CN110392526B - 用于治疗性哺乳动物细胞的冷冻保存、储存、运输和应用的装置、方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明所公开的组合物、方法和装置可用于将治疗性真核细胞冷冻、储存和施用于所需患者。在许多实施方式中，所公开的治疗细胞是源自人椎间盘组织的哺乳动物细胞。所公开的组合物、方法和装置能够保持治疗细胞的高活力和无菌性，并且允许细胞从冷冻容器取出而无需处理细胞或转移至第二容器直接给予患者。

Description

用于治疗性哺乳动物细胞的冷冻保存、储存、运输和应用的装 置、方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§1 19(e)要求2017年3月2日提交的名称为“用于冷冻保存哺乳动物细胞的装置、方法和组合物”的美国临时专利申请号62/466,228的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
领域
所公开的工艺、方法和***涉及在非常低的温度下长时间保存治疗性哺乳动物细胞而没有显著的活力丧失，并且可以在解冻后在很少或没有处理的情况下给予患者。
背景
可以直接从哺乳动物供体获得治疗性细胞，或者可以在给予患者之前在细胞培养物中选择、富集、扩增等。在一些情况下，可在给药前储存或运输治疗性细胞。为了在储存和/或运输期间维持细胞的活力，可以在非常低的温度下冷冻治疗性细胞以保持和保护它们的治疗能力(冷冻保存或冷冻储存)。这种冷冻保存可以实现长期储存和/或延长运输时间，而治疗功效很少或没有损失。
传统的冷冻保存方法可能导致治疗性细胞解冻后活力不一致或较差。另外，传统的冷冻保存方法需要额外的处理和操作，以便将细胞转移到应用设备或装置，和/或除去一种或多种冷冻保存材料。
随后对治疗性细胞的处理可能会对一致性、活力和功效产生不利影响。此外，将治疗性细胞转移到适当的医疗装置或设备增加细胞被有害细菌、病毒、化学物质等污染的风险。此外，依赖于使用动物血清的传统冷冻方法可能使人类接受者遭受动物传播疾病。
因此，用于冷冻治疗性细胞的改进的组合物和方法，以及限制解冻后操作的装置将是有益的。
概要
本文公开了一种用在治疗性药物组合物中冷冻储存和保存真核细胞的组合物。所述的组合物包括冷冻介质，冷冻试剂(例如二甲基亚砜)和一种或多种有机聚合物(例如透明质酸)。本发明的组合物还允许在有和没有动物血清的情况下冷冻治疗性细胞。所公开的组合物和装置能够通过冷冻、在-130℃和-196℃之间长时间储存、解冻维持细胞的活力和无菌性并将细胞施用于患者。
还公开了用于冷冻和解冻真核细胞的容器。在许多实施方式中，容器适于在解冻后施用细胞，并且在施用前几乎不需要或不需要处理细胞混合物。在许多实施方式中，容器可以限定医疗装置的至少一部分，例如注射器，其中容器可以在冷冻和解冻期间保持细胞混合物的无菌性，并且可以用于将混合物施用于需要其的患者。容器可包括内腔，以及第一和第二开口端，所述第一和第二开口端可构造成接收盖、套、塞子，柱塞或用于将混合物容纳在内腔中的其他合适的结构。容器由生物相容性材料制成，其经冷冻和解冻过程保持其完整性。
本文公开了用于在低温下维持治疗性哺乳动物细胞活力的装置、组合物和方法，所公开的装置还可用于在给予有需要的患者之前减少细胞的操作。所公开的组合物，装置和方法维持细胞的活力，以帮助减少治疗效果的丧失。
本发明的其它目的和优点将部分地在下面的描述中阐述，并且部分地将从描述中显而易见，或者可以通过实践本发明来了解。本发明的目的和优点将通过所附如权利要求中特别指出的元素和组合来实现和获得。
附图简要说明
图1显示了用于冷冻、储存和应用所公开的细胞组合物的装置的一个实施方式。上图显示了未组装的设备的各个部分。下图示出装置横截面视图。
图2是所公开的装置的一个实施方式的照片，其组装和配置成在冷冻、储存，运输和解冻期间减少储存在桶腔内的所公开组合物的污染。
图3比较了液氮气相1个月后含1％透明质酸的各种介质的复苏和活力。在这些实验中使用的冷冻容器是注射器***。所有介质都能带来良好的复苏和活力。
图4是显示DiscGenics注射器样品的非破坏性顶空氧测量结果的柱状图。描述的值是TO和T1时间点之间顶空氧浓度的变化；将两个时间点的顶空氧浓度作为每个注射器的5次重复测量的平均值处理。水平红线表示氧气减少3.0％，其被用作注射器的容器封闭完整性失效的标准。
详细描述
本文提供了在非常低的温度下冷冻真核细胞(例如哺乳动物细胞)用于储存和/或运输的组合物和方法。本文还提供了用于容纳冷冻细胞的医疗装置和设备，其还减少了在施用之前对细胞的后续操作。本文还描述了在所公开的装置中冷冻和储存所述组合物的方法，其中冷冻和储存的方法提供了令人惊讶的增强抵抗气体、液体和微生物(例如，细菌、真菌、病毒等)污染的能力。
在许多实施方式中，所公开的方法包括将细胞与冷冻介质组合，以产生细胞混合物，然后将细胞混合物置于所公开的装置和设备中。在许多实施方式中，所公开的冷冻组合物包含冷冻介质，冷冻试剂和有机聚合物。在很多实施方式中，在冷冻之前将细胞置于容器中，其中容器是可用于施用细胞的医疗装置的一部分。在这些实施方式中，容器被设置成承受非常低的温度和解冻，而基本上不影响细胞的活力和无菌性、或装置的功能。
本公开提供了用于冷冻和解冻细胞的组合物、装置和方法，细胞数量适于于解冻后的治疗用途。。解冻后，所公开的治疗性细胞50％-100％存活(即60-100％的细胞能够生长和***)、无菌并准备立即给药。在许多实施方式中，从容器中回收约50-100％的细胞并给予患者。在许多实施方式中，所公开的方法有助于将闭合完整性的失败率显著降低至小于20％、10％、5％或更低。令人惊讶的是，申请人已经发现单独的聚合物注射器柱塞不足以保护所公开的组合物的无菌性，因为在非常低的温度下，例如所公开的用于冷冻和储存所公开的细胞的温度，柱塞允许气体交换，可能会导致如病毒、真菌、细菌和其他微生物等生物材料的污染。
在许多实施方式中，所公开的组合物、方法和装置有助于保持所公开的治疗性细胞的效力，其可通过测量一种或多种指示基因或蛋白质的表达来分析，例如一种或多种细胞因子的产生、细胞周期标志物或细胞外基质成分。
本发明还可用于以高密度(例如，约1.0×106个细胞/毫升至5.0×108个细胞/毫升)冷冻细胞，在有或没有动物血清的情况下，同时保持细胞在组合物内活力、一致性和分散性。在一些实施方式中，细胞密度可以大于约100×103、0.5×106、1×106、1.5×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、10×106、20×106、30×106、40×106、50×106、100×106、200×106、300×106、400×106、500×106、600×106或700×106，并且小于约750×106、700×106、600×106、500×106、400×106、300×106、200×106、100×106、50×106、40×106、30×106、20×106、10×106、6×106、5×106、4x106、3×106、2×106、1.5×106，1×106、0.5×106或200×103。
在大多数情况下，可以在细胞密度为0.5×106个细胞/毫升和1.0×107个细胞/毫升之间冷冻治疗性细胞。在一些实施方式中，细胞混合物中治疗性细胞的密度为约1.0×106至9.0×106个细胞/毫升，例如大于约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5×106个细胞/毫升，且小于约9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1、3.0、2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2和1.1×106个细胞/毫升。
可以一个或多个剂量体积或量冷冻细胞。在一些实施方式中，剂量可以为约0.1毫升至5.0毫升，例如每剂量大于约0.1毫升、0.2毫升、0.3毫升、0.4毫升、0.5毫升、0.6毫升、0.7毫升、0.8毫升、0.9毫升、1.0毫升、1.1毫升、1.2毫升、1.3毫升、1.4毫升、1.5毫升、1.6毫升、1.7毫升、1.8毫升、1.9毫升、2.0毫升、2.1毫升、2.2毫升、2.3毫升、2.4毫升、2.5毫升、2.6毫升、2.7毫升、2.8毫升、2.9毫升、3.0毫升、3.1毫升、3.2毫升、3.3毫升、3.4毫升、3.5毫升、3.6毫升、3.7毫升、3.8毫升、3.9毫升、4.0毫升或4.5毫升，且每剂量小于约5.0毫升、4.5毫升、4.0毫升、3.9毫升、3.8毫升、3.7毫升、3.6毫升、3.5毫升、3.4毫升、3.3毫升、3.2毫升、3.1毫升、3.0毫升、2.9毫升、2.8毫升、2.7毫升、2.6毫升、2.5毫升、2.4毫升、2.3毫升、2.2毫升、2.1毫升、2.0毫升、1.9毫升、1.8毫升、1.7毫升、1.6毫升、1.5毫升、1.4毫升、1.3毫升、1.2毫升、1.1毫升、1.0毫升、0.9毫升、0.8毫升、0.7毫升、0.6毫升、0.5毫升、0.4毫升、0.3毫升或0.2毫升。在一些实施方式中，可以在一个装置中冷冻1、2、3或更多剂量。
细胞
与所公开的组合物、装置和方法一起使用的细胞包括哺乳动物细胞，治疗性细胞，例如治疗性人细胞。所公开的细胞可以从各种组织获得或施用于各种组织。在许多实施方式中，治疗性细胞可以从椎间盘组织获得，并且可以施用于椎间盘。在其他实施方式中，各种类型的细胞，例如成肌细胞、肌细胞、软骨细胞、上皮细胞、骨细胞、破骨细胞、祖细胞、干细胞等，可以从多种组织获得和/或施用于多种组织，包括肌肉、肝脏、心脏、肺、胰腺、关节软骨、肌腱、韧带、椎间盘、骨、胸腺、甲状腺或***。在一些实施方式中，所公开的细胞可以源自关节软骨、心脏组织或骨。
所公开的组合物、装置和方法用于治疗多种疾病和病症，包括但不限于退行性椎间盘疾病、损伤的椎间盘、烧伤、撕裂伤、心脏和肌肉损伤、骨折/分离等。
组合物
在一些实施方式中，在冷冻之前从细胞培养基收集治疗性细胞。在一个实施方式中，离心用于收集和沉淀细胞。然后可以将沉淀的细胞重新悬浮在所公开的冷冻组合物中以产生细胞混合物。在许多实施方式中，所公开的冷冻组合物可包含冷冻介质，冷冻试剂和有机聚合物。
介质
冷冻介质(或冷冻保护性介质)可包含一种或多种添加剂，包括但不限于动物血清(例如胎小牛血清(FCS)或胎牛血清(FBS))和冷冻保护剂(即，具有高水溶性和低毒性的试剂)。加入到冷冻介质的冷冻保护剂可通过在冷冻和解冻过程中限制或防止细胞损伤来增强细胞的存活。
各种商业冷冻介质可用于形成本发明的组合物，用于所公开方法。例如，在一些实施方式中，可以不使用动物血清，在这些实施方式中，可以使用“无异种”介质代替具有动物血清的介质，例如Profreeze，FreezIS，Cryostor等。在各种实施方式中，所公开的冷冻介质可进一步包含一种或多种另外的组分，例如蛋白质，如白蛋白。在一实施方式中，人、哺乳动物或合成血清白蛋白(HSA)可包含在冷冻介质中。在许多实施方式中，冷冻介质的浓度可以是不包括冷冻试剂和有机聚合物的部分的剩余部分。在一些实施例中，冷冻介质的浓度为约60％至约98.9％，例如大于约65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％且小于约100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、8％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、75％或70％。在一实施方式中，冷冻介质的浓度为约91.5％。
所公开的介质可以进一步包含其它组分，例如氨基酸(例如，谷氨酰胺、精氨酸或天冬酰胺)，维生素(包括但不限于B族维生素，例如维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B6、维生素B7、维生素B9或维生素B12中的任何一种或多种)，过渡金属(包括但不限于镍、铁(如三价铁或亚铁)或锌)和其它介质组分。本文提供的任何介质也可根据需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、离子(如钠、氯、钙、镁和磷酸盐)，缓冲液(如HEPES)，核苷(如腺苷和胸苷)、微量元素(定义为最终浓度通常以微摩尔范围内存在的无机化合物)、以及葡萄糖或等效能源。在一些方面，本文提供的冷冻介质包含源自植物或动物的蛋白质。在一些实施方式中，本文提供的冷冻介质不含源自植物或动物的蛋白质。还可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其它必需的补充剂。
试剂
冷冻试剂(或冷冻保护剂)也可称为冷冻保护剂。这些试剂可以是帮助细胞在冷冻和解冻过程中保持活力的化学物质。冷冻试剂通常进入细胞并有助于降低细胞内渗透压并保护细胞中的蛋白质免于变性。可穿过细胞膜的冷冻试剂的一个实例是DMSO(二甲基亚砜)。DMSO穿过细胞膜的能力也使其在解冻后离开细胞。其它冷冻试剂可包括甘油、藻酸盐、聚乙烯醇等。
所用冷冻试剂的浓度可在约1％(以体积或重量计)至约20％之间变化。在大多数实施方式中，冷冻试剂的浓度可为约7.5％，例如其中冷冻试剂为DMSO。在许多实施方式中，可以降低所用DMSO的浓度以使其对用治疗性细胞治疗的患者的给药最小化。
聚合物
有机聚合物被包含在冷冻组合物中。所公开的有机聚合物用于在冷冻期间保护细胞，并且如果它们在解冻后施用于患者，则其用作治疗性细胞的基质。在很多实施方式中，有机聚合物是糖胺聚糖，例如透明质酸、透明质酸钠或透明质烷。在许多实施方式中，有机聚合物的浓度为混合物重量的约0.1％-10％。在优选的实施方式中，有机聚合物的浓度为约1.0％。
方法
所公开的细胞混合物可以放置在合适的容器内，该容器被设计成能承受非常低的温度(即低于约-100℃)。在一些实施方式中，可以在与治疗性细胞组合之前预冷冷冻组合物。在许多实施方式中，细胞可以在-20℃至-80℃下冷冻5至120分钟。在长期存放之前。在一些实施方式中，组合物和装置可以储存在约-80℃或约-196℃下用于长期储存。例如，所公开的方法可以包括在约-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃、-45℃、-50℃、-55℃、-60℃、-65℃、-70℃、-75℃或-80℃下冷冻所公开的装置中的细胞大于约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟、105分钟、120分钟或180分钟，且小于约240分钟、180分钟、120分钟、105分钟、90分钟、75分钟、60分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟或15分钟。在许多情况下，组合物的温度可以以大于约0.1℃/分钟、0.2℃/分钟、0.3℃/分钟、0.4℃/分钟、0.5℃/分钟、1℃/分钟、2℃/分钟、3℃/分钟、4℃/分钟、5℃/分钟、6℃/分钟、7℃/分钟、8℃/分钟、9℃/分钟、或10℃/分钟，且小于约15℃/分钟、10℃/分钟、9℃/分钟、8℃/分钟、7℃/分钟、6℃/分钟、5℃/分钟、4℃/分钟、3℃/分钟、2℃/分钟、1℃/分钟、0.5℃/分钟、0.4℃/分钟、0.3℃/分钟、0.2℃/分钟或0.1℃/分钟的速率降低。
所公开的方法可以包括一步、多步或倾斜冷冻。在大多数实施方式中，在细胞冷冻后，它们可以储存在液氮气相中，其可以是约-135℃至约-196℃，例如低于约-130℃、-135℃、-140℃、-145℃、-150℃、-155℃、-160℃、-165℃、-170℃、-171℃、-172℃、-173℃、-174℃、-175℃、-176℃、-177℃、-178℃、-179℃、-180℃、-181℃、-182℃、-183℃、-184℃、-185℃、-186℃、-187℃、-188℃、-189℃、-190℃、-191℃、-192℃、-193℃、-194℃、-195℃或-196℃，并且高于约196℃、-197℃、-196℃、-195℃、-194℃、-193℃、-192℃、-191℃、-190℃、-189℃、-188℃、-187℃、-186℃、-185℃、-184℃、-183℃、-182℃、-181℃、-180℃、-179℃、-178℃、-177℃、-176℃、-175℃、-174℃、-173℃、-172℃、-171℃、-170℃、-165℃、-160℃、-155℃、-150℃、-145℃、-140℃和-135℃。
所公开的细胞组合物可以长期储存。在一些实施方式中，细胞可以储存超过约4周、6周、8周、10周、12周、16周、20周、24周、28周、32周、36周、40周、44周、48周、52周、1年、1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年或更长，且少于约5年、4.5年、4年、3.5年、3年、2.5年、2年、1.5年、1年、52周、48周、44周、40周、36周、32周、28周、24周、20周、16周、12周、10周、8周或6周。在大多数实施方式中，储存细胞的存活率在解冻后大于约90％，例如小于约100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、80％和75％，并且大于约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
细胞、组合物和装置可以在各种温度下运输。在一些实施方式中，冷冻细胞可以在各种介质中运输，包括液氮、气相氮。在其他实施方式中，所公开的方法可包括在-80℃至-196℃的温度下延长储存和运输。
在冷冻之前，将细胞重新悬浮在冷冻组合物中并在保持混合物的无菌性、组成和防止或抑制混合物与容器之间的空隙或空间的条件下存储在容器中。在一些实施方式中，可以将装置预装有部分组合物，并且可以将细胞添加到容器内的组合物中。在许多实施方式中，容器是医疗装置的至少一部分，例如注射器器筒，但也可以是适于在低温下维持细胞活力的任何容器。在许多实施方式中，容器可以帮助将治疗性细胞直接给予或施用于患者。在一些实施方式中，容器可以是可植入的和/或可生物降解的。在一些实施方式中，如下文更详细描述的，医疗装置可以是容器，例如注射器筒，其可以被盖住或密封以防止组合物与装置周围的氮蒸气或其他气体之间的气体交换。
所公开的方法可用于提高细胞温度降低的速率。更快速的温度降低可以通过避免冷冻的某些破坏性(例如脱水)来帮助保持细胞活力。公开的解冻率也可能比传统方法更快。在大多数实施方式中，可以通过将容器置于室温或环境温度(例如约20℃至约25℃)并使细胞混合物达到液体形式来进行解冻。在其他实施方式中，解冻可以在冰上进行，或者在加热装置的帮助下进行。在一些实施方式中，可允许细胞混合物达到液体形式，其在小于约2小时、110分钟、100分钟、95分钟、90分钟、85分钟、80分钟、75分钟、70分钟、65分钟、60分钟、55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、或20分钟内，并且大于约15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、65分钟、70分钟、75分钟、80分钟、85分钟、90分钟、95分钟、100分钟、105分钟、110分钟或115分钟大于约0℃。在一些实施方式中，在细胞混合物处于体温(即约37℃)之前将细胞混合物施用于患者，其小于约37℃、36℃、35℃、34℃、33℃、32℃、31℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃或20℃，且大于约15℃、20℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃或36℃。
医疗装置
可以在冷冻之前将细胞转移到医疗装置或容器中。在一些实施方式中，医疗装置可以是注射器的筒或内腔，并且组合物可以用一个或多个密封件、柱塞、盖或其他合适的阻挡物密封在桶内，以防止气体交换和/或注射器周围的物质或生物污染。在注射器装置中和从注射器装置中对所公开的细胞进行冷冻保存、存储和转移可有助于降低与所公开的细胞的制造、运输和应用相关的成本。例如，由于必须将细胞转移到注射器以进行施用，因此使用小瓶可能增加时间和成本。使用注射器还可以减少使所公开的细胞通过一个以上针头的需要，从而减少暴露于可能影响效力的力(如剪切力)的情况。最后，将所公开的细胞从储存容器转移到施用器也可能导致残留在第一容器中样品丢失。图1示出所述容器装置的实施方式，其中该装置是注射器。
参考图1，所公开的装置100可包括注射器筒200，柱塞杆300，柱塞400和针端盖500。还示出了可选的桶盖600。在许多实施方式中，注射器可以不包括柱塞杆。筒可以具有第一柱塞端210，包括筒凸缘215，限定进入筒腔225开口的筒孔220，和第二针端230。筒孔具有直径d1，并且筒腔具有直径DL。筒凸缘端可以限定围绕筒孔的基本上平坦的表面，并且其直径大于筒的外径。在针端处或附近可以是针座240，其可以限定由内表面242限定的针座腔241，包括多个凸起的盖或鲁尔接收脊243。筒端部件245可以位于针座管腔的中心内，用于接收针(未示出)或可选地针端盖500。限定内腔250的筒端部件具有与筒腔流体连通的第一入口孔251，以及有助于将筒腔内的组合物转移到针(未示出)中的第二出口孔252。第二出口孔具有直径d2，可以选择该第二出口孔以在细胞组合物通过筒端部件内腔并进入注射器针头(未示出)时使剪切力最小化。在各种实施方式中，筒端部件内腔可具有等于d2的恒定直径，或可变直径，其中第一入口孔限定的直径大于d2但小于d1。筒端部件内腔的内径小于筒腔DL的内径，其可以在约1.0至10.0毫米之间。在许多实施方式中，筒腔的内径为约6.0、6.1、6.2、6.3或6.4毫米，并且尖端腔可以大于约0.5毫米、0.6毫米、0.7毫米、0.8毫米、0.9毫米、1.0毫米、1.1毫米、1.2毫米、1.3毫米、1.4毫米、1.5毫米、1.6毫米、1.7毫米、1.8毫米、1.9毫米、2.0毫米、2.1毫米、2.2毫米、2.3毫米或2.4毫米，且小于约2.5毫米、2.4毫米、2.3毫米、2.2毫米、2.1毫米、2.0毫米、1.9毫米、1.8毫米、1.7毫米、1.6毫米、1.5毫米、1.4毫米、1.3毫米、1.2毫米、1.1毫米、0.9毫米、0.8毫米、0.7毫米或0.6毫米。筒端部件还可以限定长度L1，所述长度L1大于或小于针座腔L2的深度，例如小于或大于约0.1毫米、0.2毫米、0.3毫米、0.4毫米、0.5毫米、0.6毫米、0.7毫米、0.8毫米、0.9毫米、1.0毫米、1.1毫米、1.2毫米、1.3毫米、1.4毫米、1.5毫米、1.6毫米、1.7毫米、1.8毫米、1.9毫米、2.0毫米、2.1毫米、2.2毫米、2.3毫米或2.4毫米。因此，筒端部件可以从针座腔内腔突出(如果长度大于深度)或可以是凹陷的(如果长度小于深度)。所公开的注射器的一些实施方式可以包括针头端盖或针头，而其他不包括针头端盖或针头。针端盖500可构造成牢固地密封末端并防止气体交换，细胞组合物从筒腔泄漏，和/或气体、微生物或其他外来物质进入筒。在图1所示的实施方式中，如图1所示，针端盖可具有限定多个连接器脊515的外表面510，用于接合针座管腔内表面上的互补结构。在图1所示的实施方式中，针头端盖可以进一步限定筒端部件内腔520，用于接收针筒上的端部。
柱塞杆可以通过各种方法连接到柱塞。在一实施方式中，例如图1中所示，柱塞杆可包括位于一端的柱塞连接器310和位于相对端的柱塞头320。柱塞连接器可以设置成固定地连接到柱塞。在图1所示的实施方式中，柱塞连接器限定具有多个螺旋齿315的螺钉。柱塞可以限定柱塞接收器结构415，用于与柱塞杆上的柱塞连接器固定连接。图1所示的实施方式具有柱塞接收器，其被构造成用于接收柱塞杆的柱塞连接器螺钉的内腔。柱塞可具有外表面420，其被构造成接触筒的内腔。在图1的实施方式中，柱塞包括外表面上的多个脊425。
申请人惊奇地发现，当注射器在低于约-80℃的温度下储存时，聚合物不能在注射器筒内保持气密密封。在许多情况下，聚合物柱塞的失效不受柱塞杆从柱塞上移除的影响。也就是说，即使柱塞固定地连接到柱塞杆上的应用也显示出不完全闭合。申请人还惊奇地发现，在筒的凸缘孔处或附近使用聚合物盖可有助于防止气体交换和/或污染。如下面的实施例2所示，通过在筒中放置额外的柱塞不会阻止气体交换/泄漏。相反，密封筒的凸缘端部能够显著降低失效率。用于密封注射器的凸缘端部的其他方法可包括将其他合适的聚合物和非聚合物密封件放置在筒的凸缘端处或附近。在一实施方式中，粘合剂可以定位在聚合物盖和凸缘的平坦表面之间以帮助密封，在其他实施方式中，可以使用本领域技术人员已知的其他技术将盖密封到平坦表面。
图2显示了所公开的装置的一实施方式，其被配置成保持闭合完整性并减少流体、气体、微生物或其他材料对组合物的污染。在该实施方式中，通过将筒盖600至少部分地放置在筒端孔口内来密封筒孔。在一些实施方式中，盖可通过一种或多种结构或技术保持在适当位置，以防止气体交换和/或污染物进入筒腔。筒盖可由任何化合物或元件制成，所述化合物或元件可密封到筒凸缘和/或筒孔口以防止筒腔的污染。在一些实施方式中，附加结构可以帮助固定桶盖，例如脊(例如在针端盖中看到的那些)，聚合物粘合剂，金属封闭物等。
所公开的柱塞、针端盖和筒盖可以由适合使用的各种聚合物和非聚合物材料制成。在一些实施方式中，结构可以由硅树脂、聚丙烯、丁基橡胶、天然橡胶或其他合适的材料制成。在许多实施方式中，筒腔、柱塞、针端盖和/或筒盖还可包括物质的应用，层或涂层，以帮助密封和减少摩擦。在一些实施方式中，例如，涂层可以是硅树脂、PTFE(聚四氟乙烯)或用于医学应用本领域熟知的的其他合适材料。
所公开的医疗装置可以有助于冷冻、储存，解冻和施用治疗性细胞。在大多数实施方式中，所公开的装置包括具有开口第一端和开口第二端的主体，以及设置在开口之间并流体连接开口的内腔。第一开口端可以限定筒端部件，该筒端部件被构造成可移除地连接和分离密封盖或施用器，例如针。尖端可以限定与内腔流体连通的内部和外部。筒端部件的外部可包括一个或多个被设计成用于帮助固定针的结构，例如鲁尔锁。在其他实施方式中，盖和针可以压合。
第二开口端可以限定开口，该开口被构造成接受冷冻组合物中所公开的治疗性细胞，使得它们可以储存在内腔中。第二开口可以进一步被构造成接收盖、柱塞、插塞或其他结构，所述结构设计成装配在第二开口的壁内并可移动地密封第二开口的壁。第二开口的壁可以与内腔的壁邻接。盖、柱塞、插塞或其他结构可以被设计成连接(在一些实施方式中可逆地)杆部分，该杆部可以有助于将力传递到盖、柱塞、插塞或其他结构，这可能导致盖、柱塞、插塞或其他结构相对于腔的壁移动。
所公开的装置被设计成在非常低的温度下储存并与冷冻组合物的一种或多种组分接触后保持功能。例如，所公开的盖、柱塞、插塞或其他结构可在冷冻、储存和解冻期间基本上保持与第二开口端和/或内腔的壁的流体密封，以有助于防止位于内腔内的治疗性细胞的污染。
第二开口端和内腔的壁被设计成允许盖、柱塞、插塞或其他结构平稳地移动抵靠它，同时基本上保持流体密封。在一些实施方式中，内腔可包括壁上的涂层，其可防止装置与冷冻组合物之间的化学相互作用。在其他实施方式中，腔壁的组成可足以防止化学相互作用。化学相互作用可以指可以改变冷冻组合物或装置的组成的反应，其可以降低或改变细胞和/或冷冻组合物的治疗效果。
所公开的装置可以由各种材料制成。在一些实施方式中，用于制造所公开的装置的材料在冷冻和解冻时能够抵抗过度膨胀、收缩、破损、破裂、破碎等。在一实施方式中，该装置可包含聚合物玻璃替代物，例如聚合物环烯烃，例如水晶天顶(crystal zenith)，或环烯烃聚合物和共聚物。在许多实施方式中，所公开的装置可包括一种或多种透明材料，其可以允许监测治疗性细胞和冷冻组合物。
腔壁足够薄，以便控制和快速冷冻和解冻。在许多实施方式中，装置内腔的材料可以有效地传导热量以允许治疗性细胞的快速冷冻和解冻。
盖、插塞、柱塞或其他材料可以至少部分地由聚合化合物制成，其在冷冻和解冻时抵抗膨胀、收缩、破裂、破碎等。在一些实施方式中，聚合化合物包含一种或多种有机聚合物，例如异戊二烯或胶乳。在一些实施方式中，可以将润滑剂或涂层添加到盖、插塞、柱塞或其他材料中，以有助于保持对腔壁的密封。
定义
“培养基”，“介质”和“细胞培养基/介质”是指在培养中和原位(例如在给予需要这种细胞的患者之后)用于维持真核细胞的活力的溶液。所公开的介质包含用于培养细胞的营养源(例如血清、血清替代品、葡萄糖、半乳糖等中的一种或多种)，以及一种或多种其它组分(例如激素、肽、维生素、必需氨基酸、非必需氨基酸、矿物质、盐、缓冲剂等)。
“冷冻介质”可以指含有一种或多种其它组分的培养基，例如冷冻保护剂，用于在冷冻期间和之后维持真核细胞的活力。
虽然公开了多个实施方式，但是从以下详细描述中，本发明的其他实施方式对于本领域技术人员将变得明显。显而易见的是，本发明能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本发明的精神和范围。因此，详细描述本质上被认为是说明性的而非限制性的。
本文公开的所有参考文献，无论是专利还是非专利，均通过引用结合到本文中，如同每个参考文献全文包括在其引用中一样。如果参考和说明书之间存在冲突，则将以本说明书(包括定义)为主。
尽管已经以一定程度的特殊性描述了本公开，但是应当理解，本公开已经通过示例的方式示出，并且可以在不脱离所附如权利要求限定的本公开的精神的情况下进行细节或结构的改变。
实施例
实施例1-冷冻组合物的复苏和活力
比较各种培养基中的细胞复苏和活力。在如上所述容器装置中将细胞冷冻并在液氮的气相中储存一个月。用于这些实验的容器是注射器***。在所公开的注射器***中的储存能够允许在解冻后将细胞混合物直接施用于受试者，同时使操作最小化。
图3中的柱形图表明所有测试的冷冻组合物都具有良好的复苏和活力。
实施例2-封闭完整性
令人惊讶的是，初步研究表明，在极低温度下注射器中样品的冷冻和解冻，例如液氮蒸汽中的那些，导致样品中的氧气损失。这表明聚合物柱塞和/或端盖不足以在冷冻、储存和解冻期间保持密封。当柱塞杆就位时和移除柱塞杆时都看到了这种失效。
为了测试这种失效的来源，使用各种注射器和封闭物测试了一系列配置。本研究的目的是通过使用注射器顶空氧浓度[％]及其总压[托(torr)]的非破坏性分析来评估在低温下储存的多个注射器配置的容器封闭完整性(CCI)。对于该研究，制备了代表八种不同注射器配置的多个注射器。将注射器中加入样品并在低温储存容器中储存约4.5天。在这些条件下，容器封闭完整性的破坏将导致注射器顶部空间内的氧浓度降低。氧浓度的这种降低可能是由于富氮储存环境与注射器内的组合物之间的气体交换和气体泄漏造成的。
作为对照，将来自每种配置的一个注射器在室温下储存在氮气吹扫的气密容器中。设计这些阴性对照样品以研究低温储存温度对气体交换/泄漏的影响。
通过使用可调谐二极管激光吸收光谱(TDLAS)技术进行顶空氧浓度测量。
样品组
组合各种注射器、柱塞和塞子以测试不同的配置(图4和表1)以确保封闭完整性。制备7个重复样品用于下表1中所述的样品形式。
对于每次重复，在储存之前测量每个注射器的顶部空间的氧含量和总压力，然后在储存之后再次测量。
表1样品瓶摘要。注意，使用卡尺通过兆光(Lighthouse)测量瓶直径。
Figure BDA0002188425270000121
Figure BDA0002188425270000131
方法和材料
样品制备和处理
对于这些实验，PBS用作测试组合物。使用吉尔森P1000移液器(Gilson P1000Pipetman)将PBS转移到每个注射器中(Gibco；目录号：20012-027；pH7.2)。注意避免在注射器筒的内表面上形成液滴。使用Dabrico通气放置工具(Dabrico；目录号：MS-25)将指示的柱塞引入注射器中。
对于多种样品形式，通过***081塞子和420塞子形成了一个额外的屏障。具体地，将这些塞子手动***注射器中以分别用于样品形式2和7。
样品编号1至5代表该特定样品形式的实验组。样品编号6代表具有已知的制造缺陷的阳性对照。通过将注射器针***注射器的柱塞(和塞子，如果存在的话)引入样品编号6重复的缺陷。具体地，对于所有样品形式使用23号×1英寸的针，除了样品形式7之外，其使用18号×1.5英寸的针(必需刺穿柱塞和塞子)。如上所述，每种样品形式的样品编号7表示在室温下在氮气环境中储存的阴性对照。
在制造样品形式的当天测量顶空氧浓度和总压力的初始时间点(T0)。在第二天，放置每种样品形式的样品编号1至6，首先在-20℃冰箱中放置3小时，然后转移至-80℃冰箱。在将每个样品保持在-80℃约4小时后，将样品编号1至6储存在Cryoport
Figure BDA0002188425270000141
高容量干燥蒸汽运输器中(除去所有过量的液氮)。使用Apollo IV数字温度计(Uei；目录号：DT304)监测干燥蒸气运输器的温度，在～4.5天的低温储存期间保持稳定在-177℃(96K)。再次，将样品号7储存在用纯氮气吹扫的气密容器中，并在环境室温(～23℃)下保持～4.5天。
储存～4.5天后，从冷冻储存中取出样品编号1至6。立即将样品置于第二气密、氮气吹扫的环境室温(～23℃)下约2小时，以使样品解冻并平衡至室温。
测量所有形式的所有注射器的顶空氧浓度和总压力的T1时间点测量值。每个样品测量五次。图4是从T0到T1氧顶空浓度的变化图。
顶空氧测量
使用频率调制的可调谐二极管激光吸收光谱仪(兆光(Lighthouse))来测量每个重复中的顶空氧。这种称为TDLAS的技术可在密封容器内对顶部空间进行快速、非干预的气体分析，以提供特定的气体密度和总顶空压力。
在样品分析之前，每次连续测量5次具有已知氧浓度的六种氧标准物以验证仪器的性能。根据测量误差的绝对值(已知值和测量值之间的差值)和测量精度(每个标准品的多次测量的标准偏差)，在研究中顶空氧浓度测量不确定度确定为±0.8％atm。
顶空压力测量
使用FMS-湿度/压力顶空分析仪(兆光(Lighthouse))按照标准测量程序进行顶空压力测量。简而言之，打开仪器并预热，用氮气吹扫至少1标准升/分钟，在测量期之前至少进行30分钟。然后用已知的压力/湿度标准进行校准。
在样品分析之前，每次连续测量5次在已知总压力下的压力标准(一种形式10个标准，第二形式8个标准)，以验证仪器的性能。根据测量误差的绝对值(已知值和测量值之间的差值)和测量精度(每个标准的多次测量的标准偏差)，确定了本研究的顶空总压力测量不确定度为测量值的±7％和±6托的较大值。
结果
图4显示了非破坏性顶空氧测量的总结。对于九种不同样品形式中的每个注射器，显示T0和T1时间点之间的顶空氧浓度的变化。水平红线表示氧气减少3.0％，用作注射器容器封闭完整性失效的标准(见下面的讨论)。根据氧标准的性能，本研究中使用的用作标准的顶空氧浓度测量不确定度被确定为±0.8％atm。表3总结了每个注射器样品的每个测量的顶空参数的结果。根据Lighthouse压力标准的性能，这些样品形式的顶空总压力测量不确定度被确定为测量值的～7％或～6托的较大值。
表3每个DiscGenics注射器样品的平均测量顶空氧气、总压力和水分值。列出的值是每个样本的5次重复测量的平均值。氧气减少3.0％被用作确定注射器容器封闭完整性失效的首要标准(见讨论)。
Figure BDA0002188425270000151
表3(续).每个DiscGenics注射器样品的平均测量顶空氧气、总压力和水分值。列出的值是每个样本的5次重复测量的平均值。氧气减少3.0％被用作确定注射器容器封闭完整性失效的首要标准(见讨论)
Figure BDA0002188425270000161
讨论和结论
对于九种配置中的每一种的所有注射器，成功测量顶空氧浓度和总压力(表1)。该研究的顶空氧浓度测量不确定度基于氧标准确定为±0.8％atm；根据压力标准的性能，将与总压力相关的相应测量不确定度确定为测量值的±7％和±6托的较大值。因为注射器含有液态水，所以顶部空间被水蒸气饱和，因此，提供了对于所述注射器配置可获得的最大FMS信号。
测量结果总结在表3中。还将冷冻储存后观察到的顶空氧浓度[％]和总压[托]的变化进行列表。在这些条件下，特定注射器中容器封闭完整性的破坏可通过三种可能的过程降低其顶部空间中的氧浓度。首先，可能会发生减少，因为低温储存容器中的注射器周围的氮蒸气会随着温度降低而通过破裂(破坏)泄漏到注射器中，这可能导致由于顶空总氧气稀释导致的氧气浓度降低。其次，在注射器在～177℃储存温度下热平衡之后，可能发生扩散，使得氧分子将从注射器顶部空间泄漏并进入低温储存容器的氮气环境中。第三，一旦将注射器从低温存储器中取出，温度升高可能在任何已经发生泄漏的注射器的顶部空间中产生过压；这种过压将倾向于推出注射器顶空气体，包括仍然存在的任何氧气。注意如果在温度升高时重新密封容器封闭完整性的破坏处，则将保持顶部空间过压。表3中的“柱塞失效”栏表示注射器顶部空间中存在过压向上推注射器柱塞。
基于阴性对照(样品编号7)观察到的氧含量的变化，顶空氧浓度降低大于3.0％被评分为表明容器封闭失效。此外，在注射器加热后推出柱塞的任何注射器(“柱塞失效”)也被认为是容器封闭失效。最后，顶空压力增加大于100托被视为发生CCI失效的附加标准。
如示于图4并列于表3中，各个注射器的结果表明，在低温储存的45个注射器样品中有29个容器封闭失效。正如所料，所有八个阳性对照(样品编号6)也都失效。
样品形式1、4、5和8的所有五个重复，以及样品形式3的五个测试注射器中的四个都发生CCI失效。这些形式中的各个都单独使用柱塞来密封注射器的筒。有趣的是，样本形式8包括两个柱塞。样品形式7，包括筒端的塞子，是防止失效最成功的。

Claims (14)

1.一种用于冷冻和解冻治疗性细胞混合物的装置，包括：
容器，包括：
第一开口端，具有第一直径；
第二开口端，具有小于第一直径的第二直径，所述第二开口端限定能够接受注射器针的鲁尔接头；
内腔，包括内腔壁，与第一和第二开口端流体连通，并且具有与第一直径相似的内腔直径，其中，容器由一种或多种生物相容性材料构成，当在低于-130℃冷冻并解冻时保持结构完整性；
第一聚合物密封件，其被构造成位于内腔内并与内腔壁形成密封接触；
第一聚合物盖，其被设计用于密封第一开口端；和
第二聚合物盖，其被设计用于密封第二开口端。
2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述容器限定注射器筒，并且所述第一聚合物密封件是活塞或柱塞。
3.如权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述容器由半透明聚合物制成。
4.如权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述容器由聚合环状烯烃制成。
5.如权利要求4所述的装置，其特征在于，当所述第二聚合物盖被移除时，所述鲁尔接头能够接受具有相容结构的注射器针。
6.一种冷冻治疗性哺乳动物细胞的方法，包括：
将多个治疗性细胞和组合物组合以形成混合物；
将混合物放入具有第一开口和第二开口的医疗装置的容器中，第一开口的直径大于第二开口的直径，所述第二开口端限定能够接受注射器针的鲁尔接头；
将第一聚合物盖放置于第一开口处，将第二聚合物盖放置于第二开口处以形成气密密封；
将混合物的温度降至-80℃或更低；
将混合物保持在低于-80℃的温度下至少30天，其中30天后至少50%的细胞在细胞培养物中生长并***至少一次。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述混合物保持在液氮气相中并且低于-130℃或所述30天的至少一部分。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，30天后至少90%的细胞生长和***至少一次。
9.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，在保存细胞后，将混合物解冻成温度在20和40℃之间的液体形式。
10.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述治疗性细胞源自人椎间盘组织。
11.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述容器包括：
第一开口端，具有第一直径；
内腔，包括内腔壁，其与第一和第二开口端流体连通，其中容器由一种或多种生物相容性材料构成，当在低于-130℃冷冻和解冻时保持结构完整性。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，当所述装置在低于-80℃的温度下储存时，所述装置防止至少氮气交换。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述细胞源自椎间盘组织、皮肤、肌肉、肠、骨髓、神经、肝、心脏、肺、胰腺、关节软骨、骨、胸腺、甲状腺或淋巴组织。
14.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞衍生自椎间盘组织、关节软骨、心脏组织或骨。
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