CN110452693B - 一种绿色荧光碳点及其制备方法、荧光检测探针及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于荧光猝灭检测氟乐灵浓度的绿色荧光碳点，所述绿色荧光碳点呈椭球形，粒径分布在3.2‑6.8nm，所述绿色荧光碳点中C、O、P、N的质量含量分别为61％‑62％、26％‑27％、5.50％‑6％、5％‑5.5％。该绿色荧光碳点，具有优异的稳定性和光学性质，重复性好、灵敏度高，检测结果准确可靠，对氟乐灵具有高选择性，可结合氟乐灵猝灭标准曲线应用于检测环境中氟乐灵除草剂的浓度。本发明还提供该绿色荧光碳点的制备方法、荧光检测探针及其构建方法，以及荧光检测探针用于检测环境样品中所含氟乐灵浓度的应用，操作简单，成本低，反应过程环保，能够排除环境中其他类型除草剂的干扰。
Description
技术领域
本发明属于荧光传感技术领域，尤其涉及一种绿色荧光碳点纳米材料及其制备方法、基于荧光猝灭检测氟乐灵浓度的荧光检测探针及其构建方法，以及采用该荧光检测探针检测环境样品中所含氟乐灵的浓度的应用。
背景技术
氟乐灵，又名2,6-二硝基-N，N-二丙基-4-三氟甲基胺(TRF)，自1963年以来一直用于农业，作为用于各种杂草的出苗前控制的选择性除草剂。TRF是属于二硝基苯胺家族的苯衍生物，在出芽前施用，可以控制一年生草和某些阔叶杂草。TRF可以混合使用也可以单独使用，用于不同的作物培养物中。由于其广泛使用范围和明显的环境流动性，导致TRF成为食品、地下水和地表水的潜在污染物。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，氟乐灵在3类致癌物清单中。
迄今为止，氟乐灵的检测技术的发展主要集中在色谱技术检测，如气相色谱电子捕获检测(GC/ECD)，气相色谱(GC)质谱(MS)，和高效液相色谱(HPLC)与不同的检测。尽管它们具有高灵敏度和特异性，但这些方法成本高，耗时长(需要繁琐的样品预处理)，对于复杂体系内标志物的检测结果不准确，选择性较差，并且对检测人员的专业技能要求较高。因此，开发具有高灵敏度、高选择性、简单快速的氟乐灵测定方法很有必要。
碳存在于所有形式的有机生命中，在纳米材料发展的进程中起着至关重要的作用。从三维石墨，二维石墨烯和氧化石墨烯到一维碳纳米管，碳基纳米材料以其优异的性能和巨大的潜在应用继续激发着科学界的研究兴趣。碳基材料由于其低毒性，良好的生物相容性和化学稳定性等突出优点而受到越来越多的关注。碳量子点是一种碳基零维材料，具有优秀的光学性质，良好的水溶性、低毒性、环境友好、原料来源广、成本低、生物相容性好等诸多优点。碳量子点的应用广泛，在医学成像技术、环境监测、化学分析、催化剂制备、能源开发等许多的领域都有较好的应用前景。然而目前，关于碳点的应用大都是金属离子传感器、细胞成像等生物方向的应用，尚未有利用碳点作为荧光传感器对氟乐灵进行检测的先例。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种具有高灵敏度、高选择性、能够简单快速测定氟乐灵测定浓度的绿色荧光碳点(CQDs)及其制备方法，基于荧光猝灭检测氟乐灵浓度的荧光检测探针及其构建方法，以及采用该荧光检测探针检测环境样品中所含氟乐灵的浓度的应用。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种基于荧光猝灭检测氟乐灵浓度的绿色荧光碳点(CQDs)，所述绿色荧光碳点呈椭球形，粒径分布在3.2-6.8nm，平均粒径在5nm左右(在溶剂中呈现均匀分散的状态)，所述绿色荧光碳点中C、O、P、N的质量含量分别为61％-62％、26％-27％、5.50％-6％、5％-5.5％。
基于一个总的技术构思，本发明还提供一种基于荧光猝灭检测氟乐灵浓度的绿色荧光碳点的制备方法，包括如下步骤：
(1)将圣女果用乙醇清洗后，再用水洗，然后切成小块放入聚-四氟乙烯不锈钢反应釜中进行反应，得到棕褐色液体；
(2)将所述步骤(1)得到的棕褐色液体离心去除沉淀，得到的上清液用0.2μm尼龙膜过滤，然后用500Da的分子量截留量的透析袋透析除去微小杂质，得到含有绿色荧光碳点的深棕色的溶液，冷冻干燥后得到固体绿色荧光碳点。
上述的制备方法，优选的，所述步骤(1)中，反应温度为140-200℃，反应时间为4-10h；更优选的，反应温度为180℃，反应时间为6h。
优选的，所述步骤(2)中，离心转速为8000-10000rpm，离心时间为10-20min，透析时间为24-48h；更优选的，离心转速为10000rpm，离心时间为10min，透析时间为48h。
圣女果中含有丰富的维生素、含有碳水化合物、脂肪、蛋白质和纤维素，这些物质可以提供丰富的碳源，在高温条件下的聚-四氟乙烯不锈钢反应釜中进行缩合、聚合、碳化后进而得到碳点。
基于一个总的技术构思，本发明还提供一种基于荧光猝灭检测氟乐灵浓度的荧光检测探针，包括上述绿色荧光碳点以及氟乐灵猝灭标准曲线，所述氟乐灵猝灭标准曲线由所述绿色荧光碳点与不同浓度的氟乐灵混合后通过荧光强度测定、绘制得到。
基于一个总的技术构思，本发明还提供一种基于荧光猝灭检测氟乐灵浓度的荧光检测探针的构建方法，包括如下步骤：将上述绿色荧光碳点用去离子水稀释后得到绿色荧光碳点溶液，分别与不同浓度的氟乐灵溶液混合得到不同的混合溶液，并检测其荧光强度，当在激发波长340nm激发时，立即在发射波长450nm处记录不同的混合溶液的荧光强度，然后以氟乐灵溶液的不同浓度为横坐标、检测到的荧光强度值为纵坐标，绘制氟乐灵猝灭标准曲线，即完成荧光检测探针的构建。
本发明的绿色荧光碳点溶液与氟乐灵溶液混合后并没有新的紫外吸收峰出现，而且，利用Stern-Volmer方程确定绿色荧光碳点与甲草胺之间的作用机制，发现Ksv随着温度升高而减少，说明碳点与氟乐灵之间的猝灭属于静态猝灭过程，由此可知碳点表面与氟乐灵之间存在静电相互作用，进而可以引起碳点的荧光猝灭。
本发明的绿色荧光碳点具有良好的稳定性，且最佳激发波长和发射波长分别是340nm和450nm，因此选择记录在340nm激发时得到的发射位置为450nm处碳点的荧光强度值。随着氟乐灵浓度的增大，碳点的荧光强度值会随之降低，并且在氟乐灵溶液浓度为0.001～200μmol/L的范围内线性良好，因此，我们通过研究碳点的荧光猝灭程度对氟乐灵进行定量分析。
上述的构建方法，优选的，所述不同的混合溶液中所含氟乐灵的最终浓度分别为0.001μmol/L、0.005μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、100μmol/L、200μmol/L。
优选的，所述绿色荧光碳点溶液的浓度为0.3mg/mL；所述氟乐灵溶液为含氟乐灵的乙醇溶液，所述绿色荧光碳点溶液与氟乐灵溶液的体积比为1︰1。
基于一个总的技术构思，本发明还提供一种上述荧光检测探针的应用，采用所述荧光检测探针检测环境样品中所含氟乐灵的浓度。
上述的应用，优选的，具体检测方法包括如下步骤：将所述荧光检测探针的绿色荧光碳点用无水乙醇稀释后得到绿色荧光碳点溶液，与相同体积的含氟乐灵的待测样品溶液混合，检测其荧光强度得到相应荧光强度值，在所述的氟乐灵猝灭标准曲线中找到该荧光强度值所对应的氟乐灵的浓度，即得含氟乐灵的待测样品的浓度。
优选的，若所述含氟乐灵的待测样品为土样，先将土样用乙醇进行超声溶解，然后用0.2μm的有机相滤头进行过滤，收集滤液，即为含氟乐灵的待测样品溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的绿色荧光碳点，具有优异的稳定性和光学性质，重复性好、灵敏度高，检测结果准确可靠，对氟乐灵具有高选择性，可结合氟乐灵猝灭标准曲线应用于检测环境中氟乐灵除草剂的浓度。
2、本发明绿色荧光碳点的制备方法、荧光检测探针的构建方法以及氟乐灵浓度的检测方法，操作简单，成本低，反应过程环保，能够排除环境中其他类型除草剂的干扰。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明中绿色荧光碳点的合成及其用于检测氟乐灵的简略示意图；
图2是实施例中绿色荧光碳点的FT-IR结果；
图3是实施例中绿色荧光碳点的UV-可见光谱；
图4是实施例中绿色荧光碳点的激发发射光谱；
图5是实施例中绿色荧光碳点的不同激发下碳点的荧光发射光谱；
图6是实施例中绿色荧光碳点的在220～650nm激发波长范围内，发射波长在220～900nm之间碳点的三维荧光光谱图；
图7是实施例中绿色荧光碳点的不同紫外照射时间下的荧光强度变化；
图8是实施例中绿色荧光碳点的TEM图像；
图9是实施例中绿色荧光碳点的尺寸分布结果；
图10是实施例中绿色荧光碳点的EDs谱图分析；
图11是实施例中制得的绿色荧光碳点与不同浓度的氟乐灵(从上到下：0-1mM)混合后的荧光光谱；
图12是实施例中1-(F0-F)/F0对氟乐灵浓度(b)的曲线，其中F0和F分别是不存在和存在氟乐灵(0.001-200μM)时的荧光强度；
图13是实施例中绿色荧光碳点在浓度为1mM的各种除草剂存在下，含绿色荧光碳点溶液(300μg/mL)的荧光强度；
图14是实施例中绿色荧光碳点在氟乐灵(20μM)和其他干扰除草剂(1mM)存在下，绿色荧光碳点水溶液(300μg/mL)的荧光强度(F0-F)的变化。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
一种本发明的绿色荧光碳点，绿色荧光碳点的合成过程如图1所示，绿色荧光碳点其制备方法包括如下步骤：
将圣女果使用乙醇清洗后，再用水洗，然后用刀切小块，称取20g放入聚(四氟乙烯)不锈钢反应釜中，在180℃条件下反应6h，冷却至室温后，得到棕褐色液体，然后以10000rpm离心约10min以除去沉淀物，收集得到的上清液并用0.2μm尼龙膜过滤，然后在室温下用500Da的分子量截留量的透析袋透析约48h，以除去微小杂质，最后，获得含有CQDs的深棕色的溶液，另外，通过在冷冻干燥器中干燥CQDs溶液获得固体CQDs。在使用前，通过将CQDs分别溶解在水中制备5mg/mL CQDs溶液，并在4℃下保存。
本实施例制备得到的绿色荧光碳点的表征如图2-10所示，通过FTIR光谱测定合成的CQDs的表面官能团。如图2所示，观察到3430cm-1和3170cm-1处的吸收带对应于O-H伸缩振动，以及1640cm-1处C＝O的吸收带。上述FTIR结果表明，CQDs在其表面上富含羟基，羰基，从而改善了水性体系中CQDs的亲水性和稳定性。通过UV-Vis吸收光谱和荧光光谱证实了所合成的CQDs的光学性质。如图3所示，CQDs溶液显示出强烈且广泛的吸收，320nm处的紫外吸收峰是由CQDs表面上的C＝O基团的n-π*跃迁产生。从图3的插图中描绘的照片，黄棕色水溶液在(365nm)紫外灯的照射下呈现亮蓝绿色；随着激发波长从300nm增加到440nm，合成后的CQDs的发射波长从420nm红移到530nm(图4)，在最佳激发波长为340nm时，其对应的最大发射峰值为450nm(图5)。CQDs的依赖于激发的荧光行为可能有助于它们的不同尺寸和表面状态。此外，通过三维荧光扫描合成后的CQDs，并且图6中获得的结果显示碳点具有上转换特性。图7是连续紫外灯(365nm)照射10min、20min、30min、40min、50min、60min分别照射以后的碳点的荧光强度，荧光强度没有明显下降，这表明CQDs具有优异的光稳定性。从图8和9中可以看出，合成的CQDs的形状近似椭球形，CQDs的尺寸分布结果表明CQDs的直径分布在3.2-6.8nm，平均直径在5nm左右，在溶剂中成像均匀分散的状态。图10可知，CQDs中C、O、P、N的含量分别为61.60％，26.74％，5.80％和5.19％。
采用上述得到的绿色荧光碳点建立基于荧光猝灭检测氟乐灵浓度的荧光检测探针，其构建方法包括如下步骤：
通过用去离子水稀释5mg/mL的CQDs母液来制备荧光检测探针，以形成0.3mg/mL的溶液，其具有非常强的荧光用于以下实验，为了检测氟乐灵，在10mL离心管中将2.0mL不同浓度的氟乐灵溶液分别加入到2.0mL上述CQDs溶液中，得到不同的混合溶液(其中所含氟乐灵的浓度梯度为0.001μmol/L、0.005μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)，并检测其荧光强度，当在340nm激发时，立即在450nm处记录氟乐灵除草剂猝灭CQDs溶液的荧光强度，即不同的混合溶液的荧光强度(如图11所示)，然后以氟乐灵溶液的不同浓度为横坐标、检测到的荧光强度值为纵坐标，使用光谱测量来绘制氟乐灵的猝灭校准曲线，即完成荧光检测探针的建立。
在反应过程中，氟乐灵会降低CQDs的荧光强度，因此通过研究CQDs的荧光猝灭程度即可实现对氟乐灵的浓度进行分析。通过定量分析可知，检测氟乐灵的线性方程为表1所示：
表1检测氟乐灵的线性方程
其中y为荧光强度；x为氟乐灵的浓度，μmol/L；R2为相对标准偏差，线性范围为0.001～200μmol/L，LOD为检出限，实际样品中氟乐灵的检出限为0.5nmol/L。
采用本实施例制得的荧光检测探针用于环境土样氟乐灵除草剂的检测，检测方法包括如下步骤：
通过用去离子水将CQDs稀释0.3mg/mL，其具有非常强的荧光用于以下实验，为了检测氟乐灵，在10mL离心管中将2.0mL含有氟乐灵除草剂的待测样品溶液加入到2.0mL上述CQDs溶液中，检测其荧光强度得到相应荧光强度值，在所述的氟乐灵猝灭标准曲线中找到该荧光强度值所对应的氟乐灵的浓度，即得含氟乐灵的待测样品的浓度。
为了进一步验证我们的土样中氟乐灵的实际应用情况，分别检测了农田土、学校土样品。在检测之前，首先将土样用乙醇超声溶解10min，然后使用0.2μm的有机相滤头，配合使用5mL的注射器进行过滤，收集滤液备用。土样萃取液中分别加入不同浓度的氟乐灵(5μM、10μM、50μM和100μM)乙醇溶液，并使用本发明的测定法发测定回收率。将混合溶液稳定5min，然后测量其荧光强度。结果清楚地表明，本发明的荧光检测探针有望在未来实现真实样品中的氟乐灵检测。
结果如表2所示。
表2实际样品中氟乐灵的测定结果(n＝3)
结果显示荧光强度随着氟乐灵浓度从0增加到1mmol/L而逐渐降低，在氟乐灵浓度为约1mmol/L时荧光强度几乎完全猝灭，显示混合物的荧光强度对氟乐灵浓度敏感。在0.001-200μmol/L范围内，猝灭效率与氟乐灵浓度呈良好的线性关系，相关系数平方(R2)为0.992，其中F0和F分别为没有和存在氟乐灵时的荧光强度。检测限(根据S/N＝3的信噪比计算)估计为0.5nmol/L。
为测定其他除草剂(包括敌草腈、敌草隆、扑灭通、甲基紫精、氯苯胺灵、扑草净)存在时对氟乐灵与CQDs作用时是否会产生干扰，需要做干扰实验。配置0.02mmol/L的氟乐灵除草剂溶液及1.0mmol/L的其他除草剂溶液，摇匀。用本发明的荧光检测探针进行浓度检测，所有实验均在室温下进行。为了评估CQDs作为实际样品中的传感器，选择环境土样作为真实样品。在进行干扰实验测定时，我们采用的曲线纵坐标为1-(F0-F)/F0，其中F0和F分别是不存在和存在氟乐灵(0.001-200μM)时的荧光强度，如图12所示。
此外，为了评估CQDs的选择性，通过加入1mM潜在干扰除草剂(敌草腈，敌草隆，甲基紫精，氯苯胺灵，西玛津，扑草净和扑灭通)代替氟乐灵到本发明的检测方法来进行。结果表明随着氟乐灵的加入，CQDs的荧光强度显着降低，而其他选择的除草剂具有可忽略不计或非常轻微的猝灭效应，这意味着CQDs对氟乐灵具有高选择性。此外，将20μM氟乐灵和1mM上述除草剂的混合物分别加入到CQDs溶液中，得到的结果显示出氟乐灵的猝灭效应。在存在其他除草剂的情况下，CQDs溶液的荧光强度没有明显的不同，这证实了来自其他共存除草剂的影响可以忽略不计，结果如图13-14所示。由图13可知我们通过加入1mmol/L潜在干扰除草剂(敌草腈，敌草隆，甲基紫精，氯苯胺灵，西玛津，扑草净和扑灭通)代替氟乐灵到同一传感***测试该荧光响应来进行。表明随着氟乐灵的加入，CQDs的荧光强度显着降低，而其他选择的除草剂具有可忽略不计或非常轻微的猝灭效应，这意味着CQDs对氟乐灵具有高选择性。此外，将20μmol/L氟乐灵和1mmol/L上述除草剂的混合物分别加入到CQDs溶液中，得到的结果(图14)显示氟乐灵的猝灭效应。在存在其他除草剂的情况下，CQDs溶液的荧光强度没有明显的不同，这证实了来自其他共存除草剂的影响可以忽略不计。总之，上述结果表明，CQDs氟乐灵具有高度选择性。
在上述实例中，是采用环境土样为研究对象来证实本发明所制备的绿色荧光碳点对氟乐灵除草剂检测的高灵敏度和高选择性。但以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术内容方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种基于荧光猝灭检测氟乐灵浓度的荧光检测探针，其特征在于，包括绿色荧光碳点以及氟乐灵猝灭标准曲线，所述氟乐灵猝灭标准曲线由所述绿色荧光碳点与不同浓度的氟乐灵混合后通过荧光强度测定、绘制得到，所述绿色荧光碳点由圣女果经聚-四氟乙烯不锈钢反应釜进行反应后得到。
2.根据权利要求1所述的基于荧光猝灭检测氟乐灵浓度的荧光检测探针，其特征在于，所述绿色荧光碳点呈椭球形，粒径分布在3.2-6.8 nm，所述绿色荧光碳点中C、O、P、N的质量含量分别为61%-62%、26%-27%、5.50%-6%、5%-5.5%。
3.根据权利要求1所述的基于荧光猝灭检测氟乐灵浓度的荧光检测探针，其特征在于，所述绿色荧光碳点的制备方法包括如下步骤：
（1）将圣女果用乙醇清洗后，再用水洗，然后切成小块放入聚-四氟乙烯不锈钢反应釜中进行反应，得到棕褐色液体；
（2）将步骤（1）得到的棕褐色液体离心去除沉淀，得到的上清液用0.2 μm尼龙膜过滤，然后用500 Da的分子量截留量的透析袋透析除去微小杂质，得到含有绿色荧光碳点的深棕色的溶液，冷冻干燥后得到固体绿色荧光碳点。
4.根据权利要求3所述的基于荧光猝灭检测氟乐灵浓度的荧光检测探针，其特征在于，步骤（1）中，反应温度为140-200℃，反应时间为4-10 h。
5.根据权利要求3所述的基于荧光猝灭检测氟乐灵浓度的荧光检测探针，其特征在于，步骤（2）中，离心转速为8000-10000 rpm，离心时间为10-20 min，透析时间为24-48 h。
6.一种基于荧光猝灭检测氟乐灵浓度的荧光检测探针的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1-5中任一项所述荧光检测探针的绿色荧光碳点用去离子水稀释后得到绿色荧光碳点溶液，分别与不同浓度的氟乐灵溶液混合得到不同的混合溶液，并检测其荧光强度，当在激发波长340 nm激发时，立即在发射波长450 nm处记录不同的混合溶液的荧光强度，然后以氟乐灵溶液的不同浓度为横坐标、检测到的荧光强度值为纵坐标，绘制氟乐灵猝灭标准曲线，即完成荧光检测探针的构建。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述不同的混合溶液中所含氟乐灵的最终浓度分别为0.001 μmol/L、0.005 μmol/L、0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L。
8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述绿色荧光碳点溶液的浓度为0.3mg/mL；所述氟乐灵溶液为含氟乐灵的乙醇溶液，所述绿色荧光碳点溶液与氟乐灵溶液的体积比为1︰1。
9.一种如权利要求1-5中任一项所述或由权利要求6-8中任一项所述构建方法得到的荧光检测探针的应用，其特征在于，采用所述荧光检测探针检测环境样品中所含氟乐灵的浓度。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，具体检测方法包括如下步骤：将所述荧光检测探针的绿色荧光碳点用无水乙醇稀释后得到绿色荧光碳点溶液，与相同体积的含氟乐灵的待测样品溶液混合，检测其荧光强度得到相应荧光强度值，在所述的氟乐灵猝灭标准曲线中找到该荧光强度值所对应的氟乐灵的浓度，即得含氟乐灵的待测样品的浓度。
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