CN110393790B - 促***在抑制髓系白血病发展的用途 - Google Patents

促***在抑制髓系白血病发展的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了促***在抑制髓系白血病发展的用途，具体地，本发明提供了一种促***或其受体的促进剂的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于抑制髓系白血病。本发明还提供了用于诊断治疗髓系白血病的诊断试剂盒以及筛选或确定治疗髓系白血病的潜在治疗剂的方法。

Description

促***在抑制髓系白血病发展的用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及靶向促***及其受体在抑制髓系白血病发展的应用。
发明背景
急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是一种以骨髓、血液以及其它组织被异常分化的增生性造血细胞浸润为特征的癌症。作为一种严重威胁人类生命的血液疾病，在60岁以下病人中，急性髓系白血病的治愈率为35-40％，而在六十岁以上的患者群体中，该病的治愈率仅有5％-15％。尽管目前在急性髓系白血病遗传学及表观遗传学方向取得了许多进展，AML的治疗大体策略在过去三十年间一直没有出现实质性的改变。之前的观点认为，AML治疗失败的原因主要在于药物治疗所导致的细胞耐药性突变产生。而许多证据显示，耐药性的细胞在药物治疗之前就已经存在。例如对成对急性髓系白血病诊断及复发样本的深度测序分析显示，急性髓系白血病的复发在许多情况下是由在诊断时就已经出现的小遗传性亚克隆诱发，这提供了直接证据证明耐药性的细胞在药物治疗之前就已经通过进化过程产生，药物治疗仅仅只对潜在的耐药细胞群进行了筛选。由于AML中癌细胞多种耐药机制的存在，单一药物治疗往往无法完全清除肿瘤细胞，因此，AML治疗需要针对特定情况联合多种药物方案同时进行，寻找更多治疗AML的高效靶标成为目前急性髓系白血病研究的核心问题之一。
因此，本领域迫切需要开发新的能够有效抑制或治疗急性髓系白血病的活性物质及其应用方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的能够有效抑制或治疗急性髓系白血病的活性物质及其应用方法。
在本发明的第一方面，提供了一种促***或其促进剂的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于治疗和/或预防髓系白血病。
在另一优选例中，所述白血病为急性髓系白血病。
在另一优选例中，所述的促进剂包括：促***(LH)、促***释放激素(LHRH)，或其组合。
在另一优选例中，所述组合物为药物组合物。
在另一优选例中，所述的药物组合物含有药学上可接受的载体以及(a)促***或其促进剂。
在另一优选例中，所述组分(a)占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％,较佳地10-99.9wt％，更佳地70％-99.9wt％。
在另一优选例中，所述药物组合物为液态、固体、或半固体。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为口服剂型、注射剂、或外用药物剂型。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、或注射剂。
在另一优选例中，所述的组合物为液态组合物。
在另一优选例中，所述组合物为口服制剂。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：输液剂载体和/或注射剂载体，较佳地，所述的载体是选自下组的一种或多种载体：生理盐水、葡萄糖盐水、或其组合。
在另一优选例中，所述组合物或制剂可单独使用，或联合使用。
在另一优选例中，所述的联合使用包括：与其它治疗和/或预防抑制髓系白血病的药物联合使用。
在另一优选例中，所述促***的直接作用靶点是骨髓内造血干细胞。
在本发明的第二方面，提供了一种组合物，包括：
(a)第一活性成分，所述第一活性成分为促***或其促进剂；和
(b)第二活性成分，所述第二活性成分为其他的或额外的髓系白血病的药物活性成分。
(c)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述组合物中，组分(a)的含量为0.01-99.9wt％。
在另一优选例中，所述的促***促进剂包括：促***(LH)、促***释放激素(LHRH)，或其组合。
在另一优选例中，所述的第二活性成分包括抗体、ADC、或小分子化合物。
在本发明的第三方面，提供了一种药盒，包括：
(i)第一容器，以及位于该第一容器中的活性成分(a)促***或其促进剂，或含有活性成分(a)的药物；
(ii)第二容器，以及位于第二容器中的活性成分(b)其他髓系白血病的药物，或含有活性成分(b)的药物。
在另一优选例中，所述的促***促进剂包括：促***(LH)、促***释放激素(LHRH)，或其组合。
在另一优选例中，所述髓系白血病为急性髓系白血病。
在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器是相同或不同的容器。
在另一优选例中，所述的第一容器的药物是含促***或其促进剂的单方制剂。
在另一优选例中，所述的第二容器的药物是含其他髓系白血病的药物的单方制剂。
在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。
在另一优选例中，所述的活性成分(b)包括抗体、ADC、或小分子化合物。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有说明书，所述说明书中记载了给予活性成分(a)和(b)从而治疗髓系白血病的说明。
在本发明的第四方面，提供了一种促***LH或其受体或其检测试剂的用途，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于诊断或预后髓系白血病。
在另一优选例中，所述的促***LH受体包括Lhgcr。
在另一优选例中，所述诊断包括检测促***在血液中的含量。
在另一优选例中，所述诊断包括血液检测、血清检测、组织样品检测。
在另一优选例中，所述的诊断包括辅助诊断、早期诊断、或其组合。
在另一优选例中，所述促***在血液中的含量低于正常值50％时，可作为髓系白血病恶化的辅助指标。
在另一优选例中，所述诊断包括检测促黄生生成素的细胞表面受体在白血病细胞中的表达量。
在另一优选例中，所述促黄生生成素的细胞表面受体在白血病细胞中的表达量低于正常值90％时，可诊断为髓系白血病。
在另一优选例中，在所述的试剂盒中，含有促***LH和/或其受体作为阳性标准品。
在本发明的第五方面，提供了一种诊断试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)促黄生生成素受体的检测试剂；和/或
(b)LH的检测试剂；
(c)标签和/或说明书。
在另一优选例中，所述的促***LH受体包括Lhgcr。
在另一优选例中，所述检测试剂选自下组：抗体、荧光蛋白，或其组合。
在另一优选例中，利用所述试剂盒进行鉴定的样品为髓系白血病细胞或疑似髓系白血病细胞。
在另一优选例中，利用所述试剂盒进行鉴定的样品为血液样本(如血浆、血清、骨髓穿刺样品)。
在另一优选例中，所述说明书中记载了以下诊断髓系白血病的方法的说明：。
(a)当血液样本中，所述促***的含量低于正常值50％时，可作为髓系白血病恶化的辅助指标；
(b)所述促黄生生成素的细胞表面受体在白血病细胞中的表达量低于正常值90％时，可诊断为髓系白血病。
在本发明的第六方面，提供了一种确定治疗髓系白血病的潜在治疗剂的方法，所述方法包括步骤：
(i)在测试组中，在培养体系中，在存在测试化合物并外源加入促***LH的情况下，培养表达Lhcgr的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的LH和Lhcgr结合的复合物的含量C1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中的LH和Lhcgr结合的复合物的含量C2；和
(ii)将上一步骤所检测的C1、C2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是预防和/或治疗髓系白血病的潜在治疗剂；
其中，如果C1显著高于C2，则表示所述测试化合物是预防和/或治疗髓系白血病的潜在治疗剂。
在另一优选例中，所述的“显著高于”指C1/C2≥1.5，较佳地≥2，更佳地≥4。
在另一优选例中，所述方法是非治疗性的和非诊断性的。
在另一优选例中，所述时间T1的范围是4-7天。
在另一优选例中，所述外源加入的促***LH的量为5IU/天。
在另一优选例中，所述培养细胞是造血干细胞HSC或造血祖细胞MPP。
在本发明的第七方面，提供了一种确定髓系白血病的潜在治疗剂的方法，包括步骤：
(i)向模型小鼠施用待测试化合物，一段时间T2后，检测模型小鼠体内促***LH的含量C3与促***受体Lhgcr的含量C4；
并且在不存在所述测试化合物且其它条件相同的对照组中，检测对照组所述促***LH的含量C5与促***受体Lhgcr的含量C6；和
(ii)将上一步骤所检测的C3与C5，C4与C6分别进行比较，从而确定所述测试化合物是否是预防和/或治疗髓系白血病的潜在治疗剂；
其中，如果C3显著高于C5，和/或C4显著高于C6，则表示所述化合物是预防和/或治疗髓系白血病的潜在治疗剂。
在另一优选例中，所述的“显著高于”指C3/C5≥1.5，较佳地≥2，更佳地≥4。
在另一优选例中，所述的“显著高于”指C4/C6≥1.5，较佳地≥2，更佳地≥4。
在另一优选例中，所述施用包括口服、注射或外用。
在另一优选例中，所述时间T2的范围是2-4周。
在另一优选例中，所述方法是非治疗性的和非诊断性的。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图简要说明
图1显示了gr的表达高度局限于HSCs和MPPs。
图2显示了gr敲除增加了8周龄小鼠骨髓中HSC的数量和造血作用。
图3显示了L-AF9诱导的急性髓系白血病模型中，Lhcgr敲除增强了白血病细胞扩增能力。
图4显示了L-AF9诱导的急性髓系白血病模型中，Lhcgr敲除加速了白血病的发病进程。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量的筛选，首次意外地开发了一类可有效改善(包括预防和/或治疗)急性髓系白血病的药物，即促***或其促进剂。本发明的研究表明，促***或其促进剂可以有效地抑制急性髓系白血病的进展。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明人的研究表明，在白血病疾病模型中，LH信号对急性髓系白血病的发生发展有重要的调控作用。在MLL-AF9诱导的急性髓系白血病小鼠模型中，本发明人将MLL-AF9逆转录病毒转染后的Lhcgr-/-造血干祖细胞移植进受体小鼠，发现受体小鼠髓系白血病细胞增殖能力显著提高，其中肝、脾白细胞浸润等疾病表征呈现出更为迅速的发展趋势，同时相应实验组小鼠发病死亡速度与对照组相比明显加快，这一系列结果显示LH信号缺失促进了白血病的发生发展。
术语
急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)
急性髓细胞性白血病是髓系造血干/祖细胞恶性疾病。以骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生为主要特征，临床表现为贫血、出血、感染和发热、脏器浸润、代谢异常等，多数病例病情急重，预后凶险，如不及时治疗常可危及生命。本病占小儿白血病的30％。在分子生物学改变及化疗反应方面儿童AML与成人(<50岁)相似。婴幼儿的AML比成人易发生髓外白血病。
造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)
造血干细胞(HSCs)是血液***中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞，包括肿瘤干细胞，具有重要指导意义。
造血干细胞有两个重要特征：其一，高度的自我更新或自我复制能力；其二，可分化成所有类型的血细胞。造血干细胞采用不对称的***方式：由一个细胞***为两个细胞。其中一个细胞仍然保持干细胞的一切生物特性，从而保持身体内干细胞数量相对稳定，这就是干细胞自我更新。而另一个则进一步增殖分化为各类血细胞、前体细胞和成熟血细胞，释放到外周血中，执行各自任务，直至衰老死亡，这一过程是不停地进行着的。
造血干细胞是能自我更新、有较强分化发育和再生能力、可以产生各种类型血细胞的始祖细胞。造血干细胞来源于红骨髓，可以经血流迁移到外周血液循环中，不会因献血和捐献造血干细胞而损坏造血功能。
促***(Luteinizing hormone，LH)
促***(LH)由腺垂体细胞分泌的一种糖蛋白类***，可促进胆固醇在性腺细胞内转化为性激素。对于女性来说，与促卵泡激素(FSH)共同作用促进卵泡成熟，分泌***、***，以及黄体的生成和维持，分泌孕激素和***。对于男性来说，促黄体生产素促成***细胞合成和释放睾酮。
促***LH在***之初由垂体腺分泌，它能促进雄性和雌性生殖***的成熟。本发明首次发现促***这一***性的激素分子可以作为抑制髓系白血病发展的潜在分子靶标，为急性髓系白血病治疗提供了新的思路。
如本文所用，术语“促***”、“LH”、“促***(LH)”可互换使用。
促***受体(Lhcgr luteinizing hormone/choriogonadotropinreceptor,Lhcgr)是指细胞表面能够与促***结合并引起细胞功能变化的蛋白质。
在MLL-AF9诱导的小鼠AML疾病模型中，我们发现，将经MLL-AF9逆转录病毒感染后的Lhcgr-/-造血干祖细胞移植进辐照受体小鼠后，小鼠外周血中产生了与对照组相比更高比例的RFP+供体来源白血病细胞。同时，移植进经MLL-AF9逆转录病毒感染后的Lhcgr-/-造血干祖细胞后，受体小鼠的肝脏及脾脏呈现出了更为严重的白血病细胞浸润，其血液中Lineage-IL7R-Sca-I-c-kit+CD34+FcγR+表型的L-GMP细胞比例达到对照组三倍左右。此外，小鼠生存分析显示，接受了经MLL-AF9感染的Lhcgr-/-造血干祖细胞移植后，受体小鼠死亡速度明显高于对照组小鼠。总之，本发明人发现Lhcgr敲除加快了AML小鼠模型中白血病的发生进程，提示促黄体激素信号不仅能调控稳态环境下造血干细胞的功能，同时也在白血病发展过程中起着重要作用。
如本文所用，术语“促***受体”、“Lhgcr”、“促***受体(Lhgcr)”可互换使用。
药物组合物
本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量的以下活性成分：促***或其促进剂和其他髓系白血病的药物活性成分。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明的主要优点包括：
1)本发明首次发现，促***或其受体的促进剂可显著抑制髓系白血病的发展。
2)促***及其促进剂是生理性分子，临床使用安全。
3)血液中促***水平易于检测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
如无特别说明，实施例所用的材料和试剂均为市售产品。
通用方法
小鼠：野生型小鼠，Lhcgr+/+和Lhcgr-/-小鼠由中国科学院上海生物化学和细胞研究所动物平台进行饲养管理。对促黄体生长素给药，每只小鼠接受连续14天的重组hLH注射(5IU/只/天)。所有的小鼠实验流程均经过所内动物管理使用委员会批准。
流式细胞分析：骨髓细胞由25G的针头从骨髓中吹出并分散成单细胞悬液，随后经40微米尼龙网过滤至干净流式细胞管中。HSCs识别利用多种抗体联合染色，包括：anti-CD150(TC15-12F12.2),anti-CD48(HM48-1),anti-Sca1(E13-161.7),anti-c-kit(2B8)andlineage antibody cocktail(anti-Ter119(TER-119),anti-B220(6B2),anti-Gr-1(8C5),anti-CD2(RM 2-5),anti-CD3(17A2),anti-CD5(53-7.3)and anti-CD8(53-6.7))。DAPI用来区分死细胞。抗体均购自eBoiscience或Biolegend公司。对于Lhcgr抗体(Santa Cruz)染色，细胞经0.01％多聚甲醛固定十五分钟，随后使用含0.5％Triton-X的PBS进行通透处理再进行下一步的染色。
长期竞争性重构实验：成年的受体小鼠分别接受RS2000X-ray辐照仪两次相隔两小时，单次剂量为540rad的辐照处理。骨髓细胞经眼静脉窦注射移植进麻醉后的受体小鼠。受体小鼠定期进行采血以测定供体来源血液细胞的比例。用来进行细胞染色分析所使用的抗体包括：anti-CD45.2(104),anti-CD45.1(A20),anti-Ter119(TER-119),anti-Gr-1(8C5),anti-Mac-1(M1/70),anti-B220(6B2),and anti-CD3(KT31.1)。
实时定量PCR：细胞经分选后直接加入Trizol(Life Technologies)抽提RNA。RNA使用SuperScript III Reverse Transcriptase(Life Technologies)进行反转。实时定量PCR利用SYBR green探针在罗氏公司LightCycler 96 system平台上完成。所用引物序列见表1。
表1：实时定量PCR中所用引物序列
引物名称 序列 SEQ ID NO:
Esr1-F 5’-CCTTCTAGACCCTTCAGTGAAGCC-3’ 1
Esr1-R 5’-CGAGACCAATCATCAGAATCTCC-3’ 2
Esr2-F 5’-CCAGCCCTGTTACTAGTCCAAGC-3’ 3
Esr2-R 5’-GGTACACTGATTCGTGGCTGG-3’ 4
Pgr-F 5’-CCAGCTCACAGCGCTTCTACC-3’ 5
Pgr-R 5’-GAAAGAGGAGCGGCTTCACC-3’ 6
Ar-F 5’-GGTGTGTGCCGGACATGACAAC-3’ 7
Ar-R 5’-GGTCATCCACATGCAAGTTGCGG-3’ 8
β-actin-F 5’-CGTCGACAACGGCTCCGGCATG-3’ 9
β-actin-R 5’-GGGCCTCGTCACCCACATAGGAG-3’ 10
骨骼切片，免疫荧光染色，共聚焦成像：新分离的骨头利用4％多聚甲醛固定过夜后在10％的EDTA中进行3天的脱钙处理。骨骼切片在CryoJane tape-transfer system(Instrumedics)平台完成，随后利用anti-CD41-APC(eBioscience,clone eBioMWReg30,1:200),goat-anti-c-kit(R&D,1:400),rabbit-anti-Lhcgr(Santa Cruz,1:50),rabbit-anti-laminin(Abcam,1:400)等抗体进行染色。Donkey-anti-goat Alexa Fluor 488,Donkey-anti-rabbit Alexa Fluor 555等作为二抗进行二次染色。anti-fade prolonggold(Life Technologies)用来封片，成像分析利用Leica SP8共聚焦显微镜完成。
小鼠急性髓系白血病模型的建立与分析：MSCV-MLL-AF9-IRES-YFP编码质粒和pCL-ECO packaging质粒共转染进293T细胞以生产逆转录病毒。Linegae-细胞从由5-氟尿嘧啶预处理的Lhcgr-/-和Lhcgr+/+小鼠中分选出来，随后使用MLL-AF9慢病毒进行感染。2x105个被感染的细胞通过眼静脉注射移植进辐照后的受体小鼠中。为了测定白血病的发展，髓系或淋巴系细胞通过Mac-1,Gr-1,CD3,B220抗体染色进行分析。对白血病起始细胞的频率分析，Lineage-IL7R-Sca-1-c-kit+CD34+FcγR+L-GMP细胞通过流式细胞分析进行确定。受体小鼠总体生存率记录后使用log-rank检验进行分析。
实施例1：在血液***里，Lhcgr表达局限于HSCs和MPPs
促黄体激素(LH)与***的起始有关，其对雌雄小鼠性腺发生均有重要作用。此前的研究发现Lhcgr主要在原始造血干细胞(HSCs)和多潜能祖细胞MPPs中表达(图1，A)。在不同性别小鼠中，Lhcgr在HSCs中的表达没有出现异质性(图1，B)。Lhcgr的表达在小鼠不同发育阶段呈现时序性变化，在胎肝时期，小鼠骨髓内Lhcgr的表达维持在本底水平，出生后，小鼠骨髓内Lhcgr的表达水平逐渐升高，直至出生后8周达到稳定(图1，C)，这些证据显示骨髓内造血干细胞是LH信号的直接作用靶点。
同时，本实施例经过对骨髓细胞的流式细胞分析，在大部分HSCs中(82％)都检测到了Lhcgr的表达(图1，D)。借助于Confocal共聚焦成像，本发明人在小鼠股骨中检测到了Lhcgr抗体的荧光信号，这些细胞在骨髓内分布极为稀少且在形态上与造血细胞高度一致(图1，E)。大部分Lhcgr阳性细胞处于血管附近10微米的距离以内，与造血干细胞在骨髓内的物理位置一致(图1，F)。
实施例2：稳态情况下，Lhcgr敲除促进小鼠骨髓内HSC自我更新和造血
本发明人构建了Lhcgr基因敲除小鼠并在成年后对造血相关表型进行了检测分析，发现在8周龄Lhcgr-/-小鼠中，骨髓内细胞总数，HSC频率均显著高于同窝对照小鼠，同时HSC数量也出现了显著性增长(图2，A)，下游MPPs、B细胞、T细胞数量相比对照组显著增加(图2，B-F)。竞争性造血谱系重构实验显示，与对照组相比，相同数量的Lhcgr-/-小鼠骨髓造血细胞具有更强的造血谱系重构能力(图2，G)。总之，这些数据显示，在稳态情况下，LH信号对HSC的自我更新及造血具有重要的调控功能。
实施例3：Lhcgr敲除导致白血病细胞扩增速度加快
在本实施例中，本发明人构建了由MLL-AF9原癌基因驱动的急性髓系白血病小鼠模型。Lhcgr-/-小鼠和对照组Lhcgr+/+小鼠骨髓C-kit阳性细胞经流式分选后，使用MLL-AF9逆转录病毒感染，随后通过眼静脉注射移植进辐照后受体小鼠中。利用流式细胞分析技术，在移植四周后检测了受体小鼠外周血中YFP阳性细胞的比例，结果显示，实验组受体小鼠外周血中YFP+Lhcgr-/-供体白血病细胞的比例(32.5％)显著高于对照组(11.7％)(图3，A-B)。这一AML小鼠模型主要表达髓系细胞表面分子标记Mac-1和Gr-1，而淋巴细胞相关的分子标记表达较少。此外，和Lhcgr+/+白血病细胞相比，Lhcgr-/-白血病细胞中Mac-1+Gr-1+细胞频率较低，提示其分化能力与对照组白血病细胞相比较弱(图3，C-D)。
实施例4：Lhcgr敲除加速小鼠急性髓系白血病的发展
在本实施例中，本发明人分析了急性髓系白血病相关的发病表征，发现在接受经病毒感染后的Lhcgr-/-造血干祖细胞移植后，受体小鼠的肝脏和脾脏出现了较对照组受体小鼠更为严重的白血病浸润现象(图4，A-B)。同时，本发明人检测了LH信号对白血病起始细胞(LICs)频率的影响，在实验组受体小鼠中，结果显示Lhcgr-/-Lineage-IL7R-Sca-1-c-kit+CD34+FcγR+L-GMP cells频率大约是对照组Lhcgr+/+L-GMP cells的三倍(图4，D-E)，而据报道这一细胞群可以富集白血病起始细胞，这一结果表明实验组受体小鼠中LICs的频率高于对照组。随后对实验组和对照组受体小鼠进行的生存分析，结果显示接受Lhcgr-/-造血干祖细胞(经MLL-AF9逆转录病毒感染)移植的实验组小鼠发病死亡速度显著增加，在不同时间点其总体存活率明显低于对照组受体小鼠(图4，F)。总的来说，这些结果显示LH信号缺陷加速了急性髓系白血病小鼠的发病过程，提示促黄体激素信号在抑制髓系白血病发展过程中具有重要作用。
总结与讨论
1)在造血***内，促***受体特异性表达于造血干细胞(HSCs)和多能性祖细胞(MPP)中，这提示促***信号可能对造血干祖细胞的功能有着直接的调控作用。利用促***受体基因敲除小鼠模型，可以发现Lhcgr敲除导致造血干细胞的自我更新和造血功能出现异常，证明LH信号对造血稳态的维持有着至关重要的作用。
2)在MLL-AF9诱导的急性髓系白血病小鼠模型中，本发明人发现LH信号同样对急性髓系白血病发生起着关键的调控作用。通过流式细胞分选得到的Lhcgr-/-和Lhcgr+/+小鼠骨髓内Lineage-造血干祖细胞，经过MLL-AF9诱导后，被移植进辐照后的受体小鼠中以诱发小鼠急性髓系白血病的发生。本发明人意外发现，Lhcgr敲除导致白血病细胞的增殖能力显著增强，分化能力减弱，白血病相关的疾病表征也呈现更快发生的趋势。同时，实验组小鼠在生存分析实验中，呈现出更快的死亡趋势，其总体生存率在不同时间段均显著低于对照组小鼠，这一结果显示小鼠急性髓系白血病的发病过程因LH信号的缺失而被极大加快。
急性髓系白血病是一种最为普遍的恶性白血病，其致死率在几十年间居高不下，其中最主要的原因在于白血病耐药细胞的存在，多种药物联合治疗对AML的治愈具有重要意义。本发明首次揭示LH信号对遏制髓系白血病发展具有重要作用，这些结果提示促***能作为潜在的分子靶标进行AML的治疗，对相关药物研发具有重要的指导意义。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 促***在抑制髓系白血病发展的用途
<130> P2018-0268
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
ccttctagac ccttcagtga agcc 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
cgagaccaat catcagaatc tcc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
ccagccctgt tactagtcca agc 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
ggtacactga ttcgtggctg g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
ccagctcaca gcgcttctac c 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
gaaagaggag cggcttcacc 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
ggtgtgtgcc ggacatgaca ac 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
ggtcatccac atgcaagttg cgg 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
cgtcgacaac ggctccggca tg 22
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
gggcctcgtc acccacatag gag 23

Claims (27)

1.一种促***或其促进剂的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于治疗和/或预防髓系白血病；
其中，促***的细胞表面受体在所述髓系白血病的细胞中的表达量低于正常值90%。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述白血病为急性髓系白血病；
其中，促***的细胞表面受体在所述急性髓系白血病的细胞中的表达量低于正常值90%。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的促进剂包括：促***(LH)、促***释放激素(LHRH)，或其组合。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物为药物组合物。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述促***的直接作用靶点是骨髓内造血干细胞。
6.一种组合物，其特征在于，包括：
(a) 第一活性成分，所述第一活性成分为促***或其促进剂；和
(b) 第二活性成分，所述第二活性成分为其他的或额外的髓系白血病的药物活性成分；和
(c) 药学上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述的促***促进剂包括：促***(LH)、促***释放激素(LHRH)，或其组合。
8.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述的第二活性成分包括抗体、ADC、或小分子化合物。
9.一种药盒，其特征在于，包括：
(i)第一容器，以及位于该第一容器中的活性成分(a)促***或其促进剂，或含有活性成分(a)的药物；
(ii) 第二容器，以及位于第二容器中的活性成分(b)其他髓系白血病的药物，或含有活性成分(b)的药物。
10.如权利要求9所述的药盒，其特征在于，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。
11.如权利要求9所述的药盒，其特征在于，所述的药盒还含有说明书，所述说明书中记载了给予活性成分(a)和(b)从而治疗髓系白血病的说明。
12.一种促***LH或其受体或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于诊断或预后髓系白血病；
其中，促***的细胞表面受体在所述髓系白血病的细胞中的表达量低于正常值90%。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述诊断包括检测促***在血液中的含量。
14.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述诊断包括血液检测、血清检测、组织样品检测。
15.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的诊断包括辅助诊断、早期诊断、或其组合。
16.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述诊断包括检测促***的细胞表面受体在白血病细胞中的表达量。
17.如权利要求12所述的用途，其特征在于，在所述的试剂盒中，含有促***LH和/或其受体作为阳性标准品。
18. 如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包括：
(a) 促***受体的检测试剂；和/或
(b) LH的检测试剂；
(c) 标签和/或说明书。
19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述检测试剂选自下组：抗体、荧光蛋白，或其组合。
20.如权利要求18所述的用途，其特征在于，利用所述试剂盒进行鉴定的样品为髓系白血病细胞或疑似髓系白血病细胞。
21.如权利要求18所述的用途，其特征在于，利用所述试剂盒进行鉴定的样品为血液样本。
22.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述血液样本为血浆、血清或骨髓穿刺样品。
23.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述说明书中记载了以下诊断髓系白血病的方法的说明：
(a) 当血液样本中，所述促***的含量低于正常值50%时，可作为髓系白血病恶化的辅助指标；
(b) 所述促***的细胞表面受体在白血病细胞中的表达量低于正常值90%时，可诊断为髓系白血病。
24.一种确定治疗髓系白血病的潜在治疗剂的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(i)在测试组中，在培养体系中，在存在测试化合物并外源加入促***LH的情况下，培养表达Lhcgr的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的LH和Lhcgr结合的复合物的含量C1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中的LH和Lhcgr结合的复合物的含量C2；和
(ii) 将上一步骤所检测的C1、C2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是预防和/或治疗髓系白血病的潜在治疗剂；
其中，如果C1显著高于C2，则表示所述测试化合物是预防和/或治疗髓系白血病的潜在治疗剂。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述培养细胞是造血干细胞HSC或造血祖细胞MPP。
26.一种确定髓系白血病的潜在治疗剂的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)向模型小鼠施用待测试化合物，一段时间T2后，检测模型小鼠体内促***LH的含量C3与促***受体Lhgcr的含量C4；
并且在不存在所述测试化合物且其它条件相同的对照组中，检测对照组所述促***LH的含量C5与促***受体Lhgcr的含量C6；和
(ii)将上一步骤所检测的C3与C5，C4与C6分别进行比较，从而确定所述测试化合物是否是预防和/或治疗髓系白血病的潜在治疗剂；
其中，如果C3显著高于C5，和/或C4显著高于C6，则表示所述化合物是预防和/或治疗髓系白血病的潜在治疗剂。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述施用包括口服、注射或外用。
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