CN110412184B - 一种小儿热速清颗粒的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于小儿热速清颗粒检测技术领域，具体涉及一种小儿热速清颗粒的检测方法。该方法以告依春为有效成分对小儿热速清颗粒中的板蓝根进行检测，该方法有效、简单、重现性好，该方法通过对对照品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液同时进行检测，排出了其他因素的干扰，说明以告依春为对照品的方法准确、可行，创造性的提出了以告依春为对照品，通过薄层鉴别的方法能够快速检测小儿热速清颗粒中是否含有板蓝根；且该方法采用等度洗脱的方式对小儿热速清颗粒中的葛根素进行检测，避免了梯度洗脱繁琐的程序，简便可行。

Description

一种小儿热速清颗粒的检测方法

技术领域

本发明属于小儿热速清颗粒检测技术领域，具体涉及一种小儿热速清颗粒的检测方法。

背景技术

小儿热速清颗粒由柴胡、板蓝根、金银花、连翘、黄芩、葛根、水牛角及大黄8味药材组成，具有清热解毒、泻火利咽的功效，用于小儿外感风热所致感冒，症见高热、头痛、咽喉疼痛、鼻塞流涕、咳嗽及大便干结。临床研究结果表明，小儿热速清颗粒单独或联合用药对小儿外感风热、流行性感冒、急性上呼吸道感染及急性扁桃体炎等具有较好的治疗作用，且不良反应少，安全性高。该制剂组方中，柴胡疏散风热；黄芩、大黄清热泻火、解毒；葛根解肌退热；板蓝根、水牛角清热凉血、解毒；金银花、连翘清热解毒、疏散风热。其中，葛根、板蓝根在本方中有重要药理作用，板蓝根性苦、寒，具有清热解毒，凉血利咽之功效，是质量控制的关键成分；葛根素亦称葛根黄素，是从中药葛根中分离的具有扩冠作用的异黄酮类衍生物。

现有技术中，板蓝根多采用高效液相色谱法和薄层分析法进行检测，但由于有效成分的含量较低，高效液相色谱法样品提取过程较为繁琐，以致检测方法的重现性不好，薄层分析法多采用甲醇作为溶剂，但是以甲醇作为板蓝根药材的提取溶剂时，提取产物杂质成分较多，进行薄层色谱展开时，无法将杂质成分与特征成分有效分离。葛根素多采用高效液相色谱梯度洗脱的方法进行检测，该方法也存在操作繁琐的缺陷，且浪费溶剂。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中没有小儿热速清颗粒中板蓝根、葛根的检测方法的相关报道，从而提供一种小儿热速清颗粒的检测方法。

本发明要解决的另一个技术问题在于克服现有技术中没有对柴胡、金银花和连翘混合药材的挥发油提取条件的限定，从而提供一种小儿热速清颗粒的检测方法。

为此，本发明提供了以下技术方案。

本发明提供了一种小儿热速清颗粒的检测方法，包括板蓝根的检测，其步骤包括，

对照品溶液的制备：取(R，S)-告依春对照品，加入第一溶剂制备得到对照品溶液；

对照药材溶液的制备：板蓝根药材加水煮沸、过滤后得到第一滤液，然后蒸干得到第一残渣，在第一残渣中加水溶解后加入乙酸乙酯，经超声处理后取乙酸乙酯层，蒸干得到第二残渣，在第二残渣中加入第一溶剂溶解后得到对照药材溶液；

供试品溶液的制备：小儿热速清颗粒研磨后加水煮沸、过滤后得到第二滤液，然后蒸干得到第三残渣，在第三残渣中加水溶解后加入乙酸乙酯，经超声处理后取乙酸乙酯层，蒸干得到第四残渣，在第四残渣中加入第一溶剂溶解后得到供试品溶液；

阴性样品溶液的制备：不含板蓝根的小儿热速清颗粒研磨后加水煮沸、过滤后得到第三滤液，然后蒸干得到第五残渣，在第五残渣中加水溶解后加入乙酸乙酯，经超声处理后取乙酸乙酯层，蒸干得到第六残渣，在第六残渣中加入第一溶剂溶解后得到阴性样品溶液；

鉴别：分别吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，依次在同一硅胶薄层板上进行点样；以石油醚-乙酸乙酯(1:1)作为展开剂，展开、取出、晾干，置于紫外光灯下检视。

所述展开剂的展开温度为5-25℃。

所述石油醚的沸点为60-90℃。

所述第一溶剂为甲醇；所述点样的量为5-10μL。

进一步地，所述检测方法还包括小儿热速清颗粒中葛根素的检测，

色谱条件与***适应性试验：照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.1％磷酸(10：90)，等度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温为40℃；检测波长为250nm；

对照品溶液的制备：取葛根素对照品，加入第二溶剂后定容，得到对照品溶液；

供试品溶液的制备：小儿热速清颗粒加入第二溶剂，密封、称量、超声、冷却，然后再次称量，用第二溶剂补足减失的重量，过滤后得到滤液，即为供试品溶液；

阴性供试品溶液的制备：不含葛根素的小儿热速清颗粒加入第二溶剂，密封、称量、超声、冷却，然后再次称量，用第二溶剂补足减失的重量，过滤后得到滤液，即为阴性供试品溶液；

测定法：吸取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液和第二溶剂，注入液相色谱仪，测定。

所述第二溶剂为甲醇。

此外，所述检测方法还包括从重量份为20份柴胡、11份金银花和12份连翘的混合药材中提取挥发油的优化实验，所述优化实验包括，

考察水量和蒸馏时间对提取挥发油的影响；

正交试验，设定水量和蒸馏时间双因素的水平值，然后进行L9(3²)正交试验；

根据正交试验确定的水量和蒸馏时间，将所述混合药材粉碎，加水溶解，蒸馏，测定挥发油的提取率，确定挥发油的最佳提取条件。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的小儿热速清颗粒的检测方法，以告依春为有效成分对小儿热速清颗粒中的板蓝根进行检测，该方法有效、简单、重现性好，能够快速检测小儿热速清颗粒中是否含有板蓝根；该方法通过对对照品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液同时进行检测，排出了其他因素的干扰，说明以告依春为对照品的方法准确、可行，创造性的提出了以告依春为对照品，通过薄层鉴别的方法检测小儿热速清颗粒中的板蓝根。小儿热速清颗粒是由多味中药加工制成的中成药制剂，杂质成分较多，对板蓝根特征成分的提取有一定干扰，本发明提供的检测方法以水为溶媒、乙酸乙酯进行提取，可以有效地除去小儿热速清颗粒中的杂质成分；以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯作为展开剂，可以将杂质成分与板蓝根特征成分较好地分离。在本发明提供的小儿热速清颗粒中的板蓝根的检测方法中，硅胶薄层板、温度、湿度、批次等对检测结果没有影响，说明该方法的重现性较好，是一种稳定的检测方法。

2.本发明提供的小儿热速清颗粒的检测方法，通过对展开剂、点样量进行选择，说明以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(1:1)作为展开剂，点样量为5-10μL，可以有效地将杂质成分与板蓝根进行分离。

因此，本发明提供的小儿热速清颗粒中的板蓝根的检测方法的重现性和稳定性好。

3.本发明提供的小儿热速清颗粒的检测方法，以乙腈-0.1％磷酸(10：90)作为流动相，采用等度洗脱的方式对小儿热速清颗粒中葛根素进行检测，避免了梯度洗脱繁琐的程序，简便可行；此外，小儿热速清颗粒的供试品溶液的制备方法简单，易操作；以甲醇作为溶剂，超声提取操作简单、效率高。

在本发明提供的小儿热速清颗粒中的葛根素的检测方法中，取样量、提取时间对检测结果没有影响，且该方法的精密度高；稳定性试验结果RSD值为0.6％，稳定性结果好；重复性试验结果RSD值为0.9％，说明重复性好；回收率高达97.05％，说明该方法是一种稳定的测试方法。因此，本发明提供的小儿热速清颗粒中的葛根素的检测方法的重现性和稳定性好。

4.本发明提供的小儿热速清颗粒的检测方法，采用正交试验的方法确定柴胡、金银花和连翘的混合药材挥发油的最佳提取条件，为《中国药典》质量标准中提到的将连翘、柴胡、金银花三味药进行蒸馏提取挥发油提供了提取条件，为以后的生产提供了标准化操作。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中硅胶薄层板对鉴别结果考察的实验结果；其中a是自制GF254的实验结果，b是青岛海洋化工有限公司制造的GF254薄层板的实验结果，c是青岛海浪硅胶干燥剂有限公司制造的GF254薄层板的实验结果；1-是20190320批号小儿热速清颗粒供试品溶液，2-是(R,S)-告依春对照品溶液，3-是20190321批号小儿热速清颗粒供试品溶液，4-板蓝根对照药材溶液，5-是20190322批号小儿热速清颗粒供试品溶液；

图2是本发明实施例1中湿度对鉴别结果考察的实验结果；其中，a是40％湿度的实验结果，b是70％湿度的实验结果；1-是20190320批号小儿热速清颗粒供试品溶液，2-是(R,S)-告依春对照品溶液，3-是20190321批号小儿热速清颗粒供试品溶液，4-板蓝根对照药材溶液，5-是20190322批号小儿热速清颗粒供试品溶液；

图3是本发明实施例1中不同批号的小儿热速清颗粒对鉴别结果考察的实验结果；其中，a图中，1-是20190320批号小儿热速清颗粒供试品溶液，2-是(R,S)-告依春对照品溶液，3-是20190321批号小儿热速清颗粒供试品溶液，4-板蓝根对照药材溶液，5-是20190322批号小儿热速清颗粒供试品溶液；b图中，1-是20190326批号小儿热速清颗粒供试品溶液，2-是(R,S)-告依春对照品溶液，3-是20190327批号小儿热速清颗粒供试品溶液，4-板蓝根对照药材溶液，5-是20190602批号小儿热速清颗粒供试品溶液；

图4是本发明实施例1中温度对鉴别结果考察的实验结果；其中，a是5℃的实验结果，b是5℃的实验结果；1-是20190320批号小儿热速清颗粒供试品溶液，2-是(R,S)-告依春对照品溶液，3-是20190321批号小儿热速清颗粒供试品溶液，4-板蓝根对照药材溶液，5-是20190322批号小儿热速清颗粒供试品溶液；

图5是本发明实施例2中小儿热速清颗粒中葛根素检测中第二溶剂甲醇作为空白试剂的色谱图；

图6是本发明实施例2中小儿热速清颗粒中葛根素检测中阴性供试品溶液的色谱图；

图7是本发明实施例2中小儿热速清颗粒中葛根素检测中对照品溶液的色谱图；

图8是本发明实施例2中小儿热速清颗粒中葛根素检测中供试品溶液的色谱图；

图9是本发明实施例2中方法学考察中线性范围考察的进样量和峰面积的线形关系图；

图10是本发明实施例2中方法学考察中耐用性考察的以Waters Platisil ODSC18作为色谱柱，对照品溶液的色谱图；

图11是本发明实施例2中方法学考察中耐用性考察的以Waters Platisil ODSC18作为色谱柱，供试品溶液的色谱图；

图12是本发明实施例2中方法学考察中耐用性考察的以Agilent Eclipse ODBC18作为色谱柱，对照品溶液的色谱图；

图13是本发明实施例2中方法学考察中耐用性考察的以Agilent Eclipse ODBC18作为色谱柱，供试品溶液的色谱图；

图14是本发明实施例2中方法学考察中耐用性考察的以依利特Hypersil ODS C18作为色谱柱，对照品溶液的色谱图；

图15是本发明实施例2中方法学考察中耐用性考察的以依利特Hypersil ODS C18作为色谱柱，供试品溶液的色谱图；

图16是本发明实施例2中方法学考察中耐用性考察的采用Waters e2695高效液相色谱仪，对照品溶液的色谱图；

图17是本发明实施例2中方法学考察中耐用性考察的采用Waters e2695高效液相色谱仪，供试品溶液的色谱图；

图18是本发明实施例2中方法学考察中耐用性考察的采用岛津LC-2010AHT液相色谱仪，对照品溶液的色谱图；

图19是本发明实施例2中方法学考察中耐用性考察的采用岛津LC-2010AHT液相色谱仪，供试品溶液的色谱图；

图20是本发明对比例1中对比实验1中的测试结果；其中，a中的展开剂为石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(1:1)，b中的展开剂为正己烷-乙酸乙酯(1:1)，c中的展开剂为石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(5:8)；1-是20190320批号小儿热速清颗粒供试品溶液，2-是(R,S)-告依春对照品溶液，3-是20190321批号小儿热速清颗粒供试品溶液，4-板蓝根对照药材溶液，5-是20190322批号小儿热速清颗粒供试品溶液；

图21是本发明对比例2中检测小儿热速清颗粒中葛根的梯度洗脱色谱图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1

本实施例提供了一种小儿热速清颗粒的检测方法，小儿热速清颗粒包括柴胡、黄芩、板蓝根、葛根、金银花、水牛角、连翘和大黄；

上述检测方法包括小儿热速清颗粒中板蓝根的检测，具体为，

对照品溶液的制备：取(R，S)-告依春对照品，加入甲醇溶剂，制备得到0.5mg/ml的对照品溶液；

对照药材溶液的制备：取1g板蓝根药材加水100ml煮沸30min、过滤后得到第一滤液，然后蒸干得到第一残渣，在第一残渣中加10ml水溶解后加入50ml乙酸乙酯，经超声处理30min后取乙酸乙酯层，蒸干得到第二残渣，在第二残渣中加入1ml甲醇溶解后得到对照药材溶液；

供试品溶液的制备：小儿热速清颗粒研磨后称取10g，加100ml水煮沸30min、过滤后得到第二滤液，然后蒸干得到第三残渣，在第三残渣中加10ml水溶解后加入50ml乙酸乙酯，经超声处理30min后取乙酸乙酯层，蒸干得到第四残渣，在第四残渣中加入1ml甲醇溶解后得到供试品溶液；

阴性样品溶液的制备：不含板蓝根的小儿热速清颗粒研磨后称取10g，加100ml水煮沸30min、过滤后得到第三滤液，然后蒸干得到第五残渣，在第五残渣中加10ml水溶解后加入50ml乙酸乙酯，经超声处理30min后取乙酸乙酯层，蒸干得到第六残渣，在第六残渣中加入1ml甲醇溶解后得到阴性样品溶液；

鉴别：用毛细管点样器分别吸取5μL对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，依次在同一硅胶GF254薄层板(自制)上进行点样；以石油醚-乙酸乙酯(1:1)作为展开剂，展开(展开温度为20℃)、取出、晾干，置于紫外光灯(254nm)下检视。

薄层色谱中，对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液的色谱在相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性样品溶液无干扰。

硅胶薄层板对鉴别结果的考察：

分别采用青岛海洋化工有限公司(图1中b的测试结果)和青岛海浪硅胶干燥剂有限公司(图1中c的测试结果)售卖的硅胶GF254薄层板进行上述鉴别，实验结果(见图1)显示，见图1，三种硅胶GF254薄层板的分离度无明显差别，说明该方法的重现性好。

湿度对鉴别结果的考察：

上述鉴别方法分别在40％-70％的湿度范围进行，实验结果显示，见图2，分离度无明显差别，说明湿度对该方法无影响。

薄层法重现性的考察：

采用两个不同批号的小儿热速清颗粒进行鉴别，实验结果显示，见图3，分离度无明显差别，说明该方法的重现性好。

温度对鉴别结果的考察：

上述鉴别方法分别在5、25℃的温度条件下进行，实验结果显示，见图4，分离度无明显差别，说明温度对该方法无影响。

采用硅胶薄层板对小儿热速清颗粒中的板蓝根进行鉴定，能够简便的获知小儿热速清颗粒的质量情况，对小儿热速清颗粒的质量性能进行进一步地监控，有效地克服了其他组分对鉴定结果的干扰和影响；同时该方法稳定性和重现性较好。

实施例2

本实施例提供了一种小儿热速清颗粒的检测方法，

色谱条件与***适应性试验：照高效液相色谱法测定，以Hypersil ODS₂C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)为填充剂；流动相为乙腈-0.1％磷酸(10：90)，等度洗脱；流速为1ml/min；柱温为40℃；检测波长为250nm；理论板数按葛根素计算不低于2000；

对照品溶液的制备：取10mg葛根素对照品置于500ml的量瓶中，加入甲醇使其溶解，然后继续加入甲醇稀释至刻度，定容，得到对照品溶液；其中葛根素的批号为110752-201816，含量95.4％，中国食品药品检定研究院提供；

供试品溶液的制备：小儿热速清颗粒研磨后取0.6g置于锥形瓶中，加入100ml甲醇，密封、称量、超声(功率100W，频率40kHz)30min、冷却，然后再次称量，用甲醇补足减失的重量，过滤后得到滤液，即为供试品溶液；

阴性供试品溶液的制备：不含葛根素的小儿热速清颗粒研磨后取0.6g置于锥形瓶中，加入100ml甲醇，密封、称量、超声(功率100W，频率40kHz)30min、冷却，然后再次称量，用甲醇补足减失的重量，过滤后得到滤液，即为阴性供试品溶液；

检测法：分别吸取上述10μL对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液和甲醇，注入液相色谱仪，测定，测试结果见图5-8；甲醇作为空白试剂，目的在于验证溶剂对检测的结果无影响；

其中高效液相色谱仪可以是沃特世Waters e2695高效液相色谱仪、岛津LC2010A—HT高效液相色谱仪等；超声仪器可以是昆山禾创超声仪器有限公司KH300DB型数控超声波清洗器；天平可以是梅特勒AB104-N万分之一天平、赛多利斯CPA 225D十万分之一天平等；

从图5-8，可以看出，阴性样品及空白试剂均无干扰，供试品分离效果良好。

(1)不同批号对小儿热速清颗粒中葛根素含量的影响

在小儿热速清颗粒的包装中有2g和6g两种标准，选择6个批号，每个批号选择10个包装产品进行称量，检测不同包装间差异，并计算每个批号的平均装量，同时测定每个批号葛根素的含量，如下：

采用不同批号的小儿热速清颗粒进行葛根素含量的测定，装量差异限度在±7％范围内，符合《中国药典》要求，且葛根素含量的检测结果稳定，说明该方法的重现性良好。

(2)提取条件对小儿热速清颗粒中葛根素含量的影响

在A-C中，选择批号为20190320作为测试样品；

A、取样量对小儿热速清颗粒中葛根素含量的影响：

小儿热速清颗粒研磨后，分别取0.4g、0.6g和0.8g，精密称定后，置于具锥形瓶中，加入100ml甲醇，密封，称定重量，经超声处理30min后冷却，称定质量，用甲醇补足减失的重量，摇匀、过滤后取出滤液，测定葛根素含量，经计算后得到，每袋中葛根素的含量，见表1；

表1取样量对小儿热速清颗粒中葛根素含量的影响

取样量g	含量mg/袋
		0.4	4.1
0.6	4.2
		0.8	4.1

从表1中可知，取样量对葛根素含量的检测无影响。

B、第二溶剂种类对小儿热速清颗粒中葛根素含量的影响：

小儿热速清颗粒研磨后，取0.6g，精密称定，至具塞锥形瓶中，分别加30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、乙醇100ml，密塞，称定重量，超声处理(功率100W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，测定葛根素含量，经计算后得到每袋中葛根素的含量，结果见表2，

表2第二溶剂种类对小儿热速清颗粒中葛根素含量的影响

溶媒	含量mg/袋
		30％甲醇	4.0
50％甲醇	4.1
		70％甲醇	4.1
甲醇	4.2
		30％乙醇	4.0
50％乙醇	4.0
		70％乙醇	4.0
乙醇	2.8

从表2中，可知，以甲醇作为第二溶剂具有较好的效果。

C、提取时间对小儿热速清颗粒中葛根素含量的影响；

取小儿热速清颗粒，研磨，取0.6g，精密称定，至具塞锥形瓶中，加甲醇100ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率100W，频率40kHz)10、20、30、60min后，取出，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，测定葛根素含量，经计算后得到每袋中葛根素的含量，结果见表3；

取小儿热速清颗粒装量差异项下的样品适量，研细，取约0.6g，精密称定，至具塞锥形瓶中，加甲醇100ml，密塞，称定重量，加热回流60min，取出，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，测定葛根素含量，经计算后得到每袋中葛根素的含量，结果见表3；

表3不同提取时间考察结果

从表3可知，当提取时间分别为10、20、30、60min时，样品的含量基本无差异；且加热回流与超声处理的结果也无差异，基于工艺上的简便可行与节约资源的目的，因此在对小儿热速清颗粒中葛根素的提取中采用超声的方法。

(3)方法学考察：

D、精密度的考察：

取葛根素对照品溶液，连续进样6针，每次10μL，记录峰面积，结果见表4；

表4精密度实验结果

从表4中可知，精密度实验结果RSD为0.8％，说明仪器的精密度良好。

E、线形范围的考察：

取浓度为0.16104mg/ml的葛根素对照品溶液，稀释制成浓度分别为0.00403mg/ml、0.01006mg/ml、0.02013mg/ml、0.04026mg/ml、0.08052mg/ml的溶液，按上述色谱条件进行检测，记录峰面积，并以进样量μg为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表5和图9；

表5线形实验结果

序号	峰面积	进样量μg
			1	193170	0.0403
2	485150	0.1006
			3	973668	0.2013
4	1954501	0.4026
			5	3895421	0.8052
6	7835805	1.6104

从表5和图9可知，线形回归方程为y＝4865445.779x-6506.640，r＝1.000，线性范围为0.0403μg-1.6104μg，线性关系良好。

F、稳定性实验的考察：

取0.6g小儿热速清颗粒，精密称定，按供试品溶液制备方法制得供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样进行测试，同时记录峰面积，结果见表6；

表6稳定性实验结果

从表6中可知，RSD值为0.6％，说明供试品溶液在24小时内稳定性良好。

G、重复性实验的考察：

取0.6g小儿热速清颗粒，精密称定，按供试品溶液制备方法，平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进行检测分析并计算含量，结果见表7；

表7重复性实验的结果

从表7中可知，重复性试验结果RSD值为0.9％，说明本含量测定方法的重复性良好。

H、回收率实验的考察：

精密称取葛根素对照品0.00985g(含量95.4％)，置于1000ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，浓度为0.009397mg/ml；

取小儿热速清颗粒0.3g，精密称定，至具塞锥形瓶中，精密加入上述对照品溶液100ml，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行分析并计算含量，结果见表8；

表8加样回收率的结果

从表8中可知，RSD值为0.9％，说明本方法对葛根素的回收良好，平均回收率达到97.05％。

I、耐用性的考察：

取小儿热速清颗粒0.6g，精密称定，按供试品溶液制备方法制得供试品溶液，分别按下表进行耐用性考察，结果见表9、表10；

表9色谱柱耐用性考察

表10仪器耐用性考察

从表9、表10和图9-19可知，色谱柱和液相色谱仪对测定结果无明显差别，说明本方法的耐用性良好。

本发明采用等度洗脱对小儿热速清颗粒中的葛根素进行检测，方法简便、重现性和稳定性好，能够快速检测出小儿热速清颗粒中的葛根素，获知小儿热速清颗粒的质量情况，且不受其他成分的干扰和影响。

实施例3

本实施例为20份柴胡、11份金银花和12份连翘的混合药材中提取挥发油的优化实验，所述优化实验包括，

考察水量和蒸馏时间两个因素对提取挥发油的影响；

正交试验，设定水量和蒸馏时间双因素的水平值，然后进行L9(3²)正交试验，参数设置见表11；

根据表11确定的水量和蒸馏时间，将所述混合药材粉碎，加水溶解，然后蒸馏后测定挥发油的提取率，实验结果见表12，得到挥发油的最佳提取条件。

表11挥发油提取实验因素水平表

水平	A加水量(倍)	B蒸馏时间(小时)
			1	0.5	0.5
2	1	1
			3	1.5	1.5

表12挥发油提取率实验结果

实验结果表明：以挥发油提取率为考察指标，加水量1倍量蒸馏时间1.5小时为最佳，挥发油提取率为0.231％，但加水量1倍量蒸馏时间1小时的挥发油提取率为0.230％，两者无明显差异，考虑能耗因素，故选择加水量1倍量蒸馏时间1小时为最佳提取条件。

本发明提供的最佳提取条件为提取连翘、柴胡、金银花三味药的提取挥发油提供了最佳提取条件。

对比例1

本对比例提供了实施例1的两组对比试验，具体为，

对比实验1

本对比实验提供了三种不同展开剂对鉴别结果的影响，具体为，分别采用展开剂Ⅰ：石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(1:1)、展开剂Ⅱ：正己烷-乙酸乙酯(1:1)、展开剂Ⅲ：石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(5:8)三种展开剂，在实施例1中的鉴别条件进行鉴别，实验结果见图20，说明展开剂Ⅱ：正己烷-乙酸乙酯(1:1)、展开剂Ⅲ：石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(5:8)极性较高，斑点虽能够分开，但不圆整且有扩散现象；展开剂Ⅰ石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(1:1)的分离效果最佳，Rf值为0.55，该溶剂可作为小儿快速清颗粒中板蓝根鉴别的展开剂。

对比实验2

本对比实验提供了点样量对鉴别结果的影响，具体为，分别采用5μL、10μL、20μL三种点样量在实施例1中的鉴别条件下进行鉴别，20μL时的分离效果较差，说明本发明提供的点样量对于鉴别板蓝根具有较好的效果。

对比例2

本对比例与实施例2形成对比，提供了一种梯度洗脱检测小儿热速清颗粒中葛根的方法，以乙腈—0.1％磷酸溶液进行梯度洗脱，梯度洗脱程序见表13，测试结果见图21；

表13梯度洗脱程序

梯度洗脱的方式对小儿热速清颗粒供试品分离效果差。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (4)

1.一种小儿热速清颗粒的检测方法，其特征在于，包括板蓝根的检测，其步骤包括，

对照品溶液的制备：取(R，S)-告依春对照品，加入第一溶剂制备得到对照品溶液；

对照药材溶液的制备：板蓝根药材加水煮沸、过滤后得到第一滤液，然后蒸干得到第一残渣，在第一残渣中加水溶解后加入乙酸乙酯，经超声处理后取乙酸乙酯层，蒸干得到第二残渣，在第二残渣中加入第一溶剂溶解后得到对照药材溶液；

供试品溶液的制备：小儿热速清颗粒研磨后加水煮沸、过滤后得到第二滤液，然后蒸干得到第三残渣，在第三残渣中加水溶解后加入乙酸乙酯，经超声处理后取乙酸乙酯层，蒸干得到第四残渣，在第四残渣中加入第一溶剂溶解后得到供试品溶液；

阴性样品溶液的制备：不含板蓝根的小儿热速清颗粒研磨后加水煮沸、过滤后得到第三滤液，然后蒸干得到第五残渣，在第五残渣中加水溶解后加入乙酸乙酯，经超声处理后取乙酸乙酯层，蒸干得到第六残渣，在第六残渣中加入第一溶剂溶解后得到阴性样品溶液；

鉴别：分别吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，依次在同一硅胶薄层板上进行点样；以体积比为1:1的石油醚-乙酸乙酯作为展开剂，展开、取出、晾干，置于紫外光灯下检视；

还包括小儿热速清颗粒中葛根素的检测，

色谱条件与***适应性试验：照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为体积比是10:90的乙腈-0.1％磷酸，等度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温为40℃；检测波长为250nm；

对照品溶液的制备：取葛根素对照品，加入第二溶剂后定容，得到对照品溶液；

供试品溶液的制备：小儿热速清颗粒加入第二溶剂，密封、称量、超声、冷却，然后再次称量，用第二溶剂补足减失的重量，过滤后得到滤液，即为供试品溶液；

阴性供试品溶液的制备：不含葛根素的小儿热速清颗粒加入第二溶剂，密封、称量、超声、冷却，然后再次称量，用第二溶剂补足减失的重量，过滤后得到滤液，即为阴性供试品溶液；

测定法：吸取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液和第二溶剂，注入液相色谱仪，测定；

所述第一溶剂为甲醇；

所述第二溶剂为甲醇；

所述点样的量为5-10μL。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述展开剂的展开温度为5-25℃。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述石油醚的沸点为60-90℃。

4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，还包括从重量份为20份柴胡、11份金银花和12份连翘的混合药材中提取挥发油的优化实验，所述优化实验包括，

考察水量和蒸馏时间对提取挥发油的影响；

正交试验，设定水量和蒸馏时间双因素的水平值，然后进行L9(3²)正交试验；

根据正交试验确定的水量和蒸馏时间，将所述混合药材粉碎，加水溶解，蒸馏，测定挥发油的提取率，确定挥发油的最佳提取条件。

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