CN110430889B

CN110430889B - 降低c-myc蛋白质水平并减慢癌细胞生长的大环肽

Info

Publication number: CN110430889B
Application number: CN201880019278.XA
Authority: CN
Inventors: J·奥德里奇; A·穆霍帕迪亚; L·E·哈诺德
Original assignee: University of Kansas; University of Florida Research Foundation Inc
Current assignee: University of Kansas; University of Florida Research Foundation Inc
Priority date: 2017-01-20
Filing date: 2018-01-20
Publication date: 2023-09-19
Anticipated expiration: 2038-01-20
Also published as: US20190388499A1; CN110430889A; ES2924903T3; US11510964B2; WO2018136843A1; EP3570863A1; US20210308210A1; EP3570863B1; EP3570863A4

Abstract

本技术提供用于治疗***癌和乳腺癌的方法和药物。此类方法包括向患有***癌或乳腺癌的受试者施用环[Phe‑D‑Pro‑Phe‑Trp]和环[Phe‑D‑Pro‑Phe‑D‑Trp]中的至少一种。

Description

降低C-MYC蛋白质水平并减慢癌细胞生长的大环肽

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年1月20日提交的美国临时专利申请号62/448,823的权益，所述美国临时专利申请号的全部公开内容出于任何和所有目的以引用方式并入本文。

美国政府许可权利

本发明是在由国防部(Department of Defense)拨款的的基金号W81XWH-14-1-0330的政府支持下完成的。政府拥有本发明中的某些权利。

技术领域

本技术总体涉及用于治疗***癌和乳腺癌的方法和药物。

发明内容

在一个方面，提供一种方法，其中所述方法包括向患有***癌或乳腺癌的受试者施用环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种。在本文的任何实施方案中，该方法可包括向受试者施用有效量的环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种。

在一个相关方面，本技术提供环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种，所述环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种用于治疗受试者的***癌或乳腺癌的药物中。所述药物可包含有效量的环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种。

附图说明

图1A-1D示出在工作实施例中评估对c-Myc的作用的肽结构，其中，图1A提供大环四肽环[Phe-D-Pro-Phe-Trp](“CJ-15,208”)的结构；图1B提供大环四肽环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp](“[D-Trp]CJ-15,208”)的结构；图1C示出强啡肽A-(1-13)；并且图1D示出zyklophin。

图1E示出根据工作实施例，用0.5％DMSO(泳道1)、1μM强啡肽(泳道2)、10μMzyklophin(泳道3)、50μM CJ-15,208(泳道4)和50μM[D-Trp]CJ-15,208(泳道5)处理的细胞c-Myc的蛋白质印迹分析。

图1F示出根据工作实施例，在用10μM纳洛酮(naloxone)和/或10μM[D-Trp]CJ-15,208处理后PC-3细胞中c-Myc蛋白质水平的蛋白质印迹(western blot)分析。

图2A和图2B示出根据工作实施例的蛋白质印迹分析，显示分别用0μM、5μM、10μM和20μM的CJ-15,208和[D-Trp]CJ15,208处理PC-3细胞48h后的c-Myc蛋白质水平，其中图2A提供CJ-15,208的蛋白质印迹分析，并且图2B提供[D-Trp]CJ-15,208的蛋白质印迹分析以及数据的直方图。

图2C提供曲线图，示出根据工作实施例，在用CJ-15,208和[D-Trp]CJ-15,208处理48h后使用WST-1进行细胞增殖评定的结果。

图2D提供图表，显示根据工作实施例，在用10μM[D-Trp]CJ-15,208处理0-48h后PC-3细胞中的c-Myc mRNA表达。

图3A-3G绘示根据工作实施例，来自用[D-Trp]CJ-15,208处理48h或72h之后的***癌细胞系(PC-3、LNCaP、DU145、22Rv1和C4-2)、正常BPH-1***细胞和非***HEK细胞的细胞增殖数据的曲线。

图3H示出PC-3、LNCaP、DU145、22Rv1、C4-2、BPH-1和HEK细胞中c-Myc蛋白质水平的蛋白质印迹分析。

图4A-4D提供图表，示出根据工作实施例，用[D-Trp]CJ-15,208处理48h或72h后***癌细胞和正常***细胞中的细胞毒性，其中图4A提供来自PC-3细胞的数据，图4B提供来自LNCaP细胞的数据，图4C提供来自22Rv1细胞的数据，并且图4D提供来自BPH-1细胞的数据。

图5A示出根据工作实施例，在用10μM[D-Trp]CJ-15,208处理PC-3细胞24h和48h后的细胞周期阶段分布，其中图5B提供图表，示出根据工作实施例，每个细胞周期阶段中的％细胞群。

图6A示出根据工作实施例的流式细胞术分析，显示用[D-Trp]CJ-15,208处理48h后PC-3的凋亡程度，并且图6B绘示根据工作实施例，早期和晚期凋亡中的％细胞群。

图7A示出流式细胞术分析，显示用[D-Trp]CJ-15,208处理48h后非靶向siRNA或c-Myc siRINA处理的PC-3细胞的凋亡程度，图7B示出PC-3细胞中早期和晚期凋亡中的％细胞群，并且图7C提供蛋白质印迹分析，显示根据工作实施例，通过c-Myc siRNA进行的c-Myc敲低。

图8A示出流式细胞术分析，以显示用[D-Trp]CJ-15,208处理48h后含有载体对照质粒或HA-HA-c-Myc质粒的HEK-293细胞的的凋亡程度，图8B绘示早期和晚期凋亡中的％细胞群，并且图8C示出蛋白质印迹分析，显示含有HA-HA-c-Myc质粒的HEK-293细胞中的c-Myc转染。

图9A和图9B示出正常细胞(图9A)和癌细胞(图9B)中的c-Myc磷酸化和降解途径。

图10A-10C绘制并提供蛋白质印迹分析，示出根据工作实施例，在用[D-Trp]CJ-15,208处理48h后的关键蛋白质水平(Erk、Akt和PP2A)，其中图10A显示PC-3细胞中的p-Erk/总Erk蛋白质水平，图10B显示PC-3细胞中的p-Akt/总Akt蛋白质水平，并且图10C显示PC-3细胞中的p-PP2A/总PP2A蛋白质水平。

图10D示出用[D-Trp]CJ-15,208处理PC-3细胞的效果。

图11提供用[D-Trp]CJ-15,208或媒介物(50％DMSO、45％PEG 400和5％聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)处理后小鼠异种移植模型中随时间推移的肿瘤生长的图。

具体实施方式

贯穿全文使用如下定义的以下术语。

如本文和所附权利要求中所用，除非本文另外指明或者上下文明显矛盾，否则在描述要素的背景下(尤其在下文权利要求书的背景下)，单数冠词诸如“一(a和an)”和“所述”以及类似指示物应当理解为涵盖单数与复数二者。除非本文另外指明，否则本文叙述的值的范围仅仅意在作为个别地表示此范围内的每一单独值的简化方法，并且每一单独值都被并入本说明书中，就如同其在本文中被个别地叙述一样。除非本文另有指明或上下文明显矛盾，否则，本文所描述的所有方法都可按任何合适的顺序进行。除非另有叙述，否则本文提供的任何和所有示例、或例示性用语(例如，“诸如”)的使用仅意在更好地说明实施方案，而不是对权利要求的范围构成限制。说明书中的任何用语都不应被解释为表示任何不要求保护的要素是必不可少的。

如本文所用，“约”将为本领域普通技术人员所理解，并且在某种程度上将取决于使用其的上下文而变化。如果该术语的使用对于本领域普通技术人员来说是不清楚的，则考虑到使用其的上下文，“约”将意味着特定术语的至多加或减10％。

通常，提及诸如氢或H的某种元素意味着包括该元素的所有同位素。例如，如果R基团被定义为包括氢或H，则其还包括氘和氚。因此，包含诸如氚、C¹⁴、P³²和S³⁵的放射性同位素的化合物在本技术的范围内。基于本文的公开内容，将此类标签***本技术的化合物中的程序对于本领域技术人员来说将是显而易见的。

如本领域技术人员应理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还涵盖所述范围的任何和所有可能的子范围和子范围组合。任何列出的范围都可以被容易地识别为充分描述并使相同的范围被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本文论述的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中间三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还应理解的，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”的所有用语包括所引用的数字并且是指可以随后分解为如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员应理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个原子的基团是指具有1、2或3个原子的基团。类似地，具有1-5个原子的基团是指具有1个、2个、3个、4个或5个原子等等的基团。

本文所述化合物的药学上可接受的盐在本技术的范围内，并且包括保留所需药理活性并且并非是在生物学上不希望的酸加成盐或碱加成盐(例如，所述盐不是过度毒性的、过敏性的或刺激性的，并且是生物可利用的)。当本技术的化合物具有诸如氨基的碱性基团时，可以与无机酸(诸如盐酸、氢溴酸(hydroboric acid)、硝酸、硫酸和磷酸)、有机酸(诸如藻酸盐、甲酸、乙酸、苯甲酸、葡糖酸、富马酸、草酸、酒石酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、萘磺酸和对甲苯磺酸)或酸性氨基酸(诸如天冬氨酸和谷氨酸)形成药学上可接受的盐。当本技术的化合物具有诸如羧酸基团的酸性基团时，其可以与诸如碱金属和碱土金属的金属(例如，Na⁺、Li⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺)、氨或有机胺(例如二环己胺、三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺)或碱性氨基酸(例如，精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸)形成盐。这些盐可以在化合物的分离和纯化期间原位制备，或者通过以下方式来单独制备：分别使纯化的化合物以其游离碱形式或游离酸形式与合适的酸或碱反应，并分离由此形成的盐。

本领域技术人员将理解，本技术的化合物可以表现出互变异构现象、构象异构现象、几何异构现象和/或立体异构现象。由于说明书和权利要求书中的式图仅可表示可能的互变异构、构象异构、立体化学或几何异构形式中的一种，所以应理解本技术涵盖具有本文所述用途中的一种或多种用途的化合物的任何互变异构、构象异构、立体化学和/或几何异构形式，以及这些各种不同形式的混合物。

“互变异构体”是指彼此平衡的化合物异构形式。异构形式的存在和浓度将取决于发现化合物的环境，并且可以取决于例如化合物是固体还是在有机溶液或水溶液中而不同。例如，在水溶液中，喹唑啉酮可以表现出以下异构形式，所述以下异构形式被称为彼此的互变异构体：

作为另一示例，胍在质子有机溶液中可以表现出以下异构形式，所述以下异构形式也被称为彼此的互变异构体：

由于通过结构式来表示化合物的限制，应理解本文所述化合物的所有化学式代表化合物的所有互变异构形式并且在本技术的范围内。

除非明确指出特定的立体化学，否则化合物的立体异构体(也称为光学异构体)包括结构的所有手性、非对映异构和外消旋形式。因此，如从描述中显而易见的，本技术中使用的化合物包括在任何或所有不对称原子处富集或拆分的光学异构体。可以分离或合成外消旋和非对映异构体混合物以及单独的光学异构体，以便基本上不含它们的对映体配偶体或非对映体配偶体，并且这些立体异构体都在本技术的范围内。

本技术的化合物可以作为溶剂化物，尤其是水合物存在。水合物可能在化合物或包含所述化合物的组合物的制造期间形成，或者水合物可能由于化合物的吸湿性而随时间推移形成。本技术的化合物也可以作为有机溶剂化物存在，包括DMF溶剂化物、醚溶剂化物和醇溶剂化物等。任何特定溶剂化物的鉴定和制备都在合成有机化学或药物化学领域的普通技术人员的技能范围内。

贯穿本公开，各种出版物、专利和公开的专利说明书通过标识引用来引用。在本公开中还有指代引用的引用文献的***数字，所述引用文献的著录细节紧接权利要求书之前提供。这些出版物、专利和公开的专利说明书的公开内容以引用方式并入到本公开中，以更全面地描述本发明所属领域的现有技术状态。

本技术

诸如雄激素剥夺疗法或施加雄激素受体拮抗剂的当前疗法最初有效治疗***癌(PC)，但该疾病通常会由于对这些治疗无反应而复发转移^1-3。这些疗法分别降低雄激素睾酮和二氢睾酮的水平或干扰雄激素配体与雄激素受体(AR)的结合⁴，但是尽管施加了这些治疗该疾病通常还是进展，其中AR通常被表达为截短或突变形式⁵。虽然雄激素剥夺/AR拮抗剂治疗后癌症进展的机制尚不完全清楚，但可能的解释包括：i)AR基因扩增，ii)AR的组成型激活，iii)AR突变或截短，iv)由生长因子激活AR，和/或v)通过替代的雄激素非依赖性信号传导途径激活AR^5,6。

癌蛋白c-Myc是在大多数癌症类型中过表达的转录因子^5,7-10。它积聚并通过磷酸化而稳定为磷酸-Ser62-c-Myc^11-13。c-Myc在雄激素受体阳性和雄激素受体阴性的配体非依赖性去势抵抗性***癌中上调^5,14-16，并且最近的研究表明雄激素受体以雄激素非依赖性方式直接调节c-Myc蛋白质水平^5,14,17。

c-Myc在30-50％的高级乳腺癌肿瘤中过表达，并且据报道乳腺癌进展中有c-Myc的激活。有证据表明，c-Myc过表达有助于在***受体(ER)阳性肿瘤中发展出对激素治疗的抗性。与表达ER或HER2的肿瘤相比，三阴性乳腺癌(TNBC)中的c-Myc表达也升高，并且TNBC中的c-Myc过表达与不良预后相关。

本技术提供使用环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种来治疗***癌和乳腺癌的方法和药物。如本文所提供的，这两种大环肽(也称为“本技术化合物”)令人惊讶地在几种癌细胞系中诱导出细胞毒性且降低c-Myc蛋白质水平，证明了它们作为用于***癌和乳腺癌的治疗的可行性。

因此，在一个方面，提供一种方法，其中该方法包括向患有***癌或乳腺癌的受试者施用环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐。在本文的任何实施方案中，该方法可包括向受试者施用有效量的环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐。在本文的任何实施方案中，可能的是***癌表现出的c-Myc水平显著高于正常***细胞中的c-Myc水平。本文任何实施方案的***癌可包含在PC-3细胞系、LNCaP细胞系、22Rv1细胞系、DU145细胞系或这些细胞系中的任何两种或更多种的组合中发现的至少一种致癌突变(也称为“***癌包括PC-3细胞系、LNCaP细胞系、22Rv1细胞系、DU145细胞系，或这些细胞系中的任何两种或更多种的组合”)。本文任何实施方案的***癌均可包含在PC-3细胞系、LNCaP细胞系、22Rv1细胞系、DU145细胞系、或这些细胞系中的任何两种或更多种的组合中发现的致癌突变的至少约25％、至少约50％、至少约75％、或约100％。在本文的任何实施方案中，可能的是乳腺癌表现出的c-Myc水平显著高于正常乳腺细胞中c-Myc水平。本文任何实施方案的乳腺癌可包括三阴性乳腺癌。本文任何实施方案的乳腺癌可包含在BT-20细胞系、MDA-MB-468细胞系、MDA-MB-231细胞系、MCF-7细胞系、SKBR-3细胞系、BT-474细胞系、或这些细胞系中的任何两种或更多种的组合中发现的至少一种致癌突变。本文任何实施方案的乳腺癌可包含在BT-20细胞系、MDA-MB-468细胞系、MDA-MB-231细胞系、MCF-7细胞系、SKBR-3细胞系、BT-474细胞系、或这些细胞系中的任何两种或更多种的组合中发现的致癌突变的至少约25％、至少约50％、至少约75％、或约100％。施用环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐可以一天多次、约一天两次、一天一次、约一周五次、约一周四次、约一周三次、约一周两次、约一周一次、约一月两次，或者以包括这些值和/或介于这些值中的任两者之间的任何范围发生。

本文任何实施方案的方法可包括施用组合物，其中所述组合物包含环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种(或其药学上可接受的盐)和药学上可接受的载体；本文任何实施方案的方法可包括施用包含环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种(或其药学上可接受的盐)的药物。

因此，本技术还提供组合物(例如，药物组合物)和药物，所述组合物和药物包含环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种(或其药学上可接受的盐)和药学上可接受的载体(诸如一种或多种赋形剂或填充剂)。所述组合物可用于本文所述的方法和治疗中。药物组合物可包含有效量的环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种(或其药学上可接受的盐)。在本文的任何实施方案中，可以关于受试者来确定有效量。“有效量”是指产生所需效果所需的化合物或组合物的量。有效量的一个非限制性示例包括产生对于治疗(药物)用途来说可接受的毒性和生物利用度水平的量或剂量，所述治疗(药物)用途包括但不限于治疗***癌或乳腺癌。有效量的另一个示例包括产生对于治疗(药物)用途来说可接受的毒性和生物利用度水平的量或剂量，所述治疗(药物)用途包括但不限于***癌或乳腺癌。有效量的另一个示例包括能够减轻与***癌或乳腺癌相关的症状的量或剂量，减轻与***癌或乳腺癌相关的症状为例如减少癌症的增殖和/或转移。有效量可以是每克组合物约0.01μg至约100mg化合物，优选每克组合物约0.1μg至约500μg化合物。如本文所用，“受试者”或“患者”是哺乳动物，诸如猫、狗、啮齿动物或灵长类动物。通常，受试者是人，并且优选地是患有或怀疑患有***癌或乳腺癌的人。术语“受试者”和“患者”可互换使用。

在本文所述的本技术的任何实施方案中，药物组合物可以以单位剂型包装。单位剂型可有效治疗***癌或乳腺癌。通常，包含环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种(或其药学上可接受的盐)的单位剂量将取决于患者考虑因素而变化。此类考虑因素包括例如年龄、方案、状况、性别、疾病程度、禁忌症、伴随疗法等。基于这些考虑因素的示例性单位剂量也可由本领域医师调整或修改。例如，用于患者的包含环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种(或其药学上可接受的盐)的单位剂量的范围可为1×10^-4g/kg到1g/kg，优选1×10^-3g/kg到1.0g/kg。本技术化合物的剂量的范围也可以为0.01mg/kg至100mg/kg，或优选0.1mg/kg至10mg/kg。例如，剂量可以是每千克受试者约1mg至约150mg的环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种；在本技术方法的任何方法实施方案中，该方法可包括向受试者施用约1mg/kg至约150mg/kg的环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种。因此，环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种的剂量/施用可以是约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约12mg/kg、约14mg/kg、约16mg/kg、约18mg/kg、约20mg/kg、约22mg/kg、约24mg/kg、约26mg/kg、约28mg/kg、约30mg/kg、约32mg/kg、约34mg/kg、约36mg/kg、约38mg/kg、约40mg/kg、约42mg/kg、约44mg/kg、约46mg/kg、约48mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、约100mg/kg、约110mg/kg、约120mg/kg、约130mg/kg、约140mg/kg、约150mg/kg，或包括这些值的任两者之间的任何范围和/或介于这些值中的任两者之间的任何范围。

合适的单位剂型包括但不限于粉末剂、片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂、栓剂、贴剂、鼻喷雾剂、注射剂、植入式缓释制剂、粘膜粘着膜(rnucoadherent film)、局部涂剂、脂质复合物等。例如，在本技术的任何实施方案中，环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种可以包含在液体制剂(诸如可注射制剂、静脉内制剂、皮下制剂和/或口服液体制剂)中，所述液体制剂包含约0.1mg/mL(即，每1mL液体制剂0.1mg化合物)到约50mg/mL的环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种。因此，液体制剂可以包含约0.1mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.6mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约0.9mg/mL、约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约12mg/mL、约14mg/mL、约16mg/mL、约18mg/mL、约20mg/mL、约22mg/mL、约24mg/mL、约26mg/mL、约28mg/mL、约30mg/mL、约32mg/mL、约34mg/mL、约36mg/mL、约38mg/mL、约40mg/mL、约42mg/mL、约44mg/mL、约46mg/mL、约48mg/mL、约50mg/mL，或包括这些值中的任两者的任何范围和/或介于这些值中的任两者之间的任何范围的环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种。

药物组合物可以通过将环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种、其药学上可接受的盐、其互变异构体或其溶剂化物与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、粘合剂、稀释剂等混合来制备，以预防和治疗与***癌和/或乳腺癌相关的病症。环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp](或其药学上可接受的盐)可用于制备治疗***癌和/或乳腺癌的制剂和药物。此类组合物可以是例如颗粒剂、粉末剂、片剂、胶囊剂、糖浆剂、栓剂、注射剂、乳剂、酏剂、混悬剂或溶液剂的形式。本组合物可以经配制用于各种施用途径，例如通过口服、肠胃外、局部、直肠、经鼻、***施用，或经由植入储库(reservoir)。肠胃外或全身施用包括但不限于皮下注射、静脉内注射、腹膜内注射和肌内注射。以下剂型是以举例方式给出的，不应解释为限制本发明的技术。

对于口服、经颊和舌下施用，粉末剂、混悬剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、明胶胶囊(gelcap)和囊片(caplet)可作为固体剂型使用。这些剂型可以例如通过将环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐或互变异构体与至少一种添加剂(诸如淀粉或其他添加剂)混合来制备。合适的添加剂是蔗糖、乳糖、纤维素糖、甘露醇、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、藻酸盐、几丁质、壳聚糖、果胶、黄蓍胶、***树胶、明胶、胶原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物或甘油酯。任选地，口服剂型可含有其他有助于施用的成分，诸如无活性稀释剂、或润滑剂(诸如硬脂酸镁)、或防腐剂(诸如对羟基苯甲酸酯或山梨酸)、或抗氧化剂(诸如抗坏血酸、生育酚或半胱氨酸)、崩解剂、粘合剂、增稠剂、缓冲剂、甜味剂、调味剂或芳香剂。片剂和丸剂可以用本领域已知的合适的包衣材料进一步处理。

用于口服施用的液体剂型可以是药学上可接受的乳剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂和溶液剂的形式，所述形式可以含有无活性的稀释剂，诸如水。药物制剂和药物可以使用无菌液体制备成液体混悬剂或溶液剂，所述无菌液体为诸如但不限于油、水、醇以及这些的组合。可以添加药学上合适的表面活性剂、悬浮剂和/或乳化剂以用于口服或肠胃外施用。

如上所述，混悬剂可包含油。此类油包括但不限于花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄榄油。混悬剂制备物还可含有脂肪酸酯，诸如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、脂肪酸甘油酯和乙酰化脂肪酸甘油酯。悬浮剂制剂可包含醇，诸如但不限于乙醇、异丙醇、鲸蜡醇、甘油和丙二醇。醚类，诸如但不限于聚(乙二醇)、石油烃类(诸如矿物油和凡士林)；和水，也可用于悬浮剂制剂中。

可注射剂型通常包括含水混悬剂或油混悬剂，所述水混悬剂或油混悬剂可使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂制备。可注射形式可以为溶液相或混悬剂形式，所述溶液相或混悬剂形式是用溶剂或稀释剂制备的。可接受的溶剂或媒介物包括无菌水、林格氏溶液(Ringer's solution)或等渗盐水溶液。无菌油可用作溶剂或悬浮剂。通常，油或脂肪酸是非挥发性的，包括天然或合成的油、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯。

对于注射，药物制剂和/或药物可以是适于用如上所述的适当溶液重构的粉末。这些的示例包括但不限于冻干、旋转干燥或喷雾干燥的粉末、无定形粉末、颗粒、沉淀物或微粒。对于注射，制剂可任选地含有稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂，以及这些中的任何两种或更多种的组合。载体和稳定剂可以改变，并且可以包括非离子表面活性剂(吐温(Tween)、普郎尼克(Pluronic)或聚乙二醇)、无害蛋白质(诸如血清白蛋白)、脱水山梨糖醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸(诸如甘氨酸)、缓冲剂、盐、糖或糖醇中的一种或多种。例如，在本文公开的本技术的任何实施方案中，药学上可接受的载体可包括以下中的一种或多种：聚乙二醇、聚乙二醇脂肪酸单酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单酯或这些中的任何两种或更多种的组合。

本技术的化合物可通过经鼻或口吸入而施用到肺部。用于吸入的合适药物制剂包括溶液、喷雾剂、干粉剂，或含有任何适当溶剂和任选其他化合物的气溶胶，所述任选其他化合物为诸如但不限于稳定剂、抗微生物剂、抗氧化剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂以及这些的组合。载体和稳定剂根据特定化合物的要求而变化，但通常包括非离子表面活性剂(吐温、普郎尼克或聚乙二醇)、无害蛋白质(诸如血清白蛋白)、脱水山梨糖醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸(诸如甘氨酸)、缓冲剂、盐、糖或糖醇中的一种或多种。水性和非水性(例如，在碳氟化合物推进剂中)气溶胶通常用于通过吸入来递送本技术的化合物。

用于局部(包括经颊和舌下)或透皮施用本技术化合物的剂型包括粉末剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂和贴剂。活性组分可以在无菌条件下与药学上可接受的载体或赋形剂以及与可能需要的任何防腐剂或缓冲剂混合。粉末剂和喷雾剂可以例如用赋形剂(诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物)制备。软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂也可含有赋形剂，诸如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、聚硅氧烷、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌，或它们的混合物。吸收促进剂也可用于增大本技术化合物在皮肤上的通量。可以通过提供速率控制膜(例如，作为透皮贴剂的一部分)或将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制该通量的速率。

除了上述那些代表性剂型之外，药学上可接受的赋形剂和载体通常是本领域技术人员已知的，因此包括在本技术中。此类赋形剂和载体描述于例如“RemingtonsPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)”Mack Pub.Co.,New Jersey(1991)中，该文献以引用方式并入本文。

如下所述，本技术的制剂可以设计为短效、快速释放、长效和持续释放。因此，药物制剂也可以经配制用于控释或缓释。

本发明组合物还可以包含例如胶束或脂质体，或一些其他包囊形式，或者可以以延时释放形式施用以提供延长的储存和/或递送效果。因此，药物制剂和药物可以压缩成小丸或圆柱体，并作为贮库注射剂或作为植入物(诸如支架)而肌内或皮下地植入。此类植入物可以采用已知的惰性材料，诸如聚硅氧烷和可生物降解的聚合物。

可取决于受试者的疾病状况、年龄、体重、整体健康状况、性别和饮食、给药间隔、施用途径、***率和药物的组合来调整具体剂量。含有有效量的上述剂型中的任何剂型都在常规实验的范围内，因此完全在本技术的范围内。

可以容易地采用各种测定和模型***来确定根据本技术的治疗的治疗有效性。

对于本文所述的指示病状中的每一种，与安慰剂治疗的或其他合适的对照受试者相比，测试受试者将表现出所述受试者中由所述病症导致的或与所述病症相关的一种或多种症状减少10％、20％、30％、50％或更高，直到减少75-90％、或95％或更高。

在一个方面，提供用于抑制癌细胞的细胞运动的方法。该方法包括使癌细胞与本技术化合物(或其药学上可接受的盐)接触，从而抑制癌细胞的细胞运动。该方法可包括使细胞与有效量的本技术化合物(或其药学上可接受的盐)接触。在该方法中，有效量可以包括例如与不存在本技术化合物和/或其他运动减少化合物情况下的癌细胞的细胞运动相比，有效减少癌细胞的细胞运动的量。例如，有效量可包括与不存在本技术化合物和/或其他运动减少化合物时的癌细胞的细胞运动相比，使癌细胞的细胞运动有效减少至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％的量。该方法可包括抑制癌细胞的转移。癌细胞可包括本文所述任何实施方案的乳腺癌细胞或***癌细胞。接触可以在或可以不在患者体内和/或患者体表上进行。例如，接触可以在体外发生。在该方法的任何实施方案中，接触步骤可包括施用药物组合物，其中所述药物组合物包含有效量的本技术化合物(或其药学上可接受的盐)和药学上可接受的载体。

提供本文的实施例是为了说明本技术的优点，并进一步帮助本领域普通技术人员制备或使用本技术。还呈现了本文的实施例以便更全面地说明本技术的优选方面。这些实施例决不应被解释为限制由所附权利要求限定的本技术的范围。实施例可以包括或结合上述本技术的任何变型、方面或方面。上述变型、实施方案或方面还可以进一步各自包括或结合本技术的任何或所有其他变型、实施方案或方面的变型。

实施例

示例性合成程序和表征

细胞系和细胞培养条件。将人***癌PC-3细胞在EMEM(ATCC)中培养和维持，将非***HEK(人胚肾)细胞在DMEM中培养，将人***癌DU145、LNCaP、22Rv1细胞在RPMI1640(ATCC)中培养，并且将正常BPH-1***细胞和***癌C4-2细胞系在RPMI 1640(ATCC)中培养，所有培养基均含有10％胎牛血清(Atlanta Biologicals)和1％青霉素/链霉素(Invitrogen)。使细胞在37℃下在含有5％CO₂的潮湿空气中生长，并在用胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)进行胰蛋白酶消化后每隔四至五天传代¹⁶。

细胞增殖测定。使PC-3、LNCaP、DU 145、22Rv1、C4-2、BPH-1和HEK细胞在96孔板中生长至2000个细胞/孔的密度，并一式两份地用[D-Trp]CJ-15,208或其他肽处理24-72h。每24h更换含有[D-Trp]CJ-15,208的培养基。按照制造商的说明书使用细胞增殖试剂WST-1(Roche)测定经处理的细胞的增殖，并与在培养基中以1％DMSO处理的对照细胞进行比较。用化合物处理后，将10μL试剂添加到孔中的100μL培养基中，并将细胞在37℃下温育30min。使用酶标仪(BioTek)测量410nm处每个孔中培养基的吸光度。将细胞增殖百分比归一化为媒介物处理的对照细胞，计算为：(样品的平均吸光度/对照细胞的平均吸光度)×100³⁸。

细胞活力测定。按照制造商的说明书使用台盼蓝(Trypan Blue)(Sigma)来测定***癌细胞的活力。使细胞在6孔板中生长至密度为1×10⁵个细胞/孔，至75％融汇，并用在0.5％DMSO中的化合物以指定浓度处理24-72h，使用0.5％DMSO作为媒介物对照。处理后，从每个孔收集细胞培养基。将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，进行胰蛋白酶消化，并收集。将所有细胞、混合培养基和洗涤液以250×g离心5min。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500μL PBS中。将台盼蓝(10μL)添加到100μL重悬的细胞中，并将溶液温育10min。然后使用血细胞计数器对10μL中的细胞数进行计数。活细胞(未染色)与死细胞(着色为蓝色)区分，％活细胞计算如下：[(白细胞数)/(总细胞数(白色+蓝色))]*100，并与之未经处理的细胞比较¹⁶。

蛋白质印迹分析。将细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种在6孔板中，并生长至75％融汇。用[D-Trp]CJ-15,208以指定浓度处理细胞。然后如上所述收获细胞，并将细胞沉淀在由10mM Tris HCl(pH 8.0)、150mM NaCl，1mM EDTA、1％Triton-X-100、0.1％SDS、1％脱氧胆酸钠和蛋白酶抑制剂混合物#P8340(Sigma)组成的RIPA缓冲液中裂解。将细胞裂解物以13×1000rpm离心15min，并收集上清液。使用标准Bradford测定在细胞裂解物中测量总蛋白质浓度。使用4-20％聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)进行SDS凝胶电泳。使用以下抗体进行蛋白质印迹分析：i)c-Myc#5605(兔单克隆，1:2000稀释，(Cell SignalingTechnologies))；肌动蛋白#A2228(小鼠单克隆，1:5000稀释(Sigma))、PP2A#610555(小鼠单克隆，1:5000稀释，BD Biosciences)、p-PP2A#1155-1(兔多克隆，1:5000稀释，(Epitomics))、Erk#9107(小鼠单克隆，1:2000稀释(Cell Signaling Technologies)和p-Erk#4376(兔单克隆，1:2000(Cell Signaling Technologies))；Akt#2920(小鼠单克隆，1:2000稀释(Cell Signaling Technologies))、p-Akt#4056(兔单克隆，1:2000(CellSignaling Technologies))。从Jackson ImmunoResearch Laboratory获得二抗，山羊抗小鼠#116-035-003和山羊抗兔#111-035-003。使用ImageJ软件(NIH)测定蛋白质条带的信号密度，并将其归一化为内部加载对照(肌动蛋白)。

细胞周期分析。使PC-3细胞在T-75烧瓶中生长至75％融汇，并用0.5％DMSO中10μM[D-Trp]CJ-15,208或作为媒介物对照的0.5％DMSO处理24-48h。处理后，收集细胞培养基，将细胞用冰冷的PBS洗涤两次，并用培养基收集洗涤液。然后将细胞用胰蛋白酶消化，并将合并的细胞和培养基以1200rpm离心5min。将细胞沉淀重悬于PBS中，使用血细胞计数器对细胞进行计数，并将1百万个细胞重悬于300μL PBS中。将细胞用700μL冰冷的100％乙醇固定过夜，然后以1200rpm离心。去除乙醇后，将细胞重悬于含有100μg/mL的RNA酶的500μLPBS中，并在室温下温育30min。添加碘化丙啶(PI)溶液(Sigma，100μg/mL)，然后将溶液在室温下在黑暗中温育30min。使用Beckman-Coulter MoFlo XDP流式细胞仪进行细胞周期分析³⁸，并使用FlowJo v10.1分析细胞周期阶段分布。

膜联蛋白V-APC/PI测定。通过根据制造商的方案，使用膜联蛋白V-APC/PI双重染色凋亡检测试剂盒I(BD Biosciences)检测凋亡细胞上磷脂酰丝氨酸的表面表达来分析凋亡程度。在用10μM[D-Trp]CJ-15,208或媒介物处理PC-3细胞24h或48h后，收集细胞，用冷PBS洗涤两次，并以1×10⁶个细胞/mL的浓度重悬于1X结合缓冲液中。将细胞悬浮液(100μL)转移至5ml培养管中，并添加5μL膜联蛋白V-APC和25μL PI(50μg/mL)。将细胞在室温下在黑暗中以温和涡旋温育15min，然后向每个样品中添加400μL的1X结合缓冲液，并在一个小时内使用Beckman-Coulter MoFlo XDP流式细胞仪分析样品。使用FlowJo v10.0.7来对存活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的数目进行定量。凋亡率(％)计算为(凋亡细胞的数目/观察到的总细胞数目)×100％³⁸。

c-Myc mRNA测量。使PC-3细胞在10cm培养皿中生长至75％融汇，然后用[D-Trp]CJ-15,208(10μM)处理2-48h。收获细胞，并按照制造商的说明使用Aurum总RNA微型试剂盒#732-6820(Bio-Rad)来从每个样品中分离总RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计测定样品中的RNA浓度。将来自每个样品的总RNA(1μg)用于使用iScript cDNA合成试剂盒(BioRad)合成cDNA。使用以下热循环，用Power-SYBR Green PCR Master Mix(AppliedBiosystems)来进行实时PCR：在95℃下初始活化5min，然后进行40个循环：95℃，15s和60℃，1min。在产物的熔融温度下测定荧光20s(ABI PRISM 7000Sequence DetectionSystem,Applied Biosystems)。使用以下的引物组来扩增的c-Myc和GAPDH(内部对照)的区域：c-Myc(正向：5'-CTG GTG CTC CAT GAG GAG-3'，反向：5'-AGG TGA TCC AGA CTC TGAC-3')和GAPDH(正向：5'-CCA TGG AGA AGG CTG GGG-3'，反向：5'-CAA ATG TGT CAT GGATGA CC-3')。将c-Myc mRNA水平归一化为GAPDH mRNA水平³⁷。

c-Myc敲低。将PC-3细胞以2×10⁶个细胞的密度接种在10cm平板中，并在补充有10％FBS和青霉素/链霉素的EMEM中生长至75-85％融汇。然后用含有10％FBS的无抗生素EMEM替换培养基，并将细胞温育至少12h。在optiMEM中用Glutamax(Gibco)制备含有500nM针对c-Myc的siRNA#L-003292-02-0005、500nM非靶向siRNA#D-001810-10-05或5％(v/v)dharmafect 2#T-2002-02(Dharmacon)的溶液，以获得各1mL的最终体积。在室温下温育5分钟后，将siRNA溶液和dharmafect溶液合并且在室温下再温育20min。然后将转染复合物添加到含有10％FBS的新鲜无抗生素EMEM中的细胞中，并将细胞温育24h。将细胞分成两个在补充有10％FBS和青霉素/链霉素的EMEM中的10cm组织培养皿，并使所述细胞贴壁另外24h。用10μM[D-Trp]CJ-15,208或0.5％DMSO媒介物对照处理细胞总共48h。然后将细胞收集，并经制备用于如上所述的膜联蛋白V-APC/PI测定。使用BD FACSCanto-II细胞分析仪分析样品，并在FlowJo v10.2中定量。

c-Myc过表达。使用X-temeGENE HP#6366244001(Sigma)进行HEK293细胞中c-Myc的强制表达。将细胞在补充有10％FBS的无抗生素DMEM中培养，并用pcDNA3-HA-HA-c-Myc#74164(Addgene)转染。使用空载体pcDNA3-EV作为对照。用500μg/mL的G418选择转染的细胞2周。然后将转染的细胞接种到10cm组织培养板上，并使其在补充有10％FBS和青霉素/链霉素的DMEM中生长至75％融汇。将细胞用10μM[D-Trp]CJ-15,208或0.5％DMSO媒介物对照处理总共48h，之后将细胞收集并经制备以用于如上所述的膜联蛋白V-APC/PI测定。使用BDFACSCanto-II细胞分析仪分析样品，并在FlowJo v10.2中定量。

统计分析。除非图例中另有说明，否则每个实验一式三份地进行。使用GraphPadPrism 5来确定IC₅₀值。数据表示平均值+/-SEM。使用Prism软件，使用学生t检验，以双尾未配对方法来比较细胞周期阶段和凋亡实验中的化合物处理细胞相对于媒介物处理细胞(图5-8)。通过用于多重比较的单因素方差分析和Dunnett检验来评估化合物处理相对于媒介物处理对蛋白质水平的作用(图10)。

结果

包括***癌细胞在内的许多癌细胞过表达c-Myc^9,30。检查几种κ阿片样物质受体(KOR)配体对细胞c-Myc蛋白质水平的作用，所述KOR配体包括大环四肽CJ-15208和[D-Trp]CJ-15,208(图1A和图1B)、内源KOR激动剂强啡肽A(Dyn A，图1C)²⁸以及KOR拮抗剂zyklophin(图1D)³¹。c-Myc蛋白质的细胞水平在用CJ-15,208和[D-Trp]CJ-15,208处理后降低5倍(图1E，泳道4和5)，但是用强啡肽A或其拮抗剂类似物zyklophin处理后没有降低(图1E，泳道2和3)。在标准条件下使用[³H]二丙诺啡(和Dyn A-(1-13)酰胺，其用于确定非特异性结合³²)进行的KOR放射性配体结合测定，显示没有可检测的KOR与PC-3细胞的特异性结合。将PC-3细胞用10μM的非选择性阿片样物质拮抗剂纳洛酮处理48h，这显示为对c-Myc蛋白质水平没有作用(图1F，泳道3)，并且没有改变由[D-Trp]CJ-15,208造成的c-Myc蛋白质水平降低(泳道4相对于照泳道2)。这些结果证明这些环状四肽对***癌细胞中c-Myc的作用不是通过KOR介导的。

在48h处理后，[D-Trp]CJ-15,208和CJ-15,208均以浓度依赖性方式降低PC-3细胞中的c-Myc蛋白质水平(图2A和图2B)，从而在10μM时导致约50％的减少(图2A，泳道3，和图2B，泳道4)。CJ-15,208和[D-Trp]CJ-15,208表现为使48h后PC-3细胞的细胞增殖减少，对于CJ-15,208和[D-Trp]CJ-15,208表现出的IC₅₀值分别为10.1±0.9μM和16.5±0.7μM(图2C)。用10μM的[D-Trp]CJ-15,208处理PC-3细胞0h至48h不影响任何时间点的mRNA表达(图2D)。这些结果表明[D-Trp]CJ-15,208降低了这些癌细胞中的c-Myc蛋白质水平，但不影响c-Myc基因转录。

使用如本文所述的WST-1(Roche)来进行细胞增殖测定(图3A-3G)。[D-Trp]CJ-15,208抑制大多数***癌细胞系中的细胞生长(表1)，具有的IC₅₀值是：在72h处理后在LNCaP细胞中为3.0±1.0μM，在48h处理后在DU145细胞中为1.2±0.2μM，在48h处理后在22Rv1细胞中为8.8±4.0μM。[D-Trp]CJ-15,208对去势抵抗性***癌(CRPC)细胞系C4-2细胞的细胞增殖没有作用。在BPH-1细胞或HEK细胞中没有观察到[D-Trp]CJ-15,208的细胞毒性(表1)。不同***癌细胞系和正常细胞中的c-Myc蛋白质水平(图3H)与D-Trp]CJ-15,208的细胞毒性一致。除C4-2细胞外的所有***癌细胞系均表达高水平的细胞c-Myc蛋白质，而BPH-1细胞和C4-2细胞具有低水平的c-Myc蛋白质。

用[D-Trp]CJ-15,208处理几种***癌细胞系导致细胞生长减慢和细胞死亡，所述几种***癌细胞系为：i)高度转移性且雄激素非依赖性的PC-3细胞，ii)mCRPC 22Rv1细胞，和iii)低转移性、雄激素依赖性的LNCaP细胞，其中在48-72h处理后IC₅₀值的范围是2到12μM(图3A-3H，表1)。[D-Trp]CJ-15,208减慢细胞生长的所有这些细胞系都表现出高c-Myc蛋白质水平，而无论它们是雄激素依赖性(LNCaP)还是非依赖性的转移性(PC-3)/去势抵抗性(22Rv1)***癌细胞。用肽处理48h以浓度依赖性方式降低了***癌细胞中的c-Myc蛋白质水平(图2A-2D)。用[D-Trp]CJ-15,208处理并未阻止c-Myc蛋白质水平未升高的C4-2***癌细胞的细胞增殖，也未阻止正常细胞(BPH-1细胞或HEK细胞)的细胞增殖。用肽处理也没有改变cmyc mRNA水平。这些结果表明[D-Trp]CJ-15,208通过其对c-Myc蛋白质水平的作用来抑制癌细胞生长。

表1.[D-Trp]CJ-15,208对细胞生长的作用。

^*IC₅₀值是来自两个独立实验的三次测量的平均值±S.E.M；^a高度转移性的；^b低转移性的；^c中度转移性的；^d去势抵抗性的；^e正常***细胞；^f非***细胞。

图4A-D显示使用如本文所述的台盼蓝测定，用[D-Trp]CJ-15,208处理***癌细胞(PC-3、LNCaP和22Rv1)48h和72h导致细胞死亡。相比之下，在用1-40μM的[D-Trp]CJ-15,208处理48h后，没有观察到BPH-1细胞的细胞死亡迹象。

图5A和图5B显示根据本发明技术用[D-Trp]CJ-15,208处理后对PC-3细胞的细胞周期进程的作用。用10μM的[D-Trp]CJ-15,208处理24h或48h后，与媒介物处理的对照细胞相比，G2期积累的细胞数目更大(至少8倍高)(对于对照为5±1.5％，24h处理后为42±4％，48h处理后为58±4％)。G1期平均细胞数是对于对照为53±6％，对于24h处理为32±1％，并且对于48h处理为31±6％。S期平均细胞分布是对于对照为45±4％，24h处理后为26±4％，并且48小时处理后为12±0.6％。

[D-Trp]CJ-15,208处理以时间依赖性方式诱导PC-3细胞的凋亡并引起细胞周期停滞(图5A和图5B)。48h处理后观察到早期和晚期凋亡增加，但是在用[D-Trp]CJ-15,208处理24h后未发现显著的凋亡诱导。细胞周期分布是一个复杂的过程，其中c-Myc严格控制G1至M期的关键细胞周期检查点蛋白，包括细胞周期蛋白、CDK、p21和p53³⁸。几项研究已经表明，通过c-Myc抑制进行的细胞周期停滞可通过以下两种机制发生：ⅰ)使c-Myc依赖性检查点基因(诸如CDK或CDKI(P21))发生不受控制的表达，或ii)以由c-Myc直接调节的特定细胞代谢途径中的基因表达改变^41-43。用[D-Trp]CJ-15,208处理PC-3细胞24h或48h导致细胞周期停滞在G2期，从而阻止癌细胞进入有丝***和细胞***。这些结果表明，[D-Trp]CJ-15,208在PC-3细胞的细胞周期进程中显著诱导生长停滞在G2期(图5B)。

图6A和图6B显示对PC-3细胞的细胞凋亡的诱导。在图6A中，左上象限(Q1)显示存在早期凋亡细胞，所述早期凋亡细胞被膜联蛋白V阳性染色但未被PI染色，右上象限(Q2)显示晚期凋亡细胞，所述晚期凋亡细胞被PI和膜联蛋白V两者阳性染色，右下象限(Q3)显示死细胞，所述死细胞仅被PI而未被膜联蛋白V阳性染色，并且左下象限(Q4)显示活细胞，所述活细胞未被PI或膜联蛋白V染色。如图6B所示，在用10μM的[D-Trp]CJ-15,208处理48h后，与媒介物处理的对照细胞相比，早期和晚期凋亡的细胞数分别增加了10倍和3倍。在用10μM的[D-Trp]CJ-15,208处理24h后，未观察到早期或晚期凋亡细胞数目的显著变化(图6B)。

进行c-Myc实验的敲减和过表达以显示[D-Trp]CJ-15,208的c-Myc下调效应。图7A显示用针对c-Myc的siRNA或非靶向siRNA转染，随后用10μM的[D-Trp]CJ-15,208处理48h的PC-3细胞的敲低实验。分析细胞的凋亡。图7B显示用[D-Trp]CJ-15,208处理显著增加了用非靶向siRNA转染的细胞的早期细胞凋亡，但没有显著影响用针对c-Myc的siRNA转染的细胞经历早期凋亡的百分比。图7C显示对用针对c-Myc的siRNA转染的细胞中c-Myc敲低的蛋白质印迹分析。因此，数据表明，c-Myc下调的PC-3细胞在用肽处理后不再表现出早期凋亡的增加。

用含有HA标记的人c-Myc***物的pcDNA转染以过表达蛋白质的HEK-293细胞或用载体对照转染的HEK-293细胞也用10μM的[D-Trp]CJ-15,208处理48h，并分析细胞的凋亡。图8B显示过表达c-Myc并用[D-Trp]CJ-15,208处理的细胞显示出早期凋亡的显著增加，这与在PC-3细胞中观察到的一致。然而，在用空载体转染的细胞中未观察到显著差异。图8C提供蛋白质印迹分析，其显示用含有c-Myc的质粒转染的细胞中c-Myc的过表达。在免费获得的功能实验中，过表达c-Myc的HEK细胞对用[D-Trp]CJ-15,208处理变得敏感，在用肽处理后表现出早期凋亡的显著增加(图8A-8C)。

细胞c-Myc蛋白质的稳定性通过对其磷酸化状态的严格调节来确定^11，13，33。c-Myc蛋白质降解对于维持正常的细胞功能是重要的，而高水平的c-Myc蛋白质已经在包括***癌在内的各种癌细胞中发现^13，16。图9A和图9B中的示意图示出确定正常细胞(图9A)相对于癌细胞(图9B)中的c-Myc稳定性的途径。一系列关键酶，主要是Erk、PI3K/Akt和PP2A，参与通过该途径来调节c-Myc磷酸化及其降解。

c-Myc的磷酸化状态在确定细胞中c-Myc的稳定性和积聚方面起主要作用。在正常细胞条件下(图9A)，细胞周期早期G1期的Ras活化通过酶促反应的协调级联来触发c-Myc磷酸化和降解。与正常细胞相反，Ras在恶性细胞的晚期和早期G1期中通过磷酸化来活化Erk和Akt两者，从而增强c-Myc稳定性(图9B)。p-Erk磷酸化Ser62上的c-Myc，并且p-Akt抑制Thr58上的c-Myc的GSK-3β磷酸化。这些磷酸化事件阻止了c-Myc降解途径中的其余步骤，从而使细胞中c-Myc的稳定性增大^11,13(图9B)。

图10A、图10B和图10C显示用[D-Trp]CJ-15,208以指定浓度处理48h后，三种关键酶Erk、Akt和PP2A的细胞磷酸化状态和总蛋白质水平。在用递增浓度的[D-Trp]CJ-15,208处理后，作为这些酶的活化形式的p-Erk和p-Akt的细胞水平没有显著变化(图10A和图10B)。总Erk蛋白质水平也没有显著下降。当用最高浓度(50μM)的[D-Trp]CJ-15,208处理细胞时，观察到了总Akt蛋白质水平的显著降低(图10B)。不受理论束缚，认为PP2A使磷酸-Ser62 c-Myc去磷酸化，从而导致细胞中的c-Myc降解^11,34。先前的研究发现了PP2A的C末端酪氨酸307的磷酸化与导致PP2A的磷酸酶活性失活之间的关联^16,35,36,37。在媒介物处理的细胞中，PC-3细胞中的pTyr307-PP2A水平较高。以≥10μM的浓度进行[D-Trp]CJ-15,208处理显著降低了细胞中的p-PP2A水平(图10C)。与媒介物处理的细胞相比，总PP2A蛋白质水平没有显著差异。总的来说，结果显示，根据本技术用[D-Trp]CJ-15,208处理降低了PC-3细胞中的p-PP2A水平，增加了c-Myc降解，并减慢了癌细胞的生长(图10D)。用[D-Trp]CJ-15,208处理对p-Erk或p-Akt水平没有显著影响，但以浓度依赖性方式显著降低p-PP2A水平，从而导致c-Myc降解和癌细胞生长减慢(图10A-10D)。因此，结果证明[D-Trp]CJ,15-208调节参与c-Myc降解的蛋白质，从而导致***癌细胞中的c-Myc蛋白质水平降低且细胞生长减慢。

用于***癌的体内模型

进行体内研究以在小鼠异种移植模型中确定通过[D-Trp]CJ-15,208实现的肿瘤生长抑制。将PC-3细胞皮下注射到裸鼠的双后侧腹中。一旦肿瘤建立，就用媒介物(50％DMSO、45％PEG 400和5％聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)；3只小鼠，6种肿瘤)或[D-Trp]CJ-15,208(在媒介物中30mg/kg；2只小鼠，3种肿瘤)每周腹膜内处理小鼠三次。使用卡尺测量肿瘤体积。

结果：如本文所述，注射PC-3细胞的小鼠经历用[D-Trp]CJ-15,208或用媒介物进行的处理。如图10所示，与用媒介物处理对照处理的小鼠相比，用[D-Trp]CJ-15,208处理的小鼠表现出肿瘤生长减慢。

CJ-15,208和[D-Trp]CJ-15,208在抗癌活性方面具有几个优点。它们在口服给药后是有活性的，并且在60mg/kg的剂量下没有显示出对小鼠有毒性的迹象^24,25。另一个优点是这些大环四肽似乎在全身施用后穿透小鼠的血脑屏障^24,25，这使得这些化合物特别适用于转移到大脑的***癌。

总的来说，数据表明CJ-15,208和[D-Trp]CJ-15,208可用于治疗***癌(诸如晚期***癌)。

抗乳腺癌活性

如前所述，c-Myc在30-50％的高级乳腺癌肿瘤中过表达，并且据报道乳腺癌进展中有cc-Myc的激活(Fallah,Y.；Brundage,J.；Allegakoen,P.；Shajahan-Haq,A.N.MYC-Driven Pathways in Breast Cancer Subtypes(乳腺癌亚型中MYC驱动的途径).Biomolecules 2017,7)。证据表明c-Myc过表达有助于在***受体(ER)阳性肿瘤中发展出对激素治疗的抗性(McNeil,C.M.；Sergio,C.M.；Anderson,L.R.；Inman,C.K.；Eggleton,S.A.；Murphy,N.C.；Millar,E.K.；Crea,P.；Kench,J.G.；Alles,M.C.；Gardiner-Garden,M.；Ormandy,C.J.；Butt,A.J.；Henshall,S.M.；Musgrove,E.A.；Sutherland,R.L.，c-Mycoverexpression and endocrine resistance in breast cancer(c-Myc在乳腺癌中的过表达和内分泌抗性).J Steroid Biochem Mol Biol 2006,102,147-155；Shajahan-Haq,A.N.；Cook,K.L.；Schwartz-Roberts,J.L.；Eltayeb,A.E.；Demas,D.M.；Warri,A.M.；Facey,C.O.；Hilakivi-Clarke,L.A.；Clarke,R.，MYC regulates the unfolded proteinresponse and glucose and glutamine uptake in endocrine resistant breastcancer(MYC调节内分泌抗性乳腺癌中的未折叠蛋白应答以及葡萄糖和谷氨酰胺的摄取).Mol Cancer2014,13,239)。与表达ER或HER2的肿瘤相比，三阴性乳腺癌(TNBC)中的c-Myc表达也升高，并且TNBC中的c-Myc过表达与不良预后相关。(Horiuchi,D.；Kusdra,L.；Huskey,N.E.；Chandriani,S.；Lenburg,M.E.；Gonzalez-Angulo,A.M.；Creasman,K.J.；Bazarov,A.V.；Smyth,J.W.；Davis,S.E.；Yaswen,P.；Mills,G.B.；Esserman,L.J.；Goga,A.，MYC pathway activation in triple-negative breast cancer is syntheticlethal with CDK inhibition(三阴性乳腺癌中的MYC途径活化是使用CDK抑制进行合成致死的).J Exp Med 2012,209,679-696)。因此，基于上述数据，预计CJ-15,208和[D-Trp]CJ-15,208将通过减少这些肿瘤中的c-Myc表达来减少癌细胞增殖，因此可用于治疗这些类型的乳腺癌。

乳腺癌的体外模型

将在几种TNBC细胞系(BT-20、MDA-MB-468和MDA-MB-231)以及具有不同受体表达模式的其他乳腺癌细胞系(MCF-7(ER+/PR+/HER2-)、SKBR-3(ER-/PR-/HER2+)和BT-474(ER+/PR+/HER2+))中评估CJ-15,208和[D-Trp]CJ-15,208的抗增殖活性和对c-Myc水平的作用。将细胞一式三份地用0.1到50μM的各种浓度的大环四肽或媒介物(对照)处理。在处理后0-72小时将添加WST-1试剂，并将测量吸光度以确定化合物对细胞增殖的作用。将细胞一式两份地用媒介物(对照)或大环四肽以基于抗增殖研究选择的各种浓度和时间段处理，裂解细胞，并通过蛋白质印迹分析测定c-Myc蛋白质水平。预期CJ-15,208和[D-Trp]CJ-15,208将均降低表现出高c-Myc水平(即，c-Myc水平显著大于正常乳腺细胞中的c-Myc水平)的细胞系中的癌细胞增殖。

乳腺癌体内模型

将利用基于本文所述的体外研究的结果选择的人乳腺癌细胞系，在免疫受损小鼠异种移植肿瘤模型中评估CJ-15,208和[D-Trp]CJ-15,208的体内抗增殖活性。一旦肿瘤建立，就用媒介物(50％DMSO、45％PEG 400和5％吐温80；3只小鼠，6种肿瘤)或[D-Trp]CJ-15,208(在媒介物中30-60mg/kg；2只小鼠，3种肿瘤)每周腹膜内处理小鼠三次。使用卡尺测量肿瘤体积，以确定与接受媒介物的对照小鼠相比肿瘤增殖的减少。与对照小鼠相比，预期CJ-15,208和[D-Trp]CJ-15,208将均提供肿瘤增殖的显著减少。

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虽然已经说明和描述了某些实施方案，但是本领域普通技术人员在阅读前述说明书后，可以实现对本技术化合物或其盐、药物组合物、衍生物、前药、代谢物、互变异构体或外消旋混合物的改变、等同替换和其他类型的改变。上面描述的每个方面和实施方案也可以包括或结合关于任何或所有其他方面和实施方案公开的此类变型或方面。

本技术也不限于本文所述的特定方面，这些方面意在作为本技术的各个方面的单一说明。如对本领域技术人员来说将显而易见的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本技术进行许多修改和变化。对于本领域技术人员来说，除了本文列举的那些之外，本技术范围内的功能等同方法根据前面的描述也是显而易见的。此类修改和变化意在落入所附权利要求的范围内。应理解，本技术不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物、标记化合物或生物体系，它们当然可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体方面的目的，而不意在进行限制。因此，本说明书仅意在被认为是示例性的，本技术的广度、范围和精神仅由所附权利要求、其中的定义及其任何等同物表示。

本文所说明性地描述的实施方案可在不存在本文未明确公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下被合适地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被宽泛地解读并且没有限制。另外，本文所采用的术语和表达是以描述而非限制的术语使用，并且使用这些术语和表达并不意在排除所显示和描述的特征或其部分的任何等同物，而应认识到可在所要求保护的技术范围内作出各种修改。另外，短语“基本上由......组成”应理解为包括具体叙述的那些要素和不会实质上影响所要求保护的技术的基本和新颖特征的那些附加要素。短语“由......组成”排除了未指定的任何要素。

另外，在用马库什组(Markush group)描述本公开的特征或方面时，本领域技术人员将认识到，由此也是以马库什组的任何单个成员或成员亚组来描述本公开。落入该一般性公开的每个较窄的类和次一般性的组合也构成本发明的一部分。这包括带有将任何主题从一般性中去除的附带条件或负面限制来一般性地描述本发明，而不管被除去的内容是否在本文中明确述及。

如本领域技术人员应理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还涵盖所述范围的任何和所有可能的子范围和子范围组合。任何列出的范围都可以被容易地识别为充分描述并使相同的范围被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本文论述的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中间三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还应理解的，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有用语包括所引用的数字并且是指可以随后分解为如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员应理解的，范围包括每个单独的成员。

本说明书中提及的所有出版物、专利申请、已授权专利和其他文件(例如，期刊、文章和/或教科书)均以引用方式并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请、已授权专利或其他文件被具体地且单独地指示为以引用方式整体并入。以引用方式并入的文本中包含的定义在与本公开中的定义相矛盾的情况下被排除。

本技术可包括但不限于以下标字母段落中所述的特征和特征组合，应理解以下段落不应解释为限制所附权利要求的范围或强制要求所有此类特征必须包含在此类权利要求中：

A.一种方法，其包括向患有***癌或乳腺癌的受试者施用环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐。

B.根据段落A所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐。

C.根据段落A或段落B所述的方法，其中所述***癌包含在PC-3细胞系、LNCaP细胞系、22Rv1细胞系、DU145细胞系或这些细胞系中的任何两种或更多种的组合中发现的至少一种致癌突变。

D.根据段落A-C中任一段所述的方法，其中所述乳腺癌包括三阴性乳腺癌。

E.根据段落A-D中任一段所述的方法，其中所述乳腺癌包含在BT-20细胞系、MDA-MB-468细胞系、MDA-MB-231细胞系、MCF-7细胞系、SKBR-3细胞系、BT-474细胞系、或这些细胞系中的任何两种或更多种的组合中发现的至少一种致癌突变。

F.根据段落A-E中任一段所述的方法，其中施用包括口服施用或肠胃外施用。

G.根据段落A-F中任一段所述的方法，其中施用包括皮下施用、静脉内施用和口服施用中的至少一种。

H.根据段落A-G中任一段所述的方法，其中所述方法包括施用环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]或其药学上可接受的盐。

I.根据段落A-H中任一段所述的方法，其中所述方法包括施用环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]或其药学上可接受的盐。

J.根据段落A-I任一段所述的方法，其中所述方法包括施用组合物，所述组合物包含环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。

K.根据段落J所述的方法，其中所述组合物经配制用于口服施用或肠胃外施用。

L.根据段落J或段落K所述的方法，其中所述组合物经配制用于皮下施用和静脉内施用中的至少一种。

M.根据段落J-L中任一段所述的方法，其中所述药学上可接受的载体包括盐水。

N.根据段落J-M中任一段所述的方法，其中所述药学上可接受的载体包括聚乙二醇、聚乙二醇脂肪酸单酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯，或这些中的任何两种或更多种的组合。

O.根据段落J-N中任一段所述的方法，其中所述组合物是液体制剂，所述液体制剂包含约0.1mg/mL到约50mg/mL的所述环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐。

P.根据段落J-O中任一段所述的方法，其中所述组合物是药物组合物。

Q.根据段落A-P中任一段所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用每千克所述受试者约1mg至约150mg的所述环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种。

R.根据段落A-Q中任一段所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者每周施用约1次至约7次。

S.环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐或包含所述环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的组合物用于治疗患有***癌或乳腺癌的受试者的用途。

T.有效量的环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐或包含有效量的所述环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的组合物用于治疗患有***癌或乳腺癌的受试者的用途。

U.根据段落S所述的用途或根据段落T所述的用途，其中所述***癌包含在PC-3细胞系、LNCaP细胞系、22Rv1细胞系、DU145细胞系或这些细胞系中的任何两种或更多种的组合中发现的至少一种致癌突变。

V.根据段落S-U中任一段所述的用途，其中所述乳腺癌包括三阴性乳腺癌。

W.根据段落S-V中任一段所述的用途，其中所述乳腺癌包含在BT-20细胞系、MDA-MB-468细胞系、MDA-MB-231细胞系、MCF-7细胞系、SKBR-3细胞系、BT-474细胞系、或这些细胞系中的任何两种或更多种的组合中发现的至少一种致癌突变。

X.根据段落S-W中任一段所述的用途，其中所述用途包括肠胃外施用或口服施用。

Y.根据段落S-X中任一段所述的用途，其中所述用途包括皮下施用、静脉内施用和口服施用中的至少一种。

Z.根据段落S-Y中任一段所述的用途，其中所述组合物经配制用于口服施用或肠胃外施用。

AA.根据段落S-Z中任一段所述的用途，其中所述组合物经配制用于皮下施用、静脉内施用和口服施用中的至少一种。

AB.根据段落S-AA中任一段所述的用途，其中所述药学上可接受的载体包括盐水。

AC.根据段落S-AB中任一段所述的用途，其中所述药学上可接受的载体包括聚乙二醇、聚乙二醇脂肪酸单酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯，或这些中的任何两种或更多种的组合。

AD.根据段落S-AC中任一段所述的用途，其中所述组合物是液体制剂，所述液体制剂包含约0.1mg/mL到约50mg/mL的所述环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐。

AE.根据段落S-AD中任一段所述的用途，其中所述组合物是药物组合物。

AF.根据段落S-AE中任一段所述的用途，其中所述方法包括向所述受试者施用每千克所述受试者约1mg至约150mg的所述环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种。

AG.根据段落S-AF中任一段所述的用途，其中所述用途包括向所述受试者施用环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐每周约1次至约7次。

AH.环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐，其用于用以治疗受试者的***癌或乳腺癌的药物中。

AI.有效量的环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐，其用于用以治疗受试者的***癌或乳腺癌的药物中。

AJ.根据段落AH所述的药物或根据段落AI所述的用途，其中所述***癌包含在PC-3细胞系、LNCaP细胞系、22Rv1细胞系、DU145细胞系或这些细胞系中的任何两种或更多种的组合中发现的至少一种致癌突变。

AK.根据段落AH-AJ中任一段所述的药物，其中所述乳腺癌包括三阴性乳腺癌。

AL.根据段落AH-AK中任一段所述的药物，其中所述乳腺癌包含在BT-20细胞系、MDA-MB-468细胞系、MDA-MB-231细胞系、MCF-7细胞系、SKBR-3细胞系、BT-474细胞系、或这些细胞系中的任何两种或更多种的组合中发现的至少一种致癌突变。

AM.根据段落AH-AL中任一段所述的药物，其中所述组合物经配制用于口服施用或肠胃外施用。

AN.根据段落AH-AM中任一段所述的药物，其中所述药物经配制用于皮下施用、静脉内施用和口服施用中的至少一种。

AO.根据段落AH-AN中任一段所述的药物，其中所述药物包含药学上可接受的载体。

AP.根据段落AH-AO中任一段所述的药物，其中所述药物包含盐水。

AQ.根据段落AH-AP中任一段所述的药物，其中所述药物包含聚乙二醇、聚乙二醇脂肪酸单酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单酯，或这些中的任何两种或更多种的组合。

AR.根据段落AH-AQ中任一段所述的药物，其中所述药物是液体制剂，所述液体制剂包含约0.1mg/mL到约50mg/mL的所述环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐。

在以下权利要求中阐述了其他实施方案，以及此类权利要求所赋予的等同物的全部范围。

Claims

1.环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐在制备一种用于治疗***癌或乳腺癌的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物包括有效量的环

[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述***癌包含在PC-3细胞系、LNCaP细胞系、22Rv1细胞系、DU145细胞系或这些细胞系中的任何两种或更多种的组合中发现的至少一种致癌突变。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述乳腺癌包括三阴性乳腺癌。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述乳腺癌包含在BT-20细胞系、MDA-MB-468细胞系、MDA-MB-231细胞系、MCF-7细胞系、SKBR-3细胞系、BT-474细胞系、或这些细胞系中的任何两种或更多种的组合中发现的至少一种致癌突变。

6.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述药物经配制用于口服施用或肠胃外施用。

7.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述药物经配制用于皮下施用、静脉内施用和口服施用中的至少一种。

8.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述药物包括环

[Phe-D-Pro-Phe-Trp]或其药学上可接受的盐。

9.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述药物包括环

[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]或其药学上可接受的盐。

10.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述药物包括组合物，所述组合物包含环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种和药学上可接受的载体。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述组合物经配制用于口服施用或肠胃外施用。

12.根据权利要求10所述的用途，其中所述组合物经配制用于皮下施用和静脉内施用中的至少一种。

13.根据权利要求10所述的用途，其中所述药学上可接受的载体包括盐水。

14.根据权利要求10所述的用途，其中所述药学上可接受的载体包括聚乙二醇、聚乙二醇脂肪酸单酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯，或这些中的任何两种或更多种的组合。

15.根据权利要求10所述的用途，其中所述组合物是液体制剂，所述液体制剂包含约0.1mg/mL到约50mg/mL的所述环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐。

16.根据权利要求10所述的用途，其中所述组合物是药物组合物。

17.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述药物包括每千克约1mg至约150mg的所述环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种。

18.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述药物被施用每周约1次至约7次。

19.环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐或包含所述环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环

[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的组合物在制备一种用于治疗患有***癌或乳腺癌的药物中的用途。

20.有效量的环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐或包含有效量的环[Phe-D-Pro-Phe-Trp]和环[Phe-D-Pro-Phe-D-Trp]中的至少一种或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的组合物在制备一种用于治疗患有***癌或乳腺癌的药物中的用途。