CN110398480A - 一种超分辨显微镜 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种超分辨显微镜，包括沿光路依次设置的光源单元、物镜单元、阵列单元以及光电转换单元。所述光源单元用于激发待测样品中的荧光分子发光，形成荧光光斑；所述物镜单元用于放大所述荧光光斑，得到放大荧光光斑；所述阵列单元包括多个矩阵排布的微结构，且所述微结构的尺寸小于所述放大荧光光斑的尺寸。本发明实施例提供的超分辨显微镜，在保证单分子荧光点的z轴定位精度同时，还能简化超分辨显微镜的结构。

Description

一种超分辨显微镜

技术领域

本发明实施例涉及单分子荧光定位超分辨显微技术，尤其涉及一种超分辨显微镜。

背景技术

在单分子荧光定位超分辨显微技术中，随机光学重建显微法(stochasticoptical reconstruction microscopy，STORM)是一种将荧光光谱和显微分析技术应用于单个分子之上的崭新的物理手段，其是一种比传统光学显微镜高10倍以上分辨率的新型显微技术。

该技术通过对分子点发出荧光的点扩散函数(point spread function，PSF)进行定位，xy方向的成像精度可达到纳米级别，但z方向的成像精度远远低于xy方向。现有技术中，可以在成像相机前设置衍射光栅和中继透镜的方法，以提高z方向的成像精度。

但是，中继透镜的使用，使得光路复杂。

发明内容

本发明实施例提供了一种超分辨显微镜，在保证单分子荧光点的z轴定位精度同时，还能简化超分辨显微镜的结构。

本发明实施例提供的一种超分辨显微镜，包括：

沿光路依次设置的光源单元、物镜单元、阵列单元以及光电转换单元；

光源单元用于激发待测样品中的荧光分子发光，形成荧光光斑；

物镜单元用于放大荧光光斑，得到放大荧光光斑；

阵列单元包括多个矩阵排布的微结构，且微结构的尺寸小于放大荧光光斑的尺寸。

进一步地，阵列单元位于物镜单元的像焦平面位置；光电转换单元位于阵列单元的像焦平面位置。

进一步地，阵列单元包括微透镜阵列，微透镜阵列包括多个矩阵排列的微透镜；微透镜的直径d1与放大荧光光斑的直径d2满足d1≤d2/5。

进一步地，微透镜阵列包括折射型微透镜阵列或衍射型微透镜阵列。

进一步地，阵列单元包括小孔阵列，小孔阵列包括多个矩阵排列的小孔；小孔的直径d3与放大荧光光斑的直径d2满足d3≤d2/5。

进一步地，超分辨显微镜还包括会聚透镜，会聚透镜设置于物镜单元和阵列单元之间的光路中。

本发明实施例提供的超分辨显微镜，通过设置阵列单元于物镜单元和光电转换单元之间的光路中，使得放大的荧光光斑通过阵列单元的多个矩阵排布的微结构后成像，在保证单分子荧光点的z轴定位精度同时，还能简化超分辨显微镜的结构。

附图说明

图1是三维高斯光束的示意图；

图2是本发明实施例提供的一种超分辨显微镜的结构示意图；

图3是图2中椭圆虚线框部分的光路放大示意图；

图4是理想平面光束经过阵列单元后的成像示意图；

图5是本发明实施例提供的放大光斑经过阵列单元后的成像示意图；

图6是本发明实施例提供的另一种超分辨显微镜的结构示意图；

图7是荧光经过单个微透镜时的光路示意图；

图8是本发明实施例提供的又一种超分辨显微镜的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部结构。

STORM技术是一种利用光控开关探针实现单分子发光与重组成像的技术。在每次激发过程中，只使细胞内的一小部分荧光分子发光，而不是全部。在一次激发中，荧光分子发射出一定数目的光子，经过光学器件的调制，最终在显微镜的成像单元中形成成像光斑，该成像光斑的中心位置反映了光线发出的位置，从而能够确定荧光分子所在的位置。在下一次激发中，可以确定另外一部分荧光分子的位置。把这许多次激发的结果叠加，从而实现待测样品的重组成像。为了实现三维超分辨成像，STORM技术一般在照相机平面和物镜之间的光路中加入柱状透镜，以此引入非对称性来实现三维成像，但是其纵向定位精度远低于横向定位精度，且随成像深度增加，精度会快速下降。

显微镜是经过良好校正的接近衍射极限的光学***，因此聚焦于像点的成像光束可以近似看成高斯光束，成像光束的分布可以近似为高斯光束的分布。图1是三维高斯光束的示意图。将荧光分子所在位置称为物点，对应成像光斑的中心位置称为像点。参见图1，对于荧光分子的横向(x和y方向)定位，只需要计算光斑的在x和y方向的质心位置即可。而对于荧光分子的纵向(z方向)定位，当物点位于物方焦平面时，像点位于像方焦平面，成像光束的波前为平面，对应高斯光束的束腰位置；当物点偏离物方焦平面，即存在离焦时，像点也会相应的偏离像方焦平面，成像光束的波前为球面，对应高斯光束的曲面位置。正是由于在离焦的情况下，光斑直径的变化并不显著，导致z方向的定位精度较低。

根据几何光学理论，由像点的离焦量，可以计算出物点的离焦量，从而精准确定物点在z轴方向上的位置。而高斯光束中，距束腰位置的距离为z的光波的波前曲率半径R(z)与z存在如下关系：

其中，w₀为高斯光束的束腰半径，是一个确定的值，由显微镜的物镜数值孔径和横向放大率共同决定。因此，只要能测量出成像光斑的波前曲率半径R(z)，就能够得到像点的离焦量z，从而得到物点的离焦量，实现对荧光分子z方向的准确定位。基于上述原理，提出本发明实施例的技术方案：

图2为本发明实施例提供的一种超分辨显微镜10的结构示意图。本实施例可适用于单分子荧光点三维定位情况。如图2所示，该超分辨显微镜10具体包括：沿光路依次设置的光源单元110、物镜单元120、阵列单元130以及光电转换单元140。光源单元110用于激发待测样品中的荧光分子发光，形成荧光光斑；物镜单元120用于放大荧光光斑，得到放大荧光光斑；阵列单元130包括多个矩阵排布的微结构，且微结构的尺寸小于放大荧光光斑的尺寸。

其中，光源单元110发出的光能够激发被测试样品中的分子点发出荧光。示例性的，光源单元110可以为激光光源，该激光光源的波长可为632nm。物镜单元120为现有显微镜中的光学器件的组合，本发明实施例对此不做限定，本领域技术人员可根据测试需求设置物镜单元120中的光学器件。阵列单元130是指由多个微型光学器件成矩阵排布形成的一种光学器件，微型光学器件的尺寸小于放大荧光光斑的尺寸，从而保证荧光光斑可以被多个微型光学器件所采集。微型光学器件的形状可以是矩形、圆形、方形等，本发明实施对此不做限定。光电转换单元140可以包括相机和处理器，能够对分子点发出的荧光光斑进行成像，并经过后续的数据处理，实现对分子点的空间定位。示例性的，相机可为电荷耦合元件(Charge-coupled Device，CCD)相机或互补金属氧化物半导体(Complementary MetalOxide Semiconductor，CMOS)相机。

图3是图2中椭圆虚线框1部分的光路放大示意图。示例性的，本实施例中的超分辨显微镜10为有限共轭显微镜，如图3所示，分子点发出的荧光光斑经过物镜单元120后形成放大的荧光光斑，该放大的荧光光斑可被阵列单元130中的多个微型光学器件所采集，从而在各个微型光学器件对应的成像区域内会聚形成单个成像光斑。

图4是理想平面光束经过阵列单元130后的成像示意图，图5是本发明实施例提供的放大光斑经过阵列单元130后的成像示意图。图4和图5中所示矩阵排布的方格表示各个微型光学器件对应的成像区域。如图4所示，若荧光分子位于物方焦平面，则其成像光束在微型光学器件处的波面为理想平面，那么，经各个微型光学器件采集后会聚形成的各个成像光斑均位于对应成像区域的中心位置。如图5所示，当荧光分子偏离物方焦平面时，其成像光束在微型光学器件处的波面为球面，经过各个微型光学器件后会聚形成的成像光斑偏离中心位置，并且呈一定规律排布。

本方案的工作原理：放大的荧光光斑经阵列单元130的多个微型光学器件采集后会聚在光电转换单元140中形成图像。其中，荧光的光强度包络与不存在阵列单元130时的PSF的光强度分布是一致的，通过质心位置的计算，可以获得分子点x和y的坐标。而通过放大荧光光斑经过各微型光学器件后会聚形成的各个成像光斑的分布，则可以得到各个成像光斑相对于中心位置的偏移量，光电转换单元140可以根据该偏移量，计算出整个成像光斑的波前形状，通过这个波前形状可以直接计算得到成像光斑的波前曲率半径，基于上述原理可知，根据此波前曲率半径可以计算出成像光斑在z方向的离焦量，进而计算出发射荧光的分子点的离焦量，从而精准确定该分子点的z轴坐标。

本发明实施例提供的超分辨显微镜10，通过设置阵列单元130于物镜单元120和光电转换单元140之间的光路中，使得放大的荧光光斑通过阵列单元130的多个矩阵排布的微结构后成像，简化了现有的超分辨显微镜10的结构，提高了单分子荧光点的Z轴定位精度。

需要说明的是，图2所示的超分辨显微镜10中，还包括设置在物镜单元120和阵列单元130光路之间的半透半反单元150，用于反射光源单元110发出的光，使该反射光经过物镜单元120后激发待测样品中的分子点发出荧光，此设计可以减小超分辨显微镜10的体积。在本发明实施例的其他实施方式中，光源单元110也可以设置在其他位置，根据需要选择是否需要设置半透半反单元150或其他光学器件，本发明实施例对此不做限定。

示例性的，图6是本发明实施例提供的另一种超分辨显微镜10的结构示意图，如图6所示，光源单元110位于样品台的一侧，此时光源单元110发出的光直接激发待测样品分子点发出荧光，而且物镜单元120也只需要对待测样品产生的荧光进行调制，有利于简化物镜单元120内部的光学元件设置，降低物镜单元120和超分辨显微镜10的设计难度。

在上述实施例的基础上，可选的，阵列单元130位于物镜单元120的像焦平面位置，光电转换单元140位于阵列单元130的像焦平面位置。

可以理解的，通过将阵列单元130设置于物镜单元120的像焦平面，以及将光电转换单元140设置于阵列单元130的像焦平面，可以使成像更加清晰，提高分子点的定位精度。

可选的，阵列单元130可以包括微透镜阵列，该微透镜阵列包括多个矩阵排列的微透镜。

具体的，通过微透镜阵列和光电转换单元140可以构成波前传感器，从而得到整个成像光斑的波前形状，通过这个波前形状可以直接计算得到成像光斑的波前曲率半径，从而计算出成像光斑的离焦量，进而得到发射荧光的分子点的离焦量，从而精准确定该分子点的z轴坐标。另外，由于微透镜阵列的微透镜填充率几乎可以接近100％，且不存在衍射光栅器件的衍射效率问题(只考虑一级干涉时，光的利用率仅为66％)，因此可以大大提高光的利用率(理论上可以达到100％)，提高对于较暗的分子点的精准定位。

具体的，图7是荧光光斑经过单个微透镜时的光路示意图。图7中以细实线表示平面波前，以细虚线表示球面波前，以带箭头的细实线表示平面波前的光路，以带箭头的细虚线表示球面波前的光路，以带双向箭头的粗实线表示单个微透镜。如图7所示，平面光波会沿微透镜的光轴传播，最终在微透镜的焦平面的中心位置形成光点。对于球面光波，在单个微透镜收集的小截面光束上，其波前近似可以看作是平面的，但是球面光波不再沿光轴传播，而是会有一定的传播角θ，因此，在微透镜的焦平面上形成的光点会偏离中心位置。因此，放大荧光光斑经过微透镜阵列后，会在光电转换单元140上形成如图5所示的偏离各位透镜成像中心位置的具有一定排列规则的光点分布。利用微透镜的焦距以及各光点与中心位置的相对位移，可以计算出单个微透镜采集到的光束的传播角θ，从而得出波前的局部形状。通过所有光点相对位移的二维积分可以计算出整个成像光斑的波前形状。根据该波前形状，可以计算得到成像光斑的波前曲率半径，根据此波前曲率半径，计算出成像光斑的离焦量，进而得到发射荧光的分子点的离焦量，从而精准确定该分子点的z轴坐标。

可选的，微透镜的直径d1与放大荧光光斑的直径d2满足d1≤d2/5。

可以理解的，为保证分子点的定位精度，至少要使放大荧光光斑能够被5个微透镜采集到。在本发明实施例的其他实施方式中，也可以通过改变物镜单元120中光学器件的参数，进而增大荧光光斑的尺寸的方法，来达到使放大光斑被较多数量的微透镜采集的目的，因此本发明实施例所提供的微透镜的尺寸范围并非限定。

可选的，微透镜阵列可以为折射型微透镜阵列或衍射型微透镜阵列，本发明实施例对此不做限定。

可选的，阵列单元130还可以包括小孔阵列，该小孔阵列包括多个矩阵排列的小孔，小孔的直径d3与放大荧光光斑的直径d2满足d3≤d2/5。

其中，小孔阵列的作用原理和效果相当于微透镜阵列，属于一种替代方案，在此不再赘述。

图8是本发明实施例提供的又一种超分辨显微镜10的结构示意图。如图8所示，可选的，该超分辨显微镜10还包括会聚透镜160，该会聚透镜160设置于物镜单元120和阵列单元130之间的光路中。

示例性的，会聚透镜160可以是管透镜(Tube lens)，当使用无限共轭显微镜时，光束经过物镜单元120射出后，几乎为平行光束，该会聚透镜160则用于将经过物镜单元120的光束会聚到阵列单元130上。需要说明的是，当经过物镜单元120的光束可以直接会聚到阵列单元130时，即，使用有限共轭显微镜时，也可以使用该会聚透镜160，本发明实施例对此不做限定。

需要说明的是，图2和图8中以带箭头的细实线代表荧光的传播路径，以带箭头的细虚线代表光源单元110发出的光束的传播路径；图8中以带有双向箭头的加粗实线代表会聚透镜160中的透镜。在实际超分辨显微镜结构中，会聚透镜160中的透镜的数量可根据超分辨率显微镜的实际需求设置，本发明实施例对此不作限定。

另外，需要说明的是，图2、图6和图8中仅示例性的示出了超分辨率显微镜10中与本申请相关的核心部件，超分辨率显微镜还可包括本领域技术人员可知的其他光学元件或机械部件，本发明实施例对此不作限定，例如可以包括设置于阵列单元之前的荧光滤光片，用于过滤出荧光，排除激光的干扰。

注意，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。

Claims (6)

1.一种超分辨显微镜，其特征在于，包括：沿光路依次设置的光源单元、物镜单元、阵列单元以及光电转换单元；

所述光源单元用于激发待测样品中的荧光分子发光，形成荧光光斑；

所述物镜单元用于放大所述荧光光斑，得到放大荧光光斑；

所述阵列单元包括多个矩阵排布的微结构，且所述微结构的尺寸小于所述放大荧光光斑的尺寸。

2.根据权利要求1所述的超分辨显微镜，其特征在于，所述阵列单元位于所述物镜单元的像焦平面位置；所述光电转换单元位于所述阵列单元的像焦平面位置。

3.根据权利要求1所述的超分辨显微镜，其特征在于，所述阵列单元包括微透镜阵列，所述微透镜阵列包括多个矩阵排列的微透镜；

所述微透镜的直径d1与所述放大荧光光斑的直径d2满足d1≤d2/5。

4.根据权利要求3所述的超分辨显微镜，其特征在于，所述微透镜阵列包括折射型微透镜阵列或衍射型微透镜阵列。

5.根据权利要求1所述的超分辨显微镜，其特征在于，所述阵列单元包括小孔阵列，所述小孔阵列包括多个矩阵排列的小孔；

所述小孔的直径d3与所述放大荧光光斑的直径d2满足d3≤d2/5。

6.根据权利要求1所述的超分辨显微镜，其特征在于，还包括会聚透镜，所述会聚透镜设置于所述物镜单元和所述阵列单元之间的光路中。