CN110392732A - 细胞分析方法和细胞分析装置 - Google Patents

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Abstract

细胞区域提取部(241)在基于由同轴型全息显微镜(IHM)获得的全息图生成的相位像中提取细胞区域，背景值获取部(242)根据除细胞区域外的多个位置的相位值求出背景值。细胞内相位值获取部(243)避开细胞区域内的相位值有可能下降的中央部，将设定在与该细胞的周缘部接近的位置处的采样线上的多个相位值进行平均来求出细胞内相位值。相位变化量计算部(244)求出细胞内相位值与背景值之差，相位变化量判定部(245)将该差的值与两个等级的阈值进行比较，来判定细胞处于未分化状态还是处于脱离未分化的状态。由此，能够排除由于使用IHM而产生的原理上的测定误差的影响，并能够自动地进行准确的判定。

Description

细胞分析方法和细胞分析装置
技术领域
本发明涉及一种在培养多能干细胞(ES细胞、iPS细胞)的过程等中以非侵袭方式对细胞的状态进行分析的细胞分析方法和细胞分析装置，更详细地说，涉及一种基于根据由数字全息装置获得的记录有物体波与参照波的干涉条纹的全息图计算出的物体的相位像来对细胞进行分析的细胞分析方法和细胞分析装置。
背景技术
近年来，在再生医疗领域中盛行使用iPS细胞、ES细胞等多能干细胞进行研究。一般来说，细胞是透明的，通过通常的光学显微镜难以进行观察，因此以往广泛地利用相差显微镜来观察细胞。然而，关于相差显微镜，在拍摄显微图像时需要进行对焦，因此存在测定费时这样的问题。为了解决这个问题，最近开发出使用数字全息技术的全息显微镜并投入实际使用(参照专利文献1等)。
在全息显微镜中，获取来自光源的光在物体表面反射或透过后的物体光与从同一光源直接到达的参照光在图像传感器等的检测面形成的干涉条纹(全息图)，基于该全息图实施规定的运算处理，由此获得强度像、相位像来作为物体的再生像。在这样的全息显微镜中，能够在获取到全息图之后在数据处理阶段进行对焦，也就是说能够构成聚焦后的再生像，因此不需要在拍摄时逐一地进行对焦，存在能够缩短测定时间的优点。
另外，在利用多能干细胞进行的再生医疗的研究和开发中，需要大量地培养维持多能性的状态的未分化的细胞。因此，需要选择适当的培养环境以及控制环境的稳定性，并且需要以较高的频度确认培养中的细胞的状态。例如，当细胞菌落内的细胞从未分化状态脱离时，在该情况下细胞菌落内存在的所有的细胞都具有进行分化的能力，因此菌落内的细胞最终都转变成脱离未分化的状态。因此，观察者需要每天确认正在培养的细胞中是否产生脱离了未分化状态的细胞(已经分化的细胞、快要分化的细胞，下面称为“脱离未分化的细胞”)，并在发现了脱离未分化的细胞的情况下，迅速地去除该脱离未分化的细胞。
通过利用未分化标记进行染色，能够可靠地进行多能干细胞是否维持着未分化状态的判定。然而，由于进行了染色的细胞会死亡，因此在再生医疗用的多能干细胞的判定中无法实施未分化标记染色。因此，在当前的再生医疗用细胞培养的现场，观察者基于上述的使用相差显微镜对细胞的形态进行的观察，来判定是否为未分化细胞。然而，通过这样的方法来进行准确的识别需要熟练的技能。另外，由于是基于人的判断，因此在判定中不可避免地产生偏差。因此，这样的以往的方法不适于在工业上大量地生产多能干细胞。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际专利公开第2016/084420号
专利文献2：日本特开平10-268740号公报
专利文献3：国际专利公开第2013/099772号
非专利文献
非专利文献1：バレール(Barer)，“インターフェアレンス·マイクロスコピー·アンド·マス·デターミネイション(Interference Microscopy and MassDetermination：干涉显微镜和质量测定)”，ネイチャー(Nature)，1952年，Vol.169，pp.366-367
发明内容
发明要解决的问题
本发明是为了解决上述问题而完成的，其目的在于提供一种能够利用非侵袭式的细胞观查的方法来准确且高效地判定iPS细胞、ES细胞等多能干细胞处于未分化状态还是处于脱离未分化的细胞的细胞分析方法和细胞分析装置。
用于解决问题的方案
在过去的研究(参照非专利文献1)中，报告了在利用相差显微镜、微分干涉显微镜等进行的观察中求出的相位的变化与作为观察对象的细胞中包含的蛋白质的干燥物的总量成比例。根据这样的知识推测出：通过以细胞为单位或以细胞菌落为单位来比较相位的变化量，能够比较细胞的状态，从而能够进行处于未分化状态的细胞与处于脱离未分化的状态的细胞的识别。本发明的发明人着眼于这一点重复进行实验，从而完成了本发明。
为了解决上述问题而完成的本发明所涉及的细胞分析方法是使用全息显微镜的细胞分析方法，其特征在于，实施以下步骤：
a)细胞区域提取步骤，在根据利用全息显微镜获得的全息图求出的关于作为分析对象的细胞的相位像中提取存在细胞的细胞区域；
b)背景值(background value)获取步骤，基于所述相位像中的除所述细胞区域以外的区域中的多个位置的相位值来计算背景值；
c)细胞内相位值获取步骤，基于所述细胞区域中的细胞的轮廓线与从该轮廓线起向内侧分离规定距离处的虚拟线之间的测定对象范围内的多个位置的相位值，求出细胞内的相位值；以及
d)细胞状态判定步骤，基于在所述细胞内相位值获取步骤中获得的相位值与所述背景值之差，来判定作为分析对象的细胞处于未分化状态还是处于脱离未分化的状态。
另外，为了解决上述问题而完成的本发明所涉及的细胞分析装置是用于实施本发明所涉及的细胞分析方法的装置，且是使用全息显微镜的细胞分析装置，其特征在于，具备：
a)细胞区域提取部，其在根据利用全息显微镜获得的全息图求出的关于作为分析对象的细胞的相位像中提取存在细胞的细胞区域；
b)背景值获取部，其基于所述相位像中的除所述细胞区域以外的区域中的多个位置的相位值来计算背景值；
c)细胞内相位值获取部，其基于所述细胞区域中的细胞的轮廓线与从该轮廓线起向内侧分离规定距离处的虚拟线之间的测定对象范围内的多个位置的相位值，求出细胞内的相位值；以及
d)细胞状态判定部，其基于由所述细胞内相位值获取部获得的相位值与所述背景值之差，来判定作为分析对象的细胞处于未分化状态还是处于脱离未分化的状态。
在本发明所涉及的细胞分析方法和细胞分析装置中，典型地，作为分析对象的细胞是iPS细胞、ES细胞等多能干细胞。
在本发明所涉及的细胞分析装置中，通过全息显微镜来获取针对例如正在培养板内培养的作为分析对象的细胞的全息图。通过对获取到的全息图数据进行规定的数据处理(相位恢复和图像重构)，来生成包含作为分析对象的细胞的相位像。直到生成该相位像为止的一系列的处理是通过以往的一般的全息显微镜来进行的。
在本发明所涉及的细胞分析装置中，细胞区域提取部对相位像实施按照规定的算法进行的处理，来提取存在细胞的细胞区域。对于细胞区域的提取，使用在图像识别等领域中经常使用的纹理分析等已知的方法即可。通过提取细胞区域，来将相位像划分为细胞区域和不存在细胞的非细胞区域。因此，背景值获取部获取该非细胞区域中的多个位置的相位值，例如通过将所述多个相位值进行平均来计算背景值。此外，即使是非细胞区域，在由培养基中包含的灰尘、死亡的细胞或者培养板的划痕等产生的全息图中，也存在相位值相比于其它区域的相位值稍高的情况。因此，期望的是，通过选择非细胞区域中的相位值为规定阈值以下的范围等处理，来避免在背景值的计算中利用明显异常的相位值。
另一方面，细胞内相位值获取部基于细胞区域内的多个位置的相位值，来计算细胞区域内的相位值的代表值，也就是细胞内相位值。如果细胞区域内的相位值的变动小到某种程度，则使用细胞区域内的多个任意位置的相位值来求出细胞内相位值即可。然而，在使用同轴型全息显微镜来作为全息显微镜的情况下，根据光束的位置彼此接近的物体光和参照光来生成全息图，因此明确可知的是，如果正在观察的细胞的尺寸大，则由于参照光的干扰而产生原理上的测定误差。在细胞内，离细胞的周缘部越远、也就是说越接近细胞的中央，则该测定误差越大，该测定误差被观测为相位值下降。因此，虽然在细胞小的情况下不存在问题，但是如果细胞大，则存在如下情况：在接近细胞的周缘部的位置能够获得准确的、也就是反映出实际的光学厚度的相位值，但是在接近中央的位置为不反映实际的光学厚度的较小的相位值。因此，为了避免利用这样的不准确的相位值，细胞内相位值获取部基于细胞区域中的细胞的轮廓线(细胞区域与非细胞区域的边界)与从该轮廓线起向内侧分离规定距离处的虚拟线之间的测定对象范围内的多个位置的相位值、也就是说接近细胞的周缘部的部分内的多个位置的相位值，来计算细胞内相位值。
在多能干细胞的情况下，如上述那样的相位值的下降是在大量的细胞聚集而成的细胞菌落的情况下产生的，在较小的单细胞中不产生那样的问题。即，在单细胞中，在细胞内相位值的计算中能够利用细胞区域内的任意位置的相位值。
因此，在本发明所涉及的细胞分析方法和细胞分析装置中，将所述规定距离设为以在作为分析对象的细胞为单细胞的情况下使该细胞整体包含在所述测定对象范围内的方式预先决定的值即可。
但是，如果使规定距离过大，则有可能导致大的细胞中的表示不准确的相位值的部位进入到测定对象范围内。
因此，在本发明所涉及的细胞分析方法和细胞分析装置中，优选的是，在所述全息显微镜是同轴型全息显微镜的情况下，设为所述测定对象范围是所述细胞区域内的范围，且所述测定对象范围相比于被该测定对象范围包围的区域表示出相对高的相位值。
在尽管细胞的光学厚度大致固定但在接近细胞的中央的位置处观测到相位值的下降的情况下，在从细胞的轮廓线向内侧的规定距离的范围内，相位值是大致平坦的值，随着超过该距离进一步向内侧移动，存在相位值逐渐下降的倾向。在本发明的发明人基于实验进行的研究中推测出：虽然细胞区域中的相位值从大致平坦的状态开始下降的位置取决于细胞的大小，但是在接近细胞的周缘部的部分，相位值大致稳定。因此，能够预先通过实验等适当地确定不受相位值的下降影响的测定对象范围，也就是上述规定距离。具体地说，在本发明的发明人进行的研究中，在观察iPS细胞时，如果将规定距离决定为十几μm～20μm左右，则能够进行良好的判定。
如果如上述那样通过细胞内相位值获取部获得了细胞内相位值，则细胞状态判定部对该细胞内相位值计算与背景值之差，例如将其与规定的阈值进行比较，由此判定作为分析对象的细胞处于未分化状态还是处于脱离未分化的状态。通过从细胞内相位值减去背景值，来以排除全息显微镜的光源的亮度变动等环境因素的方式求出与作为分析对象的细胞对应的高精度的相位值，另外，由于未分化状态的细胞的相位值与脱离未分化的细胞的相位值之间存在显著的差，因此细胞状态判定部能够高精度地判定细胞处于未分化状态还是处于脱离未分化的状态。
但是，实际上很难以一个阈值为边界来判定处于未分化状态还是处于脱离未分化的状态，因此期望在再生医疗用细胞培养的现场形成使判定错误接近零的状态。
因此，在本发明所涉及的细胞分析装置中，优选的是，在所述差的值为第一阈值以上时，所述细胞状态判定部判断为作为分析对象的细胞处于脱离未分化的状态，在该差的值为比第一阈值小的第二阈值以下时，判断为作为分析对象的细胞处于未分化状态。
另外，作为本发明所涉及的细胞分析装置的一个方式，所述细胞内相位值获取部在所述测定对象范围内沿细胞的轮廓线决定采样线，计算在该采样线上获得的多个相位值的平均值来作为所述细胞内的相位值即可。
发明的效果
根据本发明所涉及的细胞分析方法和细胞分析装置，例如在培养iPS细胞、ES细胞等多能干细胞的现场，能够不取决于观察者的判断地以机械也就是自动的方式准确地判定正在培养的细胞正维持着未分化状态还是处于脱离未分化的状态。因此，不再存在由于观察者的熟练度、技能导致的判定偏差，并且能够迅速地进行判定。其结果为，能够容易地进行正在培养的细胞的品质管理，从而能够实现生产性的提高。
附图说明
图1是本发明的一个实施例的细胞分析装置的概要结构图。
图2是表示本实施例的细胞分析装置中的细胞判定处理的过程的流程图。
图3是图2中的细胞菌落判定处理的详细内容的流程图。
图4是用于说明用于细胞菌落判定的线设定方法的示意图。
图5是表示用于细胞菌落判定的线的设定例的示意图，(a)是细胞菌落的情况的例子，(b)是单细胞的情况的例子。
图6是表示用于计算细胞内相位值的采样线的设定例的示意图，(a)是细胞菌落的情况的例子，(b)是单细胞的情况的例子。
图7是表示细胞内的截面方向的位置与相位值的大致关系的示意图，(a)是细胞菌落的情况的例子，(b)是单细胞的情况的例子。
图8是示出未分化细胞和脱离未分化的细胞的光学厚度的实际测定结果的图。
具体实施方式
下面，参照附图说明本发明所涉及的细胞分析装置的一个实施例。
图1是本实施例的细胞分析装置的概要结构图。
本实施例的细胞分析装置具备显微观察部1、控制和处理部2、作为用户接口的输入部3以及显示部4。
显微观察部1是同轴型全息显微镜(In-line Holographic Microscopy：IHM)，具备图像传感器11和包括激光二极管等的光源部10，在光源部10与图像传感器11之间配置有包含作为观察对象的细胞13的培养板(或者其它的细胞培养容器)12。控制和处理部2对显微观察部1的动作进行控制，并且对由显微观察部1获取到的数据进行处理，该控制和处理部2具备摄影控制部20、数据存储部21、相位信息计算部22、图像生成部23以及未分化/脱离未分化识别部24来作为功能模块。另外，未分化/脱离未分化识别部24包括细胞区域提取部241、背景值获取部242、细胞内相位值获取部243、相位变化量计算部244以及相位变化量判定部245来作为下级的功能模块。
控制和处理部2的实体是个人计算机或性能更高的工作站，能够构成为通过使安装在那样的计算机中的专用的控制处理软件在该计算机上动作来实现上述各功能模块的功能。另外，如后述那样能够设为不是通过一个计算机来实现控制和处理部2的功能而是通过经由通信网络连接的多个计算机来分担控制和处理部2的功能的结构。
在本实施例的细胞分析装置中，当用户(操作者)将包含作为分析对象的细胞(多能细胞)13的培养板12设置在规定位置并通过输入部3进行规定的操作时，摄影控制部20控制显微观察部1来如下面那样进行数据的获取。
即，光源部10向培养板12的规定区域照射具有10°左右的微小发散角度的相干光。透过培养板12和细胞13后的相干光(物体光15)与透过培养板12上的接近细胞13的区域后的光(参照光14)发生干涉并到达图像传感器11。物体光15是在透过细胞13时相位发生了变化的光，另一方面，参照光14是由于不透过细胞13因此没有因该细胞13而发生相位变化的光。因而，在图像传感器11的检测面(像面)上形成因细胞13而相位发生了变化的物体光15与相位没有变化的参照光14的干涉像(全息图)。
此外，培养板12通过未图示的移动机构来在X轴-Y轴方向(与图1的纸面垂直的面内)依次移动。由此，能够使从光源部10发出的相干光的照射区域(观察区域)在培养板12上移动，来获取广泛的二维区域内的全息图。
如上述那样通过显微观察部1获得的全息图数据(在图像传感器11的检测面形成的全息图的二维的光强度分布数据)被依次发送到控制和处理部2，并被保存到数据存储部21。在控制和处理部2中，相位信息计算部22从数据存储部21读出全息图数据，并执行规定的运算处理，由此计算观察区域整体的相位信息。然后，图像生成部23基于计算出的相位信息来生成观察区域整体的相位像。在像这样计算相位信息、生成相位像时，使用专利文献1、2等中公开的周知的算法即可。此外，也可以基于全息图数据同时计算强度信息、伪相位信息等，基于这些信息生成再生像。但是，在此至少获得相位像即可，不需要生成其它的再生像。
当如上述那样获得将作为观察对象的细胞13反映为像所得到的相位像时，未分化/脱离未分化识别部24按照图2所示的过程来执行识别处理。图2是表示本实施例的细胞分析装置中的细胞判定处理的过程的流程图，图3是图2中的细胞菌落判定处理的详细内容的流程图。
首先，细胞区域提取部241基于构成相位像的数据来提取相位像中的被估计为存在细胞或细胞菌落的细胞区域，求出表示该细胞区域的轮廓的数据(步骤S1)。细胞区域通常是多个，但也有可能是一个。在细胞区域的提取中，例如能够使用广泛地利用于图像匹配等的纹理图像提取、对照阈值来判定亮度值的图像处理算法这样的周知的算法(参照专利文献3等)。
接着，背景值获取部242将相位像中的除上述提取出的细胞区域以外的区域内的相位值接近0[rad]的区域、具体地说是相位值的绝对值小于预先设定的值的区域选定为背景区域(非细胞区域)，在该背景区域中设定规定条数(例如5条)的规定长度(例如100[μm])的采样线。而且，求出所述多个采样线上的各位置的相位值，并计算该相位值整体的平均值。然后，将该计算的结果决定为该相位像的背景值(步骤S2)。
另一方面，细胞内相位值获取部243针对在步骤S1中提取出的各个细胞区域判定该细胞区域是单细胞还是多个细胞聚集而成的细胞菌落(步骤S3)。
具体地说，如图3所示，首先，针对每个细胞区域决定横穿该细胞区域的任意直线中的在细胞区域部分内的长度最大的一条直线以及与该直线正交的直线中的在细胞区域部分内的长度最大的另一条直线这两条线(步骤S31)。
通过以下方式来决定第一条直线的位置即可：一边组合地进行如图4的(a)所示那样在相位像100中使横穿细胞区域110的直线P平移的处理和如图4的(b)所示那样在相位像100中使横穿细胞区域110的直线P旋转的处理，一边找出直线P的在细胞区域110部分内的长度最大的位置。如果第一条直线的位置确定，则能够通过使与该直线正交的直线平移并调查在细胞区域110部分内的长度来决定第二条直线的位置。
图5是表示在相位像100中的细胞区域110上设定了两条线的状态的示意图。一般来说，如图5的(b)所示，多能细胞为细长形状，细胞菌落是大量单细胞的聚集，因此如图5的(a)所示，细胞菌落比单细胞大且接近圆形。因此，在此基于设定在细胞区域110上的两条线P、Q的在细胞区域部分内的长度来判定是单细胞还是细胞菌落。
即，如图5所示，关于两条线P、Q获取在细胞区域110部分内的长度L1、L2(步骤S32)，判定该长度L1、L2是否均为规定长度(在此为10μm)以上(步骤S33)。然后，如果均为规定长度以上，则判断为细胞菌落(步骤S34)，如果至少任意一方小于规定长度，则判断为单细胞(步骤S35)。在例如图5的(b)所示的单细胞的例子中，虽然长度L1为10μm以上，但长度L2通常不可能为10μm以上，因此能够正确地判断为单细胞。
在进行了步骤S34的判断时，在步骤S4中为“是”。在该情况下，在相位像100中的接近圆形的形状的细胞区域110的轮廓线的周围存在相位值极大的部分。因此，细胞内相位值获取部243例如找出相位值为规定的阈值(在此为0.95π[rad])以上的部分，并如图6的(a)所示那样在该部分的内侧的从轮廓线起向内侧分离规定距离t的位置处沿该轮廓线决定曲线状的采样线120(步骤S6)。另一方面，在进行了步骤S35的判断时，在步骤S4中为“否”。在该情况下，细胞内相位值获取部243如图6的(b)所示那样沿相位像100中的细长形状的细胞区域110的长轴方向决定直线状的采样线120(步骤S5)。典型地，上述规定距离t为10μm左右是适当的，在后面记述其理由。
如果采样线120已确定，则细胞内相位值获取部243求出采样线120上的各位置的相位值，将该相位值整体的平均值计算为细胞上相位值(步骤S7)。相位变化量计算部244计算在步骤S7中获得的细胞上相位值与在步骤S2中获得的背景值之差，将该差决定为相位变化量(步骤S8)。像这样减去背景值是为了降低观察时的光源部10的发光亮度的偏差、图像传感器11的灵敏度偏差或者培养板12的培养基的状态的变化等的影响。
接着，相位变化量判定部245判定在步骤S8中求出的相位变化量是否为第一阈值(在此为0.08π[rad])以下(步骤S9)，如果为第一阈值以下，则判断为设为对象的细胞区域的细胞为未分化细胞(步骤S11)。在相位变化量大于第一阈值的情况下，判定该相位变化量是否为第二阈值(在此为0.12π[rad])以上(步骤S10)，如果为第二阈值以上，则判断为设为对象的细胞区域的细胞为脱离未分化的细胞(步骤S12)。另一方面，在相位变化量小于第二阈值的情况下，也就是说在相位变化量进入到第一阈值与第二阈值之间的范围的情况下，难以进行准确的判断，因此判断为不确定细胞是否处于未分化(步骤S13)。
针对从一个相位像提取出的细胞区域分别进行上述步骤S3～S13的处理，由此无论该细胞区域的细胞是单细胞和细胞菌落中的哪一种，都被判定为“未分化细胞”、“脱离未分化的细胞”以及“不确定”中的某一方。然后，将该判定的结果记录到控制和处理部2的内部，并且例如与观察者从输入部3输入的指示对应地显示于显示部4。
在此，记述如使用图6说明的那样设定用于求出细胞内的相位值的采样线的理由。
在本实施例的细胞分析装置中，使用同轴型全息显微镜来作为显微观察部1。如图1所示，在同轴型全息显微镜中，参照光14与物体光15大致同轴地行进并到达图像传感器11。在作为观察对象的细胞13大的情况下，也就是说在作为观察对象的细胞13为细胞菌落的情况下，与细胞13的周缘部附近对应的全息图是基于物体光与通过了培养板12内的完全不存在细胞的部分的参照光的干涉得到的全息图。另一方面，与细胞13的中央部附近对应的全息图是基于物体光与包含通过存在细胞的部分的光的一部分的参照光的干涉得到的全息图。即，在该情况下，参照光不是理想的参照光。因此，当作为观察对象的细胞13大时，基于同轴型全息显微镜的测定原理，在细胞的轮廓附近能够获得准确的相位值，但是在细胞的中央部存在相位值相比于轮廓附近的相位值下降的倾向。
图7是表示细胞内的截面方向的位置与相位值之间的大致关系的示意图，(a)是细胞菌落的情况的例子，(b)是单细胞的情况的例子。
在图7中，[i]是不存在细胞的区域，也就是说背景区域。另外，在细胞区域的周围出现由于光晕等而相位值明显高的区域[ii]。如图7的(b)所示，在作为观察对象的细胞小的情况下(一般来说，在单细胞的情况下)，不发生如上述那样的参照光不是理想的参照光的现象(或者该现象的影响小)，在细胞区域整体内，相位值是大致平坦的。与此相对地，如图7的(a)所示，在作为观察对象的细胞大的情况下(一般来说，在细胞菌落的情况下)，由于发生上述现象，虽然在从细胞区域的轮廓(外缘)起向内侧的规定的区域[iii]内，相位值是大致平坦的，但是在比该规定的区域[iii]更靠内侧的区域、也就是说接近中央部的区域[iv]内，相位值相比于区域[iii]内的相位值下降。假定区域[iv]内的相位值的下降量与装置结构、细胞的大小等相关，因此区域[iv]不适合于计算准确的相位值，从而需要在区域[iii]内进行测定。
根据本发明的发明人们利用实验进行的研究，区域[iii]的宽度也取决于细胞的大小，为大概十几μm～20μm左右，如果是从细胞的轮廓向内侧分离10μm的位置，则认为能够可靠地获得区域[iii]内的准确的相位值。基于这样的理由，在本实施例的细胞分析装置中，如上述说明的那样设定有用于求出细胞内的相位值的采样线。
另外，在本实施例的细胞分析装置中，如上述那样，将相位变化量与第一阈值、第二阈值这两个阈值进行比较来分别进行未分化细胞和脱离未分化的细胞的判定，但这是由于通过实验确认出未分化细胞与脱离未分化的细胞的光学厚度产生较大的差，也就是说存在统计学上的显著的差。
图8是示出实际测量未分化细胞(未分化iPS细胞菌落)和脱离未分化的细胞的光学厚度的结果的图，在图中，[1]是未分化细胞，[2]是脱离未分化的细胞，(a)、(b)以及(c)分别是从开始培养起的2天后的结果、4天后的结果以及6天后的结果。在计算假设未分化细胞与脱离未分化的细胞的光学厚度不存在显著的差的假设校验的P值时，在全部期间内P值小于0.05，能够确认出光学厚度存在显著的差。由于上述的细胞的相位变化量反映出该细胞的光学厚度，因此可知基于相位变化量能够准确地识别未分化细胞和脱离未分化的细胞。
此外，上述说明中的0.95π[rad]、0.08π[rad]、0.12π[rad]、10[μm]等各种数值是本发明的发明人们通过实验求出的值，只是一例。能够容易地想到能够根据装置结构、作为观察对象的多能细胞的种类对这些数值选择更适当的值。
另外，在图1所示的实施例的结构中，在控制和处理部2中实施了所有的处理，但是一般来说，基于全息图数据来计算相位信息、使该计算的结果图像化是需要庞大的计算量的。因此，通过通常使用的个人计算机进行计算需要大量的时间，难以进行有效的分析作业。因此，利用将与显微观察部1连接的个人计算机来作为终端装置，并将该终端装置与作为高性能的计算机的服务器经由因特网、内网等通信网络进行连接所得到的计算机***为宜。在该情况下，在服务器侧基于全息图数据来实施相位信息的计算、相位像的生成等复杂的处理，由终端装置接收由此生成的图像数据，来在终端装置侧针对由该图像数据构成的相位像进行处理、也就是说未分化/脱离未分化识别部24的处理。在这样的结构中，图1所示的控制和处理部2的功能模块被分离在终端装置侧和服务器侧。像这样，也可以由多个计算机来分担控制和处理部2的功能。
另外，在上述实施例的细胞分析装置中，使用同轴型全息显微镜来作为显微观察部1，但是只要是能够获得全息图的显微镜即可，也能够置换为离轴(off-axis)型、相移型等其它方式的全息显微镜，这是不言而喻的。
另外，明确可知的是，上述实施例、上述的各种变形例是本发明的一例，在本发明的主旨的范围内进一步进行适当的变形、修正、追加也包含在本申请的权利要求书中。
附图标记说明
1：显微观察部；10：光源部；11：图像传感器；12：培养板；13：细胞；14：参照光；15：物体光；2：控制和处理部；20：摄影控制部；21：数据存储部；22：相位信息计算部；23：图像生成部；24：未分化/脱离未分化识别部；241：细胞区域提取部；242：背景值获取部；243：细胞内相位值获取部；244：相位变化量计算部；245：相位变化量判定部；3：输入部；4：显示部；100：相位像；110：细胞区域；120：采样线。

Claims (10)

1.一种细胞分析方法，是使用全息显微镜的细胞分析方法，该细胞分析方法的特征在于，实施以下步骤：
a)细胞区域提取步骤，在根据利用全息显微镜获得的全息图求出的关于作为分析对象的细胞的相位像中提取存在细胞的细胞区域；
b)背景值获取步骤，基于所述相位像中的除所述细胞区域以外的区域中的多个位置的相位值来计算背景值；
c)细胞内相位值获取步骤，基于所述细胞区域中的细胞的轮廓线与从该轮廓线起向内侧分离规定距离处的虚拟线之间的测定对象范围内的多个位置的相位值，求出细胞内的相位值；以及
d)细胞状态判定步骤，基于在所述细胞内相位值获取步骤中获得的相位值与所述背景值之差，来判定作为分析对象的细胞处于未分化状态还是处于脱离未分化的状态。
2.根据权利要求1所述的细胞分析方法，其特征在于，
所述规定距离是以在作为分析对象的细胞为单细胞的情况下使该细胞整体包含在所述测定对象范围内的方式预先决定的值。
3.根据权利要求1所述的细胞分析方法，其特征在于，
在所述细胞状态判定步骤中，在所述差的值为第一阈值以上时，判断为作为分析对象的细胞处于脱离未分化的状态，在该差的值为比第一阈值小的第二阈值以下时，判断为作为分析对象的细胞处于未分化状态。
4.根据权利要求1所述的细胞分析方法，其特征在于，
在所述细胞内相位值获取步骤中，在所述测定对象范围内沿细胞的轮廓线决定采样线，计算在该采样线上获得的多个相位值的平均值来作为所述细胞内的相位值。
5.根据权利要求1所述的细胞分析方法，其特征在于，
所述全息显微镜是同轴型全息显微镜，
所述测定对象范围是所述细胞区域内的范围，且所述测定对象范围相比于被该测定对象范围包围的区域表示出相对高的相位值。
6.一种细胞分析装置，是使用全息显微镜的细胞分析装置，该细胞分析装置的特征在于，具备：
a)细胞区域提取部，其在根据利用全息显微镜获得的全息图求出的关于作为分析对象的细胞的相位像中提取存在细胞的细胞区域；
b)背景值获取部，其基于所述相位像中的除所述细胞区域以外的区域中的多个位置的相位值来计算背景值；
c)细胞内相位值获取部，其基于所述细胞区域中的细胞的轮廓线与从该轮廓线起向内侧分离规定距离处的虚拟线之间的测定对象范围内的多个位置的相位值，求出细胞内的相位值；以及
d)细胞状态判定部，其基于由所述细胞内相位值获取部获得的相位值与所述背景值之差，来判定作为分析对象的细胞处于未分化状态还是处于脱离未分化的状态。
7.根据权利要求6所述的细胞分析装置，其特征在于，
所述规定距离是以在作为分析对象的细胞为单细胞的情况下使该细胞整体包含在所述测定对象范围内的方式预先决定的值。
8.根据权利要求6所述的细胞分析装置，其特征在于，
所述细胞状态判定部在所述差的值为第一阈值以上时，判断为作为分析对象的细胞处于脱离未分化的状态，在该差的值为比第一阈值小的第二阈值以下时，判断为作为分析对象的细胞处于未分化状态。
9.根据权利要求6所述的细胞分析装置，其特征在于，
所述细胞内相位值获取部在所述测定对象范围内沿细胞的轮廓线决定采样线，计算在该采样线上获得的多个相位值的平均值来作为所述细胞内的相位值。
10.根据权利要求6所述的细胞分析装置，其特征在于，
所述全息显微镜是同轴型全息显微镜，
所述测定对象范围是所述细胞区域内的范围，且所述测定对象范围相比于被该测定对象范围包围的区域表示出相对高的相位值。
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