CN110456034B

CN110456034B - 一种循环肿瘤细胞的检测方法

Info

Publication number: CN110456034B
Application number: CN201810425065.9A
Authority: CN
Inventors: 孙奋勇; 潘秋辉; 江赐忠; 吴棋; 黄楠; 崔中奇
Original assignee: Shanghai Tenth Peoples Hospital
Current assignee: Zhihui Medical Technology Shanghai Co ltd
Priority date: 2018-05-07
Filing date: 2018-05-07
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2038-05-07
Also published as: CN110456034A; WO2019214063A1

Abstract

本发明涉及一种循环肿瘤细胞的检测方法：采集人体液样本，用甲醛固定后增加细胞膜通透性，将细胞加入若干组PCR多联管中，每管加有携带ID1的逆转录引物，逆转录成cDNA分子后，收集细胞混合加入另一组PCR多联管中，每管中加有携带ID2且3’端能够特异性识别cDNA分子的3’端的延伸引物，通过序列互补后进行延伸反应，收集并裂解细胞，通过PCR引物预扩增延伸产物。高通量测序，分析ID1:ID2的组合方式。其优点在于：同时对不同的标志物进行逆转录与PCR扩增，可准确识别循环肿瘤细胞、发生EMT的循环肿瘤细胞，并能联合其它技术使用，最大程度检测体液样本中极少的循环肿瘤细胞以及其它非体液稀有细胞。

Description

一种循环肿瘤细胞的检测方法

技术领域

本发明涉及细胞检测技术领域，具体地说，是一种高效率检测体液中稀有细胞的方法，特别涉及一种从血液中精准检测循环肿瘤细胞的方法，本发明还涉及一种用于从肿瘤患者外周血中检测循环肿瘤细胞的试剂盒，以及循环肿瘤细胞的分析方法及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的重大疾病之一，寻找能够进行早期诊断、预测转移和预后以及侵入性小的方法对于提高该类患者生存率有重要作用。近年来，随着分子生物学技术的发展，逐渐丰富了人们对肿瘤发生发展分子机制的认识，临床上已达到对肿瘤进行基因水平上的诊断和靶向治疗。传统的组织病理学检查限于肿瘤生长部位、标本取材大小以及肿瘤的异质性，因而单一位点的组织活检难以反映肿瘤的基因组全貌。此外，由于采用侵入性手段取样，组织活检不仅给患者带来较大的创伤，更无法重复多次进行。

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)作为一种新型实时监测的非侵入性诊断工具，可被看作液体活检样本，为恶性肿瘤早期诊断、预后评估以及治疗效果监测开辟了一个新的研究领域。与组织活检相比，CTCs的检测具有便捷、无创、重复性强等独有优势，能够展现肿瘤的基因组全貌，并且实时监测患者的疾病进展和治疗过程。

1CTCs概述

CTCs是由原位肿瘤或转移灶释放入外周血循环中的，与原发病灶性质相似的肿瘤细胞，其中大部分在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数存活下来的CTCs具有极强的黏附性和侵袭性，是恶性肿瘤出现血路转移的主要生物学基础。肿瘤进展过程中，肿瘤细胞发生基因突变或表观遗传学改变，从而获得更具侵袭能力的生物表型或干细胞特性，其中上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)被公认是促使CTCs进入血液***的主要机制之一。现有研究发现在肺癌、结直肠癌、乳腺癌、***癌、胰腺癌等中均能检出CTCs，并且它存在于缺乏明确***及远处转移、临床分期为早期的患者体内，因此CTCs的检测可用于肿瘤早期筛查、判断预后和预测患者未来发生转移复发的可能性等。

2CTCs的检测方法

CTCs在肿瘤患者外周血中数量稀少，每10⁶-10⁷个单个核细胞中才有1个CTC。因此，大多数方法在检测前要对CTCs进行分离和富集，然后通过各种可靠的手段加以鉴定和分析。

2.1CTCs的分离、富集技术：

根据肿瘤细胞的免疫学与物理学特征，富集CTCs的常用方法有免疫磁珠富集法(immunomagnetic beads separation,IMS)和上皮肿瘤细胞大小分离法(isolation bysize of epithelial tumor cells,ISET)。IMS是基于某些细胞表面的分子标志物(如上皮细胞黏附分子、细胞角蛋白)在CTCs和血细胞间的差异表达，使用包被有特异性抗体的磁珠与之结合，并在外源磁场的作用下富集细胞。例如，目前唯一通过美国食品药品监督局(Food and Drug Administration，FDA)批准的

CTC检测试剂盒，就是将CTCs捕获和检测相结合的应用最广泛的方法。该试剂盒不仅用包被有上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)抗体的磁珠对CTCs富集，并用荧光素标记的CK抗体和CD45抗体对富集细胞分选，同时用DAPI对细胞核进行染色，其中CK+/CD45-/DAPI+的细胞被鉴定为CTCs；还可自动化对捕获细胞进行拍照、分析和计数。该试剂盒给出了具有预后评估意义的CTCs检出数目：转移性结直肠癌中，CTCs数目小于3个/7.5mL外周血提示患者预后较好；转移性***癌和乳腺癌中，CTCs数目小于5个/7.5mL外周血提示患者预后较好。最近，Elaine等建立了一种低成本、高通量的CTCs富集装置，通过将EpCAM抗体微接触包被在纳米多孔的二氧化硅底物上，并结合微流体技术，从而显著提高了CTCs的获取效率。但是该类技术限于标记物，如转移过程中，上皮来源的肿瘤细胞在外源刺激或自身变异下，其CK和EpCAM可能不表达或低表达，导致CTCs捕获效率低下。此外，由于肿瘤细胞与正常细胞之间的交叉抗原表达，以及肿瘤细胞的异质性，同一个患者的CTCs并不会表达一致的标记，因此可能出现假阳性或假阴性结果。

ISET技术基于CTCs比血细胞体积大、硬度高的特点，采用8μm孔径的滤过膜将CTCs从外周血中分离出来，然后结合免疫细胞化学法进行检测。该方法能够保持细胞的完整性，以便后续细胞学、基因组学的研究，同时具有便捷、经济、用时少等优点。由于ISET分离CTCs主要是通过细胞大小而不是细胞表面分子标志物，因此更适用于异质性显著的恶性肿瘤如胃癌、***癌和肺癌等，能够大大减少抗原交叉表达导致的假阳性结果。但是，ISET法只能分离得到较大体积的CTCs，对于那些体积较小的CTCs容易滤过，可能得到假阴性结果。2014年，有研究者研发了一种结合过滤通道和微流体通道的CTCs芯片，通过对肺癌患者外周血标本的检测，证实相对于抗体介导的捕获技术，这种基于细胞体积的芯片能够更高效地分离CTCs。

阴性富集策略不依赖于肿瘤特异性表面抗原，采用免疫磁珠法，通过有效去除CD45(+)的白细胞或CD61(+)的巨噬细胞、血小板等外周血其他细胞而间接富集CD45(+)或CD61(+)阴性的稀有细胞，克服了阳性富集策略的缺陷。但这种阴性富集策略得到的产物纯度较低，特异性不高，回收率也有待提高。

2.2CTCs的检测技术：

目前，CTCs的常用检测技术包括细胞计数法和核酸检测法，如流式细胞术、RT-PCR、免疫细胞化学法等。流式细胞术可对悬液中的细胞进行定量分析，检测速度快，但无法观察细胞形态。RT-PCR通过检测CTCs中特异性基因(癌基因或抑癌基因等)的表达水平，如EGFR、HER2，从而判断外周血中CTCs的存在，是目前检测CTCs的有效方法之一，可分析极微量RNA，但该方法提取核酸后无法得到细胞计数结果。免疫细胞化学法主要检测CTCs表面的特定标志，如上皮细胞膜抗原、细胞角蛋白(CK8、CK18、CK19)和EpCAM，常用于形态学分析，但此方法无法排除外周血中上皮细胞的污染，可能出现假阳性结果。此外，获取的CTCs在细胞和分子层面上还可以进行细胞培养、FISH、单细胞测序等研究。

整体上，传统的密度梯度离心法、细胞大小过滤法存在富集效率低的致命缺陷，免疫磁珠阳性富集法存在操作繁琐、使用不方便、漏检等缺点，微流控芯片技术则存在成本高、技术难度高等缺点。

发明内容

本发明的第一个目的是，针对现有循环肿瘤细胞检测技术的缺陷，提供一种从体液中提检测循环肿瘤细胞或其它非体液性稀有细胞的方法。

本发明的第二个目的是，提供一种用于检测循环肿瘤细胞的试剂盒。

本发明的第三个目的是，提供一种循环肿瘤细胞的检测***。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种对体液中的循环肿瘤细胞进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：

a.采集人体体液标本；

b.收集体液中的有核细胞，对细胞进行固定，并处理细胞增加细胞膜通透性；

c.将细胞均匀分散到一组PCR多联管中，每管中加有携带不同识别序列ID1的逆转录引物，逆转录得到cDNA分子，其5’端携带有特异性ID1序列；

d.收集细胞混合加入另一组PCR多联管中，每管中加有携带不同识别序列ID2，且3’端能够特异性识别cDNA分子的3’端的延伸引物，通过序列互补后进行延伸反应；

e.收集合并细胞，裂解细胞，10-15个循环PCR预扩增d中延伸产物；

f.收集PCR预扩增产物并纯化；

g.对PCR产物进行高通量测序；

h.分析每个有效分子序列中ID1:ID2的组合方式，可以对循环肿瘤细胞以及其它非体液稀有细胞的准确数目进行评估。

所述体液包括血液和其它体液标本，其它体液标本包括、尿液、胸腔积液、腹腔积液、脑脊液、消化液。

所述循环肿瘤细胞包括发生或未发生上皮-间充质变换的循环肿瘤细胞。

步骤b中固定细胞所用试剂选自戊二醛、甲醛、丙酮、甲醇、乙醇、醋酸、丙烯醛、醋酸铀、铬酸、苦味酸的任一种或其组合。

步骤b中增加膜通透性的试剂为非离子表面活性剂。优选的，所述非离子表面活性剂为Triton-X 100。

步骤c中PCR多联管的数量为3个或3个以上。

步骤c中ID1包括2个或2个以上的核酸序列，通过排列组合成16种或16种以上的唯一识别序列，对应每个含有细胞的PCR管。

步骤c中ID1序列直接合成在逆转录引物序列上，或通过连接、延伸、互补配对的方式连接到逆转录后的cDNA分子上。

步骤d中PCR多联管的数量为3个或3个以上。

步骤d中ID2包括2个或2个以上的核酸序列，通过排列组合成16种或16种以上的唯一识别序列，对应每个含有细胞的PCR管。

步骤d中ID2序列通过连接、延伸、互补配对或PCR扩增的方式连接到逆转录后的cDNA分子的互补链上。

步骤d中的特异性识别的标志物为上皮细胞的标志物、肿瘤特异性的标志物或***标志物。

所述上皮细胞的标志物为CK18、CK19、EpCAM、KRT20、KRT19、KRT7、E-cadherin中的任一种或其组合。

所述肿瘤特异性的标志物为CEA、SCC、CA125、CA50、CA19-9、CA242、CA724、CEA、CA125、ALP、AFP-L3、AFU、GP73、PSA、PCA3、TMPRSS2-ETS、PIVKA-II、NSE、CYFRA21-1、CEA、CA153、AFP中的任一种或其组合。

所述***标志物为Vimentin、fibronectin、MMP9、N-cadherin、AKT2中的任一种或其组合。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种用于检测循环肿瘤细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：1)上皮细胞特异标志物的逆转录与扩增引物；2)肿瘤细胞特异标志物的逆转录与扩增引物；3)固定试剂与透膜试剂。

所述上皮细胞特异标志物的逆转录与扩增引物用于检测体液中的循环肿瘤细胞或其它非体液性稀有细胞。

所述肿瘤细胞特异标志物的逆转录与扩增引物用于检测体液中的循环肿瘤细胞。

所述固定试剂选自戊二醛、甲醛、丙酮、甲醇、乙醇、醋酸、丙烯醛、醋酸铀、铬酸、苦味酸中的任一种或其组合。

所述透膜试剂为非离子表面活性剂。优选的，所述非离子表面活性剂为Triton-X100。

所述试剂盒还包括说明书，所述说明书中记载上述的方法。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种循环肿瘤细胞的检测***，所述检测***能够进行上述方法，和/或能够使用上述试剂盒处理待检测样品。

所述检测***是自动化***。

本发明优点在于：

本发明采用的是“非选择富集”技术方案。传统的CTC富集方法，无论是基于细胞物理特征或是生化标志物，也无论是基于阴性富集或是阳性富集的方法，都有可能不同程度地丢失CTC细胞。本发明采用的方法，利用PCR技术结合深度测序理论上可以检测到所有CTC细胞，极大提高检测灵敏度，从根本上解决了目前所有检测方法的弊病。另外，将富集-鉴定的两步法合并为一步检测方法，具有更大实用性。

目前有不少报道表明，CTC细胞富集后可以结合单细胞测序，可以在基因组与表达组两个层次对CTC进行深度分析，但是无法对CTC的数量进行识别，不能直接作为肿瘤临床特征的生物标志物。另一方面，如果直接采用目前主流的单细胞测序方法，考虑每毫升血中数百万有核细胞的存在，代价极其昂贵。本发明只针对CTC相关细胞进行识别，配合了PCR技术对CTC信号进行预放大，再用高通量测序进行分析，可以完全还原血液中CTC真实的数量。

肿瘤患者血液中，除白细胞，还存在少量内皮细胞，成纤维细胞，变型CTC，发生EMT的CTC，极有可能会影响干扰对CTC的识别，为了提高识别准确性，我们必须同时考虑用若干个指标联合识别。本发明所使用的技术为开放性的平台，可以通过不同的指标组合完成各种细胞的识别，具有非常大的应用价值。

本发明还可以方便地结合目前已有的其它CTC富集技术，联合提高检测技术的灵敏度与特异度。

通过设计不同的引物序列，可以检测血液中不同细胞类型的数量，例如成纤维细胞，内皮细胞，肿瘤相关巨噬细胞。

一旦肿瘤细胞从它的原生环境离开，许多退化过程包括溶血，血小板活化，细胞因子和氧化爆起作用，中性粒细胞胞外诱捕网的形成给完整的血标本带来了间接损害。循环肿瘤细胞极度稀少、脆弱的特性加剧了这些问题，不仅是因为靶细胞在这种不利环境下不易提取，而且，由于血细胞破裂、胞外DNA以及细胞形态和标志物表达的改变，严格的稀有细胞分选机制也遭受了破坏。使用添加到血液中的肿瘤细胞进行对照研究，证实采血后5h内循环肿瘤细胞的数量减少了超过60％，2–4小时内RNA也发生了明显降解。在标本短期储存通常需要3-4h的临床研究中，发现近40％的分离的单细胞RNA质量控制不合格；12小时内，79％的细胞中存在RNA降解。而本发明的方法，可以通过收集血液后，尽早加入固定试剂，防止细胞的破裂以及RNA降解。

附图说明

附图1是循环肿瘤细胞检测策略。

附图2是测序信息的分析流程。

附图3是测序结果质量检测。上图：所得序列每个位置上的碱基质量打分分布。下图：所得序列在整个基因区上的分布，表明RNA没有降解。

附图4是肿瘤细胞回收实验结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

定义：

非体液性稀有核细胞：循环的具有上皮来源的或不具有上皮来源的肿瘤细胞和循环的血管内皮细胞、肿瘤干细胞、干细胞、血中胎儿细胞，某些免疫细胞等稀有细胞。

循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTC)：通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞是非体液性稀有有核细胞的一种。

循环内皮细胞(Circulating Endothelia Cells,CEC)：把脱落入血的血管内皮细胞称为循环内皮细胞。循环内皮细胞也是非体液性稀有有核细胞的一种。

循环成纤维细胞(Circulating Fibroblast Cells,CFC)：把脱落入血的成纤维细胞称为循环成纤维细胞。循环成纤维细胞也是非体液性稀有有核细胞的一种。

上皮间充质转化(Endothelial-Mesenchymal Transformation,EMT)：是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病中发挥了重要作用，其主要的特征有细胞黏附分子(如E-钙黏蛋白)表达的减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白(Vimentin)为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等。

单管识别序列(Identity,ID)：核酸识别序列，本发明中主要用于编码不同管中细胞RNA分子的逆转录分子。

基因特异序列(Gene Specific Sequence,GSS)：针对目标基因设计的特异性识别序列，在本发明中主要用于逆转录与PCR扩增。

本发明中的待检样品通常是从体液中收集的有核细胞样品。

该体液可以是外周循环血、脐带血、尿液、脊髓及胸腔积液、腹水、***、骨髓、羊水、痰液等多种。

有核细胞，其中包含有免疫细胞，内皮细胞，成纤维细胞，以及循环肿瘤细胞，发生间充质-上皮转换的循环肿瘤细胞。

收集到样品，经过试剂的固定或透膜处理后，蛋白的表达，RNA的转录等被固定，可以放置于4℃，或于-20℃长期保存。

样品的前处理包括：

加入红细胞裂解液于摇床中旋转8-12min，离心5-10min后得到白细胞和肿瘤细胞混合物，该方法为“非选择性”收集，能够最大程度保证收集到体液中的有核细胞。

白细胞相对于其他体液/血液成分密度较低，因此能根据密度梯度的差别将其分离。采用密度梯度，血液中绝大多数的白细胞可以与其他成分分离。此方法可以去除多数白细胞，方便后续的检测，但会造成循环肿瘤细胞的丢失，或影响细胞的状态。

免疫磁珠法原理是细胞表面抗原分子能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场的作用下，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸引而留在磁场中，而其他细胞因为不带磁性，不能在磁场中停留，从而使细胞得以分离。基于免疫学的富集方法分为阴性和阳性两种。免疫阴性富集可用抗CD45抗体，或是抗CD61抗体移除血液中的白细胞。此方法虽然可以去除多数白细胞，方便后续的检测，但也会造成循环肿瘤细胞的丢失或状态变化。

对收集到的有核细胞固定与穿膜处理方法：

加入1mL预冷的PBSi缓冲液(1×PBS+0.05U/μL RNA酶抑制剂)重悬细胞。将细胞悬液收集于15mL离心管中。取3mL预冷的1.33％的甲醛溶液(1×PBS配制)加入到1mL细胞悬液中，固定10min，随后加入160μL 5％Triton X-100通透细胞3min。

本方法通过对体液中有核细胞的固定，可以增加细胞内部RNA分子与蛋白的稳定性。穿膜处理在于方便后续逆转录与核酸延伸的反应体系进入细胞进行原位反应，保证后续核酸编码的过程的进行。同时，通过优化固定与穿膜条件，确保细胞内的RNA与cDNA分子不会穿出细胞。

细胞内逆转录：将固定和穿膜后的细胞分别加入到若干条PCR多联管中，每孔均含有特异性逆转录引物：包括GSS+ID1+G_R序列，然后进行逆转录。

PCR多联管组数可以是3个或3个以上，取决于预期的循环肿瘤细胞数量，比较常用的有24孔PCR反应管。

ID1是指每管特异性的识别序列，由2个或2个以上的核酸组成，通过排列组合成16种或16种以上的唯一序列，对应每个含有细胞的管。

逆转录引物的序列组成包括：基因特异性序列(GSS,Gene Specific Sequence)+反应管识别序列1(ID1)+连接序列(linker1)，其中linker1的作用主要是与第二轮编码ID2序列互补配对，方便序列延伸反应。

逆转录引物序列中GSS是基因特异性序列，用来锚定特异性标志物mRNA分子，ID1为特异性编码序列，G_R(General Reverse Primer)为通用反向扩增序列，GSS长度可以是2个或更长的序列，可以为跨内含子序列，也可以是连续序列(要考虑基因组DNA的影响)，可以针对检测基因任一区域，可以后接polydT序列构成锚定序列，对于多数RNA进行逆转录。

优选地，对1种或多种上皮和/或肿瘤特异标志物编码基因转录产物进行针对性逆转录，主要是考虑体液中存在各种类型的稀有细胞，循环肿瘤细胞也会多种形态存在，或者性质发生改变，对多种标志物基因转录产物进行同时逆转录可以方便后续的细胞类型的鉴定。

优选地，上皮细胞的标志物是指此类细胞所特有的标志性蛋白，可以是细胞膜表面蛋白、胞浆内蛋白、细胞核内蛋白。包括：EpCAM、CK8、CK18和/或CK19，以及上述指标的组合。

优选地，肿瘤特异标志物是各种肿瘤细胞特有的标志性蛋白，可以是细胞膜表面蛋白、胞浆内蛋白、细胞核内蛋白，甚至是突变蛋白。

各种肿瘤指的是，乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、胃癌、脑癌、胰腺癌等常见恶性肿瘤。

细胞内延伸反应：将完成逆转录的细胞收集后再次加入到PCR八联管中，每孔均含12μM不同编码链(GSS+ID2+G_F)，加入Taq酶混合物进行延伸反应。

其中GSS是能够特异性识别cDNA分子下游的序列，ID2是指每管特异性的识别序列，由2个或2个以上的核酸组成，通过排列组合成16种或16种以上的唯一序列，对应每个含有细胞的孔。

G_F(General Forward primer)指的是通用上游引物，用于标志物逆转录cDNA分子的扩增。

优选地，延伸引物3’末端连接生物素标记的磁珠，方便后期PCR产物纯化的自动化。

延伸反应可以采用Klenow片段、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶I(E.coli)、Bsu DNA聚合酶大片段、Taq DNA聚合酶与其它各种形式的DNA聚合酶。

优选地，本发明采用Taq DNA聚合酶进行延伸反应。

细胞内延伸用编码链序列包括GSS+ID2+G_F，通常延伸引物方法也可以采用连接反应、PCR扩增等方式连接到逆转录后的cDNA分子上。其中连接反应可以是平端或粘端连接，也可以是PCR产物后的连接反应。

细胞裂解：收集所有上述反应体系并入15ml离心管，然后于4℃，1000g离心5min，去上清。然后加入4mL清洗液(4mL 1×PBS,40μL 10％Triton X-100)，于4℃，1000g离心5min，去上清，50μL PBS洗一遍。加入蛋白酶K溶液(20mg/mL)，55℃孵育2h同时振荡，逆转甲醛的交联作用。

优选地，细胞裂解试剂采用Triton X-100，一般也可以采用其它类型的非离子表面活性剂。

cDNA纯化：准备40μL Dynabeads MyOne Streptavidin C1磁珠(ThermoFisher)，用1×B&W缓冲液(含0.05％Tween-20)清洗3遍，用100μL 2×B&W重悬磁珠。上述细胞裂解液中加入100μL磁珠重悬液，室温放置60min以便磁珠与cDNA结合。用1×B&W缓冲液清洗磁珠两次，10mM Tris含0.1％Tween-20再清洗一次，每次清洗均温和振荡。

cDNA纯化是指去除其中的蛋白、RNA、各种离子与杂质的过程。市面上有多种适合DNA纯化的技术与试剂盒，均可以采用。优选地，本发明使用磁珠纯化的方式，主要是考虑有利于自动化操作。

PCR：用110μL 2×Kapa HiFi HotStart Master混合物(Kapa Biosystems)，8.8μL10μM基因通用上游引物G_F和通用下游引物G_R与92.4μL水重悬磁珠。PCR反应如下：95℃3min,然后98℃变性20s,65℃退火45s,72℃延伸3min,共10个循环。

考虑到体液中，循环肿瘤细胞是稀有细胞，尤其是血液中，有大量白细胞的干扰，为提高检测灵敏度，考虑对逆转录后的cDNA分子进行预扩增，方便后续高通量测序的进行。

预扩增循环数为2或2以上，本发明优先地使用10-15个循环。

优选地，基因特异性上游引物G_F和通用下游引物G_R的5’端均标记生物素，便于后续的PCR产物的磁珠纯化。

高通量测序：样本使用150个核苷酸试剂盒和双末端测序法进行高通量测序。Read1覆盖特异性标志物基因序列，Read2覆盖ID1+ID2序列。

生物信息分析：首先按照高通量测序的分析常规进行质控分析，删除低质量的序列数据，而后根据检测指标特征序列分析得到不同的CTC类型。

计数上述各类细胞ID1+ID2的组合方式，得到各类细胞的数量。

总体策略见图1与图2。

相对于目前市场上已有的商品化检测方法而言，本方法采用“非富集”的方法，最大程度地减少了循环肿瘤细胞的损失，联合PCR预扩增与高通量测序技术大幅提高了检测的灵敏度，理论上保证了每一个循环细胞都能被检出。同时，联用多种上皮细胞与肿瘤特异性指标通过生物信息学分析可以区分体液中的各种稀有细胞，包括上皮细胞、肿瘤细胞、发生上皮-间充质转换肿瘤细胞、肿瘤干细胞。本发明的方法可以作为金标准，填补本领域缺乏标准方案的空白。

实施例1：健康人外周血掺入肿瘤细胞系的模拟样本的检测分析

本实施例是使用健康人外周血掺入梯度稀释的HepG2细胞，并以此为模拟样本对其进行检测分析，评价本方法检测肿瘤的效率即本方法的回收率性能，具体详述如下：

(1)样本制备

将培养皿中的HepG2细胞消化并制成单细胞悬液，利用红细胞计数板对其计数，使用PBS将其稀释至合适浓度后用吸管小心吸取一定数量的肿瘤细胞，加入抗凝的5ml健康人外周血中，确保数量准确性。

(2)标本收集与预处理

上述人外周血样品中加入缓冲液后离心5-10min去除血浆，然后加入红细胞裂解液于摇床中旋转8-12min，离心5-10min后得到白细胞和肿瘤细胞混合物。

(3)固定细胞

上述样品中加入1mL预冷的PBSi缓冲液(1×PBS+0.05U/μL RNA酶抑制剂)重悬细胞。将细胞悬液收集于15mL离心管中。取3mL预冷的1.33％的甲醛溶液(1×PBS配制)加入到1mL细胞悬液中，固定10min，随后加入160μL 5％Triton X-100通透细胞3min。将细胞于4℃，500g离心3min，弃去上清，加入500μL PBSi缓冲液和500μL预冷的100mM Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲溶液重悬细胞。500g离心3min离心后，300μL预冷PBSi重悬。

(4)细胞内逆转录(基因特异性逆转录，同时引入ID1，进行第一轮核酸编码)

将上述细胞分别加入到若干条(推荐3条)PCR八联管中，每孔均含有特异性逆转录引物RTp(GSS+ID1+linker1)，在每个孔中加入18μL逆转录混合物。将PCR管放入PCR仪中，按照50℃，10min；8℃，12s；15℃，45s；20℃，45s；30℃，30s；42℃，2min；50℃，3min的反应条件循环3次；最后50℃条件下孵育10min。收集反应体系，转移到15mL离心管中，加入9.6μL10％Triton X-100，4℃，500g离心3min，弃上清，加入2mL 1×NEB3.1缓冲液和20μL RNA酶抑制剂重悬细胞。

(5)细胞内延伸(引入ID2，进行第二轮核酸编码)

将前一步得到的细胞再次加入到3条PCR八联管中，每孔均含12μM不同编码链(GSS+ID2+G_F)，加入18μLTaq酶混合物，延伸反应条件为95℃，3min，60℃，1min，72℃，5min。收集反应体系，转移到15ml离心管中。

(6)细胞裂解

收集所有上述反应体系并入15ml离心管，然后于4℃，1000g离心5min，去上清。然和加入4mL清洗液(4mL 1×PBS,40μL 10％Triton X-100)，于4℃，1000g离心5min，去上清，50μL PBS洗一遍。根据检测指标的情况分成若干管。每管加入1×PBS补足体积到50μL,再加入50μL 2×裂解液(20mM Tris(pH 8.0),400mM NaCl,100mM EDTA(pH8.0),4.4％SDS)，10μL蛋白酶K溶液(20mg/mL)，55℃孵育2h同时振荡，逆转甲醛的交联作用，-80℃冷冻保存。

(7)cDNA纯化

将5μL 100μM PMSF加到上述细胞裂解液中，室温孵育10min，以充分抑制蛋白酶K的活性。同时准备40μL Dynabeads MyOne Streptavidin C1磁珠(ThermoFisher)，用1×B&W缓冲液(含0.05％Tween-20)清洗3遍，用100μL 2×B&W重悬磁珠。上述细胞裂解液中加入100μL磁珠重悬液，室温放置60min以便磁珠与cDNA结合。用1×B&W缓冲液清洗磁珠两次，10mM Tris含0.1％Tween-20再清洗一次，每次清洗均温和振荡。

(8)PCR预扩增

用110μL 2×Kapa HiFi HotStart Master混合物(Kapa Biosystems)，8.8μL 10μM基因通用上游引物G_F和通用下游引物G_R与92.4μL水混合。PCR反应如下：95℃3min,然后98℃变性20s,65℃退火45s,72℃延伸3min,共10个循环。

(9)高通量测序

上述扩增产物用标准Illumina建库试剂盒构建测序文库。再用Illumina的MiSeq测序平台进行RNA测序。测序方案为150个核苷酸试剂盒和双末端测序法。Read1覆盖特异性标志物基因序列，Read2覆盖ID1+ID2序列。

(10)生物信息分析

首先对测序得到的序列进行质控分析，删除低质量的序列数据。接着只保留含有ID1与ID2的序列，把这些序列上ID1、ID2、接头序列都去除后，再用HiSat2软件把序列比对到人参考基因组上，计算肿瘤标记基因的表达水平。通过计数ID1+ID2的组合方式，得到循环细胞的数量。再根据这些细胞检测到不同肿瘤标记基因，可对肿瘤细胞进行分型。

对测序结果进行质量检测表明测序质量合格(图3)

本实施例的结果发现，30个以内的肿瘤细胞添加后回收率100％，50个细胞的添加会丢失2个细胞。充分说明，本发明的方法对肿瘤细胞有优异的特异性的回收能力，能够有效去除血细胞的背景干扰，对低细胞数量有可靠的回收率。

实施例2：临床肝癌血标本的CTC检测

(1)样本制备

本组临床诊断肝癌病例共83例，其中获得组织学诊断52例。共采集外周血标本124份。

(2)样本检测

将7.5ml上述血标本轻柔颠倒数次混匀，然后按照实施例1中的步骤检测循环肿瘤细胞数量。我们选择AFP为肝癌特异性标志物，设计引物序列如下：

肝癌AFP

GSS_F序列(3'-5')：CCGTCGTAAAGAGGTTGTCC(SEQ ID NO:1)

GSS_R序列(3'-5')：CGACGAAACCCTCAAATT(SEQ ID NO:2)

ID1(3'-5')：ATCATG(SEQ ID NO:3)

ID2(3'-5')：TCTGAC(SEQ ID NO:4)

G_R(3'-5')：GGCGACTTGGCGCACA(SEQ ID NO:5)

G_F(3'-5')：GGTTACTGGGCTGCCT(SEQ ID NO:6)

(3)检测结果分析

a.肝癌外周血CTCs的检测结果

在所有肝癌患者中CTCs在外周血中的检出率为63.85％(53/83)，检测到CTCs个数0-208，平均1.96个/ml，结果见表1。

表1全部标本CTCs检查情况

b.CTCs在手术前预测转移的价值

患者外周血内发现存在肿瘤细胞，意味着出现转移的几率将增高。但目前在手术前进行CTCs的检测能否准确预测肿瘤的转移是临床所关心的问题。本组内15例因资料不完整无法评价，其余67例根据影像诊断考虑存在远处转移和术后病理证实的存在转移的病例作为研究组，其余病例为对照组。对CTCs预测肿瘤转移的价值进行评价，结果见表2。评价标准包括：灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比、粗符合率和调整一致性等，结果见表3。结果显示，术前检测CTCs对判断肿瘤是否存在转移是准确的；当CTCs数目超过11个/7.5ml时，CTCs预测转移的敏感性、特异性较高，见表4。

表2CTCs对转移预测情况

表3CTCs数目对转移的预测

表4CTCs作为诊断实验的准确性

c.CTCs和病理特点、肿瘤分期之间的关系

肿瘤病理特点和分期是肿瘤辅助治疗和判断预后的基础，因此判断CTCs同两者的关系将对其临床指导意义做出评价。对本组52例获得组织学诊断的肝癌患者依据BCLC分期，并计算各分期的CTCs数目，结果见表5。0期肝癌患者外周血CTCs的检出率50％(1/2)，A期肝癌患者外周血检出率为44.4％(4/9)，B期肝癌患者外周血检出率为75.0％(6/8)，C期肝癌患者外周血检出率为75.7％(25/33)(见表5)。

表5CTCs数目和病理分期的关系

总结肝癌重要的病理特点包括肿瘤大小、门脉癌栓、Child-Pugh、肝硬化和***转移的资料，研究各病理特点和CTCs的关系见表6。统计结果显示肿瘤大小，门脉癌栓、***转移和CTCs具有相关性(P＝0.028、P＝0.006和P＝0.009)，见表6。为判断各因素和CTCs的相关性，应用Logistic回归分析对有可能影响CTCs的因素进行多因素分析，结果见表7。结果显示对CTCs有影响的因素仅包括***转移一项(P＝0.027)。

表6病理因素对CTCs的影响

表7病理因素对CTCs影响的Logistic回归分析

实施例3：发生EMT转化的***癌CTC细胞

研究发现CTCs能够发生上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)行为。EMT使CTCs丢失上皮细胞的表型，获得某些***的表型，表现出更强的变形及运动能力，从而有能力入侵通过周围的基底膜，使细胞失去细胞间黏附性，协助CTCs进入血液***中，这些具有高度活力、高度转移潜能的肿瘤细胞在循环***中存活下来，相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶。研究者认为2.5％的CTCs就可以导致微小转移，最终造成患者癌症复发甚至死亡。但是此类CTC细胞数量极少，较难捕获。

(1)样本制备

本专利共收集150例***患者，每位患者收集10ml血标本。

(2)样本检测

将上述血标本轻柔颠倒数次混匀，然后按照实施例1中的步骤检测循环肿瘤细胞数量。我们选择PSA为肿瘤特异性指标，EpCAM为上皮型标志物，Vimentin为间质型标志物，设计引物序列如下所示。进行高通量测序。

***癌标志物PSA

GSS_F序列(3'-5')：CGTGTACCAAGTGACGGGGT(SEQ ID NO:7)

GSS_R序列(3'-5')：TAGCACCGGTTGGGGACT(SEQ ID NO:8)

ID1(3'-5')：TGAGAC(SEQ ID NO:9)

ID2(3'-5')：TTTTTA(SEQ ID NO:10)

上皮型标志物CK18

GSS_F序列(3'-5')：CTACCAAACGTACCTCAACG(SEQ ID NO:11)

GSS_R序列(3'-5')：TTTCAAGACTCCGTAATT(SEQ ID NO:12)

ID1(3'-5')：CCCTAG(SEQ ID NO:13)

ID2(3'-5')：GCCCCT(SEQ ID NO:14)

上皮型标志物CK19

GSS_F序列(3'-5')：GGACGAGGTCGGCGCTGAAC(SEQ ID NO:15)

GSS_R序列(3'-5')：CGGAGGTTCCAGGAGACT(SEQ ID NO:16)

ID1(3'-5')：TGATAC(SEQ ID NO:17)

ID2(3'-5')：ATAGCT(SEQ ID NO:18)

上皮型标志物EpCAM

GSS_F序列(3'-5')：ACCTTTATTGGTCGTGTTGT(SEQ ID NO:19)

GSS_R序列(3'-5')：TCCCTTGAGTTACGTATT(SEQ ID NO:20)

ID1(3'-5')：CTAATT(SEQ ID NO:21)

ID2(3'-5')：ACTGAG(SEQ ID NO:22)

上皮型标志物KRT20

GSS_F序列(3'-5')：CACCTTCTTTTATAGATT(SEQ ID NO:23)

GSS_R序列(3'-5')：CGTGCAAGAAGTAGTGGATG(SEQ ID NO:24)

ID1(3'-5')：AAAGTC(SEQ ID NO:25)

ID2(3'-5')：TGACAG(SEQ ID NO:26)

上皮型标志物KRT19

GSS_F序列(3'-5')：ACGGAGGTTCCAGGAGAC(SEQ ID NO:27)

GSS_R序列(3'-5')：CTCGAGGGACAGGAAGA(SEQ ID NO:28)

ID1(3'-5')：ACGAGG(SEQ ID NO:29)

ID2(3'-5')：GGTATG(SEQ ID NO:30)

上皮型标志物KRT7

GSS_F序列(3'-5')：TCCTCACGGGCGCTGACT(SEQ ID NO:31)

GSS_R序列(3'-5')：TCCAGCAGTGCGGGTCCTG(SEQ ID NO:32)

ID1(3'-5')：AGCCGA(SEQ ID NO:33)

ID2(3'-5')：ATGCGT(SEQ ID NO:34)

上皮型标志物E-cadherin

GSS_F序列(3'-5')：GAGGGACGGTAAAAAATT(SEQ ID NO:35)

GSS_R序列(3'-5')：ATCTTGGCCTCCCAGAGTAT(SEQ ID NO:36)

ID1(3'-5')：GCTTGG(SEQ ID NO:37)

ID2(3'-5')：CGTTGG(SEQ ID NO:38)

EMT标志物N-cadherin

GSS_F序列(3'-5')：CCACCTCCACTACTGACT(SEQ ID NO:39)

GSS_R序列(3'-5')：AGTGGTGGTGAGCAGGACTATGA(SEQ ID NO:40)ID1(3'-5')：ATTGGC(SEQ ID NO:41)

ID2(3'-5')：GTATTC(SEQ ID NO:42)

EMT标志物vimentin

GSS_F序列(3'-5')：GTGCTACTGGAACTTATT(SEQ ID NO:43)

GSS_R序列(3'-5')：AGATGGACAGGTTATCAACG(SEQ ID NO:44)

ID1(3'-5')：TACATC(SEQ ID NO:45)

ID2(3'-5')：TAGGCG(SEQ ID NO:46)

EMT标志物fibronectin

GSS_F序列(3'-5')：CTTCTAAGGGCTCTCATT(SEQ ID NO:47)

GSS_R序列(3'-5')：AGATGTACAGGCTGACA(SEQ ID NO:48)

ID1(3'-5')：GAGAGC(SEQ ID NO:49)

ID2(3'-5')：AGCGGT(SEQ ID NO:50)

EMT标志物MMP9

GSS_F序列(3'-5')：GTCACGGGACTCCTGATC(SEQ ID NO:51)

GSS_R序列(3'-5')：TACGTGACCTATGACATCCTG(SEQ ID NO:52)

ID1(3'-5')：GCCCCA(SEQ ID NO:53)

ID2(3'-5')：ATTGTC(SEQ ID NO:54)

EMT标志物AKT2

GSS_F序列(3'-5')：CGGTCGTAGGCGCTCACT(SEQ ID NO:55)

GSS_R序列(3'-5')：GGAGCTGGACCAGCGGACCC(SEQ ID NO:56)

ID1(3'-5')：ACTCAG(SEQ ID NO:57)

ID2(3'-5')：ATACAA(SEQ ID NO:58)

(3)检测结果分析

150例***患者，其中94％(141/150)的患者在7.5ml外周血样本中检测到了CTCs，对每个检测出的CTC根据不同类型的标记分为上皮型CTCs(PSA⁺EpCAM⁺Vimentin^-)、间质型CTCs(PSA⁺Vimentin⁺EpCAM^-)和混合型CTCs(PSA⁺EpCAM⁺Vimentin⁺)。

a.TNM分期与外周血CTC亚型分布的关系

通过与患者的临床病理特征进行对比发现，患者的TNM分期不同，其外周血中检测到CTC亚型由上皮型至间质型的分布差异有统计学意义(Z＝39.723，P<0.001，如表8所示)。II期(41.5％)和III期(43.4％)的患者中检测出的间质型CTCs明显高于I期患者(29.0％)。

表8不同TNM分期的患者外周血CTC亚型分布的差异

b.是否包膜侵犯与外周血CTC亚型分布的关系

以肿瘤有无包膜侵犯分为两组，对比两组之间CTC亚型的分布情况，其CTC亚型由上皮型至间质型的分布差异也存在统计学意义(z＝-8.85，P<0.001，如表9所示)。发生包膜侵犯患者外周血中检测出的上皮型CTCs所占的比例小于未发生包膜侵犯的患者(14.5％vs21.4％)，而间质型CTCs所占的比例大于未发生包膜侵犯患者(46.6％VS 30.4％)。

表9肿瘤是否发生包膜侵犯的患者外周血CTC亚型分布的差异

c.病理分级与外周血CTC亚型分布的关系

按照病理分级别有Gx,G1,G2,G3,G4，其CTC亚型由上皮型至间质型的分布情况可见有统计学意义的差异(z＝24.684，P<0.001，如表10示)，随着恶性程度不断增加，患者外周血中间质型CTCs所占的比例逐渐升高。

表10不同病理分级的患者外周血CTC亚型分布的差异

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市第十人民医院

<120> 一种循环肿瘤细胞的检测方法

<130> /

<160> 58

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccgtcgtaaa gaggttgtcc 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgacgaaacc ctcaaatt 18

<210> 3

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atcatg 6

<210> 4

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctgac 6

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggcgacttgg cgcaca 16

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggttactggg ctgcct 16

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgtgtaccaa gtgacggggt 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tagcaccggt tggggact 18

<210> 9

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgagac 6

<210> 10

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttttta 6

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctaccaaacg tacctcaacg 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tttcaagact ccgtaatt 18

<210> 13

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccctag 6

<210> 14

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcccct 6

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggacgaggtc ggcgctgaac 20

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cggaggttcc aggagact 18

<210> 17

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgatac 6

<210> 18

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atagct 6

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

acctttattg gtcgtgttgt 20

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tcccttgagt tacgtatt 18

<210> 21

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ctaatt 6

<210> 22

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

actgag 6

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

caccttcttt tatagatt 18

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cgtgcaagaa gtagtggatg 20

<210> 25

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

aaagtc 6

<210> 26

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tgacag 6

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

acggaggttc caggagac 18

<210> 28

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ctcgagggac aggaaga 17

<210> 29

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

acgagg 6

<210> 30

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ggtatg 6

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tcctcacggg cgctgact 18

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

tccagcagtg cgggtcctg 19

<210> 33

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

agccga 6

<210> 34

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

atgcgt 6

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gagggacggt aaaaaatt 18

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

atcttggcct cccagagtat 20

<210> 37

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

gcttgg 6

<210> 38

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

cgttgg 6

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ccacctccac tactgact 18

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

agtggtggtg agcaggacta tga 23

<210> 41

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

attggc 6

<210> 42

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

gtattc 6

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gtgctactgg aacttatt 18

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

agatggacag gttatcaacg 20

<210> 45

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

tacatc 6

<210> 46

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

taggcg 6

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

cttctaaggg ctctcatt 18

<210> 48

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

agatgtacag gctgaca 17

<210> 49

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

gagagc 6

<210> 50

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

agcggt 6

<210> 51

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

gtcacgggac tcctgatc 18

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

tacgtgacct atgacatcct g 21

<210> 53

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

gcccca 6

<210> 54

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

attgtc 6

<210> 55

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

cggtcgtagg cgctcact 18

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

ggagctggac cagcggaccc 20

<210> 57

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

actcag 6

<210> 58

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

atacaa 6

Claims

1.细胞内逆转录和细胞内延伸反应的试剂在制备用于检测循环肿瘤细胞的试剂盒中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

a .采集人体体液标本；

b .加入红细胞裂解液，收集体液中的有核细胞，对细胞进行固定，并处理细胞增加细胞膜通透性；

c .将细胞均匀分散到一组PCR多联管中，每管中加有携带不同识别序列ID1的逆转录引物GSS+ID1+G_R，逆转录得到cDNA分子，其5’端携带有特异性ID1序列，其中GSS为针对目标基因设计的特异性识别序列，G_R为通用反向扩增序列；

d .收集细胞混合加入另一组PCR多联管中，每管中加有携带不同识别序列ID2的编码链GSS+ID2+G_F，ID2 的3’端能够特异性识别cDNA分子的3’端的延伸引物，通过序列互补后进行延伸反应，延伸引物3’末端连接生物素标记的磁珠，其中GSS为能够特异性识别cDNA分子下游的序列，G_F为通用上游引物；

e .收集合并细胞，裂解细胞，使用Streptavidin 磁珠进行cDNA纯化，10-15个循环PCR预扩增d中延伸产物；

f .收集PCR预扩增产物并纯化；

g .对PCR产物进行高通量测序；

h .分析每个有效分子序列中ID1+ID2的组合方式，对循环肿瘤细胞以及其它非体液稀有细胞的准确数目进行评估。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述体液包括血液、尿液、胸腔积液、腹腔积液、脑脊液、消化液。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤b中固定细胞所用试剂选自戊二醛、甲醛、丙酮、甲醇、乙醇、醋酸、丙烯醛、醋酸铀、铬酸、苦味酸的任一种或其组合。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤b中增加膜通透性的试剂为非离子表面活性剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述非离子表面活性剂为Triton-X 100。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤c和/或步骤d中PCR多联管的数量为3个或3个以上。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤c中ID1包括2个或2个以上的核酸序列，通过排列组合成16种或16种以上的唯一识别序列，对应每个含有细胞的PCR管；步骤d中ID2包括2个或2个以上的核酸序列，通过排列组合成16种或16种以上的唯一识别序列，对应每个含有细胞的PCR管。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤c中ID1序列直接合成在逆转录引物序列上，或通过连接、延伸、互补配对的方式连接到逆转录后的cDNA分子上。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤d中ID2序列通过连接、延伸、互补配对或PCR扩增的方式连接到逆转录后的cDNA分子的互补链上。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤d中的特异性识别的标志物为上皮细胞的标志物、肿瘤特异性的标志物或***标志物。