基因组加倍前的突变，其经历了拷贝数扩增并且在血浆中具有最高的变异等位基因频率。
包括肿瘤的早期克隆、克隆和/或亚克隆突变的突变图谱，可用于重建来自每个患者的每个肿瘤的***进化树。将会理解的是，每个肿瘤的***进化树代表肿瘤是如何进化的。肿瘤的进化在该树中被编码，并提供关于癌症的异质性以及早期克隆、克隆和/或亚克隆突变组成的遗传多样性的重要生物信息。来自肿瘤的突变可以被组装成***进化树，其定义肿瘤的早期克隆、克隆和/或亚克隆突变图谱。这种***进化树将对肿瘤是特异性的，并且对于已经切除肿瘤的患者是特异性的。
***进化树表征了患者特异性的肿瘤中的早期克隆、克隆和/或亚克隆突变。
早期克隆和/或克隆突变或克隆位于树的“躯干”中。克隆突变是复发指标，并且在样品(例如cfDNA)中检测它们的存在和/或升高指示肿瘤的复发。早期克隆突变在cfDNA中具有高变异等位基因频率，并且它们的存在和/或升高代表预测或指示手术后肿瘤复发的敏感方法。
亚克隆突变位于树的“分支”中。亚克隆突变或亚克隆的检测允许鉴定对肿瘤复发进行播种的分支。鉴定对复发进行播种的分支可能对患者特异性的治疗选择有影响。
条形码
在一些实施方式中，患者特异性的“条形码”由如实施例8和9中所例证的早期克隆、克隆和/或亚克隆突变生成。患者特异性的条形码包含SNV和/或***和/或缺失突变，或由其组成；该突变是特定患者中的肿瘤特征，其可以是起源于克隆或亚克隆以描绘肿瘤***进化树。患者特异性的条形码的SNV的检测，表明特定患者中的肿瘤是否已经复发。条形码对特定患者中的肿瘤是特异性的。因此，条形码对于每位患者都是唯一的。条形码也可以称为个性化条形码。
患者特异性的条形码可包含一种或多种突变。患者特异性的条形码可包含一种或多种SNV和/或***和/或缺失突变。患者特异性的条形码可包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十五种、至少二十种、至少二十五种、至少三十种、至少三十五种、至少四十种、至少四十五种、至少五十种、至少一百种、至少一百五十种、至少二百种、至少二百五十种、至少三百种、至少三百五十种、至少四百种、至少四百五十种、至少或高达500种表示特定患者的肿瘤特征的SNV和/或***和/或缺失突变。
条形码的SNV可以是早期克隆突变、克隆突变和/或亚克隆突变和/或***和/或缺失突变。因此，患者特异性的条形码可包含早期克隆突变、克隆突变和/或亚克隆突变和/或***和/或缺失突变，或由其组成。患者特异性的条形码也可仅包含早期克隆突变。患者特异性的条形码还可以包含由早期克隆驱动基因和/或早期克隆扩增染色体臂产生的SNV(表1)和/或突变标记(表2)。在优选的实施方式中，包含患者特异性的条形码或由其组成的SNV是为检测肿瘤复发提供高灵敏度和高分辨率的SNV。
患者特异性的条形码可包含源自单个区域的早期克隆突变、克隆突变和/或亚克隆突变。上文描述了单个区域。因此，单个区域的患者特异性的条形码可包含早期克隆突变、克隆突变和/或亚克隆突变和/或***和/或缺失突变，或由其组成。单个区域的患者特异性的条形码也可仅包含早期克隆突变。单个区域的患者特异性条形码还可包含由早期克隆驱动基因和/或早期克隆扩增染色体臂产生的SNV(表1)和/或突变标记(表2)。在优选的实施方式中，包含单个区域的患者特异性条形码或由组其成的SNV是那些为检测肿瘤复发提供高灵敏度和高分辨率的SNV。
无细胞DNA(cfDNA)
本发明涉及在对象中检测肿瘤复发的对象特异性的方法，其中在样品中鉴定出克隆和/或亚克隆突变。该样品可以是体液。体液是指其中可存在cfDNA、外泌体来源的肿瘤DNA、循环肿瘤DNA和/或循环肿瘤细胞的任何体液，包括但不限于全血、血清、血浆、骨髓、脑脊髓液、腹膜/胸膜液、淋巴液、腹水、浆液、痰液、泪液、粪便和尿液。通常，将要根据本发明而被分析的体液源自于全血的样品(即，包含血细胞和血浆的血液样品)。优选地，体液是血浆或血清。样品可包含cfDNA、循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞或包含肿瘤DNA的外泌体。将会理解的是，外泌体来源的肿瘤DNA是指由肿瘤细胞释放并含有肿瘤DNA的外泌体。肿瘤DNA被包含在外泌体内并源自于该外泌体。
可以通过任何非侵入性方法从特定患者中获得样品。非侵入性方法包括任何不侵入身体或切开身体的方法。这些方法包括但不限于静脉穿刺、获得液体活检的方法、腰椎穿刺、胸膜液抽吸、心包液抽吸和腹水液抽吸。
在优选的实施方式中，样品包含cfDNA。本文中的无细胞DNA或“cfDNA”是指存在于对象中的细胞外的DNA或这种DNA的分离形式(通常在体液中)。除非另有说明或与上下文相反，否则本文的“循环DNA”是指血液中存在的cfDNA。
肿瘤测序
例如，可以通过外显子组测序、全基因组测序和/或靶向基因试验组测序，将从肿瘤样品中分离的DNA和/或RNA序列和来自相同对象的对比性健康样品进行比较，从而确定肿瘤样品中存在的突变。
与来自非肿瘤样品的DNA和/或RNA相比，鉴定来自肿瘤样品的DNA和/或RNA中的核苷酸差异(例如单核苷酸变异或SNV)的序列比对，可以使用本领域中已知的方法执行。参考样品可以是种系DNA和/或RNA序列。
本发明的方法优选地使用多区域高深度全外显子组测序。
本发明的方法涉及定义一组试剂以在对象中检测肿瘤复发的对象特异性的方法。
在本发明的一些实施方式中，对肿瘤的全基因组和/或全外显子组进行测序。在本发明的其他实施方式中，对肿瘤的基因组和/或外显子组的一部分进行测序。因此，可以对来自肿瘤的DNA的基因组和/或外显子组的全部或一部分进行测序。被测序的肿瘤的基因组和/或外显子组的一部分可以是特异性基因或染色体区域。例如，被测序的肿瘤的基因组和/或外显子组的一部分可包括表1中定义的任何基因或染色体区域。
可以对肿瘤的基因组和/或外显子组的全部或一部分进行测序，并与测序自健康样品的基因组和/或外显子组的全部或一部分进行比较。健康样品可以是健康组织样品或健康血液样品，该样品取自没有肿瘤或不受肿瘤或肿瘤生长影响的患者身体的一部分。
可以对肿瘤或健康样品的基因组和/或外显子组的全部或一部分进行测序，以鉴定或定义肿瘤中的早期克隆、克隆和/或亚克隆突变。确定肿瘤中早期克隆、克隆和/或亚克隆突变的存在，使得能够确定取自对象的cfDNA中的可比较的早期克隆、克隆和/或亚克隆突变。
可以对肿瘤或健康样品的基因组和/或外显子组的全部或一部分进行测序，以鉴定或定义肿瘤中的早期克隆、克隆和/或亚克隆突变。确定肿瘤中早期克隆、克隆和/或亚克隆突变的存在，使得能够确定取自对象的cfDNA中的可比较的早期克隆、克隆和/或亚克隆突变。
在一些实施方式中，从整个肿瘤中或从肿瘤的子部分中对基因组和/或外显子组的全部或一部分进行测序。将会理解的是，肿瘤的子部分是指从患者切除的整个肿瘤的被切除的部分。可以从一种或多种肿瘤子部分中对外显子组的全部或一部分进行测序。可以从至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少或多达十种子部分中对外显子组的全部或一部分进行测序。
在本发明的一些实施方式中，对对象的非肿瘤基因组和/或外显子组的全部或一部分进行测序。在一些实施方式中，对对象的非肿瘤基因组和/或外显子组的全部或一部分进行测序，并与肿瘤基因组和/或外显子组序列进行比较，以定义在对象的肿瘤中发现的克隆和/或亚克隆突变。
在本发明的一些实施方式中，对来自肿瘤的DNA的基因组和/或外显子组的全部或一部分进行测序，以定义肿瘤中的克隆和/或亚克隆突变，这使得可以定义将在来自肿瘤的cfDNA中检测克隆和/或亚克隆突变的存在的一组试剂。
在cfDNA中定义和检测克隆和/或亚克隆突变
合成、定义和/或使用一组试剂，以通过早期克隆、克隆和/或亚克隆突变的存在来检测来自肿瘤的DNA的存在。将会理解的是，一组试剂包括执行核苷酸序列扩增和测序所需的任何试剂。还将理解的是，一组试剂包括捕获cfDNA片段所需的任何试剂。例如，一组试剂可以是用于实施CAPP-SEQ试验的一组试剂或用于实施数字PCR试验的一组试剂。在优选的实施方式中，一组试剂是包含探针和/或引物的一组试剂。此类探针和/或引物可通过本领域中使用的已知和常规技术生产。通常，探针和/或引物将用于多重PCR。在优选的实施方式中，一组试剂是一组多重PCR探针和/或引物。用于执行多重PCR的一组试剂是本领域技术人员已知的。
在本发明的一些实施方式中，在移除肿瘤之前从对象中获得cfDNA，以鉴定在来自肿瘤的cfDNA中发现的突变，并使用这些突变来定义一组试剂。
在本发明的一些实施方式中，基于哪些突变发生在哪些肿瘤子部分中来定义早期克隆、克隆和/或亚克隆突变。例如，早期克隆、克隆和/或亚克隆突变可以被定义在相同肿瘤子部分和/或不同肿瘤子部分中发生的突变上。在优选的实施方式中，肿瘤中的早期克隆、克隆和/或亚克隆突变由一个或多个肿瘤子部分定义。肿瘤中的早期克隆、克隆和/或亚克隆突变可以由至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少八种、至少九种、至少或最多十种子部分定义。在本发明的一些实施方式中，一组检测试剂能够检测一种或多种突变。一组检测试剂能够检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十五种、至少二十种、至少二十五种、至少三十种、至少三十五种、至少四十种、至少四十五种、至少五十种、至少一百种、至少一百五十种、至少两百种、至少两百五十种、至少三百种、至少三百五十种、至少四百种、至少四百五十种、至少或最多五百种表示肿瘤的每个子部分的特征的突变。
本发明的方法涉及在对象中检测肿瘤的复发，包含用对象特异性的一组试剂来分析cfDNA，所述一组试剂将检测来自该肿瘤的克隆和/或亚克隆突变的存在。在移除肿瘤随后或之后从对象中获得cfDNA，并通过cfDNA中肿瘤的克隆和/或亚克隆突变的检测对其进行分析，以确定肿瘤是否已经复发。在优选的实施方式中，cfDNA中克隆和/或亚克隆突变的分析是多重PCR。
在一个实施方式中，该方法涉及通过分析cfDNA以鉴定来自肿瘤的早期躯干突变来检测对象中肿瘤的复发。由于早期的躯干变异将在肿瘤中普遍存在并且由于基因组加倍事件而被扩增，因此检测在基因组加倍之前的这些早期事件将在预测疾病活动和复发的生物标志物方面提供更大的敏感性。检测早期突变的另外的优点是不必对多个区域进行测序，并且因此将减少执行该方法所花费的时间。
为了进一步提高方法的灵敏度，早期的躯干突变可能是被分类为高置信度早期(基因组加倍前)事件的基因中的体细胞SNV，或者被分类为参与高置信度早期(基因组加倍前)扩增事件的染色体区域的体细胞SNV。表1中给出了NSCLC的此类基因和染色体区域的例子。
在另一优选的实施方式中，被合成、定义和/或用于通过克隆和/或亚克隆突变的存在来检测来自肿瘤的DNA的存在的一组试剂，是一组多重PCR探针和/或引物，其用于在多重PCR反应中分析cfDNA中的克隆和/或亚克隆突变。一组检测试剂可以是一组用于多重PCR反应的多重引物。
在本发明的一些实施方式中，一组试剂检测表示***进化树的躯干的特征的一种或多种突变。一组试剂可以检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十五种、至少二十种、至少二十五种、至少三十种、至少三十五种、至少四十种、至少四十五种、至少五十种、至少一百种、至少一百五十种、至少二百种、至少二百五十种、至少三百种、至少三百五十种、至少四百种、至少四百五十种、至少或最多500种表示***进化树的躯干的特征的突变。
在本发明的一些实施方式中，一组试剂检测表示***进化树的分支的特征的一种或多种突变。一组试剂可以检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十五种、至少二十种、至少二十五种、至少三十种、至少三十五种、至少四十种、至少四十五种、至少五十种、至少一百种、至少一百五十种、至少二百种、至少二百五十种、至少三百种、至少三百五十种、至少四百种、至少四百五十种、至少或最多500种表示***进化树的每个分支的特征的突变。
在本发明的一些实施方式中，一组试剂检测表示***进化树的躯干的特征的一种或多种突变以及表示***进化树的分支的特征的一种或多种突变。该一组试剂可以检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十五种、至少二十种、至少二十五种、至少三十种、至少三十五种、至少四十种、至少四十五种、至少五十种、至少一百种、至少一百五十种、至少二百种、至少二百五十种、至少三百种、至少三百五十种、至少四百种、至少四百五十种、至少或最多500种表示***进化树的躯干的特征的突变，以及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十五种、至少二十种、至少二十五种、至少三十种、至少三十五种、至少四十种、至少四十五种、至少五十种、至少一百种、至少一百五十种、至少两百种，至少两百种、至少三百种、至少三百五十种、至少四百种、至少四百五十种、至少或多达500种表示***进化树的每个分支的特征的突变。
在一些实施方式中，从肿瘤切除后起至少48小时、48小时至7天、7至14天、14天至1个月、1至2个月、2至6个月、6个月至1年或超过1年实施cfDNA样品分析。
在进一步的实施方式中，在一段时间内多种场合中实施cfDNA样品分析，例如以规则的间隔实施。
通过分析从肿瘤切除后的对象中获得的cfDNA，检测到表示肿瘤的特征的克隆和/或亚克隆突变，表明肿瘤复发。通过分析从肿瘤切除后对象获得的cfDNA，不存在表明肿瘤的特征的克隆和/或亚克隆突变，表明肿瘤没有复发。
基于发现的治疗方案
本发明的方法需要对样品(例如来自血液样品的cfDNA)的患者特异性的表明肿瘤特征的克隆和/或亚克隆突变进行分析。克隆和/或亚克隆突变是肿瘤复发的敏感标志物。基于克隆变异，例如***进化树的“分支”中的亚克隆突变，可以决定被施用至患者的治疗。亚克隆突变或亚克隆的检测允许鉴定对肿瘤的复发进行播种的分支。鉴定对复发进行播种的分支，可能对患者特异性治疗的选择有影响。
基于cfDNA中表示肿瘤特征的早期克隆、克隆和/或亚克隆突变，创建了个性化治疗方案。存在于患者的cfDNA中的表示复发性肿瘤特征的克隆和/或亚克隆突变，可能更容易受依据不同方法的治疗的影响。基于表示肿瘤特征的克隆和/或亚克隆突变的存在和/或升高，设计治疗方案。治疗可包括但不限于手术、靶向小分子疗法、免疫疗法、抗体疗法、过继性T细胞疗法、疫苗疗法、化学疗法和/或放射疗法。治疗可以单独地或组合地被施用。治疗可以是辅助疗法，其可以包括但不限于过继性T细胞疗法、树突细胞疫苗接种和癌症疫苗接种。
治疗可包含辅助化学疗法，例如顺铂和/或长春瑞滨。治疗还可以包含免疫疗法，例如免疫检查点抑制剂、过继性免疫T细胞免疫疗法、癌症疫苗接种和/或CAR-T细胞。治疗还可以包含针对克隆新抗原的T细胞疗法或通过追踪编码患者特异性的新抗原的克隆变异(即使蛋白质对宿主免疫***可见的肿瘤突变)的实时调节过继性T细胞疗法。治疗可包括使用针对可靶向的改变(例如EGFR突变体或ERBB2扩增)的靶向治疗(例如阿法替尼)。
cfDNA中早期克隆和/或克隆突变的存在和/或升高，可用于监测对治疗的反应。cfDNA中早期克隆和/或克隆突变的存在和/或升高，可用于监测对辅助治疗(例如辅助化疗)的反应。cfDNA中检测到的早期克隆、克隆和/或亚克隆克隆突变，表明缺乏对治疗的反应。cfDNA中早期克隆、克隆和/或亚克隆突变的不存在，与成功的治疗结果相关。
在治疗期间的特定患者中，cfDNA中表示肿瘤特征的早期克隆、克隆和/或亚克隆突变的存在和/或升高，可改变治疗方案。在辅助治疗(例如辅助化疗)期间特定患者中，cfDNA中表示肿瘤特征的早期克隆、克隆和/或亚克隆突变的存在和/或升高，可以改变治疗方案。在治疗和/或辅助治疗(例如辅助化疗)期间特定患者中，cfDNA中表示肿瘤特征的早期克隆、克隆和/或亚克隆突变的这种存在和/或升高，可以用作停止治疗的工具，并使用替代治疗、升级治疗(例如进行临床试验)和/或降级治疗。例如，该治疗或辅助治疗可能不治疗特定患者中的肿瘤，或该治疗或辅助治疗可能对该特定患者有毒。在停止治疗、使用替代治疗、升级治疗和/或降低治疗背后的原理，可以基于cfDNA中早期克隆、克隆和/或亚克隆突变的存在、不存在、升高和/或下降。
cfDNA中早期克隆、克隆和/或亚克隆突变的存在、不存在、升高和/或下降，可以帮助临床医生决定对特定患者施用什么治疗。基于cfDNA中早期克隆、克隆和/或亚克隆突变的存在、不存在、上升和/或下降，临床可决定施用或不施用辅助化学疗法。基于cfDNA中早期克隆、克隆和/或亚克隆突变的存在、不存在、升高和/或下降来施用或不施用辅助化学疗法的决定，也可以基于在手术后的一段时间时早期克隆、克隆和/或亚克隆突变的水平。可以在手术后的一段时间内多种场合实施cfDNA样品分析，例如以规律的间隔实施。可以从手术后起至少48小时、48小时至7天、7至14天、14天至1个月、1至2个月、2至6个月、6个月至1年、或一年以上实施cfDNA样品分析。可在手术后4至6周之间实施cfDNA样品分析。
现在将通过例子的方式进一步描述本发明，这些例子意为用来帮助本领域普通技术人员实施本发明，而不是旨在以任何方式来限制本发明的范围。
实施例
材料和方法
引言
研究表明，在癌症患者的血浆中成功检测到与癌症相关的点突变。
通过全外显子组测序(WES)或AmpliSeq确定了4种肺癌肿瘤的突变图谱，并且使用多重PCR-下一代测序(mPCR-NGS)方法在相应的血浆样品中成功检测到这些突变的子集。
mPCR-NGS方法用于随时间检测和追踪癌症患者血浆中的癌症特异性突变，并用于评估该方法在监测通过治疗的疾病进展中的效用。该项目的第一阶段是确定在50名未接受过肺癌治疗患者的血浆中的基线突变图谱。
提供来自50名患者的来自几个肿瘤区域(每个肿瘤1-7个区域)的纯化的基因组DNA样品、纯化的种系DNA样品、以及完整血浆样品。先通过全外显子组测序(WES)和AmpliSeq确定所有肿瘤区域的突变图谱，并确定每位患者的突变子集。这些突变包括驱动突变(driver mutation)和乘客突变(passenger mutation)，以及克隆和亚克隆突变。每种肿瘤的完整突变图谱，用于重建每种肿瘤的***进化树。
基于这些数据，设计了多重PCR试验，对相应的引物进行了排序，制备了引物池，控制引物池质量，并针对每个池对mPCR方案进行优化。将血浆cfDNA进行纯化、定量并转化成文库。然后将该文库用作该mPCR的输入，对产物进行测序和分析。将类似的方案应用于来自肿瘤和匹配的正常样品的基因组DNA。
工作流程图如图1所示。每个样本的SNV总数和通过驱动类别进行排序的工作试验如图2所示。
研究人群
对于前50名患者中的每一名，在肿瘤切除之前和任何疗法之前获得的血浆分离出4-5mL。将血浆样品等分到2mL管中。
纯化来自受累的***(如果可用)和来自白细胞分数(称为匹配的正常组)的多达7个肿瘤子部分的纯化的基因组DNA，并获得来自每个样品的500ng纯化的DNA(归一化为10ng/uL)。
使用全外显子组测序来确定突变图谱，其包括每个肿瘤子部分的单核苷酸变异(SNV)。使用每个肿瘤的完整突变图谱来重建每个肿瘤的***进化树。
使用PyClone来鉴定SNV的簇，并计算它们的癌症-细胞分数。这被用于将SNV分类为克隆或亚克隆。确定每个SNV的驱动分类，并将其作为驱动分类提供(1-4，其中1最可能是驱动突变，而4是最不可能的)。对于每位患者，鉴定了多达108种SNV，横跨了所有驱动分类，包括克隆和亚克隆突变。还鉴定了每个肿瘤子部分、***和匹配的正常DNA样品中每种SNV的检测到的等位基因分数，以及PyClone克隆/亚克隆簇信息。
对于每位患者，可获得以下的信息：肿瘤大小(mm)、肿瘤位置(肺叶)、肿瘤分期、肿瘤组织学类型、受累***的数量、血管侵犯状态以及关于采集医院的反识别信息。
试验设计和方案优化
标准试验设计流水线用于设计所有给出的SNV的右PCR引物和左PCR引物。我们将靶向SNV的一对右PCR引物和左PCR引物称为用于该特定SNV的试验。注意，如果它们非常接近，则一个试验覆盖超过1种靶SNV是可能的。对于试验中的每一对，使用标准流水线计算形成引物二聚体的概率。使用LICHeE(癌症异质性和进化的谱系推断)，使用每个肿瘤中的SNV等位基因分数数据来重建***进化树。将每个样品的试验列表进行过滤，以移除被预测将形成引物二聚体的引物，同时优先考虑覆盖驱动1和2SNV的试验。剩余的试验用于创建5个平衡池，每个池都包含10名患者的试验。被汇集在一起的所有试验都是相容的，这意味着在池中没有被预测将形成引物二聚体的引物。在每个步骤中，选择试验以使得：
·覆盖驱动1和2的SNV的试验具有最高优先级
·对于每个患者，每个分支的所选SNV的数量与来自重建的***进化树的该分支的总SNV数成比例。更具体地说，我们尝试从该重建的***进化树中的分支中对SNV进行均匀采样，确保所选择的试验能够提供对该重建树的良好覆盖。
最终设计由均匀分布在5个池中972个试验组成，并且对每个样品含有15-20个试验。
池质量控制(QC)和优化
通过整合的DNA技术(IDT)在各孔中合成了972个引物对，脱盐并归一化至100uM。根据池化方案将试验池化，并将每个池用于组合的QC/优化实验。对于优化实验，将几个PCR参数改变，并且从序列数据中评估对测序性能以及失败试验的数量的影响。确定在靶读出序列、读出序列深度均一性以及错误率上产生最佳百分比的PCR条件。对为大多数引物二聚体负责的引物进行鉴定，并将其从每个库中移除(对于被移除的每个引物，其相应的配偶体也将被除去)。在该步骤之后，剩余908个总试验，均匀分布在5个池中。
DNA提取和QC
在cfDNA提取之前将来自每位患者的所有血浆的等分样品池化，并且肉眼评估每个池化的血浆样品的溶血等级(没有溶血、轻度溶血或严重溶血)。使用Qiagen NA试剂盒遵循针对5mL血浆优化的方案提取cfDNA。所有cfDNA样品均在生物分析仪高灵敏度芯片上进行质量控制。通过在校正曲线上的单核小体峰的***，相同的生物分析仪高灵敏度运行也用于定量cfDNA样品，该校正曲线从先前被定量的纯cfDNA样品中制备。这是必要的，因为cfDNA有时含有与芯片上的高尺寸标记物重叠的完整DNA部分，这使得该单核小体峰的定量不可靠。使用QuantIt DNA高灵敏度试剂盒定量被纯化的基因组DNA样品的代表性子集(来自肿瘤子部分、***和白细胞)。定量的所有样品均在预期范围内(～10ng/uL)。
cfDNA文库制备
使用文库制备试剂盒并遵循试剂盒说明书，将来自每个血浆样品的全部cfDNA量用作到文库制备(Library Prep)中的输入。对于具有极高cfDNA量的两个样品，将文库制备中的输入量限制为～50,000基因组当量(165ng)。将文库扩增至平台，然后遵循制造商的方案使用Ampure磁珠进行纯化。被纯化的文库在LabChip上进行质量控制。
cfDNA多重PCR和测序
使用相关试验池和优化的血浆mPCR方案，将来自每个血浆样品的文库材料用作到多重PCR(mPCR)中的输入。在单独的PCR步骤中将mPCR产物条形码化，并根据试验池信息将条形码化的PCR产物池化到5个池中。遵循制造商的方案使用Ampure磁珠将该池纯化，对其进行质量控制，并在生物分析仪DNA1000芯片上将其定量。每个池包含10种癌症血浆文库和20种阴性对照(从假定健康的志愿者中提取的cfDNA中制备)。所有20种对照样本均由临床研究部门遵循优质临床规范(Good Clinical Practice，GCP)根据适当经患者同意的IRB批准的方案而获得。样品获得自三种来源之一：健康的志愿者、Advanced BiomedicalResearch,Inc或StemExpress。在单独的HiSeq2500 Rapid run上对每个池进行测序，其具有50个循环单标签双端测序(paired end single index read)。
gDNA多重PCR和gDNA测序
使用相关试验池和优化的基因组mPCR方案，将基因组DNA样品用作到相似mPCR中的输入。在单独的PCR步骤中将mPCR产物条形码化，并将所有条形码化的产物合并到一个池中。遵循制造商的方案，使用Ampure磁珠纯化该池，对其进行QC并在生物分析仪DNA 1000芯片上进行定量。在单个HiSeq2500 Rapid run上对该池进行测序，其具有50个循环单标签单端测序(single end single index read)。
亚克隆解构
为了确定突变是克隆还是亚克隆，以及每种肿瘤的克隆结构，使用改良版的PyClone。对于每个突变，计算两个值obsCCF和phyloCCF。obsCCF对应于每个突变的观察到的癌细胞分数(CCF)。相反，phyloCCF对应于突变的***进化的CCF。为了阐明这两个值之间的差异，考虑肿瘤内每个癌细胞中存在的突变。一个肿瘤区域中的亚克隆拷贝数事件可能导致癌细胞的子集中的这种突变的丧失。因此当这种突变的obsCCF低于1，从***进化的角度来看，该突变可以被认为是克隆，因为它发生在该肿瘤的***进化树的躯干上，并且因此phyloCCF可以是1。
为了计算每个突变的obsCCF，将局部拷贝数(从ASCAT获得)、肿瘤纯度(也从ASCAT获得)和变异等位基因频率进行了整合。简而言之，对于给定的突变，我们首先使用以下公式计算观察到的突变拷贝数nmut，其描述了携带给定突变的肿瘤细胞的分数乘以该基因座处的染色体拷贝数：
其中VAF对应于突变碱基处的变异等位基因频率，并且p、CNt、CNn分别是肿瘤纯度、肿瘤基因座的特异性拷贝数和正常基因座的特异性拷贝数(对于常染色体，将CNn假定为2)。计算使用VAF的预期突变拷贝数nchr,，并指定使用最大似然性的针对可能的局部拷贝数状态之一的突变。在这种情况下，只考虑整数拷贝数。
然后使用PyClone Dirichlet过程聚类将所有突变进行聚类。对于每个突变，使用观察到的var_count并且设置ref_count从而使得VAF等于预聚类CCF的一半。鉴于拷贝数和纯度已经被校正，设置主要等位基因拷贝数为2，以及次要等位基因拷贝数为0，纯度为0.5；基于其预聚类CCF的估算，允许聚类以简单地将克隆和亚克隆突变进行分组。我们以10,000次迭代和1000次预烧以及默认参数运行了PyClone，但--var_prior设置为'BB'和-ref_prior设置为'normal'。
为了确定每个突变的phyloCCF，实施与上述类似的程序，不同之处在于针对亚克隆拷贝数事件将突变进行校正。具体而言，如果观察到的变异等位基因频率与给定克隆突变的预期显著不同(P<0.01，使用R中的prop.test)，则我们确定亚克隆拷贝数事件是否能导致观察到的和预期的VAF之间的不显著差异(P>0.01)。然后通过用nmut除以nchr来计算每个突变的预聚类CCF。使用来自ASCAT输出的原始数值估计亚克隆拷贝数事件。
为了确保可能不可靠的***缺失的VAF不会导致单独的突变簇，将每个估计的***缺失CCF乘以区域特异性校正因子。假设存在于所有区域中的大多数普遍存在的突变是克隆的，那么通过将普遍存在的突变的中位突变CCF除以普遍存在的***缺失的中位***缺失的CCF来计算该区域特异性校正因子。
突变的定时
通过如上所述的PyClone聚类，将个体突变(SNV、DNV和***缺失)定时为克隆或亚克隆。对于克隆的定时，使用来自phyloCCF的值。然后将克隆突变进一步定时为早期的、晚期的或不定时的克隆。首先相对于如前所述的重叠拷贝数事件在每个肿瘤区域内进行此操作。简而言之，如果突变拷贝数(如上所述)为>1，则将具有至少两个主要等位基因拷贝的部分基因组中的突变初步分类为早期，如果<＝1，则分类为晚期。然后在所有区域进行时序分析。如果给定突变在所有区域上为早期，或者如果突变在大多数区域为早期，则被分类为克隆的突变被称为“早期克隆”。如果它在所有区域上被称为晚期或如果它在大多数区域上是晚期，则克隆突变被称为“晚期克隆”。不能被定时为早期或晚期的任何克隆突变都被分类为“不定时克隆”。
染色体臂SCNA的定时
如上所述，整个染色体臂的增加和丢失被称为克隆和亚克隆。通过给定臂上的所有突变的突变拷贝数，进一步对克隆染色体臂的增加进行定时。将映射到该臂的增加的所有突变进行鉴定，并在主要等位基因的一个拷贝之内确定具有突变拷贝数的突变的跨区域平均比率。如果在主要等位基因的一个拷贝之内大多数突变示出了拷贝数，表明该突变发生在拷贝数增加之前并且通过该染色体臂而增加，则该染色体臂的增加被称为“晚期克隆”。如果大多数突变示出了较低的拷贝数，表明该突变发生在染色体臂的增加之后，那么该拷贝数的增加被称为“早期克隆”。如果没有足够的映射到染色体臂的增加的区域的突变，染色体臂的增加被称为“不定时克隆”。对于克隆性染色体臂的丢失，我们在基因组加倍的肿瘤中将相对于LOH状态的损失进行定时。在基因组加倍的情况下示出了LOH的任何染色体臂损失，可能在基因组加倍之前发生，因为否则其将需要两次独立的命中。因此，在基因组加倍的情况下示出了LOH的染色体臂的损失被称为“早期克隆”，在没有LOH的基因组加倍情况下的染色体臂损失被称为“晚期克隆”，并且不在基因组加倍的情况下的染色体臂的损失被称为作为“不定时克隆”。
***进化树构建
如上所述，遍及肿瘤区域将突变进行聚类。在***进化分析中包括具有至少5种突变的突变簇。在该分析中仅包括具有至少两个具有良好拷贝数数据的区域和至少两种突变簇的肿瘤(来自90种肿瘤的292个肿瘤区域)。为了推断突变簇之间的***进化关系，在所有肿瘤区域中在每个突变簇对的phyloCCF值之间进行单侧t检验。应用0.025的p值阈值来确定给定的突变的簇是否显著小于另一个簇。如果簇A在至少一个区域中显著小于B，并且簇B在任何区域中都不显著小于簇A，则簇A被确定为起源于簇B。这有时会导致不可能的***进化关系，其中例如簇A被注释为起源于两个不同的簇B和C，这两个簇都来自D，在该***进化树中创建了循环。为了解决这个问题，将所有循环进行鉴定，并且通过顺序地移除包含最少突变的簇直到在***进化树的结构中找不到循环来将其解决。通过将具有pyclone聚类的CCF值的逐个区域的散点图的树形结构进行比较，手动验证所有***进化树。通过在校正拷贝数变化之前和之后比较遍及区域的CCF值，尝试将用于引起循环的较小的突变簇移除。有时特别是较小的突变簇在特定区域具有大的置信区间，可能是由于拷贝数变化，引起在***进化树结构中的错误放置。这在手动验证步骤中被解决。
突变标记分析
使用R中的deconstructSigs程序包，估计突变标记。考虑了标记1A、2、4、5、13。对于暂时解剖的突变标记，如果存在至少15种突变，才应用突变标记分析。类似地，亚克隆特异性突变标记分析仅限于具有至少15种突变的亚克隆。
数据分析
血浆SNV调用
每次血浆测序运行包含10个癌症样品和20个阴性对照样品，所有样品都用相应的mPCR池进行测序。将由池中的试验所覆盖的SNV的集合认为是用于相关的运行的靶标SNV。在每个SNV位置处，使用所有20个阴性对照样品加上预期不含有该特定SNV的9个癌症样品构建误差模型。在推定的阴性样品中具有高血浆VAF(>20％)的样品被认为具有可能的种系突变，并且从背景误差模型中被排除。基于背景误差模型计算每个靶标SNV的置信度得分。如果相应血浆样品中该突变的被计算的置信度超过我们的置信阈值，则进行阳性血浆SNV调用。
使用具有相同置信度阈值的相同调用策略，来尝试在预期不包含给定SNV的剩余样品(包括其他癌症样品和对照样品)上进行SNV调用。以这种方式检测到的SNV被认为是“假阳性”。假阳性率为0.24％(在突变水平)。
组织SNV调用
在一次测序运行中对所有肿瘤子部分、***样品和匹配的正常样品进行测序。对于每个样品(组织子部分、***或匹配的正常样品)，仅使用适当的mPCR池。每个预期突变的组织VAF直接地从序列数据中确定(突变体DOR)/(总DOR)。只有组织VAF>5％的突变才被认为是阳性。
SNV试验池创建和验证
cfDNA提取
每个病例可获得多达5毫升血浆用于本研究。将整个体积的血浆用于cfDNA提取。使用QIAamp Circulating Nucleic Acid试剂盒(Qiagen)提取cfDNA，并洗脱到50ul DNA悬浮缓冲液(Sigma)中。将纯化的cfDNA冷冻保存在-20℃直至使用。
cfDNA QC和定量
对每个cfDNA样品进行QC并在高灵敏度生物分析仪(Agilent)上进行定量。血浆cfDNA由主要单核小体峰(～160bp)组成；对于一些样品，可见双核小体和三核小体峰(分别为～320bp和～500bp)。所使用的文库制备方法选择性地扩增该cfDNA的单核小体分数。因为高分子质量DNA分数有时与生物分析仪上使用的上部标记重叠，所以定量并不总是可靠的。因此，使用标准曲线从该单核小体的峰高估计被分析的cfDNA的量。
SNV试验设计
将Natera的标准化试验设计流水线用于设计肿瘤样本中检测到的所有SNV的正向和反向PCR引物；靶向SNV的每对引物都包括用于该SNV的试验。如果两个SNV非常接近，则单个试验可以覆盖超过1个靶标SNV。对于一些SNV，设计试验是不可能的。当创建试验池时，计算两个试验的每个配对形成引物二聚体的概率。对于每个患者样品，选择为被预测为引物二聚体的最佳试验列表，同时优先考虑覆盖驱动SNV的试验。这些剩余的试验用于创建10个平衡池，每个池都包含10位患者的SNV的试验和平均每位患者20个试验。总是选择试验，使得1)覆盖驱动SNV的试验具有最高优先级，以及2)对来自重建的***进化树中的分支的SNV进行均匀抽样。基线队列的最终设计由1835个试验组成，其均匀分布在10个池中并且包含每个样品的15-20个试验。
对于纵向队列，为腺癌样品增加了多达10个额外的试验。被设计的试验用于创建5个平衡池，每个池都含有5位患者。将总共598个试验分析用于纵向队列。
SNV池QC
以96孔板中的单个寡核苷酸的形式从IDT(Coralville，IA)订购SNV试验，其每个都由正向和反向引物组成，脱盐并标准化至每个100μM。根据池化方案将寡核苷酸池化，并通过使用来自健康对象的一个血浆cfDNA文库运行多重PCR和测序方案，对每个池进行QC。对于每个池，分析测序数据以确定引物二聚体读数的量且鉴定脱扣试验(drop-outassay)。如果大部分测序读数由引物二聚体造成，则分析该引物二聚体读数以确定有助于二聚体形成的引物，并且移除对大多数引物二聚体读数有贡献的引物。创建仅由来自每个池的功能试验组成的最终池，并用于相应血浆样品中的SNV检测。
分析验证
将20种合成的探针(spike)以等摩尔比混合并用于制备文库。将该文库滴定到由来自正常细胞系(来自Coriell，Camden，NJ的AG16778)的单核小体DNA(10,000个拷贝)制备的文库中。合成的探针与被分组到基线样品的池1中的20个SNV匹配。每个合成的探针由160bp的dsDNA寡核苷酸组成，其在80位具有SNV，侧翼为人基因组中该位置的正常序列。
将20种合成的探针的文库以2.5％、0.5％、0.25％、0.1％、0.05％(各一式三份)和0.01％、0.005％和0.001％(各一式四份)滴定到单核小体DNA文库中；该单核小体文库也在没有探针的情况下运行(一式三份，作为阴性对照)。因为以如此低水平制备加标样品(spiked sample)要么会受到采样噪声影响(0.01％探针到10,000个基因组拷贝中的背景相当于一个突变体拷贝)，要么是不可能的(水平低于0.01％)，所以将样品混合为文库。此外，因为该文库制备过程具有～80％的效率，所以对于低拷贝突变体样品，不可能知道最终文库中所表示的突变分子的数量。文库混合允许SNV检测步骤的测试而不受该文库制备步骤的干扰。
在文库混合和测序之后，分析了20种掺入探针的SNV。用于具有2.5％标称输入的样品的每个探针的测量的VAF，被用于计算输入校正因子(测量的VAF/2.5％)；这也被应用至相应探针的其他输入。测量的VAF与标称输入(例如，2.5％)不同，最可能的是因为单核小体断裂模式不是完全随机的(所以可以用特异性PCR试验检测到的DNA片段的实际数量与10,000个拷贝的平均输入不同)。因此，实际输入水平与标称输入不同，并且测量输入间隔的灵敏度。选择输入间隔，使得每个间隔中存在有意义数量的样本。
血浆SNV分析
使用Natera文库制备试剂盒，将来自每个病例的40微升提取的cfDNA用作到文库制备中的输入，该试剂盒包括平末端修复、A尾加工、通用衔接子连接、PCR扩增至平台期和扩增材料的纯化。所有被纯化的文库在LabChip GX 5k DNA芯片上进行QC。成功的文库在～250bp处具有单峰。
然后通过mPCR-NGS分析被扩增的文库。在肿瘤样品(多达20个靶标/样品)的分析中检测到靶向SNV的PCR引物。在Jamal Hanjani et al.Ann Oncol.2016中，示出了每个池的最佳PCR条件。
每个PCR试验池都用于扩增来自10个相应样品和20个阴性对照样品(从健康对象中制备的血浆文库)的SNV靶标。每个扩增子池都在一个Illumina HiSeq 2500Rapid Run上进行测序，其使用Illumina Paired End v1试剂盒进行50个循环的双端测序，每个试验的平均靶标DOR为～40,000。
统计方法
每个血浆测序运行都含有10个癌症样品和20个阴性对照样品，所有样品都用相应的mPCR池进行测序。由池中的试验所覆盖的SNV的集合，被认为是该相关运行的靶标SNV。血浆样品中<1000个读数的靶标试验，被认为是失败并且未进一步分析。在每个SNV位置处，使用所有20个阴性对照样品加上预期不含有该特定SNV的9个癌症样品(基于肿瘤组织测序)构建误差模型。在推定的阴性样品中具有高血浆VAF(>20％)的样品，被认为具有可能的种系突变，并且被排除在背景误差模型之外。基于背景误差模型计算每个靶标SNV的置信度得分。如果相应血浆样品中该突变的计算置信度超过我们的置信度阈值，则进行阳性血浆SNV调用。
具有相同置信度阈值的相同调用策略，被用于来尝试在预期不含有给定SNV的剩余样本(包括其他癌症样本和对照样本)上进行SNV调用。以这种方式检测到的SNV被认为是“假阳性”。假阳性率为0.24％(在突变水平)。
肿瘤组织和基线DNA SNV分析
将来自肿瘤子部分和种系DNA样品(通过CRUK提取并归一化至10ng/μl)的纯化的gDNA，用于确认每个患者中的靶标SNV。为此，使用相应的引物池和在血浆文库上使用的相同PCR条件，将gDNA(70ng/rxn)用作到mPCR中的输入。在一个Illumina HiSeq 2500 RapidRun上对该样品进行测序，其使用llumina Single End v1试剂盒进行50个循环单端读取测序，每个试验的平均靶标DOR为～4,000。将序列数据用于确定每个样品中每种预期SNV的变异等位基因频率(VAF)。将以这种方式确定的VAF与通过CRUK确定的VAF进行比较。
实施例1-cfDNA提取和分析
50个血浆样品的cfDNA浓度分布(图3)遵循基于5mL血浆的预期分布(中值为2,200基因组拷贝当量/mL血浆)。在表3中示出了cfDNA浓度、溶血等级(视觉上估计)和cfDNA大小分布的定性评估(根据生物分析仪的痕量视觉上估计)。
实施例2-肿瘤子部分中的变异等位基因频率(VAF)分析
分析来自每个肿瘤子部分的序列数据，以确定每个肿瘤子部分、***和匹配的正常样品中的每个SNV的变异等位基因频率。将该数据与类似数据进行比较。对于大多数样品，来自每个肿瘤子部分的组织VAF值与测定的组织VAF值紧密匹配(图4)。然而，有大量样品存在显著差异(图5)。观察到三种类型的差异：
·(i)对于一种或两种子部分，所有VAF在该分析中均为0或接近0，但在随后的分析(例如：LTX041、LTX111)中是非零的(并且横跨相同样品的其他子部分中所见的VAF范围)；
·(ii)对于几种试验，VAF在分析中为0，但在随后的分析中是非零的(并且横跨相同样品的其他子部分中所见的VAF的范围)，但是用这种差异模式(例如：LTX093、LTX074)没有看到子部分的聚类；
·(iii)对于几种试验或区域，没有一种试验失败，但两种分析中获得的VAF之间的一致性通常较差(例如：LTX063、LTX059)。
实施例3-血浆SNV检测
一个样品(LTX206，19个试验)测序失败并从该分析中被移除(该样品将在随后的实验中被拯救)。留下覆盖911个SNV的889个试验。读出序列的深度小于1,000的试验，被认为是失败的；并且它们相应的SNV被标记为“无调用”。从该分析中移除了总共21个“无调用”的SNV；分析了总共890个SNV。
血浆中的总体SNV检测率为35.5％(310/890)，这与我们在初步研究中观察到的相似。未检测到的SNV可能是由于血浆样品中不存在突变的事实。以高置信度被检测到的SNV的平均突变等位基因频率为0.875％(范围为0.011-13.93％)。如果被预期存在于该样品中的≥1SNV在血浆中被确信地检测到，则癌症样品被认为是“在血浆中被检测到的”。使用该定义，血浆中的整体样本检测率为69％(34/49个样本)，并且对于那些，并且在血浆中检测到的SNV的平均数量为9.1(范围为1-19)。对于在血浆中被检测到的SNV的直观表示，参见图6。通过SNV和样品进行的分解如图7所示。每个样品的血浆中被检测到的SNV数量如表4所示，所有被分析的SNV的完整数据如表5所示。从每个样品中检测到的SNV的血浆VAF作为SNV克隆状态的函数如图8所示。
实施例4-额外的发现
除了靶标SNV之外，我们还检查了肿瘤和血浆中通过我们的试验扩增的每个位置。从组织样品中鉴定出未被报道的总共16种体细胞新SNV。其中，7种也用其对应血浆样品调用。由于我们使用了非常严格的置信度阈值来避免潜在的假阳性，我们对被检测到的突变非常确信。它们如表6所示。
实施例5-影响血浆中SNV检测的因素
有几个因素可影响血浆SNV检测。在这里，我们旨在确定具有最显著相关性的因素。为了相关性而被分析的因素包括：肿瘤大小(表5中的Lesion1SizeDer值)、分期、肿瘤组织学类型、***状态、血管侵犯、肺叶的定位、肿瘤子部分中的SNV频率、每个SNV的克隆信息以及cfDNA的量。下面描述了用于样品水平和突变水平的血浆SNV检测的多变量分析。样品水平分析旨在鉴定在血浆样品中影响被检测到的SNV数量的因素。突变水平分析旨在鉴定影响血浆SNV调用的因素。
样品水平分析
针对过度离散进行调整的Poisson回归分析表明，在血浆中被检测到的SNV的数量与组织学类型之间在统计学上高度显著的相关性。估计的模型系数对应于组织学类型1.29，标准误差0.30(p值＝2.48e-05)。在调整肿瘤大小、阶段或部位时，这种相关性没有改变。
我们还发现在相同Poisson回归模型之内血浆中检测到的SNV数量与肿瘤大小之间存在弱的相关性(估计的肿瘤大小的模型系数为0.02，标准误差为0.01，p值＝0.0682)。肿瘤大小和阶段是相关的，并且似乎提供关于血浆中可检测的SNV数量的类似信息。一旦考虑到肿瘤大小，那么肿瘤分期似乎没有增加可以解释血浆中被检测到的SNV数量上的变化的额外信息(肿瘤分期的模型系数在0.05的标准显著性水平上与零没有统计学差异，p值＝0.3677)。
我们将该模型系数解释如下。与腺癌相比，具有相同肿瘤大小、阶段和部位的鳞状细胞肿瘤具有平均exp(1.29)～3.7倍的血浆中检测到的SNV。对于组织学亚型、肿瘤分期和肿瘤部位的固定值，肿瘤大小中增加一个单位(mm)导致exp(0.02)＝1.02的SNV计数的乘性增加(平均增加约2％)。
总之，在血浆中是否检测到特定肿瘤的最重要的预测因子似乎是组织学类型：在血浆中检测到100％的鳞状细胞癌(SQCC)，而仅检测到52％(15/29)的腺癌(ADC)(图9)。
在该队列中仅存在一种癌肉瘤肿瘤和一种腺鳞癌肿瘤，所以关于这些肿瘤类型这次没有得出任何关于血浆中的一般可检测性的结论。
cfDNA的量与血浆样品中被检测到的SNV的数量和比例之间没有明显的相关性。然而，所有具有高输入(>25,000个拷贝)的样品在血浆中被检测到≥1SNV(图10)。
突变水平分析
执行回归分析，以确定可用于预测血浆中突变的检测的变量。更具体地，使用二元响应变量来将突变注释为“被调用”或“未被调用”。肿瘤中的平均VAF是指所有肿瘤区域中的平均突变VAF。使用PyClone确定克隆/亚克隆信息。Logistic回归分析示出了，以下变量与突变的检测具有统计学上显著的相关性(p值<5％)：
·组织学类型(p＝8.3e-30)
·肿瘤中的平均VAF(p＝4.3e-6)
·克隆状态(p＝1.6e-4)
·肿瘤的大小(p＝3.5e-4)
组织学类型具有最低的p值，意味着最强的相关性，支持了来自样品水平分析的观察结果(图9)。与来自ADC的SNV的检出率为14％相比，来自SQCC的SNV的检出率为70％。肿瘤中的平均VAF与血浆中SNV的检测次要地显著相关(图11)。克隆状态也与血浆中SNV的检测相关(克隆SNV的检出率为48％，相对地亚克隆SNV的检出率为22％)。最后，肿瘤的大小也影响血浆SNV检测率(也在样品水平分析中观察到)。
剩余的变量要么对检测率没有统计学上的显著影响，要么可以通过模型中已有的四个变量来解释假定的效果(例如，肿瘤VAF足以解释在各阶段中的检测率中观察到的差异)。
实施例6-血浆中未被检测到的SNV的分析
几个证据支持这样的结论：未能检测到血浆中预期SNV>60％(911中的580个)可能是由于cfDNA样品中不存在这些变异，而不是mPCR/NGS方法的某些失败。我们在此阐明了这些证据。
·对于检测到预期血浆SNV的试验和未检测到的试验，读出序列的深度(DOR)分布是相似的(对于检测到该预期SNV的试验平均为45,551，对于未检测到SNV的试验为45,133，图10A)。这表明对应于假阴性SNV调用的试验与真阳性调用的试验一样有效。
·尽管在靶标SNV位置处的读出序列的深度很高，但对于大多数未被检测到的位置，突变体读出序列的数量很少：在未被检测到的580个SNV中，207个(36％)具有0个突变体读出序列，以及414个(71％)具有<5个突变体读出序列。此外，所有未被检测到的位置的观察到的突变体VAF均小于0.1％，并且所有病例中的突变水平与其相应的背景错误率难以区分。
·未检测到的580个SNV中有275个属于没有血浆突变的样品，这意味着它们未被检测到可能是由于血浆中的ctDNA不足。
·通过将每个位置的检测极限(LOD)估计为与该位置处的平均背景突变体VAF相差3个标准差，真阳性和假阴性SNV位置的检测极限的分布是相似的(图10B)。这表明如果样品中存在SNV，则将检测到该SNV。
实施例7-***进化树
为了研究能够从cfDNA数据中重现肿瘤***进化树的可能性，我们检查了从血浆中检测到的SNV是否与从肿瘤组织数据重建的肿瘤***进化树的结构一致。从血浆中检测到的SNV可以重现肿瘤进化发育，如果它们可以覆盖该树中足够数量的分支，并且它们的VAF值遵循该树中SNV的顺序——即，位于早期分支中的SNV需要在血浆中具有更高的VAF。更具体地说，我们定义了两个约束条件，这些约束条件应该适用于维持从血浆中检测到的SNV与根据组织数据重建的肿瘤***进化树的结构一致：
约束条件1)对于具有在血浆中检测到的SNV的树中的每个分支，其树中的子分支的估计的癌细胞分数(CCF)的总和不应超过该分支的CCF
约束条件2)对于在血浆中检测到的每对SNV A和B，如果SNV A属于SNV B的前身分支，则与SNV B相比其应该具有更高的血浆VAF
基于每个肿瘤样品的组织数据的SNV等位基因分数，被用来使用LICHeE来重建肿瘤***进化树。之后，使用被检测到的SNV的血浆VAF数据来评估每个样品的约束条件1和2的正确性。为了评估约束条件1的正确性，首先我们基于该分支中被检测到的SNV的血浆VAF估计该树中每个分支的血浆癌细胞分数(CCF)。然后，我们计算该树中分支的数量，其中约束条件1对它们有效的SNV在血浆中被检测到。为了评估约束条件2的正确性，我们测量了所有SNV对的比率，其中一个是另一个的前身，并且约束条件2对它们有效。
这里研究的所有49个样品的在血浆SNV数据和肿瘤***进化树之间的相关性的结果总结在表7中。因为对血浆中检测到的很少SNV的样品的这种研究是不相关的，所以在图11A和11B中我们呈现了我们在血浆中检测到至少10个SNV的样品的结果。图11A示出了树中分支的总数和血浆中被检测到的分支数。对于17个样品中的7个样品，在血浆中检测到树的所有分支。图11A还示出了大多数被检测到的分支具有有效的CCF估值，意为约束条件1通常对于被检测到的分支有效。图11B示出了SNV对的百分比，其中在肿瘤树中一个是另一个的前身，并且它们的血浆VAF值确认了树结构，意味约束条件2对它们有效。可以看出，17个样本中有12个样本的百分比≥80％。
实施例8-条形码
背景
通过被切除的NSCLC的多区域全外显子组测序和通过生物信息管道处理测序数据，鉴定体细胞单核苷酸变体(SNV)并执行亚克隆解构，以鉴定突变是亚克隆还是克隆。使用时序分析，基于基因组加倍事件，将个体突变定时为早期、晚期或不定时。
使用基于将亚克隆簇条形码化的“定制”变异试验组，以追踪NSCLC复发的***进 化
如在上述实施例1至7中地，基于多区域全外显子组测序数据、亚克隆解构和***进化树分析，鉴定克隆和亚克隆变异簇。未公开的数据示出了NSCLC复发可以是单克隆的并且源自早期的躯干克隆或特异性亚克隆，或者复发可以是源自多个亚克隆的多克隆。通过将存在于***进化树中的所有变异簇进行条形码化(即，具有对于在引物试验池内表示的个体簇是私有的SNV)，已经证明了cfDNA可以预测哪个“部分”的肿瘤引起该复发，并因此预测哪个亚克隆群体引起该复发。例如，如果血浆中被检测到的SNV对应于原始***进化树的一个分支中的特异性亚克隆簇，那么可以推断该分支对疾病复发进行“播种”。通过使用我们的***进化条形码，我们可以追溯到该特异性分支的生物学，并鉴定治疗上相关的复发的驱动因素，其可用于改变或适应早期疾病环境中的疗法。靶向使用小分子或免疫疗法的复发的这些驱动因素，当疾病体积较小时，可以潜在地克服由疾病量和癌细胞数量增加驱动的瘤内异质性相关的后期问题，这可能导致更好的患者结果。
生成翻译相关的“高灵敏度”条形码，以预测复发、最小残留疾病、治疗反应，并确 定含有治疗上相关变异的亚克隆的克隆性和相对大小
作为上述的改进，靶向的测序或单样品全外显子组测序，可用于从NSCLC的基因组区域产生“早期克隆”条形码，其已被确定为对应于血浆中检测的高可能性(基于对NSCLC生物学的理性认识)。因为早期克隆变异(基因组加倍前)将在整个NSCLC肿瘤中存在并且由于基因组加倍事件而被扩增，所以基于在基因组加倍之前的这些早期事件预测的条形码，将在预测NSCLC疾病活性和复发的生物标志物方面提供了最大灵敏度。由于没有多区域测序的先决条件，这种方法将在临床上更适用，并且比上述方法具有更快的周转时间，因此更适用于佐剂和转移性疾病环境中的复发和疾病活动的生物标志物。
为了在鉴定微小残留疾病中获得最大灵敏度，“早期克隆”条形码将专注于鉴定在NSCLC致癌作用中被分类为高置信度早期(基因组加倍前)事件的基因中的体细胞SNV(表1中的例子)以及还鉴定被分类为参与高置信度早期(基因组加倍前)扩增事件的染色体区域中的体细胞SNV(表1中的例子)。此外，突变标记可用于鉴定统计学上更可能是克隆的变异(例如肺鳞状细胞癌中的标记4变异)(参见表2)。
一旦被生成，则该“早期克隆”条形码将用于为患者生成基于30-40bp扩增子大小的定制引物组，其覆盖被确定为患者个人条形码的一部分的SNV。该引物组将用于扩增无细胞DNA文库。然后对扩增子进行测序并鉴定突变体变异。然后设想的是，每个组可以在手术前血浆样品中进行验证(例如，当肿瘤在原位时)。然后被验证的组将用于手术后2-6周采集的血浆样品以鉴定最小残留疾病，其将提供预后信息并且潜在地鉴定将从辅助化学疗法中受益的患者。经验证的组也将用于推断肿瘤体积和对佐剂或姑息化疗的反应。如果在佐剂或姑息化疗期间突变体的变异等位基因频率升高，则可以推断为缺乏反应并且治疗可以升级或改变(针对不同的治疗方式)。如果在佐剂或姑息化疗期间突变体的变异等位基因频率下降，则可以降低化学疗法、免疫疗法或靶向疗法剂量，尤其是在毒性的情况下。在选择患者的复发检测点处，可以利用将该肿瘤的亚克隆结构“条形码化”的引物组来鉴定复发的亚克隆驱动因素，其可以受例如ERBB2扩增的靶向疗法的检验。早期克隆条形码也将用于监测免疫疗法、靶向疗法、过继性细胞疗法、化学疗法和特异性靶向该肿瘤的躯干的癌症疫苗接种。
在原发性和转移性环境中，单个活检可能无法提供对患者大部分疾病中存在的可行的改变、新抗原或潜在抗性机制的广度的了解。由于拷贝数事件，克隆改变可能在特定肿瘤区域中丢失，并且亚克隆改变可能不会在单个活检中被表示。可以执行探测ctDNA的通用ctDNA驱动器组、通用ctDNA抗性机制组或通用ctDNA新抗原编码变异组的使用，以鉴定在单个肿瘤活检中未被表示的治疗上相关的突变。定制的早期克隆条形码可以作为伴随诊断工具，以确定在组织中未被表示但通过通用组在血浆中被鉴定的变异的治疗价值。例如，通过比较早期克隆条形码中存在的高置信度的克隆突变的变异等位基因频率与由通用组鉴定的未知克隆状态突变，可以推断出非组织代表突变的克隆性。此外，组织中亚克隆变异的癌细胞分数与所述变异的血浆变异等位基因频率相关。因此，通过利用早期克隆条形码作为比较诊断工具，可以推断出相对于整个肿瘤体积含有驱动因素、抗性赋予或编码变异新抗原的亚克隆的大小。在鉴定和监测驱动因素、抗性机制和新抗原以及选择可行的驱动因素、抗性机制和新抗原以靶向化学疗法、靶向治疗、树突细胞疫苗、自体T细胞疗法和CAR-T细胞疗法中，该方法在治疗期间可具有治疗价值。
追踪编码患者特异性条形码中的新抗原的克隆SNV
细胞毒性CD8和CD4肿瘤浸润性T细胞可以识别由肿瘤SNV编码的新抗原。克隆新抗原代表了不受肿瘤内异质性混淆的有吸引力的治疗靶标(Mcgranahan et al.Science2016)。过继性T细胞策略和癌症疫苗接种可用于靶向克隆新抗原。可以使用生物信息学方法预测新抗原。可以使用MHC多聚体鉴定新抗原反应性T细胞，所述MHC多聚体示出了由高置信度新抗原编码的合成肽。将编码通过生物信息学分析确定的高置信度的新抗原的SNV或体外鉴定为新抗原反应性T细胞的靶标的新抗原的SNV并入患者特异性cfDNA条形码，可以允许通过cfDNA基因分型对过继性T细胞疗法和癌症疫苗进行非侵入性监测。
实施例9
方法
患者
从100名未接受治疗的患者中收集多区域的肿瘤样品。符合条件的患者为≥18岁，诊断为IA-IIIA期NSCLC，例外的是患者LTX0103，根据术后组织学检查发现其肿瘤为IIIB期。在5年内被诊断或复发恶性肿瘤患者或接受新辅助治疗的患者被排除在外。组织学数据通过中心审查确认和标准化。通过中心审查收集并标准化基线正电子发射断层扫描(PET)CT扫描。收集并处理手术前和手术后的血浆样品。
cfDNA基因分型
从每个患者的基线外显子组的***进化树中鉴定克隆和亚克隆SNV。通过标准试验设计流水线处理这些SNV，并创建了10个平衡试验池，每个池都含有10名患者的SNV，并且每位患者平均20个试验。在每个病例和时间点可获得高达5毫升的血浆。从血浆中提取cfDNA并进行文库制备。通过mPCR-NGS分析被扩增的文库。每个PCR试验池都用于扩增来自10个相应样品和20个阴性对照样品(从健康对象制备的血浆文库)的SNV靶标。每个扩增子池在Illumina HiSeq 2500 Rapid Run上进行测序，使用Illumina Paired End v1试剂盒进行50个循环的双端测序，每个试验的平均靶标DOR为～40,000。
结果
患者特异性多重PCR试验组生成
设计工作流程以前瞻性地促进为前100名患者生成个性化的多重PCR分析池(图1)。为这些患者中的96/100设计了试验组(图12)。在试验组设计期间，试验池富集靶标驱动(1a至2a类)变异，并设计来确保对每个个体的重建的肿瘤***进化树进行均匀取样。在每个个性化试验池中的试验中位数为18(IQR＝2)，其中中位数为11(IQR＝8)的试验是针对通过外显子组分析工作流被命名为克隆的躯干变异，以及中位数为6(IQR＝8)的试验针对被命名为亚克隆、“条形码”亚克隆***进化簇的分支特异性变异(图12)。平均65％的外显子组构建的***进化树由靶向一个或多个亚克隆变异簇的变异代表。在基线手术前队列内探测了总共1748个单核苷酸变体(SNV)，并且在复发队列中探测3172个SNV。
不同的生物学因素预测血浆中的早期NSCLC检测
使用患者特异性多重PCR-NGS工作流程来分析术前的血浆样品。如果通过对其cfDNA的分析鉴定出两个或更多个克隆SNV，则认为患者的NSCLC被置信地检测到。在此基础上，术前检测到45/96I-IIIA期NSCLC(图13)。在检测到的NSCLC中，在试验池中被鉴定的克隆SNV的中值百分比是94％(IQR＝37％)，被鉴定的亚克隆SNV的中值百分比是29％(IQR＝57％)(图13)。克隆SNV更可能被鉴定为存在于血浆中而亚克隆则不是(P<0.001，OR＝5.237，[CI 95％3.9-7.1])。
观察到LUSC组织学亚型是ctDNA检测的重要预测因子(图13)。与10/58 LUAD相比，检测到了30/31 LUSC(P<0.001，OR＝144[95％CI 17.5-1182.6])。在对病理性TNM分期的复合体(肿瘤体积和***受累)、每个试验池中克隆突变的数量和总cfDNA输入(ng)进行了调节的多变量分析(MVA)中，这一观察结果仍然显著(P<0.001，OR＝178.3，[95％CI 19.7-1612.1])。***受累也是该模型的重要预测因子(表2)。值得注意的是，与仅4/39I期LUAD相比，多重PCR-NGS平台能够检测该队列内的16/17TNM I期LUSC(图13)。
通过比较表征这些组织学亚型的特征，来评估可能影响ctDNA释放的生物因子。与LUAD相比，LUSC是常见的坏死性NSCLC亚型，并且与此一致的是，通过组织学检查确定了该队列内存在的LUSC比LUAD坏死性更高(中位坏死40％比2％，Mann-Whitney U检验P<0.001)。与坏死的重要性一致，检测到的LUAD明显比未检测到的LUAD坏死性更高(中位坏死17.5％比2％，Mann-Whitney U检验P＝0.004)。与之前的早期NSCLC研究相似，LUSC比LUAD更亲和PET(中位肿瘤背景比(TBR)9.0比4.6 Mann-Whitney U检验P<0.001)(8,9)；与未检测到的LUAD相比，PET亲和力在检测到的LUAD中显著更高(中位TBR 10.2比3.6，Mann-Whitney U检验P＝0.001)。在亚组的MVA中，坏死和PET亲合力都是LUAD检测的仅有的显著的预测因素(表3)，该MVA被执行来确定坏死、PET TBR、***受累、肿瘤体积、每个试验池中克隆突变的数量和总cfDNA输入(ng)的影响。因为I期NSCLC中的PET亲合力与肿瘤加倍时间相关，并且在快速增殖的肿瘤中发生了缺氧性坏死，所以我们假设高细胞更新可有助于这些观察(10)。在队列的组织微阵列上执行的Ki67免疫组化显示，与LUAD相比，LUSC中的Ki67阳性细胞数量更高(LUSC中Ki67+细胞中位百分比为50％，相比之下LUAD中的为4％，Mann-Whitney U检验P<0.0001)；并且被检测到的LUAD比未被检测到的LUAD示出了显著更高的Ki67阳性(被检测到的LUAD中的Ki67+细胞的中位百分比为65％，相比之下未检测到的LUAD中的为3％，Mann-Whitney U检验P＝0.007)(图14)。在盲法组织学评价中，还观察到检测到的LUAD具有比未检测的LUAD显著更高数量的每个高倍视野(HPF)的外周有丝***图像(Mann-Whitney U Test P<0.001)(图14)。这些数据一起表明，控制LUSC固有的肿瘤特异性细胞周期动力学的生物因子存在于LUAD的亚群中，其控制ctDNA释放而不是TNM期或技术因素。
值得注意的是，8/10被检测到的LUAD证明了实体主要组织学(solid predominanthistology)，这是与较高增殖率和较差的预后相关的一种LUAD亚型，未检测到胚层主要LUAD(lepidic predominant LUAD)(图14)。
变异等位基因频率与肿瘤大小、克隆性和拷贝数状态相关
在患有被确信地检测到的肿瘤的被确信地检测的患者的血浆内，确定变异检测的频率中涉及的因素。被检测到的突变的变异等位基因频率(VAF)示出了显著的患者间异质性(图15A)。平均克隆VAF与肿瘤体积强烈相关(Spearman's Rank Rs(42)＝0.60，P<0.001)(图15C)；LTX201和LTX240在此观察的背景下是异常值。LTX201是腺鳞状细胞癌，在组织学检查中被确定为主要是LUAD。鉴于我们之前关于来自LUAD的有限ctDNA检测的观察，这提出了肿瘤的仅该LUSC成分释放ctDNA的可能性。LTX240是大肿瘤，在放射学检查中注意到其由围绕大的坏死腔的PET亲合肿瘤边缘组成，突出了受限的活肿瘤体积(图15D)。在单变量分析中，没有观察到组织学检查上的坏死百分比、***受累、PET TBR、组织学亚型、cfDNA输入量和肿瘤位置(中央、外周、上/中或下叶)与平均克隆VAF之间的关联。执行VAF的标准化以控制肿瘤大小的影响，我们注意到被命名为克隆的SNV比被命名为亚克隆的SNV具有显著更高标准化的VAF(克隆SNV的中值VAF为1±0.74，相比之下亚克隆SNV的为0.32±0.6，Mann-Whitney U Test P<0.001)(图15B)。值得注意的是，遍及采样用于m-seq的区域的检测到的克隆变异的平均癌细胞分数与标准化VAF相关，表明可以从血浆VAF推断亚克隆的大小，并且我们观察到检测到的SNV的拷贝数量状态与归一化的血浆VAF相关(图16)。
鉴于在克隆和亚克隆突变之间观察到的VAF的差异，确定了对血浆基因分型是否可以作为单区域活检的伴随诊断工具以推断检测到的驱动变异的克隆性。
ctDNA检测预示着辅助治疗中的复发
25名患者的复发子队列(在该研究的时间范围内遭受其NSCLC的临床复发的96名患者队列中的13名患者、以及12名对照)。在术后环境中以规律的间隔捐献的来自该队列的血浆样品，以盲法方式进行cfDNA基因分型。在血浆中检测到13名NSCLC复发中的12名(图17)。未检测到的复发病例(LTX102)尤其是具有低wgII评分的胚层主型LUAD，在我们的基线数据中，我们注意到ctDNA无法检测具有相似特征的肿瘤。与利用其他SNV阈值相比，将分子复发定义为在术后环境中的两个克隆SNV的检测，在鉴定复发方面获得了最高的灵敏度和特异性(分别为92％和83％)(表10)。值得注意的是，在两个对照病例的血浆中检测到两个克隆SNV：LTX013和LTX210。在LTX013的血浆中两次检测到增加数量的肿瘤特异性SNV，涉及亚临床进展，其可能在临床上用更长的随访潜在地证明(图18A)。LTX210证实了在手术后48小时和38天可检测到肿瘤特异性SNV的微小残留病的证据。在开始辅助化学疗法和放射疗法后，观察到完全分子反应的证据(图18L)。在剩余的10名对照病例中没有观察到分子复发的证据(图18)。
与LUAD相比，LUSC中分子复发的检测与临床复发(提前期)之间的中位间隔显著更长(LUSC的中位提前期为116.5天(IQR＝122.25，n＝4)，而LUAD为20.5天(IQR＝44.25，n＝8)，Mann-Whitney U检验P＝0.048)。值得注意的是，LUAD队列的异常值是LTX046，其在确认临床复发之前290天在血浆中被检测到。在这种情况下，在确认复发前133天进行胸部和腹部CT，用于监测肺结节(图17M中注释)。该CT显示胸椎中有可疑的硬化灶，并且安排了间隔CT扫描以监测该病变。在这个时间点，伴随cfDNA基因分型可支持临床复发，可能导致更早开始抗EGFR单一疗法。
通过血浆cfDNA分型追踪肿瘤进化
确定了亚克隆节点“条形码”策略，其用于非侵入性地监测在疾病复发点发生的NSCLC进化动力学。在手术前血浆样品中，平均百分比为55％(SD±35％，范围0-100％)条形码化的亚克隆簇在被检测到的LUSC的血浆中表示，平均百分比为26％(SD±37％，范围0-100％)条形码化亚克隆节点在被检测到的LUAD的血浆中表示，表明cfDNA基因分型可用于监测血浆中的肿瘤***进化结构(图19)。在LTX019中，在试验池中将两个F1亚克隆节点(定义为共享克隆节点作为其最近的祖先的亚克隆节点)条形码化。在手术前血浆中仅代表这些节点中的一个，这表明这是原发性肿瘤中***进化树的主要分支。在复发时，未检测到的F1亚克隆节点在血浆中普遍存在(图20)。有趣的是，原发肿瘤的外显子组分析显示该节点在涉及CD44的11p13中含有亚克隆特异性扩增，CD44为淋巴细胞归巢受体，被认为参与转移前微环境的制备。在LTX038中，条形码外显子组***进化树的两个分支在血浆中的基线处是可检测的。在复发时，仅可检测到单个分支，并且在血浆中以显著更高的频率检测到在该分支上将亚克隆节点条形码化的变异。值得注意的是，在复发点时血浆中富集的F4亚克隆节点含有Notch1驱动突变(图20)。不幸的是，该患者在复发后迅速衰退，并且来自该部位的组织不能够用于进行外显子组分析。
表1
表2
表3
表8
表9
表10

Claims (33)

1.一种用于在对象中检测肿瘤的复发的对象特异性的方法，其包含：
a）对对象的肿瘤的基因组或外显子组中的全部或一部分进行测序，以定义所述肿瘤中的克隆和/或亚克隆突变；
b）定义一组试剂，所述一组试剂将通过所述克隆和/或亚克隆突变的存在，检测来自所述肿瘤的DNA的存在；
c）使用所述一组试剂，分析在肿瘤移除之后从所述对象获得的包含来自所述肿瘤的DNA的样品，以通过检测所述样品中的所述克隆和/或亚克隆突变，确定所述肿瘤是否已经复发。
2.一种定义一组试剂以在对象中检测肿瘤的复发的对象特异性的方法，其包括：
a) 对所述对象的肿瘤的基因组或外显子组中的全部或一部分进行测序；
b) 定义在所述肿瘤中的克隆和/或亚克隆突变；以及
c) 定义一组试剂，所述一组试剂将在来自所述对象的样品中检测所述克隆和/或亚克隆突变的存在。
3.一种用于在对象中检测肿瘤的复发的对象特异性的方法，其包含：使用将检测来自所述肿瘤的克隆和/或亚克隆突变的存在的对象特异性的一组试剂，对在肿瘤移除之后从所述对象中获得的样品中的DNA进行分析，以通过在所述样品中检测来自所述肿瘤的所述克隆和/或亚克隆突变，确定所述肿瘤是否已经复发。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中在肿瘤活检上或在来自所述对象的无细胞DNA（cfDNA）、循环肿瘤DNA、外泌体来源的肿瘤DNA或循环肿瘤细胞上实施所述测序，所述肿瘤活检为所述肿瘤的全部或一部分、或所述肿瘤的一个或多个子部分。
5.根据权利要求4所述的方法，其中在移除肿瘤之后在所述肿瘤或其子部分上实施所述测序。
6.根据权利要求1或3所述的方法，其中将被分析的所述样品包含cfDNA、循环肿瘤DNA、外泌体来源的肿瘤DNA或循环肿瘤细胞。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中对所述肿瘤的至少两个子部分的基因组或外显子组中的全部或一部分进行测序，并基于哪些突变发生在哪些肿瘤子部分中来定义克隆和/或亚克隆突变。
8.根据权利要求7所述的方法，其中通过对所述肿瘤的多达10个子部分的基因组或外显子组进行测序，定义所述肿瘤中的克隆和/或亚克隆突变。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述克隆和/或亚克隆突变是单核苷酸变异（SNV）突变。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一组试剂是一组多重PCR引物，并且所述分析是多重PCR。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包含合成所述一组试剂。
12.根据权利要求1、2或4-11中任一项所述的方法，其还包含：对所述对象的非肿瘤基因组或外显子组中的全部或一部分进行测序，并将其与所述肿瘤基因组或外显子组序列进行比较，以定义在所述对象的肿瘤中发现的克隆/亚克隆突变。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一组检测试剂检测至少一种或至少两种克隆突变。
14.根据权利要求4-13中任一项所述的方法，其中所述一组检测试剂检测表示所述肿瘤的每个子部分的特征的至少一种突变。
15.根据前述权利要求中任一项的所述方法，其中将克隆和亚克隆突变组装成定义所述肿瘤的克隆/亚克隆突变图谱的***进化树。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述一组检测试剂能够检测表示***进化树的躯干的特征的至少一种突变以及表示***进化树的每个分支的特征的至少一种突变。
17.根据权利要求1、2或4-16所述的方法，其中对来自所述肿瘤的所述DNA的全基因组或全外显子组，和/或所述至少两个肿瘤子部分的全外显子组，和/或所述对象的非肿瘤的全外显子组，进行测序。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对基因组或外显子组中的一部分进行测序，以在所述对象的cfDNA中鉴定来自所述对象的肿瘤的早期克隆突变。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述早期克隆突变是被分类为高置信度的基因组加倍前事件的基因中的体细胞SNV，和/或被分类为参与高置信度的早期（基因组加倍前）扩增事件的染色体区域中的体细胞SNV。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中在表1的基因中的一种或多种中检测突变。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是实体肿瘤。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是肺肿瘤、乳腺肿瘤、结直肠肿瘤、***肿瘤或黑素瘤。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述肺肿瘤是非小细胞肺肿瘤。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述非小细胞肺肿瘤是鳞状细胞癌、腺癌或大细胞癌。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在从所述对象中获得的血浆上实施所述测序，或者将被分析的所述样品是来自所述对象的血浆样品。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中从移除所述肿瘤起至少48小时、48小时至7天、7至14天、14天至1个月、1至2个月、2至6个月、6个月至1年或超过一年实施所述分析。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中（c）的所述分析在一段时间内多次被实施，例如以规律的间隔实施。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述对象是人类对象。
29.一组对象特异性的检测试剂，其用于在所述对象的cfDNA中检测来自肿瘤的克隆和/或亚克隆突变，所述一组试剂通过权利要求1、2或4-28中任一项所述的方法获得或可获得。
30.根据权利要求29所述的一组检测试剂，其是一组用于多重PCR反应的多重引物。
31.一种治疗对象的方法，其包含执行权利要求1或3-30中任一项所述的方法，其中基于在来自所述对象的样品中检测到的克隆和/或亚克隆突变，为患者选择治疗。
32.根据权利要求31所述的治疗对象的方法，其中所述治疗被施用至所述患者。
33.根据权利要求31或32中任一项所述的治疗对象的方法，其中所述治疗是辅助治疗。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111402952A (zh) * 2020-03-27 2020-07-10 深圳裕策生物科技有限公司 一种检测肿瘤异质性程度的方法及***
CN111429968A (zh) * 2020-03-11 2020-07-17 至本医疗科技（上海）有限公司 用于预测肿瘤类型的方法、电子设备和计算机存储介质
CN117497047A (zh) * 2023-11-16 2024-02-02 杭州联川生物技术股份有限公司 基于外显子测序筛选肿瘤基因标志物的方法、设备和介质

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10083273B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US10081839B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
EP2854056A3 (en) 2009-09-30 2015-06-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive pre-natal ploidy calling
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
EP2854058A3 (en) 2010-05-18 2015-10-28 Natera, Inc. Methods for non-invasive pre-natal ploidy calling
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
BR112013016193B1 (pt) 2010-12-22 2019-10-22 Natera Inc método ex vivo para determinar se um suposto pai é o pai biológico de um feto que está em gestação em uma gestante e relatório
AU2011358564B9 (en) 2011-02-09 2017-07-13 Natera, Inc Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US10577655B2 (en) 2013-09-27 2020-03-03 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
US10262755B2 (en) 2014-04-21 2019-04-16 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
EP3561075A1 (en) 2014-04-21 2019-10-30 Natera, Inc. Detecting mutations in tumour biopsies and cell-free samples
US11479812B2 (en) 2015-05-11 2022-10-25 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
US11485996B2 (en) 2016-10-04 2022-11-01 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
CA3049139A1 (en) 2017-02-21 2018-08-30 Natera, Inc. Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids
WO2019236478A1 (en) * 2018-06-04 2019-12-12 Guardant Health, Inc. Methods and systems for determining the cellular origin of cell-free nucleic acids
US11525159B2 (en) 2018-07-03 2022-12-13 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
JP7407193B2 (ja) * 2018-08-08 2023-12-28 イニヴァータ リミテッド 可変の複製多重ｐｃｒを使用した配列決定方法
EP3826024A1 (en) * 2019-11-19 2021-05-26 Koninklijke Philips N.V. Apparatus for diagnostic image acquisition determination
CN111126062B (zh) * 2019-12-25 2021-09-24 北京中技华软科技服务有限公司 一种产业自动分类方法及***
AU2021280311A1 (en) 2020-05-29 2022-11-24 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
EP4298248A1 (en) 2021-02-25 2024-01-03 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free dna in transplant recipients of multiple organs
CA3213399A1 (en) 2021-03-18 2022-09-22 Natera, Inc. Methods for determination of transplant rejection
CN113284554B (zh) * 2021-04-28 2022-06-07 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 一种筛查结直肠癌术后微小残留病灶及预测复发风险的循环肿瘤dna检测***及应用
GB202114434D0 (en) 2021-10-08 2021-11-24 Francis Crick Institute Ltd Methods and systems for tumour monitoring
US20240003888A1 (en) 2022-05-17 2024-01-04 Guardant Health, Inc. Methods for identifying druggable targets and treating cancer
US20230392212A1 (en) * 2022-06-03 2023-12-07 Saga Diagnostics Ab Detection of target nucleic acids
WO2023244735A2 (en) 2022-06-15 2023-12-21 Natera, Inc. Methods for determination and monitoring of transplant rejection by measuring rna
WO2024003004A1 (en) * 2022-06-30 2024-01-04 Koninklijke Philips N.V. Methods and systems for generating and visualizing patient information including tumor heterogeneity,therapy effectiveness, and survival statistics

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103097888A (zh) * 2010-05-06 2013-05-08 赛昆塔公司 利用克隆型谱监测健康和疾病状态
CN104662168A (zh) * 2012-06-21 2015-05-27 香港中文大学 用于癌症检测的血浆dna突变分析
CN104885090A (zh) * 2012-10-09 2015-09-02 凡弗3基因组有限公司 肿瘤克隆性分析的***和方法
CA2945962A1 (en) * 2014-04-21 2015-10-29 Natera, Inc. Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140364439A1 (en) * 2011-12-07 2014-12-11 The Broad Institute, Inc. Markers associated with chronic lymphocytic leukemia prognosis and progression
WO2014004726A1 (en) * 2012-06-26 2014-01-03 Caifu Chen Methods, compositions and kits for the diagnosis, prognosis and monitoring of cancer

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103097888A (zh) * 2010-05-06 2013-05-08 赛昆塔公司 利用克隆型谱监测健康和疾病状态
CN104662168A (zh) * 2012-06-21 2015-05-27 香港中文大学 用于癌症检测的血浆dna突变分析
CN104885090A (zh) * 2012-10-09 2015-09-02 凡弗3基因组有限公司 肿瘤克隆性分析的***和方法
CA2945962A1 (en) * 2014-04-21 2015-10-29 Natera, Inc. Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABBOSH C等: "Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution [published correction appears in Nature", 《NATURE》 *
JAMAL-HANJANI M等: "Detection of ubiquitous and heterogeneous mutations in cell-free DNA from patients with early-stage non-small-cell lung cancer", 《 ANN ONCOL》 *
JAMAL-HANJANI M等: "Tracking genomic cancer evolution for precision medicine: the lung TRACERx study.", 《PLOS BIOL》 *
MCBRIDE DJ等: "Use of cancer-specific genomic rearrangements to quantify disease burden in plasma from patients with solid tumors", 《GENES CHROMOSOMES CANCER》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111429968A (zh) * 2020-03-11 2020-07-17 至本医疗科技（上海）有限公司 用于预测肿瘤类型的方法、电子设备和计算机存储介质
CN111429968B (zh) * 2020-03-11 2021-06-22 至本医疗科技（上海）有限公司 用于预测肿瘤类型的方法、电子设备和计算机存储介质
CN111402952A (zh) * 2020-03-27 2020-07-10 深圳裕策生物科技有限公司 一种检测肿瘤异质性程度的方法及***
CN117497047A (zh) * 2023-11-16 2024-02-02 杭州联川生物技术股份有限公司 基于外显子测序筛选肿瘤基因标志物的方法、设备和介质

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