CN110438076A - T细胞培养基及培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种T细胞培养基，其包含无血清培养基，包括麸酰胺酸；介白素‑2，浓度为10‑6000IU/mL；碱性纤维母细胞生长因子，浓度为1‑300pg/mL；转化生长因子‑α，浓度为1‑3000pg/mL；以及趋化因子配体5，浓度为50‑1500pg/mL。并且，本发明提供一种T细胞培养方法，其包含下列步骤：(a)从血液中取得T细胞；以及；(b)将T细胞培养于如前所述的T细胞培养基中。借由如上所述的T细胞培养基及培养方法，可以提高T细胞的增殖率，同时可以提高具有增殖活性T细胞以及免疫功能活化T细胞的比例并减少T细胞发生细胞凋亡的状况。

Description

T细胞培养基及培养方法
技术领域
本发明关于一种T细胞培养基及培养方法，尤其是一种能提高T细胞的增殖率，同时可以提高具由增殖活性T细胞以及免疫功能活化T细胞的比例并减少T细胞发生细胞凋亡的状况的T细胞培养基及培养方法。
背景技术
T细胞为淋巴细胞的一种，其来自于人体骨髓的造血干细胞(Hematopoietic stemcells,HSC)，T细胞由胸腺迁移到胸腺内而分化成熟，T细胞在胸腺内分化成熟后进一步移居到淋巴组织中。T细胞还可进一步分为毒杀型T细胞(Cytotoxic T cell)及辅助型T细胞(Helper T cell)、调节型T细胞(Regulatory T cell)以及记忆型T细胞(Memory T cell)，各类T细胞皆在人体免疫反应中扮演重要角色。因此，近年来T细胞常被用于进行有关于免疫***的实验研究或是相关范畴的应用，然而，当要以T细胞进行实验研究或是将T细胞应用于其他范畴时，都需要增殖出足够的T细胞，如何有效提高T细胞的增殖率，即为一项有待解决的问题。
发明内容
本发明的目的即针对上述问题，提供一种T细胞培养基，其包含无血清培养基，包括麸酰胺酸；介白素-2，浓度为10-6000IU/mL；碱性纤维母细胞生长因子，浓度为1-300pg/mL；转化生长因子-α，浓度为1-3000pg/mL；以及趋化因子配体5，浓度为50-1500pg/mL。
如上所述的T细胞培养基，所述碱性纤维母细胞生长因子的浓度为40pg/mL。
如上所述的T细胞培养基，所述转化生长因子-α的浓度为400pg/mL。
如上所述的T细胞培养基，所述趋化因子配体5的浓度为1000pg/mL。
如上所述的T细胞培养基，还包含抗-CD3抗体，其浓度为10-100ng/mL。
如上所述的T细胞培养基，还包含唑来膦酸，其浓度为1μM-20μM。
如上所述的T细胞培养基，还包含半乳糖苷基神经酰胺，其浓度为20-200ng/mL。
为达上述目的及其他目的，本发明提供一种T细胞培养方法，其包含下列步骤：(a)从血液中取得T细胞；以及；(b)将T细胞培养于如上所述的T细胞培养基中。
如上所述的方法，在步骤(a)中，从血液中分离出外周血液单核细胞，并将外周血液单核细胞培养于促T细胞增殖培养基中，使外周血液单核细胞中的T细胞增殖，所述促T细胞增殖培养基为无血清培养基并包括麸酰胺酸以及介白素-2。
借由如上所述的T细胞培养基及培养方法，可以提高T细胞的增殖率，同时可以提高具增殖活性T细胞以及免疫功能活化T细胞的比例并减少T细胞发生细胞凋亡的状况。
附图说明
图1为本发明实施例1的T细胞增殖培养实验的实验结果图；
图2为本发明实施例1的具有增殖活性T细胞比例分析中对照组样本的前方散射光(forward scatter,FSC)/侧方散射光(side scatter,SSC)散点图；
图3为本发明实施例1的具有增殖活性T细胞比例分析中实验组样本的FSC/SSC散点图；
图4为本发明实施例1的具有增殖活性T细胞比例分析中对照组样本的CD3+/Ki67+细胞表面标记散点图；
图5为本发明实施例1的具有增殖活性T细胞比例分析中实验组样本的CD3+/Ki67+细胞表面标记散点图；
图6为本发明实施例1的具有增殖活性T细胞比例分析的结果图；
图7为本发明实施例1的T细胞凋亡比例分析中实验组样本的Annexin V/PI标记散点图；
图8为本发明实施例1的T细胞凋亡比例分析中对照组样本的Annexin V/PI标记散点图；
图9为本发明实施例1的T细胞凋亡比例分析的结果图；
图10为实施例1的免疫功能活化T细胞比例分析中对照组样本的CD3+/CD69+细胞表面标记散点图；
图11为本发明实施例1的免疫功能活化T细胞比例分析中实验组样本的CD3+/CD69+细胞表面标记散点图；
图12为本发明实施例1的免疫功能活化T细胞比例分析的结果图；
图13为本发明实施例2的T细胞增殖培养实验的实验结果图；以及
图14为本发明实施例3的T细胞增殖培养实验的实验结果图。
具体实施方式
为充分了解本发明的目的、特征及功效，借由下述具体的实施例，并配合所附的图式，对本发明做详细说明，说明如下：
实施例1的T细胞培养基的制备：
在本实施例1中，是以液体无血清培养基AIM-V(Thermo,Co.)(内含有左旋谷氨酰胺(L-Glutamine))作为T细胞培养基的基底，并分别加入浓度为3000IU/mL的介白素-2(interleukin-2,IL2)、浓度为50ng/mL的抗-CD3(anti-CD3)抗体、浓度为40pg/mL的碱性纤维母细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)、浓度为400pg/mL的转化生长因子-α(Transforming growth factor-α,TGF-α)以及浓度为1000pg/mL的趋化因子配体5(Chemokine ligand 5,CCL5)，即可得到T细胞培养基。
上述的T细胞培养基成分及各个T细胞培养基成分的浓度仅为本发明的一实施例，但在其他实施例中，使用者可视实验条件或应用需求来调整配方成分及配方浓度。
例如，T细胞培养基中的无血清培养基可以其他含有麸酰胺酸的无血清培养基(麸酰胺酸的浓度范围可视细胞培养需求而任意调整)取代，例如：X-VIVO15、Cellgro SCGM等无血清培养基。
在其他实施例中，IL2的浓度范围可为10-6000IU/mL，IL2的浓度范围优选可为10-50IU/mL(参考文献PNAS 2016Nov 1；113(44):12520-12525中所说明的IL2浓度而设定)；IL2的浓度范围优选可为100-400IU/mL(参考文献J Urol.2001Jul；166(1):299-303.中所说明的IL2浓度而设定)；IL2的浓度优选可为300IU/mL(参考文献J Immunother.2010Oct；33(8):759-768.中所说明的IL2浓度而设定)；IL2的浓度优选可为6000IU/mL(参考文献Anticancer Res.2011Dec；31(12):4099-4109.中所说明的IL2浓度而设定)。
在其他实施例中，anti-CD3抗体的浓度范围可为10-100ng/mL，bFGF的浓度范围可为1-300pg/mL。bFGF的浓度范围是参考文献Jpn J Cancer Res.2002Apr；93(4):459-466.中所说明的人类血清的bFGF浓度而设定。TGF-α的浓度范围可为1-3000pg/mL，TGF-α的浓度范围是参考文献Int J Gynecol Cancer.2012Sep；22(7):1138-1142.中所说明的人类血清的TGF-α浓度而设定。CCL5的浓度范围可为50-1500pg/mL，CCL5的浓度范围是参考文献Bio-suspension array system tech note 6029中所说明的人类血清的CCL5的浓度而设定。
此外，在其他实施例中，T细胞培养基可以包含含有麸酰胺酸的无血清培养基、IL2、bFGF、TGF-α及CCL5，而不包含anti-CD3，不以本实施例1为限。
实施例1的T细胞增殖培养实验：
首先，准备血液样本，以聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)密度梯度离心纯化法从血液样本中分离出外周血液单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，外周血液单核细胞中含有T细胞，同时，血液中的T细胞中大多数都是αβT细胞。当外周血液单核细胞培养于含有IL2、anti-CD3抗体及谷氨酰胺且为无血清培养基的促T细胞增殖培养基时，会特别促使外周血液单核细胞中的αβT细胞增殖，使得细胞液中的αβT细胞占据大部分比例。亦即，通过将外周血液单核细胞培养于含有IL2、anti-CD3抗体及谷氨酰胺的促T细胞增殖培养基中，经过一段时间的细胞增殖或是进行细胞继代培养，最终即可取得αβT细胞，在本实施例1中，通过上述方式取得αβT细胞。但在其他实施例中，亦可以其他方法或组从血液样本中取得出αβT细胞，例如，利用磁性细胞分离法(magnetic cell separation)从血液样本中分离出αβT细胞，而不以本实施例1为限。此外，促T细胞增殖培养基可视所欲增殖的T细胞类型来调整促T细胞增殖培养基的配方，只要使所欲增殖的T细胞类型能够增殖即可，而不以本实施例1中的促T细胞增殖培养基成分为限。例如，用于培养γδT细胞的促T细胞增殖培养基的成分中含有唑来膦酸(Zoledronic acid)，但不含有anti-CD3抗体。
接着，准备6个T-175细胞培养瓶，其中3个细胞培养瓶内分别加入20ml如前所述的T细胞培养基，以作为实验组。另外3个细胞培养瓶加入20ml的对照组T细胞培养基，对照组的T细胞培养基与实验组的T细胞培养基的成分大致相同，唯一差别在于，对照组的T细胞培养基内不含bFGF、TGF-α及CCL5这三种配方。随后，在每个细胞培养瓶中加入以前述方式取得的αβT细胞，每个细胞培养瓶中的细胞个数为1x108个，并将上述的6个细胞培养瓶放入细胞培养箱中，在37℃、二氧化碳浓度5％的条件下进行培养。每隔2-3天从各个细胞培养瓶中取细胞液样本进行细胞计数，并依据实验组样本及对照组样本中的细胞增殖情形，将实验组及对照组中的细胞液样本换置到容量较大的细胞培养瓶中，再将新鲜的实验组T细胞培养基及新鲜的对照组T细胞培养基分别加入实验组及对照组的T细胞培养瓶中，借此使各个细胞培养液样本中的细胞浓度维持于1-5x106cells/ml的范围内，实验组样本及对照组样本皆同时连续培养14天。
图1显示实施例1的T细胞增殖培养实验的实验结果。由图1可见，实验组样本与对照组样本中的αβT细胞数量皆随着时间而增加，并且，在培养到第7天后，实验组样本的αβT细胞数量相较对照组样本的αβT细胞数量大幅增长，因此，由实施例1的T细胞增殖培养实验结果可知，T细胞培养基中的IL2及anti-CD3抗体皆有助于αβT细胞的增殖，而bFGF、TGF-α及CCL5的配方组合还可大幅提高αβT细胞的增殖率。
上述T细胞增殖培养实验中的细胞培养条件仅为本发明的一实施例，但在其他实施例中，实验组及对照组中的无血清培养基成分及实验组的T细胞培养基中的IL2、anti-CD3抗体、bFGF、TGF-α及CCL5的浓度范围可视实验条件及应用需求而依前述的浓度范围调整，不以本实施例1为限。
在本实施例1中，是以一般的细胞培养方法及条件来培养T细胞，但在其他实施例中，亦可在不同细胞培养条件下以生物反应器(magnetic cell separation)培养T细胞，或是使用封闭***(closed system)细胞培养方法来培养T细胞，例如，以一次性生物反应器(single-use bioreactor,SUB)培养T细胞，而不以本实施例1的细胞培养方法为限。
实施例1的具增殖活性T细胞比例分析：
依前述实施1的T细胞增殖培养实验中的T细胞培养方法分别培养3个实验组T细胞样本及3个对照组T细胞样本，将实验组T细胞样本及对照组T细胞样本培养14天后，分别从实验组的细胞液样本及对照组的细胞液样本中取出分析样本放入流式细胞仪中，侦测具有增殖活性T细胞表面上的分子标记CD3及Ki67。
参照图2及图3，图2为对照组样本的前方散射光(forward scatter,FSC)/侧方散射光(side scatter,SSC)散点图，图3为实验组样本的FSC/SSC散点图，实验组样本及对照组样本的FSC/SSC散点图中虚线框所圈选的较为集中的细胞群体即为T细胞。
参照图4及图5，图4为对照组样本的T细胞群体的CD3+/Ki67+细胞表面标记散点图，图5为实验组样本的T细胞群体的CD3+/Ki67+细胞表面标记散点图，在图4及图5中，同时呈现细胞表面标记CD3及细胞表面标记Ki67的T细胞即为具增殖活性的T细胞，经由图4及图5的比较可以看到，实验组样本中的具有增殖活性T细胞的数量明显多于对照组样本中的具有增殖活性T细胞的数量。
图6为显示实验组样本及对照组样本中的具有增殖活性T细胞的比例分析图，由图6中可见，实验组样本中具有增殖活性的T细胞占所有T细胞的比例约为75％，对照组样本中具有增殖活性的T细胞占所有T细胞的比例约为58％。因此，由具有增殖活性T细胞的比例分析结果可知，T细胞培养基中的bFGF、TGF-α及CCL5配方组合有助于提高具增殖活性T细胞的比例。
实施例1的T细胞凋亡比例(apoptosis)分析：
依前述实施例1的T细胞增殖培养实验中的T细胞培养方法分别培养3个实验组T细胞样本及3个对照组T细胞样本，将实验组T细胞样本及对照组T细胞样本同时连续培养14天后，分别从实验组的细胞液样本及对照组的细胞液样本中取出分析样本，并将分析样本以膜联蛋白-萤光素组合物(Annexin V-FITC)及碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)进行染色，实验组的细胞液样本及对照组的细胞液样本经Annexin V及PI染色标记后放入流式细胞仪中进行分析，凋亡T细胞可经由Annexin V及PI的染色标记而被流式细胞仪侦测到。
参见图7及图8，图7显示实验组样本的T细胞Annexin V/PI标记散点图，图8显示对照组样本的T细胞Annexin V/PI标记散点图，在图7及图8中，方框中呈现Annexin V/PI标记的T细胞即为凋亡的T细胞，经由图7及图8的比较可以看到，实验组样本中的凋亡T细胞数量明显少于对照组样本中的凋亡T细胞数量。
图9为显示实验组样本及对照组样本中的凋亡T细胞比例图，由图9中可见，实验组样本中的凋亡T细胞占所有T细胞的比例约为9％，对照组样本中的凋亡T细胞占所有T细胞的比例约为20％。因此，由T细胞凋亡比例分析结果可知，T细胞培养基中的bFGF、TGF-α及CCL5配方组合有助于减少T细胞发生细胞凋亡的状况。
实施例1的免疫功能活化T细胞比例分析：
依前述实施1的T细胞增殖培养实验中的T细胞培养方法分别培养3个实验组T细胞样本及3个对照组T细胞样本，将实验组T细胞样本及对照组T细胞样本培养14天后，分别从实验组的细胞液样本及对照组的细胞液样本中取出分析样本放入流式细胞仪中，侦测免疫功能活化的T细胞其表面上的分子标记CD3及CD69。
参照图10及图11，图10为对照组样本的T细胞群体的CD3+/CD69+细胞表面标记散点图，图11为实验组样本的T细胞群体的CD3+/CD69+细胞表面标记散点图，在图10及图11中，同时呈现细胞表面标记CD3及细胞表面标记CD69的T细胞即为免疫功能被活化的T细胞，经由图10及图11的比较可以看到，实验组样本中免疫功能被活化的T细胞数量多于对照组样本中免疫功能被活化的T细胞数量。
图12为显示实验组样本及对照组样本中免疫功能被活化的T细胞比例分析图，由图12中可见，实验组样本中免疫功能被活化的T细胞占所有T细胞的比例约为17％，对照组样本中免疫功能被活化的T细胞占所有T细胞的比例约为11％。因此，由活化T细胞比例分析结果可知，T细胞培养基中的bFGF、TGF-α及CCL5配方组合有助于提高免疫功能被活化的T细胞的比例。
实施例2的T细胞培养基的制备：
本实施例2的T细胞培养基用于培养γδT细胞，本实施例2的T细胞培养基与实施例1的T细胞培养基的制备方式及成分大致相同，唯一差别在于，本实施例2的T细胞培养基中的IL2浓度为1000IU/mL，且不含有anti-CD3抗体，本实施例2的T细胞培养基并另外加入5μM的唑来膦酸(Zoledronic acid)。在其他实施例中，唑来膦酸的浓度范围可为1μM-20μM。
实施例2的T细胞增殖培养实验：
首先，通过类似上述实施例1中的αβT细胞取得方式，将外周血液单核细胞培养在本实施例2的T细胞培养基中，可促使外周血液单核细胞中的γδT细胞大量增殖，经过一段时间的细胞增殖或是进行细胞继代培养，最终即可取得γδT细胞。接着，准备6个T-175细胞培养瓶，其中3个细胞培养瓶内分别加入10ml实施例2的T细胞培养基，以作为实验组。另外3个细胞培养瓶加入10ml的对照组T细胞培养基，对照组的T细胞培养基与实验组的T细胞培养基的成分大致相同，唯一差别在于，对照组的T细胞培养基内不含bFGF、TGF-α及CCL5这三种配方。随后，在每个细胞培养瓶中加入以前述方式取得的γδT细胞，每个细胞培养瓶中的细胞个数为1x107个，并将上述的6个细胞培养瓶放入细胞培养箱中，在37℃、二氧化碳浓度5％的条件下进行培养。每隔3-4天从各个细胞培养瓶中取细胞液样本进行细胞计数，并依据实验组样本及对照组样本中的细胞增殖情形，将实验组及对照组中的细胞液样本换置到容量较大的细胞培养瓶中，再将新鲜的实验组T细胞培养基及新鲜的对照组T细胞培养基分别加入实验组及对照组的T细胞培养瓶中，借此使各个细胞培养液样本中的细胞浓度维持于1-2x106cells/ml的范围内，实验组样本及对照组样本皆同时连续培养16天。
图13显示实施例2的T细胞增殖培养实验的实验结果。由图13可见，实验组样本与对照组样本中的γδT细胞数量皆随着时间而增加，并且，在培养到第9天后，实验组样本的γδT细胞数量相较对照组样本的γδT细胞数量大幅增长，因此，由实施例2的T细胞增殖培养实验结果可知，T细胞培养基中的IL2及唑来膦酸皆有助于γδT细胞的增殖，而bFGF、TGF-α及CCL5的配方组合还可大幅提高γδT细胞的增殖率。
实施例3的T细胞培养基的制备：
本实施例3的T细胞培养基是用于培养自然杀手T细胞(Natural killer T cell,NKT cell)，本实施例3的T细胞培养基与实施例1的αβT细胞培养基的制备方式及成分大致相同，唯一差别在于，本实施例3的T细胞培养基中的IL2浓度为200IU/mL，且不含有anti-CD3抗体，本实施例3的T细胞培养基并另外加入100ng/mL的半乳糖苷基神经酰胺(α-GalactosylCeramide,α-GalCer)。在其他实施例中，α-GalCer的浓度范围可为20-200ng/mL。
实施例3的T细胞增殖培养实验：
首先，准备血液样本，以Ficoll-Hypaque密度梯度离心纯化法从血液样本中分离出外周血液单核细胞，并利用anti-iNKT微珠(anti-iNKT microbeads)组从外周血液单核细胞中分离取得TCRα-chain Vα24-Jα18NKT细胞。
接着，准备6个T-175细胞培养瓶，其中3个细胞培养瓶内分别加入10ml实施例3的T细胞培养基，以作为实验组。另外3个细胞培养瓶加入10ml的对照组T细胞培养基，对照组的T细胞培养基与实验组的T细胞培养基的成分大致相同，唯一差别在于，对照组的T细胞培养基内不含bFGF、TGF-α及CCL5这三种配方。随后，在每个细胞培养瓶中加入以前述方式取得的NKT细胞，每个细胞培养瓶中的细胞个数为1x106个，并将上述的6个细胞培养瓶放入细胞培养箱中，在37℃、二氧化碳浓度5％的条件下进行培养。每隔3-4天从各个细胞培养瓶中取细胞液样本进行细胞计数，并依据实验组样本及对照组样本中的细胞增殖情形，将实验组及对照组中的细胞液样本换置到容量较大的细胞培养瓶中，再将新鲜的实验组T细胞培养基及新鲜的对照组T细胞培养基分别加入实验组及对照组的T细胞培养瓶中，借此使各个细胞培养液样本中的细胞浓度维持于1-2x106cells/ml的范围内，实验组样本及对照组样本皆同时连续培养9天。
图14显示实施例3的T细胞增殖培养实验的实验结果。由图14可见，实验组样本与对照组样本中的NKT细胞数量皆随着时间而增加，并且，从第0天开始，实验组样本的NKT细胞数量相较对照组样本的NKT细胞数量大幅增长，因此，由实施例3的T细胞增殖培养实验结果可知，T细胞培养基中的IL2及α-GalCer皆有助于NKT细胞的增殖，而bFGF、TGF-α及CCL5的配方组合更可大幅提高NKT细胞的增殖率。
上述实施例中的T细胞培养基及利用所述T细胞培养基来培养T细胞的T细胞培养方法借由bFGF、TGF-α及CCL5的配方组合，可大幅提高T细胞的增殖率，同时，bFGF、TGF-α及CCL5的配方组合还能够提高具增殖活性T细胞以及免疫功能活化T细胞的比例并减少T细胞发生细胞凋亡的状况。此外，在上述实施例的T细胞培养基中，IL2有助于提高各类T细胞的增殖率，anti-CD3抗体有助于提高αβT细胞的增殖率，唑来膦酸有助于提高γδT细胞的增殖率，α-GalCer有助于提高NKT细胞的增殖率。
本发明在上文中已以优选实施例说明，然而本领域普通技术人员应理解的是，所述实施例仅用于描绘本发明，而不应解读为限制本发明的范围。应注意的是，举凡与所述实施例等效的变化与置换，均应设为涵盖于本发明的范畴内。因此，本发明的保护范围当以所附权利要求所界定的范围为准。

Claims (10)

1.一种T细胞培养基，其特征在于，所述T细胞培养基包含：
无血清培养基，所述无血清培养基包括麸酰胺酸；
介白素-2，浓度为10-6000IU/mL；
碱性纤维母细胞生长因子，浓度为1-300pg/mL；
转化生长因子-α，浓度为1-3000pg/mL；及
趋化因子配体5，浓度为50-1500pg/mL。
2.根据权利要求1所述的T细胞培养基，其特征在于，所述碱性纤维母细胞生长因子的浓度为40pg/mL。
3.根据权利要求1所述的T细胞培养基，其特征在于，所述转化生长因子-α的浓度为400pg/mL。
4.根据权利要求1所述的T细胞培养基，其特征在于，所述趋化因子配体5的浓度为1000pg/mL。
5.根据权利要求2所述的T细胞培养基，其特征在于，所述转化生长因子-α的浓度为400pg/mL，所述趋化因子配体5的浓度为1000pg/mL。
6.根据权利要求5所述的T细胞培养基，其特征在于，还包含抗-CD3抗体，其浓度为10-100ng/mL。
7.根据权利要求5所述的T细胞培养基，其特征在于，还包含唑来膦酸，其浓度为1μM-20μM。
8.根据权利要求5所述的T细胞培养基，其特征在于，还包含半乳糖苷基神经酰胺，其浓度为20-200ng/mL。
9.一种T细胞培养方法，其特征在于，所述方法包含下列步骤：
(a)从血液中取得T细胞；以及
(b)将T细胞培养于根据权利要求1-8中任一项所述的T细胞培养基中。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，从血液中分离出外周血液单核细胞，并将外周血液单核细胞培养于促T细胞增殖培养基中，使外周血液单核细胞中的T细胞增殖，所述促T细胞增殖培养基为无血清培养基并包括麸酰胺酸以及介白素-2。
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