CN110396522B

CN110396522B - 调控木质素提高块根作物产量的应用技术

Info

Publication number: CN110396522B
Application number: CN201810366885.5A
Authority: CN
Inventors: 张鹏; 王红霞; 杨楠; 殷旻昊; 钟英英; 张延娣
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2018-04-23
Filing date: 2018-04-23
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2038-04-23
Also published as: CN110396522A

Abstract

本发明涉及调控木质素提高块根作物产量的应用技术。本发明揭示了一种与块根或块茎类植物的产量性状密切相关的基因――4CL1，及其编码蛋白。本发明公开了这种4CL1基因的用途，尤其是用于增加块根或块茎植物的产量。

Description

调控木质素提高块根作物产量的应用技术

技术领域

本发明属于植物学领域，更具体地，本发明涉及调控木质素提高块根作物产量的应用技术。

背景技术

薯类植物主要指具有可供食用块根或地下茎的一类陆生作物。有块根、块茎类，如番薯(红薯、甘薯)、木薯、马铃薯、薯蓣(山药)、脚板薯等，多行无性繁殖，只留薯块作种，并可以用藤本进行繁殖。这类植物一般耐寒力较弱，多在无霜季节栽培，低温会抑制薯类作物的生长，造成块根或块茎的减产，因此种植薯类作物应尽量避免长时间的低温期；此外，疏松、肥沃、深厚的土壤和多量钾肥有利于提高薯类作物产量及品质。

以甘薯为代表的薯类作物，是世界上重要的粮食、饲料和工业原料作物，在保证中国生物质能和粮食安全等方面具有重要作用。甘薯属旋花科，甘薯属，甘薯种，为蔓生性草本植物。甘薯植株可分为根、茎、叶、花、果实、种子等部分。甘薯是一种重要的粮食作物，也是食品加工业的重要原料，营养价值丰富。因此，甘薯品种优化以及培植、再生技术的研究具有重要的意义。常见的与甘薯一样具有块根结构的植物还有：木薯，紫薯，何首乌呢等，而马铃薯为块茎植物。

薯类植物的储藏根是重要的储能器官，储藏根的发育是一个复杂的生物学过程，包括膨大启始和后续加厚等。这些过程不仅受内源激素和基因的调控，还受外界环境的影响。然而，目前对于调控储藏根膨大发育的分子机制还知之甚少。

因此，本领域有必要研究薯类植物中能够调控薯类植物的储藏根的优良基因，从而为植物的改良提供新的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供木质素合成通路基因4CL1显著提高块根产量的应用。

在本发明的第一方面，提供一种提高块根植物(作物)或块茎植物(作物)的产量的方法，所述方法包括：在块根或块茎植物中增加4-香豆酸-辅酶A-连接酶(4CL1多肽)的表达或活性。

在一个优选例中，所述的块根植物或块茎植物是薯类植物。

在另一优选例中，所述的块根植物或块茎植物包括(但不限于)：甘薯、紫薯、木薯、甘薯、马铃薯、山药、芋头、葛根、魔芋、洋姜、雪莲果。

在另一优选例中，所述的4-香豆酸-辅酶A-连接酶选自下组：

(a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；

(c)与(a)限定的多肽序列有85％以上(较佳地90％以上，更佳地95％以上，如98％以上，99％以上)同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(d)具有(a)蛋白功能的SEQ ID NO:2的蛋白片段。

在另一优选例中，所述的4-香豆酸-辅酶A-连接酶是外源的4-香豆酸-辅酶A-连接酶，通过重组方式将编码4-香豆酸-辅酶A-连接酶的多核苷酸引入到块根植物或块茎植物中。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：

(i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含编码4-香豆酸-辅酶A-连接酶的多核苷酸；

(ii)利用农杆菌使所述编码4-香豆酸-辅酶A-连接酶的多核苷酸转入块根植物或块茎植物。

在另一优选例中，所述的块根植物或块茎植物是甘薯。

在另一优选例中，所述的提高块根植物或块茎植物的产量包括：

增大块根植物或块茎植物的储藏根；和/或

增加块根植物或块茎植物的牛蒡根数量。

在另一优选例中，还包括给予块根植物或块茎植物激素处理，所述的激素选自：MeJA、GA、IAA、6-BA或ABA；

较佳地，给予：

MeJA：100～800uM；

GA：50～1500uM；

IAA：80～300uM；

6-BA：10～1500uM；

ABA：10～1500uM。

在本发明的另一方面，提供一种4-香豆酸-辅酶A-连接酶或编码该多肽的多核苷酸的用途，用于提高块根植物或块茎植物的产量。

在一个优选例中，所述的提高块根植物或块茎植物的产量包括：增大块根植物或块茎植物的储藏根。

在本发明的另一方面，提供一种4-香豆酸-辅酶A-连接酶或编码该多肽的多核苷酸的用途，用于作为鉴定植物的产量的分子标记物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、甘薯4CL基因家族成员4792(4CL1)、5346(4CL2)、380(4CL3)、675(4CL4)在野生型甘薯中的组织特异性表达。

Lf表示：叶色(leaf color)；St表示茎；

Ft1表示：白色须根(white fibrous root)；

Ft2表示：红色须根(red fibrous root)；

Dt表示：发育根(development root)；

Mt表示：成熟根(mature root)。

图2、Ib4CL1超表达载体的构建及转化甘薯愈伤。

A～J、愈伤组织的制备以及转基因植物的获得。

K、构建Ib4CL1超表达载体的构建物的示意图。

图3、Real-time PCR检测转基因植株中Ib4CL1的表达量。其中，OE4CL1-1、OE4CL1-2、OE4CL1-7分别表示转基因培育后获得的几株具体的转基因植株。

图4、Ib4CL1超表达的表型及产量。

A、Ib4CL1超表达的表型；

B、间苯三酚对甘薯茎的染色；

C、生长二个月植株的储藏根及牛蒡根数量的统计；

D、生长二个月植株产量的统计；

其中，OE4CL1-1、OE4CL1-2、OE4CL1-3分别表示转基因培育后获得的几株具体的转基因植株。

图5、Ib4CL1超表达植株块根在大田的表型及产量统计。

A、Ib4CL1超表达植株块根在大田的表型；

B、Ib4CL1超表达植株块根产量统计。

图6、不同浓度的MeJA、GA、IAA、6-BA、ABA对于Ib4CL1的表达的影响的柱形图。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了一种与块根或块茎类植物的产量性状密切相关的基因――4-香豆酸-辅酶A-连接酶(4CL1)，及其编码蛋白。本发明还公开了这种4CL1基因的用途，尤其是用于增加块根或块茎植物的产量，具有极为显著的优异性能。

4CL1是木质素合成通路中的基因，该基因的表达能引起甘薯茎中木质素含量的提高，本发明人首次发现Ib4CL1能引起储藏根变大，从而显著提高产量。

本发明的4CL1蛋白(多肽)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明还包括4CL1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的4CL1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种4CL1蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，4CL1蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的4CL1蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长4CL1蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长4CL1蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本发明中，术语“4CL1蛋白”指具有4CL1蛋白活性的SEQ ID NO:2序列的多肽。该术语还包括具有与4CL1蛋白相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端(特别是N末端)添加或缺失一个或数个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端(特别是N末端)添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括4CL1蛋白的活性片段和活性衍生物。

任何与所述的4CL1蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO:2所示的序列的同源性为50％或更高；优选的，同源性为60％或更高；优选的，同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有4CL1蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。

本发明还涉及编码本发明4CL1蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的4CL1蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或4CL1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

本发明中，4CL1蛋白多核苷酸序列可***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中***增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。

在本发明的优选实施例中，本发明人克隆了木质素通路的4CL基因并构建超表达载体，转化甘薯，得到35S::Ib4CL1在甘薯中的转基因植株。之后，在山东和上海二地的田间实验数据发现，转基因植株甘薯的块根产量显著提高。不同区域的中试实验已经表明，转基因植株甘薯的产量都有提高。体内实验表明，Ib4CL1可能引起茉莉酸甲酯(MeJA)含量的变化去调节甘薯储藏根的发育。

因此，本发明提供了所述的4CL1蛋白或其编码基因的用途，用于提高块根或块茎植物的产量；包括：增大块根植物或块茎植物的储藏根和/或增加块根植物或块茎植物的牛蒡根数量。

本发明还涉及一种改良植物的方法，该方法包括提高所述块根或块茎植物中4CL1蛋白的表达。在得知了所述的4CL1蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来提高所述的4CL1蛋白的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带4CL1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的4CL1蛋白。

优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：

(1)将外源的4CL1蛋白的编码多核苷酸转入植物组织、器官或组织，获得转化入4CL1蛋白的编码多核苷酸的植物组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了外源4CL1蛋白的编码多核苷酸的植物组织、器官或种子再生成植物植株。

其它增加4CL1基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强4CL1基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该4CL1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。

此外，本发明还涉及利用4CL1蛋白或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用4CL1蛋白或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中4CL1蛋白的表达情况，鉴定植物的产量特征，储藏根特征。以及利用4CL1蛋白或其编码基因进行改良品种的筛选。

本发明首次发现木质素通路中4CL1基因在块根或块茎植物的储藏根膨大发育中发挥着重要作用，超表达该基因，能引起块根或块茎植物的膨大提前并能显著提高块根或块茎植物的产量，从而产生更多的经济效益。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、Ib4CL的克隆及序列分析

利用同源克隆的方法克隆到一个木质素代谢通路的功能的4CL基因，本发明人将该基因命名为Ib4CL1。

Ib4CL1编码区核苷酸长1710bp，编码569个氨基酸的多肽。

Ib4CL1的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:1)：

ATGCTATCTGTGGAAACTCAGAAACCAGAGCTTGAAGTTGCAGATTCTGGGAAGACACAAGCACAGTCTTCCCAGATTCATATTTTCCGATCGAGGTTGCCGGATATACCCATCCCCAATCAAATCCCACTCCATACTTATTGTTTCCAGAATCTGGCCGAGTACCGGGACCGGACATGTCTCATCGTGGGTTCCACCGGAAAAACATATTCCTTCGCCGAAACCCATTTGATTTGCCGGAAAGTCGCGTCGGGATTGGCCAAACTCGGGGTTAAGAAGGGGGATGTGATTATGACCCTATTTCAGAACTGCCCGGAGTTTGTTTTCTCCTTCATGGGGGCTTCTATGATCGGCGCCGTCACCACCACGGCCAACCCTTTCTACACCAAAGCCGAGATTTTTAAGCAGATGAGTGCTTCCAAGGCGAAGGTTGTCATTACCCAATCTGTGTACGTAGAAAAGCTCAAAGATGCCGGCGAGGAGAACCCTAAAATCGGGGAGGATTTCTCGGTGGTCACCATCGATGACCCGCCGGAAAATTGCTTGCATTTCTCCGTGCTGTCGGAGGCCGACGAGGAGGATATGCCGGCGACGGTGGAAATCGCCCCTGACGACGCCGTGGCTCTGCCGTTCTCTTCCGGGACTACCGGGCTGCCGAAAGGAGTGGTGTTGACCCACAAGAGCTTGATCACCAGCGTGGCCCAGCAAGTCGACGGCGAGAACCCGAACTTATACCTCAAGGAAGACGACGTCGTTCTGTGCGTGCTACCATTGTTCCACATATTTTCCCTCAACTCCGTTCTCCTCTGCTCCCTCCGAGCAGGGGCGGCGGTGCTGCTGATGCAGAAATTCGAAATCAAATCGTTGCTGGAGCTGATAAAGAAGCACCGGGTGTCCGTGGCGGCGGTGGTGCCGCCGCTGGTCCTGGCGCTGGCCAAGAATCCGATCGTGGATTCCTACGATTTGAGCTCGATTCGGGTGGTGCTCTCCGGCGCGGCGCCGCTGGGGAAGGAGCTGGAGGAGGCCCTCCATCAGAGAGTCCCTCAGGCCATTTTTGGTCAGGGTTATGGAATGACTGAGGCAGGGCCAGTATTGTCAATGTGTCCGGCTTTCGCGAAGCAGGCGCTGCCTGCTAAATCCGGCTCATGCGGCTCAGTAGTGAGGAACGCGGAGCTGATGGTGGTAGATCCGGAAACCGGCTGCTCCCTTGGCCGCAACCAACCCGGAGAGATTTGCATACGCGGCTCTCAAATCATGAAAGAGTATTTGAATGATCCGGCGGCCACCGCTCGGACTATTGACGTGGATGGCTGGCTCCATACCGGCGACATTGGCTATGTAGACGATGACGATGAAGTTTTCATCGTCGATAGAGTGAAAGAACTCATCAAATTTAAAGGCTTCCAGGTGCCACCAGCTGAGCTTGAGGCTCTGCTTCTGAGCCACCCGATGATTGCAGATGCTGCTGTCGTACCGCAAAAAGATGATGCAGCCGGAGAAGTCCCTGTTGCGTTTGTGGTTCGATCCGCGGATGGATTTGATCTCACTGAAGAAGCTGTAAAGGAATTTATTGCCAAACAGGTGGTATTTTATAAGAAGTTACACAAGGTATACTTTATTCATGCAATTCCAAAATCAGCATCCGGAAAAATATTGAGAAAAGAGCTCCGGGAAAAACTACAAGCTGCGCCACCTTCCACGCCGCAATAA

Ib4CL1的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2)：

MLSVETQKPELEVADSGKTQAQSSQIHIFRSRLPDIPIPNQIPLHTYCFQNLAEYRDRTCLIVGSTGKTYSFAETHLICRKVASGLAKLGVKKGDVIMTLFQNCPEFVFSFMGASMIGAVTTTANPFYTKAEIFKQMSASKAKVVITQSVYVEKLKDAGEENPKIGEDFSVVTIDDPPENCLHFSVLSEADEEDMPATVEIAPDDAVALPFSSGTTGLPKGVVLTHKSLITSVAQQVDGENPNLYLKEDDVVLCVLPLFHIFSLNSVLLCSLRAGAAVLLMQKFEIKSLLELIKKHRVSVAAVVPPLVLALAKNPIVDSYDLSSIRVVLSGAAPLGKELEEALHQRVPQAIFGQGYGMTEAGPVLSMCPAFAKQALPAKSGSCGSVVRNAELMVVDPETGCSLGRNQPGEICIRGSQIMKEYLNDPAATARTIDVDGWLHTGDIGYVDDDDEVFIVDRVKELIKFKGFQVPPAELEALLLSHPMIADAAVVPQKDDAAGEVPVAFVVRSADGFDLTEEAVKEFIAKQVVFYKKLHKVYFIHAIPKSASGKILRKELREKLQAAPPSTPQ*

不同的甘薯4CL基因家族成员4792(4CL1)、5346(4CL2)、380(4CL3)、675(4CL4)在野生型甘薯中的组织(根、茎、叶、根)的特异性表达情况如图1所示。

实施例2、Ib4CL1超表达载体的构建及转化甘薯

以甘薯cDNA为模板，以引物5’-cggggtaccatgctatctgtggaaactca-3’(SEQ ID NO:3)和5’-aactgcagttattgcggcgtggaaggtg-3’(SEQ ID NO:4)进行扩增，获得扩增产物。

pCambia1301为表达载体，在该表达载体的KPNI/PstI位点***Ib4CL1编码序列(即前述的扩增产物)。该获得的重组表达载体，其结构示意图如图2K，可以以烟草花叶病毒的35S启动子启动Ib4CL1的表达。

将上述构建的重组表达载体转化甘薯的愈伤组织，用潮霉素作为转化阳性苗的抗性筛选标记。其中，愈伤组织的制备以及转基因植物的获得如图2A～J。

约6个月的时间后，获得Ib4CL1超表达的转基因植株。同时用Southern Blot和Real-time PCR对获得的转基因植株进行检测。

Real-time PCR检测转基因植株中Ib4CL1的表达量的结果如图3。结果表明，转基因植株中Ib4CL1的表达量相对野生型显著升高。

实施例3、Ib4CL1超表达植株的表型及产量

观察Ib4CL1超表达甘薯植株的表型发现，在温室生长2个月的转基因植株相比野生型茎短且粗壮，顶端聚集花青素(图4A)。

对转基因植株的茎用间苯三酚染色后发现，相比野生型颜色加深(图4B)，说明聚集了更多地木质素，即Ib4CL1超表达植株茎中的木质素含量提高，茎伸长生长受影响，茎变得短粗。

同时，也对2个月甘薯植株的产量进行统计发现，转基因甘薯植株的储藏根及牛蒡根数量显著高于野生型(图4C)；转基因甘薯植株的产量明显高于野生型，说明转基因植株的块根膨大相比野生型提前(图4D)。

实施例4、Ib4CL1超表达植株块根在大田的表型及产量统计

将转基因甘薯植株在2017年7月和5月，于山东和上海二地的田间进行大田种植，同时种植野生型甘薯作为对照。在分别种植4个月和6个月时间后，收获甘薯，观察表型，并进行产量统计比较。

结果显示，转基因甘薯植株在大田的产量比野生型甘薯显著提高，如OE4CL1-2的产量达到6kg/株，是野生型的4倍多，整体转基因甘薯株系的产量相比野生型都有显著提高，如图5A-B。这为工业应用及食品的安全性提供了更多的经济价值及保障。

实施例5、不同的外源激素处理甘薯及Ib4CL1基因的表达

Ib4CL1基因的过表达引起块根的膨大及增产，本发明人猜想可能和激素的调节有关，具体是什么激素起调节作用还不清楚，因此本发明人用不同浓度(0～1000uM)的激素处理。选取最适浓度的激素，在用最适浓度激素的不同时间去处理甘薯的野生型，检测Ib4CL1的表达，从而推测可能的调控Ib4CL1的表达的激素。

结果如图6，茉莉酸甲酯(MeJA)、GA、IAA、6-BA、ABA对于Ib4CL1的表达存在影响，并且存在最适宜的处理浓度。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 调控木质素提高块根作物产量的应用技术

<130> 179649

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1710

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 1

atgctatctg tggaaactca gaaaccagag cttgaagttg cagattctgg gaagacacaa 60

gcacagtctt cccagattca tattttccga tcgaggttgc cggatatacc catccccaat 120

caaatcccac tccatactta ttgtttccag aatctggccg agtaccggga ccggacatgt 180

ctcatcgtgg gttccaccgg aaaaacatat tccttcgccg aaacccattt gatttgccgg 240

aaagtcgcgt cgggattggc caaactcggg gttaagaagg gggatgtgat tatgacccta 300

tttcagaact gcccggagtt tgttttctcc ttcatggggg cttctatgat cggcgccgtc 360

accaccacgg ccaacccttt ctacaccaaa gccgagattt ttaagcagat gagtgcttcc 420

aaggcgaagg ttgtcattac ccaatctgtg tacgtagaaa agctcaaaga tgccggcgag 480

gagaacccta aaatcgggga ggatttctcg gtggtcacca tcgatgaccc gccggaaaat 540

tgcttgcatt tctccgtgct gtcggaggcc gacgaggagg atatgccggc gacggtggaa 600

atcgcccctg acgacgccgt ggctctgccg ttctcttccg ggactaccgg gctgccgaaa 660

ggagtggtgt tgacccacaa gagcttgatc accagcgtgg cccagcaagt cgacggcgag 720

aacccgaact tatacctcaa ggaagacgac gtcgttctgt gcgtgctacc attgttccac 780

atattttccc tcaactccgt tctcctctgc tccctccgag caggggcggc ggtgctgctg 840

atgcagaaat tcgaaatcaa atcgttgctg gagctgataa agaagcaccg ggtgtccgtg 900

gcggcggtgg tgccgccgct ggtcctggcg ctggccaaga atccgatcgt ggattcctac 960

gatttgagct cgattcgggt ggtgctctcc ggcgcggcgc cgctggggaa ggagctggag 1020

gaggccctcc atcagagagt ccctcaggcc atttttggtc agggttatgg aatgactgag 1080

gcagggccag tattgtcaat gtgtccggct ttcgcgaagc aggcgctgcc tgctaaatcc 1140

ggctcatgcg gctcagtagt gaggaacgcg gagctgatgg tggtagatcc ggaaaccggc 1200

tgctcccttg gccgcaacca acccggagag atttgcatac gcggctctca aatcatgaaa 1260

gagtatttga atgatccggc ggccaccgct cggactattg acgtggatgg ctggctccat 1320

accggcgaca ttggctatgt agacgatgac gatgaagttt tcatcgtcga tagagtgaaa 1380

gaactcatca aatttaaagg cttccaggtg ccaccagctg agcttgaggc tctgcttctg 1440

agccacccga tgattgcaga tgctgctgtc gtaccgcaaa aagatgatgc agccggagaa 1500

gtccctgttg cgtttgtggt tcgatccgcg gatggatttg atctcactga agaagctgta 1560

aaggaattta ttgccaaaca ggtggtattt tataagaagt tacacaaggt atactttatt 1620

catgcaattc caaaatcagc atccggaaaa atattgagaa aagagctccg ggaaaaacta 1680

caagctgcgc caccttccac gccgcaataa 1710

<210> 2

<211> 569

<212> PRT

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 2

Met Leu Ser Val Glu Thr Gln Lys Pro Glu Leu Glu Val Ala Asp Ser

1 5 10 15

Gly Lys Thr Gln Ala Gln Ser Ser Gln Ile His Ile Phe Arg Ser Arg

20 25 30

Leu Pro Asp Ile Pro Ile Pro Asn Gln Ile Pro Leu His Thr Tyr Cys

35 40 45

Phe Gln Asn Leu Ala Glu Tyr Arg Asp Arg Thr Cys Leu Ile Val Gly

50 55 60

Ser Thr Gly Lys Thr Tyr Ser Phe Ala Glu Thr His Leu Ile Cys Arg

65 70 75 80

Lys Val Ala Ser Gly Leu Ala Lys Leu Gly Val Lys Lys Gly Asp Val

85 90 95

Ile Met Thr Leu Phe Gln Asn Cys Pro Glu Phe Val Phe Ser Phe Met

100 105 110

Gly Ala Ser Met Ile Gly Ala Val Thr Thr Thr Ala Asn Pro Phe Tyr

115 120 125

Thr Lys Ala Glu Ile Phe Lys Gln Met Ser Ala Ser Lys Ala Lys Val

130 135 140

Val Ile Thr Gln Ser Val Tyr Val Glu Lys Leu Lys Asp Ala Gly Glu

145 150 155 160

Glu Asn Pro Lys Ile Gly Glu Asp Phe Ser Val Val Thr Ile Asp Asp

165 170 175

Pro Pro Glu Asn Cys Leu His Phe Ser Val Leu Ser Glu Ala Asp Glu

180 185 190

Glu Asp Met Pro Ala Thr Val Glu Ile Ala Pro Asp Asp Ala Val Ala

195 200 205

Leu Pro Phe Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Val Leu

210 215 220

Thr His Lys Ser Leu Ile Thr Ser Val Ala Gln Gln Val Asp Gly Glu

225 230 235 240

Asn Pro Asn Leu Tyr Leu Lys Glu Asp Asp Val Val Leu Cys Val Leu

245 250 255

Pro Leu Phe His Ile Phe Ser Leu Asn Ser Val Leu Leu Cys Ser Leu

260 265 270

Arg Ala Gly Ala Ala Val Leu Leu Met Gln Lys Phe Glu Ile Lys Ser

275 280 285

Leu Leu Glu Leu Ile Lys Lys His Arg Val Ser Val Ala Ala Val Val

290 295 300

Pro Pro Leu Val Leu Ala Leu Ala Lys Asn Pro Ile Val Asp Ser Tyr

305 310 315 320

Asp Leu Ser Ser Ile Arg Val Val Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Gly

325 330 335

Lys Glu Leu Glu Glu Ala Leu His Gln Arg Val Pro Gln Ala Ile Phe

340 345 350

Gly Gln Gly Tyr Gly Met Thr Glu Ala Gly Pro Val Leu Ser Met Cys

355 360 365

Pro Ala Phe Ala Lys Gln Ala Leu Pro Ala Lys Ser Gly Ser Cys Gly

370 375 380

Ser Val Val Arg Asn Ala Glu Leu Met Val Val Asp Pro Glu Thr Gly

385 390 395 400

Cys Ser Leu Gly Arg Asn Gln Pro Gly Glu Ile Cys Ile Arg Gly Ser

405 410 415

Gln Ile Met Lys Glu Tyr Leu Asn Asp Pro Ala Ala Thr Ala Arg Thr

420 425 430

Ile Asp Val Asp Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Tyr Val Asp

435 440 445

Asp Asp Asp Glu Val Phe Ile Val Asp Arg Val Lys Glu Leu Ile Lys

450 455 460

Phe Lys Gly Phe Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu Ala Leu Leu Leu

465 470 475 480

Ser His Pro Met Ile Ala Asp Ala Ala Val Val Pro Gln Lys Asp Asp

485 490 495

Ala Ala Gly Glu Val Pro Val Ala Phe Val Val Arg Ser Ala Asp Gly

500 505 510

Phe Asp Leu Thr Glu Glu Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Lys Gln Val

515 520 525

Val Phe Tyr Lys Lys Leu His Lys Val Tyr Phe Ile His Ala Ile Pro

530 535 540

Lys Ser Ala Ser Gly Lys Ile Leu Arg Lys Glu Leu Arg Glu Lys Leu

545 550 555 560

Gln Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Gln

565

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 3

cggggtacca tgctatctgt ggaaactca 29

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

aactgcagtt attgcggcgt ggaaggtg 28

Claims

1.一种提高块根植物或块茎植物的产量的方法，其特征在于，所述方法包括：在块根或块茎植物中增加4-香豆酸-辅酶A-连接酶的表达或活性；所述的4-香豆酸-辅酶A-连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，所述的块根植物或块茎植物是薯类植物，所述的薯类植物是甘薯。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的4-香豆酸-辅酶A-连接酶是外源的4-香豆酸-辅酶A-连接酶，通过重组方式将编码4-香豆酸-辅酶A-连接酶的多核苷酸引入到块根植物或块茎植物中。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(i) 提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含编码4-香豆酸-辅酶A-连接酶的多核苷酸；

(ii) 利用农杆菌使所述编码4-香豆酸-辅酶A-连接酶的多核苷酸转入块根植物或块茎植物。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的块根植物或块茎植物是甘薯。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的提高块根植物或块茎植物的产量为增大块根植物或块茎植物的储藏根。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括给予块根植物或块茎植物激素处理，所述的激素选自：MeJA、GA、IAA、6-BA或ABA。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，给予：

MeJA：100～800 uM；

GA：50～1500 uM；

IAA：80～300 uM；

6-BA：10～1500 uM；

ABA：10～1500 uM。

8. 一种4-香豆酸-辅酶A-连接酶或编码该多肽的多核苷酸的用途，用于提高块根植物或块茎植物的产量；所述的4-香豆酸-辅酶A-连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，所述的块根植物或块茎植物是薯类植物，所述的薯类植物是甘薯。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的提高块根植物或块茎植物的产量包括：增大块根植物或块茎植物的储藏根。

10. 一种4-香豆酸-辅酶A-连接酶或编码该多肽的多核苷酸的用途，用于作为鉴定植物的产量的分子标记物；所述的4-香豆酸-辅酶A-连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，所述的块根植物或块茎植物是薯类植物，所述的薯类植物是甘薯。