CN110461323A

CN110461323A - 溶瘤病毒的增殖方法和抗肿瘤剂

Info

Publication number: CN110461323A
Application number: CN201880020318.2A
Authority: CN
Inventors: 绪方久修; 谷宪三朗
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2019-11-15
Also published as: WO2018182014A1; US20200023023A1; EP3610870A4; JPWO2018182014A1; EP3610870A1; US11857584B2; JP7114571B2

Abstract

本发明提供一种发挥优异的抗肿瘤效果且副作用少的使用溶瘤病毒的抗肿瘤疗法。一种抗肿瘤剂，是将溶瘤病毒以及选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂组合而成的。

Description

溶瘤病毒的增殖方法和抗肿瘤剂

技术领域

本发明涉及使用溶瘤病毒的新的抗肿瘤疗法。

背景技术

恶性肿瘤是日本人的第一大死因，统计上，日本国民中三分之一的人死于恶性肿瘤。经过多年的努力，针对恶性肿瘤的手术疗法、放射疗法、包含分子靶向药物的化学疗法的进步显著，治疗成绩提高。但是，因恶性肿瘤所致的死亡率仍然很高，期望一种对恶性肿瘤有效的新的治疗方法。

作为新的治疗方法，溶瘤病毒疗法具有直接的杀细胞效果，在该方面备受瞩目。例如，以脑肿瘤、乳腺癌作为对象实施了使用作为DNA病毒的溶瘤腺病毒、单纯疱疹病毒的临床研究，并报告了表明安全性和有效性的结果。

另外，作为RNA病毒的小核糖核酸病毒科的肠道病毒在感染后没有整合到宿主细胞的基因组中，因基因突变所致的癌化风险低，此外，不具有癌基因，因此，安全性高，并且细胞内的增殖速度快，因此，可以期待迅速且高的抗肿瘤效果。例如，报道了使用作为肠道病毒的柯萨奇病毒(CV)A21型、艾柯病毒(EV)6型、EV7型、EV11型、EV12型、EV13型、EV29型的溶瘤病毒疗法(专利文献1)、使用CVA13型、CVA15型、CVA18型、CVA21型、EV1型、EV7型、EV8型、EV22型的溶瘤病毒疗法(专利文献2)等。

进而，本发明人等近年来发现柯萨奇病毒A11型(称为“CVA11型”)和艾柯病毒4型(EV4型)是对肿瘤细胞显示高细胞毒性并且对人的病原性低、安全性高的病毒(专利文献3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2007-527719号公报

专利文献2：日本特开2012-46489号公报

专利文献3：国际专利公开第2013/157648号

发明内容

本发明涉及提供一种发挥优异的抗肿瘤效果且副作用少的使用溶瘤病毒的抗肿瘤疗法。

课题解决方法

本发明人对溶瘤病毒疗法反复进行了研究，结果发现通过将特定的抗癌剂与柯萨奇病毒等并用，可促进该病毒的增殖，可在不增强副作用的情况下显著地增强基于该病毒的抗肿瘤效果。

即，本发明包含以下的1)～18)。

1)一种抗肿瘤剂，是将溶瘤病毒以及选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂组合而成的。

2)根据1)所述的抗肿瘤剂，其中，溶瘤病毒为柯萨奇病毒或腺病毒。

3)根据2)所述的抗肿瘤剂，其中，柯萨奇病毒为A11型或B3型。

4)根据1)～3)中任一项所述的抗肿瘤剂，其中，植物生物碱系抗癌剂由选自SN-38、伊立替康和它们的盐中的1种以上构成。

5)根据1)～3)中任一项所述的抗肿瘤剂，其中，抗代谢剂为5-FU或其盐。

6)一种抗肿瘤剂，包含溶瘤病毒以及选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂。

7)根据6)所述的抗肿瘤剂，其中，溶瘤病毒为柯萨奇病毒或腺病毒。

8)根据7)所述的抗肿瘤剂，其中，柯萨奇病毒为A11型或B3型。

9)根据6)～8)中任一项所述的抗肿瘤剂，其中，植物生物碱系抗癌剂由选自SN-38、伊立替康和它们的盐中的1种以上构成。

10)根据6)～8)中任一项所述的抗肿瘤剂，其中，抗代谢剂为5-FU或其盐。

11)根据1)～5)中任一项所述的抗肿瘤剂，是由含有溶瘤病毒而成的药剂以及含有选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂而成的药剂构成的试剂盒。

12)一种溶瘤病毒的抗肿瘤效果增强剂，将选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂作为有效成分。

13)根据12)所述的抗肿瘤效果增强剂，其中，溶瘤病毒为柯萨奇病毒或腺病毒。

14)一种溶瘤病毒的增殖促进方法，将选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂与溶瘤病毒一起培养。

15)一种癌细胞的病毒受体表达增强剂，将选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂作为有效成分。

16)根据15)所述的病毒受体表达增强剂，其中，病毒受体为DAF和/或ICAM-1。

17)一种用于制造抗肿瘤剂的溶瘤病毒以及选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂的应用。

18)一种用于抗肿瘤疗法的溶瘤病毒以及选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂的组合。

19)一种抗肿瘤疗法，对患者给药溶瘤病毒以及选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂。

根据本发明，可以提供发挥优异的抗肿瘤效果，对人的安全性高的抗肿瘤疗法。

附图说明

图1是表示对奥沙利铂抗性大肠癌细胞株(WiDr)的细胞毒性的图。A：奥沙利铂、CVA11型均不添加，B：仅添加奥沙利铂(50μM)，C：添加奥沙利铂(50μM)后添加CVA11型(MOI(感染效价)＝0.01)，D：仅添加CVA11型(MOI＝0.01)。

图2是表示通过奥沙利铂促进CVA11型的增殖的图。

图3是表示基于奥沙利铂的病毒受体的表达增加效果的图。

图4是表示人大肠癌荷瘤小鼠的抗肿瘤效果(肿瘤体积的增加抑制)的图。

图5是表示人大肠癌荷瘤小鼠的不良事件的发生(体重减少抑制)的图。

图6是表示人大肠癌荷瘤小鼠的抗肿瘤效果(存活率)的图。

图7是表示人大肠癌荷瘤小鼠的抗肿瘤效果的图(肿瘤组织图像)。箭头表示死细胞。

图8是表示通过并用奥沙利铂和CVB3型所带来的对奥沙利铂抗性大肠癌细胞株(WiDr)的细胞毒性的图。

图9是表示通过奥沙利铂促进CVB3型的增殖的图。1：不添加奥沙利铂、2：添加0.5μM的奥沙利铂、3：添加1.0μM的奥沙利铂。

图10是表示通过奥沙利铂促进AAV的增殖的图。

图11是表示通过SN-38促进CVA11型的增殖的图。1：不添加SN-38、2：添加1.0μM的SN-38、3：添加5.0μM的SN-38、4：添加50μM的SN-38。

图12是表示通过5-FU促进CVA11型的增殖的图。1：不添加5-FU、2：添加50μM的5-FU。

图13是表示对脑肿瘤细胞U-87的细胞毒性的图。

图14是比较奥沙利铂和顺铂的并用CVA11时的细胞毒性的图。(a)并用奥沙利铂与CVA11时的图。(b)并用顺铂与CVA11时的图。

图15是表示在添加顺铂时不促进CVB3型的增殖的图。

具体实施方式

溶瘤病毒是感染癌细胞而使癌细胞溶解、细胞死亡的病毒。作为本发明的溶瘤病毒，只要是使癌细胞溶解、引起细胞死亡的病毒就没有特别限定，可举出作为肠道病毒的CVA11型、CVB3型(柯萨奇病毒)、EV4型(艾柯病毒)；作为腺病毒的AAV；作为单纯疱疹病毒的变种的HF10等，特别优选为CVA11型、CVB3型和AAV。CVA11型和CVB3型是作为属于小核糖核酸病毒科的肠道系病毒(肠道病毒)的一种的柯萨奇病毒(Coxsackie virus)。柯萨奇病毒被分为A、B两组，A组被进一步分为24型，B组被分为6型。本发明的CVA11型为A组11型的柯萨奇病毒，CVB3型为B组3型的柯萨奇病毒。

溶瘤病毒可以通过与细胞表面的病毒受体结合而感染该细胞。作为病毒受体，例如可举出衰变加速因子(DAF或CD55)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1或CD54)、整联蛋白α₂β₁(CD49b)等。通过溶瘤病毒与病毒受体相互作用，使衣壳不稳定，由此诱导溶瘤病毒的脱皮。

溶瘤病毒可以通过离心分离法、基于培养细胞的病毒增殖法等已知的病毒分离方法从检体等分离。另外，本发明的溶瘤病毒可以通过将天然存在的病毒经过多次传代在细胞株中进行培养来进行生物选拔以获得对癌细胞的高感染性。适于生物选拔的细胞株优选为具有DAF、ICAM-1、整联蛋白α₂β₁等病毒受体的细胞株，可举出HEK293细胞、H1299细胞、A549细胞、LK-87细胞、PC-9细胞、H460细胞等。

本发明的溶瘤病毒可以为天然存在的溶瘤病毒，也可以为经修饰的溶瘤病毒，还可以为部分突变的溶瘤病毒。另外，除通常的病毒以外，还可以为载体型病毒。例如，作为CVA11型的变体，可举出其衣壳被除去的病毒。衣壳例如可以通过利用糜蛋白酶或胰蛋白酶等蛋白酶的处理而除去。具体而言，例如可以将CVA11型在烷基硫酸盐等表面活性剂的存在下用糜蛋白酶进行处理而除去衣壳。通过除去CVA11型的衣壳，能够增大病毒对癌细胞的感染性。另外，由于存在于衣壳中的蛋白质为宿主的体液免疫和细胞免疫的主要的活化因子，因此，通过除去CVA11型的衣壳，能够降低宿主的免疫应答。该结果，能够提高CVA11型对癌细胞的感染性，进而提高药物组合物对癌细胞的细胞毒性。

另外，本发明中，溶瘤病毒包含来自感染癌细胞的溶瘤病毒的核酸。来自溶瘤病毒的核酸包含从溶瘤病毒直接分离的病毒RNA、合成RNA、与分离的病毒RNA的碱基序列对应的cDNA。

在分离病毒RNA时，可以使用苯酚/氯仿提取法、利用磁珠的分离等任意的方法。

另外，上述核酸也可以为整合有用于产生病毒的核酸的病毒质粒、表达载体。表达载体包含例如能够表达DNA的质粒，所述DNA编码用于产生病毒所需的病毒蛋白质。表达载体也可以包含所***的核酸功能性连接的转录调节控制序列。在此的转录调节控制序列例如为用于开始转录的启动子、用于使核糖体与转录的mRNA的结合成为可能的表达控制元件等。

柯萨奇病毒中，作为来自CVA11型的核酸，具体地可举出由序列号1所示的碱基序列构成的核酸。作为来自CVB3型的核酸，具体地可举出由序列号2所示的碱基序列构成的核酸。作为表达载体，例如可以使用pSV2neo、pEF-PGk.puro、pTk2、非复制型腺病毒穿梭载体、巨细胞病毒启动子等。编码用于产生病毒所需的病毒蛋白质的cDNA可以通过对病毒RNA或其片段进行逆转录而制备。

腺病毒中，作为来自AAV的核酸，具体地可举出由序列号3所示的碱基序列组成的核酸。作为表达载体，例如可以使用pSV2neo、pEF-PGk.puro、pTk2、非复制型腺病毒穿梭载体、巨细胞病毒启动子等。编码用于产生病毒所需的病毒蛋白质的cDNA可以通过对病毒RNA或其片段进行逆转录而制备。

本发明中，抗癌剂选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂，作为植物生物碱系抗癌剂，例如可举出长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、依托泊苷、伊立替康或者其活性代谢物或它们的盐、拓扑替康、索布佐生、多西他赛、紫杉醇、紫杉醇注射剂、艾日布林等，优选为伊立替康、SN-38和它们的盐。另外，作为抗代谢剂，可举出氟尿嘧啶(5-FU)、5-FU的前药(例如替加氟或其盐)、卡培他滨或其盐、TS-1(也称为S-1。在替加氟中并用调节剂而成的配合剂)、卡莫氟、去氧氟尿苷等氟化嘧啶系抗癌剂以及吉西他滨、阿糖胞苷、依诺他滨、巯嘌呤、氟达拉滨、克拉屈滨、甲氨蝶呤、培美曲塞、羟基脲、奈拉滨、喷司他丁、它们的前药等，更优选为使氟尿嘧啶存在于生物体内的氟化嘧啶系抗癌剂，特别优选为5-FU或其盐。

奥沙利铂是也作为L-OHP已知的第三代铂络合物系抗癌剂。本发明中，“奥沙利铂”包含顺式-草酸合(反式-l-1,2-二氨基环己烷)铂(II)、作为其光学对映体的顺式-草酸合(反式-d-1,2-二氨基环己烷)铂(II)和它们的混合物。

伊立替康是作为来自喜树的抗肿瘤性生物碱的喜树碱的衍生物，具有拓扑异构酶I抑制作用。SN-38(7-乙基-10-羟基喜树碱，7-ethyl-10-hydro xycamptothecin)是伊立替康的活性代谢物，具有比伊立替康强的抗肿瘤活性。

作为伊立替康和SN-38的盐，可举出与无机酸或有机酸的盐，但优选为盐酸盐。

5-FU是氟化嘧啶系的抗代谢剂，是通过抑制核酸的合成来发挥抗肿瘤效果的抗癌剂。

上述抗癌剂中，优选为奥沙利铂。奥沙利铂、SN-38、5-FU其本身具有抗肿瘤效果，如后述的实施例所示，奥沙利铂具有促进溶瘤病毒、特别是柯萨奇病毒的增殖的作用，并且具有对癌细胞的病毒受体(DAF、ICAM-1)的表达促进作用。而且，奥沙利铂、SN-38等植物生物碱系抗癌剂和5-FU等抗代谢剂在并用柯萨奇病毒和奥沙利铂的情况下，发挥远强于将柯萨奇病毒单剂应用于奥沙利铂抗性的癌细胞的情况的细胞毒性。认为这是因为通过奥沙利铂、SN-38、5-FU增强了柯萨奇病毒所具有的抗肿瘤效果。

即，在奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂或抗代谢剂与溶瘤病毒的并用中，选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂可成为溶瘤病毒的增殖促进剂、溶瘤病毒的抗肿瘤效果增强剂，溶瘤病毒与选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂的抗癌剂的组合可成为抗肿瘤剂(以下将这些也统称为本发明的“抗肿瘤疗法”)。另外，选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂的抗癌剂可成为癌细胞的病毒受体的表达增强剂。

在此，基于选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂的溶瘤病毒的增殖促进效果可以通过将选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂与溶瘤病毒一起培养而得到。培养可以使用基于培养细胞的病毒增殖法等已知的方法。增殖促进效果可以通过使用算出病毒的感染效价(MOI)的已知的方法来评价。

本发明的基于溶瘤病毒与选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂的抗癌剂的抗肿瘤效果(对癌细胞的细胞毒性)可以通过在抗癌剂的存在下对暴露于溶瘤病毒的癌细胞的细胞株的存活进行试验来确认。对细胞株的存活进行试验的方法例如有将固定的细胞用染色液进行染色，对染色后的活细胞的数量进行定量的方法；结晶紫法；对细胞凋亡特异性标记物进行定量的方法等。使用这些方法，对于在抗癌剂的存在下与溶瘤病毒培养的癌细胞的细胞株，对在规定时间后存活的癌细胞进行定量，结果能够对因基于溶瘤病毒和抗癌剂的细胞毒性而死亡的癌细胞进行定量。

本发明的抗肿瘤疗法的对象症种只要是溶瘤病毒、特别是溶瘤病毒感染癌细胞而发挥细胞毒性的癌种就没有特别限定，包含实体癌和液性癌。

作为实体癌中诱导特别强的细胞毒性的癌细胞，例如可举出小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺鳞癌、恶性间皮瘤、大肠癌、结肠直肠癌、胃癌、食道癌、喉咽癌、乳腺癌、***、卵巢癌、***癌、膀胱癌等的癌细胞。因此，本发明的抗肿瘤疗法中，除上述实体癌以外，还优选将非霍奇金淋巴瘤、淋巴性白血病、人B淋巴瘤等的癌细胞作为对象，特别优选为大肠癌、结肠直肠癌的癌细胞。

另外，本发明的抗肿瘤疗法也能够用于对奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂或抗代谢剂为抗性的癌、所谓难治性癌的治疗。例如奥沙利铂抗性的癌例如是即使给药可得到临床效果的用量的奥沙利铂，也没有发现肿瘤体积的减少、增大的抑制或与该癌相关的状态的改善等的癌，例如在小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺鳞癌、恶性间皮瘤、大肠癌、结肠直肠癌、胃癌、食道癌、喉咽癌、乳腺癌、***、卵巢癌、***癌、膀胱癌、非霍奇金淋巴瘤或淋巴性白血病、人B淋巴瘤等癌中发现。

本发明的抗肿瘤疗法中，可以为以适当的配合比包含各自的有效量的溶瘤病毒以及选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂，制剂化为一个剂型的配合剂(1剂型形态)；也可以为以可以同时或隔开间隔分开使用的方式将含有溶瘤病毒和抗癌剂的各自的有效量的药剂单独制剂化后组合而成的配合剂(2剂型形态。称为试剂盒)。配合剂中，除溶瘤病毒以及选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂以外，还可以包含载体(キャリア)、稀释剂、辅助剂、载体(担体)。作为载体(キャリア)，例如优选为脂质体、胶束等。脂质体包含脂质与有助于膜稳定性的类固醇或类固醇前体的组合。此时，作为脂质，可举出磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、磷脂酰乙醇胺、脑苷脂、神经节苷脂等磷脂酰化合物。被脂质体或胶束覆盖的溶瘤病毒能够降低宿主的免疫应答。作为稀释剂，例如可举出脱盐水、蒸馏水和生理盐水等，另外，作为辅助剂，可举出植物系油、纤维素衍生物、聚乙二醇和脂肪酸酯等。作为载体(担体)，可例示在常规药剂中通用的各种载体，例如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、稀释剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、着色剂、矫味剂、矫臭剂等。另外，配合剂可以与除配合剂以外的其它药剂组合而给药。

另外，试剂盒除含有溶瘤病毒的药剂以及含有选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂的药剂以外，还可以进一步组合其它药剂而给药。

含有溶瘤病毒的上述制剂除溶瘤病毒以外，还可以包含载体、稀释剂或辅助剂等。作为载体，例如优选为脂质体、胶束等。脂质体包含脂质与有助于膜稳定性的类固醇或类固醇前体的组合。此时，作为脂质，可举出磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、磷脂酰乙醇胺、脑苷脂、神经节苷脂等磷脂酰化合物。被脂质体或胶束覆盖的溶瘤病毒能够降低宿主的免疫应答。

作为稀释剂，例如可举出脱盐水、蒸馏水和生理盐水等，另外，作为辅助剂，可举出植物系油、纤维素衍生物、聚乙二醇和脂肪酸酯等。

另外，含有选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂的制剂可以使用药理学上允许的载体并通过通常公知的方法而制备。作为该载体，可例示常规药剂中通用的各种载体，例如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、稀释剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、着色剂、矫味剂、矫臭剂等。

应予说明，上述制剂中的溶瘤病毒的配合量可举出例如液剂1mL中为1×10²～1×10¹⁰空斑形成单位，优选为1×10⁵空斑形成单位以上。另外，选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂的配合量优选例如在制剂中为1～1000mg。

本发明的抗肿瘤疗法中，可以将溶瘤病毒以及选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂通过各种方法、即口服、肌肉、皮下、直肠、***、鼻腔等对癌症患者进行给药，但优选根据癌种进行肿瘤内给药、静脉给药、腹腔内给药。特别是食道癌、大肠癌等消化器官癌多可以一边用内视镜等视认肿瘤组织一边将上述制剂组合物直接注射到肿瘤组织。此时，由于可以用内视镜等确认注射的部位，因此也具有即使出血也容易应对的优点。

另外，溶瘤病毒以及选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂只要以足以治疗癌症的量进行给药即可，给药量基于患者的体重、年龄、性别、肿瘤组织的大小来决定。例如，成人每天、溶瘤病毒可例示1×10²～1×10¹⁰空斑形成单位，抗癌剂可例示1～1000mg。

给药方法可以为单次给药，也可以为多次给药，还可以作为缓释制剂持续给药。另外，给药顺序、给药间隔只要是可得到溶瘤病毒与选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂的组合的效果的范围就没有特别限定，更优选在给药选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂后给药溶瘤病毒。另外，在采用试剂盒的情况下，可以分别将单独的制剂同时或者隔开间隔进行给药。

实施例

通过以下的实施例对本发明具体地进行说明，但本发明并不受实施例限定。

实施例1通过并用奥沙利铂和CVA11型所带来的抗肿瘤效果

(1)方法

(a)CVA11型的制备

CVA11型从国立感染症研究所获得。CVA11型使用HELA细胞(从ATCC购买)进行增殖。在使用10mL的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium)(DMEM)(Sigma-Aldrich制造)进行传代培养而得的HELA细胞(约2×10⁶细胞/mL)中将CVA11型(接种量：MOI＝0.1～1.0)孵育放置1小时后，将培养基替换为DMEM，静置直至细胞变性效果开始。除去培养基后，在培养用皿中添加1mL的OPTI-MEM I，使用细胞刮棒将细胞剥离回收。应予说明，CVA11型和HELA细胞在培养箱内在37℃、5％CO₂下进行培养。使用液氮反复进行3次回收的HELA细胞的冷冻、解冻后，以4℃、3000rpm离心15分钟，回收上清液。回收的上清液(病毒溶液)在-80℃保存。

(b)MOI的算出

MOI通过专利文献3中记载的以下的方法而算出。

将奥沙利铂抗性大肠癌细胞株(WiDr)(从ATCC获得)以5×10³细胞/100μL/孔接种于96孔板，在37℃、5％CO₂下维持5小时。病毒用OPTI-MEM I稀释100倍或1000倍，将其作为MOI测定用的病毒原液(将在此的稀释倍率的常用对数设为L)。将病毒原液按每次10倍进行阶段稀释(将在此的稀释倍率的常用对数设为d)，制备稀释系列液。接着，在各孔中各添加0.05mL的稀释系列液(将添加的稀释系列液的体积设为v)。将120小时后确认到50％以上的细胞变性效果的孔数的合计除以8而算出值S，通过下式算出MOI。

(数学式1)

log10(MOI)＝L+d(S-0.5)+log10(1/v)

(c)CVA11型的使用结晶紫法的抗肿瘤效果的研究

通过结晶紫法对基于CVA11型的抗肿瘤效果(细胞毒性)进行评价。

将奥沙利铂抗性大肠癌细胞株(WiDr)以72小时后达到融合的密度(3×10⁴细胞/孔)接种于24孔板。以成为适当的感染效价(MOI＝0.001、0.01、0.1)的方式用OPTI-MEM I稀释CVA11型，制备CVA11型的稀释液。约6小时后，从板除去培养基，将CVA11型的稀释液在各孔中添加200μL，在37℃、5％CO₂下将板维持1小时。接着，除去CVA11型的稀释液，在各孔中加入1mL各细胞用培养基，培养72小时。72小时后，用磷酸缓冲盐水(PBS)缓慢地清洗，在各孔中添加300μL的含有0.5％戊二醛的PBS后，在室温静置15分钟，从而将存活贴壁细胞固定。然后，除去含有戊二醛的PBS，用PBS清洗后，在各孔中添加300μL的含有2％乙醇和0.1％水晶紫的无菌水，在室温静置10分钟，从而将活细胞染色。将染色后的板的各孔用500μL的无菌水清洗2次，使用扫描仪记录染色，从而确认抗肿瘤效果。

分为A：奥沙利铂、CVA11型均不添加、B：仅添加奥沙利铂(50μM)、C：添加奥沙利铂(50μM)后添加CVA11型(MOI＝0.01)、D：仅添加CVA11型(MOI＝0.01)这4个组进行比较。

(2)结果

图1表示结晶紫法的结果。B：仅添加奥沙利铂的WiDr、D：仅添加CVA11型的WiDr中未确认到抗肿瘤效果。另一方面，C：添加奥沙利铂后添加CVA11型(MOI＝0.01)的组中确认到较强的抗肿瘤效果。

实施例2基于奥沙利铂的CVA11型的增殖促进作用

(1)方法

将培养的奥沙利铂抗性大肠癌细胞株(WiDr)以成为3×10⁶细胞/mL的方式悬浮于DMEM培养基。在96孔板的各孔中各分注100μL的得到的细胞悬浮液，以成为3×10⁵细胞/孔的方式进行接种。在37℃、5％CO₂下将板静置约8小时后，以最终浓度成为50μM的方式添加奥沙利铂。然后，在37℃、5％CO₂下将板静置约12小时后，以成为MOI＝0.01的方式添加CVA11型。在37℃、5％CO₂下将板静置约30小时后，通过实施例1(1)(b)中记载的方法测定病毒的感染效价。分为A：奥沙利铂、CVA11型均不添加、B：不添加奥沙利铂，仅添加CVA11型、C：在添加奥沙利铂(50μM)后添加CVA11型(MOI＝0.01)这3个组进行比较。检验使用t检验。

(2)结果

图2表示CVA11型的病毒效价的结果。进行了奥沙利铂添加的组中，确认到显著的CVA11型病毒量的增加。确认到奥沙利铂促进CVA11型的增殖。

实施例3基于奥沙利铂的病毒受体表达促进作用

(1)方法

将培养的奥沙利铂抗性大肠癌细胞株(WiDr)以成为3×10⁶细胞/mL的方式悬浮于DMEM培养基。在96孔板的各孔中各分注100μL的得到的细胞悬浮液，以成为3×10⁵细胞/孔的方式进行接种。在37℃、5％CO₂下将板静置约8小时后，以最终浓度成为50μM的方式添加奥沙利铂。然后，在37℃、5％CO₂下将板静置约42小时后，采取mRNA制作cDNA。细胞接种后，约20小时后与添加CVA11型的组进行比较。通过实时PCR(real-time PCR)对DAF(衰变加速因子，decay Accelerating factor)、ICAM-1(细胞间粘附分子1，intercellular adhesionmolecule 1)的表达进行比较。检验使用t检验。

(2)结果

图3表示实时PCR的结果。

奥沙利铂抗性大肠癌细胞株(WiDr)中，通过添加奥沙利铂，作为病毒受体的DAF和ICAM-1的表达显著增加。另一方面，添加CVA11型病毒的组中，DAF和ICAM-1的表达没有增加。受体中也已知有影响病毒增殖的受体，根据该结果，认为基于CVA11型的对WiDr的抗肿瘤效果通过基于奥沙利铂的前处理而增加是因为DAF、ICAM-1参与病毒的增殖，使CVA11型病毒增殖。

实施例4通过并用奥沙利铂和CVA11型所带来的体内(in vivo)抗肿瘤效果1

(1)方法

使用基于奥沙利铂抗性大肠癌细胞株WiDr的荷瘤裸鼠对实施例1中确认的CVA11型对癌细胞的抗肿瘤效果进行研究。用PBS清洗WiDr，以成为5.0×10⁷细胞/mL的方式悬浮于OPTI-MEM I。使用27G针对6-8周龄的BALB/c裸鼠的右侧腹部各皮下注射100μL的包含WiDr的悬浮液。小鼠分为1)非给药组、2)奥沙利铂单独给药组、3)CVA11型单独给药组、4)奥沙利铂给药后给药CVA11型的组这4个组。在第1天腹腔内给药奥沙利铂100μg。在第2、4、6、8、10天，在皮下肿瘤内局部注射5×10⁷空斑形成单位(PFU)的CVA11型。对于非给药组，对右侧腹部与CVA11型给药组等量给药不含CVA11型的OPTI-MEM I。CVA11型给药后，测定各组的肿瘤体积和体重。应予说明，肿瘤体积由长径×短径×短径×0.5算出。另外，各组使用5只小鼠进行试验，检验使用t检验。

(2)结果

图4表示非给药组的肿瘤体积和奥沙利铂单独给药组、CVA11型单独给药组、奥沙利铂给药后给药CVA11型的组(并用组)的肿瘤体积。奥沙利铂给药后给药CVA11型的小鼠中，与非给药组相比，显著抑制了肿瘤体积的增加。另外，并用组与奥沙利铂单独给药组、CVA11型单独给药组相比，肿瘤体积的增加也得到抑制，确认到具有较高的抗肿瘤效果。

另外，图5表示这4组的体重的变化。其结果，与非给药组相比，单独给药了奥沙利铂的小鼠、单独给药了CVA11型的小鼠、奥沙利铂给药后给药CVA11型的小鼠中，没有确认到显著的体重减少。该时刻的体重减少表明不良事件，因此，没有确认体重减少可以说奥沙利铂给药后给药CVA11型的小鼠中也没有确认到不良事件，可以说本发明的抗肿瘤疗法安全性高。

实施例5通过并用奥沙利铂和CVA11型所带来的体内抗肿瘤效果2

(1)方法

对皮下移植了实施例4的奥沙利铂抗性大肠癌细胞株WiDr的荷瘤裸鼠的存活率进行比较，通过H.E.(苏木精-伊红，hematoxylin eosin)染色对皮下移植后第40天的肿瘤的病理组织进行评价。

(2)结果

图6表示将荷瘤裸鼠的存活率进行比较而得的数据。发现奥沙利铂给药后给药CVA11型的小鼠的存活率与未治疗组的小鼠、奥沙利铂单独给药组的小鼠、CVA11型单独给药组的小鼠相比得到改善。另外，图7表示肿瘤组织的病理组织(H.E.染色)。经H.E.染色的肿瘤的病理组织中，在奥沙利铂给药后给药CVA11型的小鼠的肿瘤的病理组织中更广范围地确认到细胞死亡。由此，根据存活率、病理组织的观察，也能够确认到本发明具有较高的抗肿瘤效果。

实施例6通过并用奥沙利铂和CVB3型所带来的抗肿瘤效果

(1)方法

(a)CVB3型的制备

CVB3型从国立感染症研究所获得。CVB3型使用HELA细胞(从ATCC购买)进行增殖。在使用10mL的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)(Sigma-Aldrich制造)进行传代培养而得的HELA细胞(约2×10⁶细胞/mL)中将CVA11型(接种量：MOI＝0.1～1.0)孵育放置1小时后，将培养基替换为DMEM，静置直至细胞变性效果开始。除去培养基后，在培养皿中添加1mL的OPTI-MEM I，使用细胞刮棒将细胞剥离回收。应予说明，CVB3型和HELA细胞在培养箱内在37℃、5％CO₂下进行培养。使用液氮反复进行3次回收的HELA细胞的冷冻、解冻后，以4℃、3000rpm离心分离15分钟，回收上清液。回收的上清液(病毒溶液)在-80℃保存。

(b)MOI的算出

MOI的算出通过与实施例1(1)(b)同样的方法进行。

(c)CVB3型的使用结晶紫法的抗肿瘤效果的研究

使用CVB3型作为病毒。另外，使CVB3型的感染效价(MOI)为0(不添加)、0.001、0.01、0.1，使奥沙利铂的添加量为0μM(不添加)、0.5μM、1μM、5μM，除此以外，通过与实施例1(1)(c)同样的方法进行。

(2)结果

图8表示结晶紫法的结果。仅添加奥沙利铂的组(图8的CVB3型的MOI为0的横一列)、仅添加CVB3型的组(图8的OXA为0的纵一列)中没有确认到抗肿瘤效果。另一方面，添加奥沙利铂后添加CVA11型的组(框内的组)中，依赖于MOI和奥沙利铂添加量的量而确认到较强的抗肿瘤效果。

实施例7基于奥沙利铂的CVB3型的增殖促进作用

(1)方法

CVB3型的制备通过与实施例6(1)(a)同样的方法进行。另外，MOI的算出通过与实施例1(1)(b)同样的方法进行。

将培养的奥沙利铂抗性大肠癌细胞株(WiDr)以成为3×10⁶细胞/mL的方式悬浮于DMEM培养基。在96孔板的各孔中各分注100μL的得到的细胞悬浮液，以成为3×10⁵细胞/孔的方式进行接种。在37℃、5％CO₂下将板静置约8小时后，以最终浓度成为0(不添加)、0.5、1.0μM的方式添加奥沙利铂。然后，在37℃、5％CO₂下将板静置约12小时后，将以成为MOI＝0.01的方式添加CVB3型。在37℃、5％CO₂下将板静置约30小时后，通过实施例1(1)(b)中记载的方法测定病毒的感染效价。分为1：不添加奥沙利铂、2：添加0.5μM的奥沙利铂、3：添加1.0μM的奥沙利铂这3个组进行比较。试验为6次试验，检验使用t检验。

(2)结果

图9表示CVB3型的病毒效价的结果。进行了奥沙利铂添加的组中，确认到CVB3型病毒量的增加。特别是在添加1μM的奥沙利铂时确认到显著的增加。由此确认到奥沙利铂不仅促进CVA11型的增殖，也促进CVB3型的增殖。

实施例8基于奥沙利铂的AAV的增殖促进作用

(1)方法

(a)AAV的制备

作为AAV，使用pAAV-CMV Vector(Takara Bio株式会社制造)。pAAV-CMV Vector使用AAVpro(R)Helper Free System(Takara Bio株式会社制造)进行制备。回收的上清液(病毒溶液)在-80℃保存。

(b)MOI的算出

MOI的算出通过与实施例1(1)(b)同样的方法进行。

(c)奥沙利铂的添加

将培养的奥沙利铂抗性大肠癌细胞株(WiDr)以成为3×10⁶细胞/mL的方式接种于DMEM培养基。在96孔板的各孔中各分注100μL的得到的细胞悬浮液，以成为3×10⁵细胞/孔的方式进行接种。在37℃、5％CO₂下将板静置约8小时后，以最终浓度成为0(无添加)、0.25、0.5、1.0、2.5μM的方式添加奥沙利铂。然后，在37℃、5％CO₂下将板静置约24小时后，以成为MOI＝0.01的方式添加AAV。在37℃、5％CO₂下将板静置约30小时后，使用AAVpro(R)Titration Kit(for Real Time PCR)Ver.2(Takara Bio株式会社制造)测定病毒的拷贝数。检验使用t检验。

(2)结果

图10表示AAV的拷贝数的结果。进行了奥沙利铂的添加的组中，确认到显著的AAV的拷贝数的增加。特别是在奥沙利铂的添加量为0.25～1.0μM之间发现显著的增加。由此，确认到奥沙利铂促进AAV的增殖。

实施例9基于SN-38的CVA11型的增殖促进作用

(1)方法

CVA11型的制备和MOI的算出通过与实施例1(1)(a)和(b)同样的方法进行。

将培养的奥沙利铂抗性大肠癌细胞株(WiDr)以成为3×10⁶细胞/mL的方式悬浮于DMEM培养基。在96孔板的各孔中各分注100μL的得到的细胞悬浮液，以成为3×10⁵细胞/孔的方式进行接种。在37℃、5％CO₂下将板静置约8小时后，以最终浓度成为0(不添加)、1.0、5.0、50μM的方式添加SN-38。然后，在37℃、5％CO₂下将板静置约12小时后，以成为MOI＝0.01的方式添加CVA11型。在37℃、5％CO₂下将板静置约30小时后，通过实施例1(1)(b)中记载的方法测定病毒的感染效价。分为1：不添加SN-38、2：添加1.0μM的SN-38、3：添加5.0μM的SN-38、4：添加50μM的SN-38这4个组进行比较。试验为6次试验，检验使用t检验。

(2)结果

图11表示添加SN-38时的CVA11型的病毒效价的结果。进行了SN-38添加的组中，确认到显著的CVA11型病毒量的增加。确认到不仅奥沙利铂促进CVA11型的增殖，SN-38也促进CVA11型的增殖。

实施例10基于5-FU的CVA11型的增殖促进作用

(1)方法

将培养的奥沙利铂抗性大肠癌细胞株(WiDr)以成为3×10⁶细胞/mL的方式悬浮于DMEM培养基。在96孔板的各孔中各分注100μL的得到的细胞悬浮液，以成为3×10⁵细胞/孔的方式进行接种。在37℃、5％CO₂下将板静置约8小时后，以最终浓度成为0(不添加)、50μM的方式添加5-FU。然后，在37℃、5％CO₂下将板静置约12小时后，以成为MOI＝0.01的方式添加CVA11型。在37℃、5％CO₂下将板静置约30小时后，通过实施例1(1)(b)中记载的方法测定病毒的感染效价。分为1：不添加5-FU、2：添加50μM的5-FU这2个组进行比较。试验为6次试验，检验使用t检验。

(2)结果

图12表示添加5-FU时的CVA11型的病毒效价的结果。进行了5-FU添加的组中，确认到显著的CVA11型病毒量的增加。确认到不仅奥沙利铂、SN-38促进CVA11型的增殖，5-FU也促进CVA11型的增殖。

实施例11使用脑肿瘤细胞株U-87时的通过并用奥沙利铂和CVA11型所带来的抗肿瘤效果

(1)方法

(a)CVA11型的制备

CVA11型的制备通过与实施例1(1)(a)同样的方法进行。

(b)MOI的算出

MOI的算出使用脑肿瘤细胞株U-87代替奥沙利铂抗性大肠癌细胞株(WiDr)，除此以外，通过与实施例1(1)(b)同样的方法进行。

(c)CVA11型的使用结晶紫法的抗肿瘤效果的研究

通过结晶紫法对使用脑肿瘤细胞株U-87时的通过并用CVA11型和奥沙利铂所带来的抗肿瘤效果(细胞毒性)进行评价。

将脑肿瘤细胞株U-87以72小时后达到融合的密度(3×10⁴细胞/孔)接种于24孔板。然后，添加0(不添加)或50μM的奥沙利铂。以感染效价成为MOI＝0.001的方式用OPTI-MEM I稀释CVA11型，制备CVA11型的稀释液。约6小时后，从板除去培养基，在各孔中添加200μL的CVA11型的稀释液，在37℃、5％CO₂下将板维持1小时。接着，除去CVA11型的稀释液，在各孔中加入1mL的各细胞用培养基，培养72小时。72小时后，用磷酸缓冲盐水(PBS)缓慢地清洗，在各孔中添加300μL的含有0.5％戊二醛的PBS后，在室温静置15分钟，从而将存活贴壁细胞固定。然后，除去含有戊二醛的PBS，用PBS清洗后，在各孔中添加300μL的含有2％乙醇和0.1％水晶紫的无菌水，在室温静置10分钟，从而将活细胞染色。将染色后的板的各孔用500μL的无菌水清洗2次，使用扫描仪记录染色，从而确认抗肿瘤效果。

(2)结果

图13表示结晶紫法的结果。虽然仅CVA11型时也确认到抗肿瘤效果，但与50μM的奥沙利铂并用时确认到抗肿瘤效果的增强。由此表示即使对于作为除大肠癌以外的癌种的脑肿瘤，该抗肿瘤疗法也有效。

比较例1并用CVA11型与奥沙利铂或顺铂时的抗肿瘤效果的比较

(1)方法

(a)CVA11型的制备和MOI的算出

(c)使用结晶紫法的抗肿瘤效果的比较

使CVA11型的感染效价(MOI)为0(不添加)、0.001、0.01、0.1，使奥沙利铂或顺铂的添加量为0μM(不添加)、0.5μM、1μM、5μM。除此以外，通过与实施例1(1)(c)同样的方法进行。

(2)结果

图14(a)表示添加奥沙利铂时、图14(b)表示添加顺铂时的结晶紫法的结果。CVA11型和奥沙利铂的并用与CVA11型和顺铂的并用相比，显示较强的抗肿瘤效果。根据该结果，表示作为溶瘤病毒的CVA11型与奥沙利铂的组合与已经报道的(国际公开第2013-157648号)的CVA11型和顺铂的组合相比，特别有用。

比较例2基于顺铂的CVB3型的增殖促进作用

(1)方法

使用顺铂代替奥沙利铂，除此以外，通过与实施例7同样的方法进行。分为1：不添加顺铂、2：添加0.5μM的顺铂、3：添加1.0μM的顺铂这3个组进行比较。

(2)结果

图15表示CVB3型的病毒效价的结果。与添加奥沙利铂的情况(图9)不同，即使添加顺铂也没有确认到CVB3型病毒量的增加。根据该结果，表示奥沙利铂与顺铂相比，在与溶瘤病毒的并用中有用。

序列表

<110> 株式会社益力多本社

绪方久修

谷宪三朗

<120> 溶瘤病毒的增殖方法和抗肿瘤剂

<130> YK0102 PCT

<150> JP 2017-071296

<151> 2017-03-31

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7453

<212> DNA

<213> 柯萨奇病毒 A11

<400> 1

ttaaaacagc tgtggggttg ttcccacccc agaggcccac gtggcggcta gtactccggt 60

atcacggtac ccttgtacgc ctgttttata ctccctcccc cgtaacttag aagcaatcaa 120

atcaagttca ataggagggg gtacaaacca gtaccaccac gaacgagcac ttctgtttcc 180

ccggtgaagt tgcatagact gttaccacgg ttgaaagcga ccgatccgtt atccgctcat 240

gtacttcgag aagcctagta cctccttgga atcttcgatg cgttgcgctc agcactcaac 300

cccggagtgt agcttaggct gatgagtctg gacagccctc accggcgacg gtggtccagg 360

ctgcgttggc ggcctacctg tggcccaaag ccacaggacg ctagttgtga acaaggtgtg 420

aagagcctat tgagctacat gagagtcctc cggcccctga atgcggctaa tcctaaccac 480

ggagcaggcg atcgcaaacc agcaattagc ctgtcgtaac gcgaaagtct gtggcggaac 540

cgactacttt gggtgaccgt gtttctctta tttttattca tggctgctta tggtgacaat 600

catagattgt tatcataaag cgagttggat tggccatccg gtaaaagtca agtatatcat 660

ttacttgttt gtaggattta ttcctttgaa cgtccattta ctcaatctta tcagagtcac 720

attactagta agatctcact atcacaatgg gagctcaagt atcatctcag aaagtgggtg 780

cccatgaaaa caccaatgtg gccaccggtg ggtcaactgt aaactacact actattaatt 840

actacaaaga ctcagctagt aacgctgctt ctaaacagga cttctcccag gacccatcaa 900

aatttactga gcctgttaaa gacatcatgc tcaagtcagc ccctgctcta aactcaccca 960

atattgaggc atgcgggtat agtgataggg tgatgcagtt gactcttggg aattccacca 1020

ttactacaca ggaagcagcc aattcagtgg tagcatacgg tgagtggccg tcttatttgt 1080

cagacaaaga ggctaacccg gttgaccagc caacggagcc cgaagtgtct gcatgcagat 1140

tctacacgtt agatacagtc acgtggagta agagttcaaa aggatggtgg tggaaactac 1200

cggatgcact caaagacatg gggttgttcg ggcaaaacat gtactaccac tacctgggcc 1260

gttcgggcta cactgtgcat gtgcaatgta atgcatccaa gttccaccag ggcgctttgg 1320

gcgttttcgc cattccagag tactgtatgg cctgcaacac tgatgctaag accaactatg 1380

ttagctatgt acaagcaaac ccaggtgagg ctggtggagt ctttaccgac atgtacaatc 1440

ccagttcaga aacaactggg gcacgaaagt ttgcagcggt ggattacctg cttggttgtg 1500

gagtgttggc tggtaacgct ttcgtcttcc cccaccaaat catcaatctc cgcaccaaca 1560

actgtgctac actagtttta ccttacgtga actcaatggc aattgattgt atggcaaaac 1620

acaacaattg gggaatagca atactacctc ttgctgagct ggactttgct gaggcgtcat 1680

ctcctgaaat ccccataacc atcacaatcg caccgatgtg ttgtgagttc aatggactga 1740

ggaatttgac tagtccagct aaacagggcc taccagtaat gaatgtacct ggtagtaatc 1800

agttcttatc atctgacaat ttccaatcac cgtgtgcctt acctgagttt gacgtaacac 1860

caccgataca cattccaggt gaagttagga acatgatgga gcttgccgaa atagatacct 1920

taattccaat ggatctcagc gaatccaaga aaaacacaat gggaatgtac agagttgagt 1980

tagggtctgg caagtcacta tctaaaccca tactgtgtct tagcttgagt ccagctagtg 2040

aacaacgttt agggtacacc atgttgggag agattctgaa ttactataca cactggagtg 2100

ggtctttgaa attcaccttt ctgttctgtg ggagcatgat ggcaacaggc aagattttaa 2160

tatcgtatgc accaccaggt gcgaaaccac ctacaaccag aagggaggcc atgcttggca 2220

cacacgtgat ttgggacatt ggacttcagt catccgcgac catggtcgtg ccttggatca 2280

gtaacgttat gtaccggagg tgtgtgaagg atgactttac tgaaggtgga tatatatcaa 2340

tgttctacca gactaaaatc gtggtgcctc tatcaacacc caccacaatg acactactca 2400

gctttgtgtc agcatgcaac gactttaccg tgcggttgtt gagagacacc acccacatct 2460

cccaaacaac gaaaatcaac actcaagggc caatagaaga aatcatctca actgttgcca 2520

gtaacgcgtt ggcgctcagt caacccaagc cagtggacaa ctctgtacaa aacacccaac 2580

aaagtgctcc agtgcatagc caggaggtgc cagcattgac cgcagtggag acaggggcga 2640

caagtgatgt ggttccatct gacctaattc agactagaca cgtattgaat gttaaatcca 2700

ggtctgaatc caccatcgag tcattttttg caagagctgc atgtgtaacc attatgcagg 2760

tggacaattt caacgcaacc tctgtggaag acaaaagaaa gttgtttgct aaatgggcaa 2820

tcacctacac tgataccgtc cagctgagac ggaaattaga gtttttcact tattctagat 2880

ttgacttaga gatgactttt gtgctaactg agagatacta ctcccaaagc tcagggcatg 2940

ctagatctca ggtgtaccaa attatgtatg ttccaccagg ggcacccacg cctagtgcat 3000

gggacgacta cacatggcaa acatcctcca acccatccat tttctttacc accggcaatg 3060

caccaccgcg catttcaatt ccatttgttg gaatcgccaa tgcatactca cacttttatg 3120

atggctttag tagagtacct ttggagggag aaacaacaga cacaggagac gcttactacg 3180

ggctcacttc aataaacgat tttggtacac ttgcagtcag ggtagttaat gactacaacc 3240

cagccagggt ggagacaagg attagagtat acatgaagcc caaacatgtg agagtctggt 3300

gcccgcgacc tccaagagcg gtaagctaca gaggacctgg agtcgacctc ctatcaacat 3360

cagtaacacc tttatccaaa catgacctag cgacatacgg gtttggccac cagaacaaag 3420

cagtttacac agcagggtat aagatttgca actaccacct agctacccag gaagacatgc 3480

agaacgcagt gagcatcatg tggaatagag atctcttgat cgccgagtca aaggctcagg 3540

gtattgactc aatagccagg tgtaattgca atacaggtgt atattattgt gagtctagga 3600

gaaagtacta cccaatttcc tttgtggggc caaccttcca atacatggag gccaacgatt 3660

actaccctgc aaggtatcaa tcacacatgc taatagggca cggttttgca tcaccaggcg 3720

attgtggtgg cattctcaga tgtcaacatg gagtcatagg attgataact gccgggggcg 3780

agggcctagt tgcattctcg gacatcagag atttatatgc atatgaagag gaagccatgg 3840

agcaaggaat ctcgaactac attgagtcac taggggctgc atttggcagc gggtttactc 3900

aacagattgg agataaaata tcagagctta ccagtatggt caccagcacg atcactgaaa 3960

aattacttaa aaacttgatc aaaattatct cgtctcttgt catcatcacc agaaattatg 4020

aggacaccac cacggtgctc gccaccttgg cactcctcgg ctgtgacgtt tctccatggc 4080

aatggctgaa gaagaaagca tgtgacatct tagaaatccc ctatgttgta aggcaaggtg 4140

atagttggct gaagaaattc accgaggcgt gcaacgcagc taaaggcctg gagtgggtgt 4200

caaacaagat ttctaagttt atagactggc tcaaggaaag gatcattcca caagctagag 4260

ataaacttga gttcgtcact aagcttaagc agctggagat gctagagaat cagattgcta 4320

ccatacacca atcttgtccc agccaagagc atcaggagat tctgttcaat aatgtacgtt 4380

ggttgtcgat ccaatccaaa agatttgcac ctttgtatgc acttgaggcc aaaagaatcc 4440

aaaagttgga acacaccatt aacaactaca tacagttcaa gagcaaacac cgtattgaac 4500

cagtatgttt actagtgcat ggtagtccag gaacaggcaa gtcagttgca acaaatttaa 4560

tagctagagc aattgctgag aaagagaaca cttcaacata ctcgctacca cccgaccctt 4620

cacactttga tggwtacaaa cagcagggag tggtaatcat ggacgacctc aatcagaacc 4680

ctgatggggc tgacatgaaa ctattctgtc agatggtgtc tacagttgaa tttatcccac 4740

caatggcatc tttagaagag aaaggcattc tgtttacgtc caactatgtg ctagcttcca 4800

ccaactccag tcggattgca ccacctactg tagcccatag tgatgcacta gccaggaggt 4860

ttgcctttga catagatatt caggtcatga atgagtactc cagagatgga aagcttaata 4920

tggcaatggc tacggagatg tgcaagaact gccaccaacc agcaaacttc aagagatgct 4980

gtcctctggt gtgcggaaaa gcaattcagt taatggataa gtcatcaaga gtcaggtata 5040

gtgtggatca gattactact atgatcatca atgaaaggaa tagaagatca aatattggca 5100

attgtatgga agcactcttc caaggaccac tccagtacaa agacttgaaa attgacatta 5160

aaacaacacc acccccagag tgcatcaatg atttgctcca ggcagttgac tcccaagagg 5220

ttagggacta ttgtgagaag aaagggtgga ttgtcaatat caccagtcaa gtccaaactg 5280

aaaggaacat caatagagct atgacaattc tgcaagctgt cacaacattt gctgcggtgg 5340

ccggagttgt gtacgtcatg tacaaacttt tcgctggata tcaaggagct tacaccggcc 5400

tcccgaacaa aagacctagc gtacctacca ttagaactgc taaggtgcag ggtccaggct 5460

tcgactacgc agtcgcaatg gctaaaagaa acatagttac tgctaccacc agtaaggggg 5520

aatttaccat gctaggagtt catgacaatg tggcgatttt accaactcat gcgtcgcctg 5580

gagagagcat tgtgattgat ggaaaagagg tggagatttt agatgcaaag gctcttgaag 5640

accaagcagg cacaaatctg gaaattacaa ttataacact gaaaagaaat gaaaaattca 5700

gagacattag accacacatt cccacacaga ttactgagac taacgatgga gtgctgatcg 5760

tgaacactag taagtatccc aacatgtatg tgcctgttgg tgctgtgacc gaacagggat 5820

atcttaatct cggtgggcgt caaacagctc gtacattaat gtacaatttc ccaactagag 5880

cgggccagtg tggtggagtt gtcacttgca ctggtaaggt catcgggatg catgttggtg 5940

ggaatggttc acatgggttc gcagcggccc taaagcgatc gtatttcact cagagtcaag 6000

gtgagattca gtggataaga ccatcaaaag aagtgggtta ccccatcatt aatgctcctt 6060

ccaagactaa attagaacct agtgcctttc attatgtgtt tgagggagtc aaagagccag 6120

cagtccttac taagaatgac cctagactaa aaacagattt tgaagaggcc attttctcaa 6180

aatacgtagg gaacaaaatc acggaagtag atgaatacat gaaggaagca gtagaccact 6240

atgcgggaca actactttcc ctagacatca acacagacca gatgtgcctt gaggatgcca 6300

tgtacggcac tgatgggctt gaagctttgg acctcagtac tagtgcaggc tacccttatg 6360

ttgccatggg aaagaaaaag agggacattc taaataaaca aaccagggat accaaggaga 6420

tgcagagatt actcgacacc tatggaatta atctacctct agttacttat gtaaaagatg 6480

aactcaggtc taagacaaaa gtggaacaag gtaaatctag gctaattgaa gcatccagtc 6540

tcaatgattc agttgcaatg agaatggcct ttggtaactt gtatgcagca ttccacaaaa 6600

acccaggtgt ggtgacagga tctgcagttg ggtgcgaccc agacctgttc tggagtaaga 6660

taccagtgct aatggaagaa aaactctttg ctttcgatta cacgggatat gatgcatcac 6720

tcagtcccgc ttggttcgaa gctttgaaaa tggttttgga gaaaattggt tttggagata 6780

gggtagatta cattgactac ttgaatcact cacaccactt atacaaaaac aaaacttatt 6840

gtgttaaggg tggtatgcca tctggctgct ctggcacttc aatcttcaac tcaatgatca 6900

acaatttgat tatcaggacg ctcttactga aaacctacaa gggcatagat ttagatcacc 6960

taaaaatgat tgcctatggt gatgatgtaa ttgcttctta cccccatgag gttgacgcta 7020

gtctcctagc ccaatcagga aaagactatg gactaaccat gactccagca gacaagtcag 7080

ctacattcga aacagtcaca tgggagaacg taacattctt gaaaagattc ttcagagcag 7140

atgaaaagta cccctttctg atacatccag tgatgccaat gaaggaaatt catgaatcaa 7200

ttagatggac taaagatccc agaaacaccc aggatcatgt gcgctcatta tgcctattgg 7260

cttggcataa tggcgaagag gagtataaca aatttttagc tagaattaga agtgtgccaa 7320

ttggaagagc attattgctc cctgagtact ctacattgta ccgccgttgg cttgactcat 7380

tctagtaacc ctacctcagt cgaattggat tgggtgatac tgatgtaggg gtaaattttt 7440

ctttaattcg gag 7453

<210> 2

<211> 7399

<212> DNA

<213> 柯萨奇病毒 B3

<400> 2

ttaaaacagc ctgtgggttg atcccaccca cagggcccat tgggcgctag cactctggta 60

tcacggtacc tttgtgcgcc tgttttatac cccctccccc aactgtaact tagaagtaac 120

acacaccgat caacagtcag cgtggcacac cagccacgtt ttgatcaagc acttctgtta 180

ccccggactg agtatcaata gactgctcac gcggttgaag gagaaagcgt tcgttatccg 240

gccaactact tcgaaaaacc tagtaacacc gtggaagttg cagagtgttt cgctcagcac 300

taccccagtg tagatcaggt cgatgagtca ccgcattccc cacgggcgac cgtggcggtg 360

gctgcgttgg cggcctgccc atggggaaac ccatgggacg ctctaataca gacatggtgc 420

gaagagtcta ttgagctagt tggtagtcct ccggcccctg aatgcggcta atcctaactg 480

cggagcacac accctcaagc cagagggcag tgtgtcgtaa cgggcaactc tgcagcggaa 540

ccgactactt tgggtgtccg tgtttcattt tattcctata ctggctgctt atggtgacaa 600

ttgagagatt gttaccatat agctattgga ttggccatcc ggtgaccaat agagctatta 660

tatatctctt tgttgggttt ataccactta gcttgaaaga ggttaaaaca ttacaattca 720

ttgttaagtt gaatacagca aaatgggagc tcaagtatca acgcaaaaga ctggggcaca 780

tgagaccagg ctgaatgcta gcggcaattc catcattcac tacacaaata ttaattatta 840

caaggatgcc gcatccaact cagccaatcg gcaggatttc actcaagacc cgggcaagtt 900

cacagaacca gtaaaagata tcatgattaa atcactacca gctctcaact cccccacagt 960

agaggagtgc ggatacagtg acagggtgag atcaatcaca ttaggtaact ccaccataac 1020

gactcaggaa tgcgccaacg tggtggtggg ctatggagta tggccagatt atctaaagga 1080

tagtgaggca acagcagagg accaaccgac ccaaccagac gttgccacat gtaggttcta 1140

tacccttgac tctgtgcaat ggcagaaaac ctcaccagga tggtggtgga agctgcccga 1200

tgctttgtcg aacttaggac tgtttgggca gaacatgcag taccactact taggccgaac 1260

tgggtatacc gtacatgtgc agtgcaatgc atctaagttc caccaaggat gcttgctagt 1320

agtgtgtgta ccggaagctg agatgggttg cgcaacgcta gacaacaccc catccagtgc 1380

agaattgctg gggggcgata gcgcaaaaga gtttgcggac aaaccggtcg catccgggtc 1440

caacaagttg gtacagaggg tggtgtataa tgcaggcatg ggggtgggtg ttggaaacct 1500

caccattttc ccccaccaat ggatcaacct acgcaccaat aatagtgcta caattgtgat 1560

gccatacacc aacagtgtac ctatggataa catgtttagg cataacaacg tcaccctaat 1620

ggttatccca tttgtaccgc tagattactg ccctgggtcc accacgtacg tcccaattac 1680

ggtcacgata gccccaatgt gtgccgagta caatgggtta cgtttagcag ggcaccaggg 1740

cttaccaacc atgaatactc cggggagctg tcaatttctg acatcagacg acttccaatc 1800

accatccgcc atgccgcaat atgacgtcac accagagatg aggatacctg gtgaggtgaa 1860

aaacttgatg gaaatagctg aggttgactc agttgtccca gtccaaaatg ttggagagaa 1920

ggtcaactct atggaagcat accagatacc tgtgagatcc aatgaaggat ctggaacgca 1980

agtattcggc tttccactgc aaccagggta ctcgagtgtt tttagtcgga cgctcctagg 2040

agagatcttg aactattata cacattggtc aggcagcata aagcttacgt ttatgttctg 2100

tggttcggcc atggctactg gaaaattcct tttggcatac tcaccaccag gtgctggagc 2160

tcctacaaaa agggttgatg ccatgcttgg tactcatgta gtttgggacg tggggctaca 2220

atcaagttgc gtgctgtgta taccctggat aagccaaaca cactaccggt ttgttgcttc 2280

agatgagtat accgcagggg gttttattac gtgctggtat caaacaaaca tagtggtccc 2340

agcggatgcc caaagctcct gttacatcat gtgtttcgtg tcagcatgca atgacttctc 2400

tgtcaggcta ttgaaggaca ctcctttcat ttcgcagcaa aactttttcc agggcccagt 2460

ggaagacgcg ataacagccg ctatagggag agttgcggat accgtgggta cagggccaac 2520

caactcagaa gctataccag cactcactgc tgctgagaca ggtcacacgt cacaagtagt 2580

gccgggtgac accatgcaga cacgccacgt taagaactac cattcaaggt ctgagtcaac 2640

catagagaac ttcctatgta ggtcagcatg cgtgtacttt acggagtata aaaactcagg 2700

tgccaagcgg tatgctgaat gggtattaac accacgacaa gcagcacaac ttaggagaaa 2760

gctagaattc tttacctacg tccggttcga cctggagctg acgtttgtca taacaagtac 2820

tcaacagccc tcaaccacac agaaccaaga cgcacagatc ctaacacacc aaattatgta 2880

cgtaccacca ggtggacctg taccagataa agttgattca tacgtgtggc aaacatctac 2940

gaatcccagt gtgttttgga ccgagggaaa cgccccgccg cgcatgtcca taccgttttt 3000

gagcattggc aacgcctatt caaatttcta tgacggatgg tctgaatttt ccaggaacgg 3060

agtttacggc atcaacacgc taaacaacat gggcacgcta tatgcaagac atgtcaacgc 3120

tggaagcacg ggtccaataa aaagcaccat tagaatctac ttcaaaccga agcatgtcaa 3180

agcgtggata cctagaccac ctagactctg ccaatacgag aaggcaaaga acgtgaactt 3240

ccgacccagc ggagttacca ctactaggca aagcatcact acaatgacaa atacgggcgc 3300

atttggacaa caatcagggg cagtgtatgt ggggaactac agggtagtaa atagacatct 3360

agctaccagt gctgactggc aaaactgtgt gtgggaaagt tacaacagag acctcttagt 3420

gagcacgacc acaacacatg gatgtgatat tatagccaga tgtcagtgca caacgggagt 3480

gtacttttgt gcgtccaaaa acaagcacta cccaatttcg tttgaaggac caggtctagt 3540

agaggtccaa gagagtgaat actaccccag gagataccaa tcccatgtgc ttttagcagc 3600

tggattttcc gaaccaggtg actgtggcgg tatcctaagg tgtgagcatg gtgtcattgg 3660

cattgtgacc atggggggtg aaggcgtggt cggctttgca gacatccgtg atctcctgtg 3720

gctggaagat gatgcaatgg aacagggagt gaaggactat gtggaacagc ttggaaatgc 3780

actcggctcc ggctttacta accaaatatg tgagcaagtc aacctcctga aagaatcact 3840

agtgggtcaa gactccatct tagagaaatc tctaaaagcc ttagttaaga taatatcagc 3900

cttagtaatt gtggtgagga accacgatga cctgatcact gtgactgcca cactagccct 3960

tatcggttgt acctcgtccc cgtggcggtg gctcaaacag aaggtgtcac aatattacgg 4020

aatccctatg gctgaacgcc aaaacaatag ctggcttaag aaatttactg aaatgacgaa 4080

tgcttgcaag ggtatggaat ggatagctgt caaaattcag aaattcattg aatggctcaa 4140

agtaaaaatt ttgccagagg tcagggaaaa acacgaattc ctgaacagac ttaaacaact 4200

ccccttatta gaaagtcaga tcgccacaat cgagcagagc gcgccatccc aaagtgacca 4260

ggaacaatta ttttccaatg tccaatactt tgcccactat tgcagaaagt acgctcccct 4320

ctacgcagct gaagcaaaga gggtgttctc ccttgagaag aagatgagca attacataca 4380

gttcaagtcc aaatgccgta ttgaacctgt atgtttgctc ctgcacggga gccctggtgc 4440

cggcaagtcg gtggcaacaa acttaattgg aaggtcgctt gctgagaaac tcaacagctc 4500

agtgtactca ctaccgccag acccagatca cttcgacgga tacaaacagc aggccgtggt 4560

gattatggac gatctatgcc agaaccctga tgggaaagac gtctccttgt tctgccaaat 4620

ggtttccagt gtagattttg taccacccat ggctgcccta gaagagaaag gcattctgtt 4680

cacctcaccg tttgtcttgg catcgaccaa tgcaggatct attaatgctc caaccgtgtc 4740

agatagcaga gccttggcaa ggagatttca ctttgacatg aacatcgagg ttatttccat 4800

gtacagtcag aatggcaaga taaacatgcc catgtcagtc aagacttgtg acgatgagtg 4860

ttgcccggtc aattttaaaa agtgctgccc tcttgtgtgt gggaaggcta tacaattcat 4920

tgatagaaga acacaggtca gatactctct agacatgcta gtcaccgaga tgtttaggga 4980

gtacaatcat agacatagcg tggggaccac gcttgaggca ctgttccagg gaccaccagt 5040

atacagagag atcaaaatta gcgttgcacc agagacacca ccaccgcccg ccattgcgga 5100

cctgctcaaa tcggtagaca gtgaggctgt gagggagtac tgcaaagaaa aaggatggtt 5160

ggttcctgag atcaactcca ccctccaaat tgagaaacat gtcagtcggg ctttcatttg 5220

cttacaggca ttgaccacat ttgtgtcagt ggctggaatc atatatataa tatataagct 5280

ctttgcgggt tttcaaggtg cttatacagg agtgcccaac cagaagccca gagtgcctac 5340

cctgaggcaa gcaaaagtgc aaggccctgc ctttgagttc gctgtcgcaa tgatgaaaag 5400

gaactcaagc agggtgaaaa ctgaatatgg cgagtttacc atgctgggca tctatgacag 5460

gtgggccgtt ttgccacgcc acgccaaacc tgggccaacc atcttgatga atgatcaaga 5520

ggttggtgtg ctagatgcca aggagctagt agacaaggac ggcaccaact tagaactgac 5580

actactcaaa ttgaaccgga atgagaagtt cagagacatc agaggcttct tagccaagga 5640

ggaagtggag gttaatgagg cagtgctagc aattaacacc agcaagtttc ccaacatgta 5700

cattccagta ggacaggtca cagaatacgg cttcttaaac ctaggtggca cacccaccaa 5760

gagaatgctt atgtacaact tccccacaag agcaggccag tgtggtggag tgctcatgtc 5820

caccggcaag gtactgggta tccatgttgg tggaaatggc catcagggct tctcagcagc 5880

actcctcaaa cactacttca atgatgagca aggtgaaata gaatttattg agagctcaaa 5940

ggacgccggg tttccagtca tcaacacacc aagtaaaaca aagttggagc ctagtgtttt 6000

ccaccaggtc tttgagggga acaaagaacc agcagtactc aggagtgggg atccacgtct 6060

caaggccaat tttgaagagg ctatattttc caagtatata ggaaatgtca acacacacgt 6120

ggatgagtac atgctggaag cagtggacca ctacgcaggc caactagcca ccctagatat 6180

cagcactgaa ccaatgaaac tggaggacgc agtgtacggt accgagggtc ttgaggcgct 6240

tgatctaaca acgagtgccg gttacccata tgttgcactg ggtatcaaga agagggacat 6300

cctctctaag aagactaagg acctaacaaa gttaaaggaa tgtatggaca agtatggcct 6360

gaacctacca atggtgactt atgtaaaaga tgagctcagg tccatagaga aggtagcgaa 6420

aggaaagtct aggctgattg aggcgtccag tttgaatgat tcagtggcga tgagacagac 6480

atttggtaat ctgtacaaaa ctttccacct aaacccaggg gttgtgactg gtagtgctgt 6540

tgggtgtgac ccagacctct tttggagcaa gataccagtg atgttagatg gacatctcat 6600

agcatttgat tactctgggt acgatgctag cttaagccct gtctggtttg cttgcctaaa 6660

aatgttactt gagaagcttg gatacacgca caaagagaca aactacattg actacttgtg 6720

caactcccat cacctgtaca gggataaaca ttactttgtg aggggtggca tgccctcggg 6780

atgttctggt accagtattt tcaactcaat gattaacaat atcataatta ggacactaat 6840

gctaaaagtg tacaaaggga ttgacttgga ccaattcagg atgatcgcat atggtgatga 6900

tgtgatcgca tcgtacccat ggcctataga tgcatcttta ctcgctgaag ctggtaaggg 6960

ttacgggctg atcatgacac cagcagataa gggagagtgc tttaacgaag ttacctggac 7020

caacgtcact ttcctaaaga ggtattttag agcagatgaa cagtacccct tcctggtgca 7080

tcctgttatg cccatgaaag acatacacga atcaattaga tggaccaagg atccaaagaa 7140

cacccaagat cacgtgcgct cactgtgtct attagcttgg cataacgggg agcacgaata 7200

tgaggagttc atccgtaaaa ttagaagcgt cccagtcgga cgttgtttga ccctccccgc 7260

gttttcaact ctacgcagga agtggttgga ctccttttag attagagaca atttgaaata 7320

atttagattg gcttaaccct actgtgctaa ccgaaccaga taacggtaca gtaggggtaa 7380

attctccgca ttcggtgcg 7399

<210> 3

<211> 5031

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 3

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gaattgcctg 240

caggcagctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc 300

gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc 360

catcactagg ggttcctatc gatatcaagc tttaatagta atcaattacg gggtcattag 420

ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 480

gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 540

caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 600

cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 660

ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 720

tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 780

gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 840

gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 900

tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctggtttag 960

tggatatcct taagggccca gccggcccga atcccggccg ggaacggtgc attggaacgc 1020

ggattccccg tgccaagagt gacgtaagta ccgcctatag agtctatagg cccacaaaaa 1080

atgctttctt cttttaatat acttttttgt ttatcttatt tctaatactt tccctaatct 1140

ctttctttca gggcaataat gatacaatgt atcatgcctc tttgcaccat tctaaagaat 1200

aacagtgata atttctgggt taaggcaata gcaatatttc tgcatataaa tatttctgca 1260

tataaattgt aactgatgta agaggtttca tattgctaat agcagctaca atccagctac 1320

cattctgctt ttattttatg gttgggataa ggctggatta ttctgagtcc aagctaggcc 1380

cttttgctaa tcatgttcat acctcttatc ttcctcccac agctcctggg caacgtgctg 1440

gtctgtgtgc tggcccatca ctttggcaaa gaattgggat tcgcgagaat tctctagagt 1500

cgacactagt gcggatccac gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg 1560

ccctggaagt tgccactcca gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca 1620

ttttgtctga ctaggtgtcc ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca 1680

aggggcaagt tgggaagaca acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga 1740

gtgcagtggc acaatcttgg ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc 1800

tgcctcagcc tcccgagttg ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt 1860

tgtttttttg gtagagacgg ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat 1920

ctcaggtgat ctacccacct tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg 1980

ctcccttccc tgtccttatc gatagatcta ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc 2040

ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg 2100

ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg cagcttggca 2160

ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc 2220

cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc 2280

ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc tgatgcggta ttttctcctt 2340

acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata cgtcaaagca accatagtac gcgccctgta 2400

gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 2460

gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 2520

ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 2580

acctcgaccc caaaaaactt gatttgggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 2640

agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 2700

aaactggaac aacactcaac cctatctcgg gctattcttt tgatttataa gggattttgc 2760

cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta 2820

acaaaatatt aacgtttaca attttatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg 2880

catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc 2940

tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga 3000

ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt 3060

tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa 3120

atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 3180

tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 3240

aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 3300

acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 3360

acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 3420

ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg 3480

ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 3540

caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 3600

ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 3660

aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 3720

aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 3780

tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 3840

aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 3900

cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca 3960

ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 4020

gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta 4080

agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 4140

atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 4200

cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 4260

cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 4320

cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 4380

tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 4440

tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 4500

ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 4560

aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 4620

cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 4680

ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 4740

agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 4800

ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 4860

acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg 4920

cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 4980

gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa g 5031

Claims

1.一种抗肿瘤剂，是将溶瘤病毒以及选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂组合而成的。

2.根据权利要求1所述的抗肿瘤剂，其中，溶瘤病毒为柯萨奇病毒或腺病毒。

3.根据权利要求2所述的抗肿瘤剂，其中，柯萨奇病毒为A11型或B3型。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的抗肿瘤剂，其中，植物生物碱系抗癌剂由选自SN-38、伊立替康和它们的盐中的1种以上构成。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的抗肿瘤剂，其中，抗代谢剂为5-FU或其盐。

6.一种抗肿瘤剂，包含溶瘤病毒以及选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂。

7.根据权利要求6所述的抗肿瘤剂，其中，溶瘤病毒为柯萨奇病毒或腺病毒。

8.根据权利要求7所述的抗肿瘤剂，其中，柯萨奇病毒为A11型或B3型。

9.根据权利要求6～8中任一项所述的抗肿瘤剂，其中，植物生物碱系抗癌剂由选自SN-38、伊立替康和它们的盐中的1种以上构成。

10.根据权利要求6～8中任一项所述的抗肿瘤剂，其中，抗代谢剂为5-FU或其盐。

11.根据权利要求1～5中任一项所述的抗肿瘤剂，是由含有溶瘤病毒而成的药剂以及含有选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂而成的药剂构成的试剂盒。

12.一种溶瘤病毒的抗肿瘤效果增强剂，将选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂作为有效成分。

13.根据权利要求12所述的抗肿瘤效果增强剂，其中，溶瘤病毒为柯萨奇病毒或腺病毒。

14.一种溶瘤病毒的增殖促进方法，将选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂与溶瘤病毒一起培养。

15.一种癌细胞的病毒受体表达增强剂，将选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂作为有效成分。

16.根据权利要求15所述的病毒受体表达增强剂，其中，病毒受体为DAF和/或ICAM-1。

17.一种用于制造抗肿瘤剂的溶瘤病毒以及选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂的应用。

18.一种用于抗肿瘤疗法的溶瘤病毒以及选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂的组合。

19.一种抗肿瘤疗法，对患者给药溶瘤病毒以及选自奥沙利铂、植物生物碱系抗癌剂和抗代谢剂中的抗癌剂。