CN110438156A - 重组杆状质粒及其在表达PCV3 Cap蛋白、疫苗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及重组杆状质粒及其在表达PCV3 Cap蛋白、疫苗中的应用。本发明将PCV3 Cap基因正确***杆状病毒载体，构建了pFBD‑P2C质粒，并获得穿梭质粒，通过脂质体转染的方法将穿梭质粒转染SF9昆虫细胞，获得重组杆状病毒，成功地利用昆虫表达***表达了PCV3 Cap蛋白，所表达的蛋白分子质量约23KDa；间接免疫荧光试验和Western Blot结果表明，利用杆状病毒表达***能够正确表达Cap蛋白，且Cap蛋白具有良好的抗原性。

Description

重组杆状质粒及其在表达PCV3 Cap蛋白、疫苗中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及重组杆状质粒及其在表达PCV3 Cap蛋白、疫苗中的应用。
背景技术
猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)为单链环状无囊膜DNA病毒，属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，是迄今为止发现的最小动物病毒之一。在2016年猪圆环病毒3型(porcine circoviurs 3，PCV3)发现之前，PCV分为猪圆环病毒1型(porcine circoviurs 1，PCV1)和猪圆环病毒2型(porcine circoviurs 2，PCV2)两种血清型。PCV1最早于1974年在PK15细胞中被发现；PCV2是引起断奶仔猪多***衰竭综合征(porcine multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原之一，具有较强的致病性。2016年，Palinski等借助宏基因组测序技术从暴发猪皮炎与肾病综合征(porcinedermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)疫情的美国某商品化猪场的患病猪中发现了一种新病毒，根据该病毒的基因组结构和遗传特性将其归类为新型圆环病毒，并命名为PCV3。PCV3基因组结构与PCV相似，为单股环状DNA，全长2000bp，包含3个主要开放阅读框(ORFs)，其中ORF1全长891bp，编码含有296个氨基酸的复制酶(Rep)；ORF2全长645bp编码含有214个氨基酸的衣壳蛋白(Cap)。另外还有一个开放阅读框ORF3全长693bp，编码230个氨基酸组成的蛋白，目前该蛋白功能未知。
自2016年美国首次报道PCV3后，亚洲及美洲等地陆续报道了PCV3。表明这种病毒可能已经在世界范围内传播。根据最近报道，PCV2和PCV3的混合感染在猪身上很常见。此外，有迹象显示，将PCV3与其他病原体(如PRRSV)混合感染可能会增加猪的致病性。在大多数报告中PCV3可能与PDNS、生殖功能衰竭、心脏、猪皮炎与肾病综合征、母猪繁殖障碍、多***炎症、猪呼吸道疾病综合征、仔猪腹泻、仔猪先天性震颤等有关，在不同年龄和不同性别以及无明显临床发病症状的猪中均能检测到PCV3。此外，有报告显示猪只感染PCV3，没有任何明显的临床征状或症状。野猪对PCV3(无临床症状)的易感性也有报道。最近证实，4周龄和8周龄仔猪的PCV3感染可诱发PDNS样疾病的发生。根据对死胎仔猪***、母猪初乳和组织中PCV3的检测，流产胎儿中PCV 3感染是由垂直传播引起的。
PCV3是一种新型的圆环病毒科病毒属病毒，其对养猪业的影响难以估计，但目前对PCV3尚无有效的防控措施。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种重组杆状质粒及其在表达PCV3 Cap蛋白、疫苗中的应用。本发明以PCV3的主要抗原蛋白Cap作为研究对象，通过Bac-to-杆状病毒表达***进行PCV3 Cap基因表达研究，以期为后期PCV3诊断检测和新型疫苗研制奠定基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了重组质粒，包括2个PCV3 Cap基因和杆状病毒表达载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述杆状病毒表达载体为pFastBacTM。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述重组质粒的构建方法，获得PCV3 Cap基因，克隆至pEASY-Blunt载体上，验证正确后将目的基因分别克隆至含有双启动子的杆状病毒表达载体pFastBacTM上，获得含有2个PCV3 Cap基因的重组质粒pFBD-P2C。
此外，本发明还提供了重组杆状质粒，其构建方法为：将所述重组质粒转化宿主感受态细胞，经蓝白斑筛选，获得重组杆状质粒。
重组杆状质粒及其在表达PCV3 Cap蛋白中的应用，所述宿主为大肠杆菌DH10-BacTM。
本发明还提供了所述重组质粒或所述重组杆状质粒在表达PCV3 Cap蛋白中的应用。
此外，本发明还提供了所述重组质粒或如所述重组杆状质粒在制备疫苗或检测试剂盒中的应用。
更进一步研究，本发明还提供了表达PCV3 Cap蛋白的方法，包括如下步骤：
步骤1：获得PCV3 Cap基因，克隆至pEASY-Blunt载体上，验证正确后将目的基因分别克隆至含有双启动子的杆状病毒表达载体pFastBacTM上，获得含有2个PCV3 Cap基因的重组质粒pFBD-P2C；
步骤2：将所述重组质粒转化宿主感受态细胞，经蓝白斑筛选，获得重组杆状质粒Bacmid P2C；
步骤3：将所述重组杆状质粒Bacmid P2C利用脂质体转染至SF9细胞中进行病毒拯救，转染后72h时，收取上清病毒液，盲传三代，收取SF9细胞。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述方法获得的PCV3 Cap蛋白。
将上述研究成果转化，本发明还提供了疫苗或检测试剂盒，包括所述的PCV3 Cap蛋白。
PCV3是一种最新发现的猪圆环病毒，其基因组与PCV1和PCV2的同源性都很低，为了更好地减少PCV3给我国养猪行业带来的损失，本实验研究内容围绕猪圆环病毒Cap蛋白，猪圆环病毒Cap蛋白是重要免疫原性区域，含有多个抗原表位，宿主细胞和病毒的结合与Cap蛋白密切相关[19]。对Cap蛋白进行生物信息学分析以及结构预测，有利于深入了解病毒的特性，为今后PCV3的病毒检测和疫苗研制等提供重要的理论依据。
杆状病毒表达***是一个成熟、高效的真核表达***，其表达产物的生物学活性、结构与功能特点、抗原性和免疫原性等与天然外源基因产物极其相似，而且杆状病毒具有高度的种属特异性，对脊椎动物无感染性，其表达的产物具有较高的生物安全性。本实验通过PCV3基因的扩增得到目的片段后根据Bac-to-杆状病毒表达***表达目的蛋白，并在基因N端***His标签，以便于后期蛋白的表达鉴定。本发明中，使用Bac-to-Bac表达***制备pFBD-P2C蛋白通过双核载体表达PCV3 Cap蛋白经Anti-6xHis-tag抗体检测可清晰看到特异性蛋白与理论值相符，并在间接免疫荧光中可看到特异性荧光，也同时证明了PCV3Cap基因在SF9细胞当中的表达成功，也证明了使用Bac-to-Bac表达***包装PCV3 Cap的可行性。
本发明将PCV3 Cap基因正确***杆状病毒载体，构建了pFBD-P2C质粒，并获得穿梭质粒，通过脂质体转染的方法将穿梭质粒转染SF9昆虫细胞，获得重组杆状病毒，成功地利用昆虫表达***表达了PCV3 Cap蛋白，所表达的蛋白分子质量约23KDa；间接免疫荧光试验和Western Blot结果表明，利用杆状病毒表达***能够正确表达Cap蛋白，且Cap蛋白具有良好的抗原性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示PCV3 Cap基因PCR扩增结果；其中，A：M-DL5000 marker；1-PCV3 Cap1 PCR产物；B：M-DL5000 marker；1-PCV3 Cap2 PCR产物；
图2示重组质粒pEASY-PCV3 Cap酶切鉴定结果；其中，M-DL5000 marker；1-重组质粒；2-重组质粒双酶切；
图3示PCV3 Cap基因分析结果；
图4示重组质粒pFBD-P2C的构建与鉴定结果；其中，图4(A)为质粒pFBD-P2C示意图；图4(B)为酶切鉴定图：M-DL5000 marker；1-重组质粒；2-重组质粒双酶切；3-重组质粒上游双酶切；4-重组质粒pFBD-P2C全长酶切鉴定；
图5示重组穿梭质粒pFBD-P2C的菌液PCR验证；其中，M-DL5000 marker；1-重组穿梭质粒pFBD-P2C的菌液PCR验证(Puc/M13-R，PHF)；2-重组穿梭质粒pFBD-P2C的菌液PCR验证(Puc/M13-F，P10R)；
图6示重组杆状病毒的拯救；其中，A-正常的SF9细胞；B-重组杆状病毒pFBD-PCV3-1-PCV3-2感染SF9细胞48h病变；C-重组杆状病毒pFBD-PCV3-1-PCV3-2感染SF9细胞120h病变；
图7示IFA鉴定Cap蛋白的表达结果，其中，图7(A)示正常SF9细胞未出现特异性荧光；图7(B)、图7(D)示感染重组病毒pFBD-P2C的SF9细胞出现特异性荧光；图7(C)示DAPI染核对照；
图8示重组蛋白pFBD-P2C的鉴定结果；其中，M-Color Prestained ProteinStandard Broad Rang；1-空白对照组；2-重组蛋白pFBD-P2C；
图9示BEI灭活杆状病毒结果；其中，图9(A)示0.5mmol/L BEI灭活杆状病毒；图9(B)示1mmol/L BEI灭活杆状病毒；图9(C)示2mmol/L BEI灭活杆状病毒；图9(D)示3mmol/LBEI灭活杆状病毒；图9(E)示4mmol/L BEI灭活杆状病毒。
具体实施方式
本发明公开了一种重组杆状质粒及其在表达PCV3 Cap蛋白、疫苗中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的重组杆状质粒及其在表达PCV3 Cap蛋白、疫苗中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
材料
含有目的基因PCV3 Cap的质粒由本实验室设计并合成，TransStartFastPfu FlyPolymerase、pEASY-Blunt Simple购自北京全式金生物提供；T4 DNA Ligase，ColorPrestained Protein Standard Broad Range均购自NEB公司；DNA Marker DL5000、Trans5α感受态细胞均购自大连TaKaRa公司；胶回收试剂盒购自BioFluX公司；pFastBacTMDual双载体、EcoRⅠ、NotⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ均购自Thermo Scientific；BSA、PBS、IPTG、X-gal购自索莱宝公司；DH10 Bac感受态大肠杆菌由实验室保存；SF-9细胞由本实验室保存；胎牛血清(FBS)、青-链霉素溶液购自Gibco公司；Anti-6×His tag抗体购自Abcam；DAPI、Western及IP裂解液、山羊抗鼠IgG、FITC标记山羊抗鼠IgG均购自碧云天生物技术公司。
引物设计与合成
参考GenBank中登录的基因序列(MH900466.1)，设计扩增引物(表1)。本研究拟将PCV3 Cap基因分别连接到杆状病毒表达载体的不同启动子下游，根据下游多克隆位点进行引物设计。在扩增引物PCV3-Cap1上游添加EcoRⅠ，下游添加NotⅠ酶切位点，在扩增引物PCV3-Cap2上游添加XhoⅠ，下游添加KpnⅠ酶切位点，通用引物Puc/M13-F与P10R和Puc/M13-R与PHF参考Invitrogen提供的用户手册。引物由吉林省酷美生物科技有限公司合成。
表1本发明所用引物
斜体加下划线为限制性核酸内切酶识别位点。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 PCV3 Cap基因的扩增、克隆及鉴定分析
以含有目的基因PCV3 Cap的质粒为模板，分别用扩增PCV3 Cap基因的两对引物(表1)进行目的基因扩增，反应条件分别为：PCV3-Cap1:95℃5min，95℃30s，60℃40s，72℃30s，72℃5min，4℃∞，35个循环。PCV3-Cap2:95℃5min，95℃30s，65℃25s，72℃30s，72℃5min，4℃∞，35个循环。经1％琼脂糖凝胶电泳分离回收目的片段，克隆至pEASY-Blunt载体上，并转化至Trans5α感受态细胞，涂布于固体LB平板上，37℃，倒置培养12h后，挑取单克隆菌株至液体LB中震荡培养12h，提取质粒命名为pEPC1、pEPC2，分别用EcoRI和NotI、XhoI和KpnI进行双酶酶切鉴定，Sanger测序进一步确认。
使用表1所示引物进行PCV3 Cap基因的扩增，琼脂糖凝胶电泳结果可见约680bp左右的条带(图1A和B)，分别回收后克隆至pEASY-Blunt载体上，构建重组质粒pEASY-PCV3-Cap1、pEASY-PCV3-Cap2，用限制性内切酶NotI和EcoRI、KpnI和XhoI双酶切，可见680bp左右的条带(图2A和B)。进一步DNA序列测定结果显示，与原序列完全一致，表明成功获得目的基因。
目的基因经测序验证正确后，将其与在NCBI上已知的中国国内比较典型的PCV3Cap序列进行基因进化分析(图3)，结果显示，本研究中所使用的PCV3 Cap核苷酸序列与广西分离株(GenBank ID：MH900466.1)比较接近，与北京分离株处于同一进化分支(GenBankID：MG546667.1、MG778698.1、MG7788698.1)。同源性分析显示，PCV3 Cap核苷酸序列与其它分离株的同源性介于98.1％至100％，表明Cap基因核苷酸序列非常保守。
实施例2重组转移质粒的构建与鉴定
将测序正确的pEPC1、pEPC2经过酶切，先后分别连接至pFBD Dual载体上，命名为pFBD-P2C，经常规分子生物学方法提取质粒，分别用EcoRI和NotI与XhoI和KpnI双酶切进行鉴定。
将测序鉴定正确的含有PCV3-Cap1与PCV3-Cap2基因的质粒及表达载体pFBD分别用相应的酶进行酶切，并依次连接到pFBD上，构建含有两个PCV3Cap基因的穿梭质粒pFBD-P2C(如图4A所示)。酶切鉴定结果如图4B所示，质粒pFBD-P2C能够分别切出单个基因片段(图4B，泳道2、3)及含有两个基因的片段(图4A，泳道4)，表明质粒构建成功。DNA序列鉴定也进一步表明目的序列与原序列完全一致。
实施例3重组杆粒Bacmid-P2C的构建与鉴定
将质粒pFBD-P2C转化到DH10BacTM感受态细胞中，并涂布于含有四环素(10μg/mL)、硫酸卡纳霉素(50μg/mL)、庆大霉素(7μg/mL)、IPTG/X-Gal的蓝白斑筛选平板上，37℃倒置培养48h。挑取白色菌落加入SOC培养基中，振荡培养3h，按照表1所示通用引物进行菌液PCR鉴定，将鉴定正确的菌株进行杆粒提取，命名为Bacmid-P2C。
利用表1通用引物对Bacmid-P2C菌液进行PCR验证，结果如图5所示，应用引物Puc/M13-R、PHF进行扩增得到1400bp左右的条带，应用引物Puc/M13-F、P10R进行扩增得到2400bp左右条带，与预期结果一致，表明重组杆粒Bacmid-P2C构建成功。
实施例4重组杆状病毒的拯救
接种SF9细胞至六孔板中，27℃培养12h后，更换完全培养基为1mL双无Grace’s培养基，使用双无Grace’s培养基稀释阳性重组杆粒Bacmid-P2C(3μg)与PEI(4μL)轻轻混匀，静置20min均匀加入6孔板中，27℃静置培养5h，换液为SF-900Ⅱ完全培养基27℃，静置培养5-7天，每天观察细胞状态，待60％细胞出现病变时，收取上清为第一代重组杆状病毒，命名为rBV-P2C，继续盲传三代。
用重组杆粒Bacmid-P2C转染SF9细胞产生P1代毒，转染48h后SF9细胞均出现细胞变圆，体积变大，破裂，细胞数目减少，细胞核明显增大(如图6B)，转染120h后出现典型CPE(如图6C)，表明重组杆状病毒rBV-P2C拯救成功。
实施例5 IFA鉴定PCV3 Cap蛋白的表达
取生长状态良好的SF9细胞均匀铺入六孔板，待细胞长至70％,，接种重组杆状病毒rBV-P2C，每孔10μL。27℃培养48h后弃掉培养基。用4％甲醛固定液固定30min，Trion X-100透化处理10min，10％BSA封闭2h，1:1000稀释Anti-6x His tag一抗孵育2h，1:1000稀释FITC-标记的山羊抗鼠IgG避光孵育1h，1:1000稀释DAPI避光孵育30min，用荧光显微镜观察。每步操作结束均使用PBS清洗三次。
利用His-tag抗体对重组杆状病毒进行IFA检测，结果显示，正常SF9细胞未出现特异性荧光(图7A)，而感染重组病毒rBV-P2C的SF9细胞出现特异性荧光(图7B、7D)，表明外源Cap基因在杆状病毒中成功表达。
实施例6 Western Blot验证PCV3 Cap蛋白的表达
低速离心收集感染rBV-P2C的SF9细胞，使用适量的Western裂解液裂解并进行超声破碎，12000rpm离心2min。收取上清制备蛋白样品。通过蛋白电泳SDS-PAGE，转印至NC膜上，以Anti-6×His tag为一抗，山羊抗鼠IgG为二抗，进行WesternBlot鉴定。
利用脂质体转染法，将重组穿梭质粒pFBD-P2C转染至SF9细胞，于27℃温箱培养5-7天，待细胞出现大约60％病变，收取上清，接入铺入长好60％左右SF9细胞的6孔板，盲传三代，待细胞出现大约60％病变收取细胞沉淀进行裂解破碎，SDS-PAGE电泳后，用Anti-6xHis-tag作为一抗进行Western Blot分析，结果如图8所示，可见23kDa的目的蛋白条带，与理论值相符，而对照细胞没有条带，表明PCV3 Cap蛋白成功表达并具有反应原性。
实施例7 BEI灭活杆状病毒及其验证
1.材料
BEA试剂购自Sigma公司；基因组DNA提取试剂盒、2×TaqPCR Mix购自天根有限公司；
2.方法
2.1试剂的配置
0.2mol/L BEI(二乙烯亚胺)的配置：
(1)先配制l0ml lmol/L BEA溶液，取2.05g BEA粉末溶解至8mL灭菌蒸馏水中定容至10ml。
(2)取0.14g NaOH完全溶解至8mL灭菌蒸馏水中。
(3)取2mL 1mol/L BEA溶液到8mL NaOH溶液中，混匀，置于37℃水浴锅1h，每隔15分钟混匀一次。
2.2BEI灭活杆状病毒
将制备验证正确的重组杆状病毒rBV-p2C大量培养后灭活处理，将重组杆状病毒装入6孔板，每孔5mL，分别在每孔加入0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L和4mmol/L的BEI，当BEI浓度为0.5mmol/L与1mmol/L时分别在第6h、12h、18h、24h、30h分别收取重组杆状病毒，当BEI浓度为2mmol/L、3mmol/L与4mmol/L时分别在第1h、2h、3h、4h、5h分别收取重组杆状病毒，每隔3h混匀一次。
2.3DNA提取及PCR验证
应用基因组DNA提取试剂盒提取杆状病毒当中的DNA，并设计通用引物Puc/M13-F、Puc/M13-R进行PCR扩增，以提取的DNA为模板进行扩增，反应体系为20μL：DNA模板1μL、Puc/M13-F：1μL、Puc/M13-R：1μL、2×Taq PCR Mix：10μL、水：7μL。反应条件为：94℃3min、94℃30s、55℃30s、72℃1min、72℃5min。琼脂糖凝胶电泳判断灭活的重组杆状病毒DNA受到破坏，PCR的电泳结果应无目的条带。
表2本实验所用引物
3.结果
在灭活浓度为0.5mmoL/L时，在测试时间点上并未完全灭活重组杆状病毒rBV-P2C；在灭活浓度为1mmoL/L时，18h时重组杆状病毒rBV-PCV3可以完全灭活。在灭活浓度为2mmoL/L时，2h时重组杆状病毒rBV-PCV3就能完全灭活。在灭活浓度为3mmoL/L时，2h时重组杆状病毒rBV-PCV3就完全灭活。在灭活浓度为4mmoL/L时，1h时重组杆状病毒rBV-PCV3就完全灭活。见图9(A)～图9(E)。
因高浓度BEI会在灭活病毒后有残留会影响免疫效果，后续实验仍需用Na2SO3对BEI进行终止，引入了其他盐类，所以后续实验我们综合浓度与时间因素，采取低浓度灭活病毒，选择在灭活浓度为1mmoL/L时，18h时灭活重组杆状病毒rBV-PCV3。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 申请人
<120> 重组杆状质粒及其在表达PCV3 Cap蛋白、疫苗中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcatgc atcaccatca c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcggccgcct agagaacgga c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcgagatgc atcaccatca c 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtaccctag agaacggac 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccagtcacg acgttgtaaa acg 23
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggaccttta attcaaccc 19
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttcataccgt cccaccat 18
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agcggataac aatttcacac agg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccagtcacg acgttgtaaa acg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agcggataac aatttcacac agg 23

Claims (10)

1.重组质粒，其特征在于，包括2个PCV3 Cap基因和杆状病毒表达载体。
2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述杆状病毒表达载体为pFastBacTM。
3.如权利要求1或2所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，获得PCV3 Cap基因，克隆至pEASY-Blunt载体上，验证正确后将目的基因分别克隆至含有双启动子的杆状病毒表达载体pFastBacTM上，获得含有2个PCV3 Cap基因的重组质粒pFBD-P2C。
4.重组杆状质粒，其特征在于，其构建方法为：将如权利要求1或2所述的重组质粒转化宿主感受态细胞，经蓝白斑筛选，获得重组杆状质粒。
5.如权利要求4所述的重组杆状质粒，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌DH10-BacTM。
6.如权利要求1或2所述的重组质粒或如权利要求4或5所述的重组杆状质粒在表达PCV3 Cap蛋白中的应用。
7.如权利要求1或2所述的重组质粒或如权利要求4或5所述的重组杆状质粒在制备疫苗或检测试剂盒中的应用。
8.表达PCV3 Cap蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得PCV3 Cap基因，克隆至pEASY-Blunt载体上，验证正确后将目的基因分别克隆至含有双启动子的杆状病毒表达载体pFastBacTM上，获得含有2个PCV3 Cap基因的重组质粒pFBD-P2C；
步骤2：将所述重组质粒转化宿主感受态细胞，经蓝白斑筛选，获得重组杆状质粒Bacmid P2C；
步骤3：将所述重组杆状质粒Bacmid P2C利用脂质体转染至SF9细胞中进行病毒拯救，转染后72h时，收取上清病毒液，盲传三代，收取SF9细胞。
9.如权利要求8所述方法获得的PCV3 Cap蛋白。
10.疫苗或检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求9所述的PCV3 Cap蛋白。
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