CN110387412A - 用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物组合及试剂盒及方法 - Google Patents
用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物组合及试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物组合,其特征在于,所述引物组合包括针对ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)基因位点的特异性引物及探针。本发明还公开了包含所述引物组合的试剂盒及其分析方法。本发明具有操作简单、经济、检测快速、准确性高、特异性好及结果判读简单的特点,实现对用于瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因多态性的快速及准确测定,以降低临床瑞舒伐他汀药物常见用药的不良反应,降低医疗成本,节约社会资源。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域,具体涉及一种用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物组合及试剂盒及方法。
背景技术
高脂血症为临床上常见的代谢疾病,是因脂肪代谢或转异常导致血浆一种或多种脂质高于正常指标的疾病。高血脂症是一种血脂水平偏高的慢性疾病,其发病原因较为复杂,年龄、性别、遗传、环境和不良的生活习惯均会导致该病的发生。临床研究表明,高血脂是多种心血管疾病的诱发因素,如动脉粥样硬化、冠心病等。近些年,随着人们物质生活的不断提高,该病的发病率也逐年增高,目前该病是公认的心肌梗死、脑卒中等致残、致死性动脉粥样硬化性病变的独立危险因素之一,并与糖尿病、心血管疾病发生有关。
瑞舒伐他汀是一种用作降脂剂的他汀类药物。FDA批准的适应症是纯合家族性高胆固醇血症,高脂血症,混合性血脂异常,原发性异常脂蛋白血症,高甘油三酯血症和预防心血管疾病。
我国卫计委于2015年发布了《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》,指出对药物代谢酶和药物靶点基因进行检测,可指导临床针对特定的患者选择合适的药物和给药剂量实现个体化用药,从而提高药物治疗的有效性和安全性。建议临床上根据SLCO1B1基因型选择他汀类药物进行治疗。
SLCO1B1*5等位基因突变破坏了转运蛋白在质膜上的定位,导致肝摄取减少、他汀类药物的全身血浆浓度增加,肌肉他汀类药物暴露增加,与肌病的发生相关。
ABCG2基因编码的乳腺癌耐药蛋白(BCRP)是瑞舒伐他汀的主要外排转运体。研究证实亚洲人群常见的ABCG2 421C>A突变可以显著升高瑞舒伐他汀血药浓度。
综上,通过对基因多态性的检测判断患者是否存在瑞舒伐他汀抗性,以便通过增加瑞舒伐他汀剂量、增加使用频率、增加新药等措施降低高脂血症的发生。
目前市场上还没有针对瑞舒伐他汀耐药性检测的基因检测试剂盒,临床上基因检测类试剂盒多采取Sanger测序法、高分辨率溶解曲线法、芯片杂交法检测基因多态性。但上述方法存在以下问题,其中Sanger测序包括PCR扩增、PCR产物纯化、DNA测序等操作,步骤繁琐,实验耗时长,专业技术要求高,且测序花费高,不适合临床推广;高分辨率溶解曲线法对设备要求特殊,且检测灵敏度不高,也不适合临床推广;芯片杂交法检测灵敏度低且特异性差,容易出现假阳性结果。
荧光定量PCR的检测方法较以上方法,其拥有成本低、灵敏度高、特异性强,结果的重复性好等优点,2小时内可完成Sanger测序12-13小时才能完成的通量,大大缩短了临床检测时间,是一种非常好的基因多态性检测手段,Genotyping基因分型散点图是基于荧光定量PCR的一种更简单快速直观判读基因型的检测方法,但是目前没有基于该方法的用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的的引物组合及试剂盒产品。
发明内容
为了解决传统临床经验医疗方式诊断及瑞舒伐他汀药物用药时易出现临床用药不良反应且没有合适的试剂盒产品的技术问题,本发明提供一种操作简单、检测快速、准确性高及特异性好的用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物组合、试剂盒及其方法。
本发明的目的之一在于提供一种检测快速、准确性高及特异性好的用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物组合。
本发明的目的之二在于提供一种操作简单的包含所述引物组合的试剂盒。
本发明的目的之三在于提供一种用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的方法。
为了实现本发明的目的之一,所采用的技术方案是:
一种用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物组合,包括针对ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)基因位点的特异性引物及探针,如下:
ABCG2(rs2231142)正向引物:
5'-GCTATTTGCCTTAAGGATGATGTTG-3'(SEQ ID NO.1);
ABCG2(rs2231142)反向引物:
5'-TGAATGACCCTGTTAATCCGTTC-3'(SEQ ID NO.2);
ABCG2(rs2231142)野生型探针:
5'FAM-TGACGGTGAGAGAAAACTTACAGTTCTC-TAMRA3'(SEQ ID NO.3);
ABCG2(rs2231142)突变型探针:
5'VIC-CTGACGGTGAGAGAAAACTTAAAGTTCTC-TAMRA3'(SEQ ID NO.4);
SLCO1B1(rs4149056)正向引物:
5'-GAAACACTCTCTTATCTACATAGGTTGT-3'(SEQ ID NO.5);
SLCO1B1(rs4149056)反向引物:
5'-CCTTCTTTAGCGAAATCATCAA-3'(SEQ ID NO.6);
SLCO1B1(rs4149056)野生型探针:
5'FAM-CCCATGAACACATATA-MGB3'(SEQ ID NO.7);
SLCO1B1(rs4149056)突变型探针:
5'VIC-ACCCATGAACGCATATA-MGB3'(SEQ ID NO.8)。
为了实现本发明的目的之二,所采用的技术方案是:
一种用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的试剂盒,包括含有所述的特异性引物及探针的PCR反应液,所述PCR反应液分别为ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1PCR反应液,其分别包括:
ABCG2(rs2231142)正向引物、ABCG2(rs2231142)反向引物、ABCG2(rs2231142)野生型探针及ABCG2(rs2231142)突变型探针;
SLCO1B1(rs4149056)正向引物、SLCO1B1(rs4149056)反向引物、SLCO1B1(rs4149056)野生型探针及SLCO1B1(rs4149056)突变型探针;
所述的PCR反应液当中还包括NuHi SNP Mix(2×)PCR预混液及无核酸酶水。
在本发明的一个优选实施例中,所述PCR反应液的成分终浓度为:1×NuHi SNPMix,0.5μM的各特异性引物及0.2μM探针。
在本发明的一个优选实施例中,所述试剂盒还包括阳性对照品一、阳性对照品二及阳性对照品三;
所述阳性对照品一分别为ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)基因位点野生型质粒;
所述阳性对照品二分别为ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)基因位点野生型与突变型按1:1数量比杂合的质粒;
所述阳性对照品三分别为ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)基因位点突变型质粒。
在本发明的一个优选实施例中,所述试剂盒还包括空白对照品,所述空白对照品为无核酸酶水。
为了实现本发明的目的之三,所采用的技术方案是:
一种用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的方法,包括如下步骤:
步骤一:取待检测样本抽提的DNA,作为PCR模板;
步骤二:提供所述的试剂盒,取出适量PCR反应液,将所述PCR反应液与适量所述PCR模板混匀;
步骤三:进行PCR扩增反应:95℃变性5min;95℃10sec,60℃40sec(采集荧光),45cycles;
步骤四:PCR结果判定:在所述试剂盒的阳性对照品和空白对照品符合规定的情况下,根据荧光扩增曲线及Genotyping基因分型散点图进行结果判定,得到用于瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因的基因型。
本发明的有益效果在于:
本发明具有操作简单、经济、检测快速、准确性高、特异性好及结果判读简单的特点,实现对用于瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因多态性的快速及准确测定,以降低临床瑞舒伐他汀药物常见用药的不良反应,降低医疗成本,节约社会资源。
附图说明
图1为临床样本ABCG2(rs2231142)引物探针的CC分型的qPCR扩增曲线图(FAM在上);
图2为临床样本ABCG2(rs2231142)引物探针的CA分型的qPCR扩增曲线图(FAM在上);
图3为临床样本ABCG2(rs2231142)引物探针的AA分型的qPCR扩增曲线图(FAM在下);
图4为临床样本ABCG2(rs2231142)引物探针的CC,CA,AA三种分型的Genotyping散点图;
图5为临床样本SLCO1B1(rs4149056)引物探针的TT分型的qPCR扩增曲线图(FAM在上);
图6为临床样本SLCO1B1(rs4149056)引物探针的TC分型的qPCR扩增曲线图(FAM在上);
图7为临床样本SLCO1B1(rs4149056)引物探针的CC分型的qPCR扩增曲线图(FAM在下);
图8为临床样本SLCO1B1(rs4149056)引物探针的TT,TC,CC三种分型的Genotyping散点图;
图9为临床样本ABCG2(rs2231142)采用对比引物探针的CC分型的qPCR扩增曲线图(FAM在上);
图10为临床样本ABCG2(rs2231142)采用对比引物探针的CA分型的qPCR扩增曲线图(FAM在上);
图11为临床样本ABCG2(rs2231142)采用对比引物探针的AA分型的qPCR扩增曲线图(FAM在下);
图12为临床样本ABCG2(rs2231142)采用对比引物探针的CC,CA,AA三种分型的Genotyping散点图;
图13为临床样本SLCO1B1(rs4149056)采用对比引物探针的TT分型的qPCR扩增曲线图(FAM在上);
图14为临床样本SLCO1B1(rs4149056)采用对比引物探针的TC分型的qPCR扩增曲线图(FAM在上);
图15为临床样本SLCO1B1(rs4149056)采用对比引物探针的CC分型的qPCR扩增曲线图(FAM在上);
图16为临床样本SLCO1B1(rs4149056)采用对比引物探针的TT,TC,CC三种分型的Genotyping散点图;
具体实施方式
本发明所基于的操作方法在于:
本发明提供的用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物组合、试剂盒及方法的有益效果在于:通过设计特异性高的引物及Taqman荧光检测探针并通过检测荧光的释放和强度来检测基因多态性。引物设计在探针结合区域的上下游,两条探针分别对应两种不同基因型,qPCR过程中,当探针与模板链互补结合后,探针被酶切水解时,5’端连接的FAM或VIC报告基团发出对应的荧光信号,通过荧光扩增曲线可判读基因型;以三种对应基因型的阳性对照品作为多态性分布标准,通过Genotyping基因分型散点图更加直观快速判读样本基因型。此外本发明所述试剂盒采用预混合的方式进行包装,使用时仅需加入基因组DNA,简化了qPCR的反应程序。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,下面结合附图及实施例,对本发明进行进一步的详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1:试剂盒的制备
一、引物和探针的设计与合成
针对人基因组中ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)基因位点(序列参见NCBI数据库公开的人类全基因组序列),使用Primer Premier 5.0及Primer Express 3.0软件,分别设计特异性引物及Taqman探针。
特异性引物及探针序列,如下表1所示:
表1引物和探针序列和长度信息
二、对照品选择
所述阳性对照品一分别为ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)基因位点野生型质粒;
所述阳性对照品二分别为ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)基因位点野生型与突变型按1:1数量比杂合的质粒;
所述阳性对照品三分别为ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)基因位点突变型质粒。
空白对照品为无核酸酶水。
三、PCR反应液组成
包括含有上述特异性引物及探针的PCR反应液,所述PCR反应液分别为ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)PCR反应液,其分别包括:
ABCG2(rs2231142)正向引物、ABCG2(rs2231142)反向引物、ABCG2(rs2231142)野生型探针及ABCG2(rs2231142)突变型探针;
SLCO1B1(rs4149056)正向引物、SLCO1B1(rs4149056)反向引物、SLCO1B1(rs4149056)野生型探针及SLCO1B1(rs4149056)突变型探针;
上述PCR反应液还包括NuHi SNP Mix(2×)PCR预混液及无核酸酶水。
其中,所述NuHi SNP Mix(2×)PCR预混液购自苏州新海生物科技股份有限公司;所述无核酸酶水为Ambion品牌Nuclease-FreeWater。
所述PCR反应液成分的终浓度为:
1×NuHi SNP Mix
0.5μM特异性引物
0.2μM探针
无核酸酶水适量(将体系补充至23ul)。
实施例2:利用上述试剂盒进行用于瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的方法
一、生物样本
本发明所采用的生物材料均来自公司内部。为2018年9-12月期间在公司内部检测的500例剩余人群抗凝血。
二、取待检测样本抽提的DNA,作为PCR模板:
DNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的提取试剂盒《血液基因组DNA提取试剂盒》进行提取(货号:DP318)。
1)取全血400ul,加800ul细胞裂解液CL混匀,10000rpm/11500×g,1min离心,弃上清,若裂解不彻底可重复一次。
2)沉淀中加入200ul缓冲液GS,混匀,再加入20ul蛋白酶K,混匀。
3)加入200ul缓冲液GB,混匀,56℃,10min,期间颠倒数次,直至溶液变澄清(若未澄清,可延长时间至澄清)。
4)加200ul无水乙醇混匀,短暂离心。
5)转移样本混合液到吸附柱CB3,13400×g/12000rpm,30s离心,弃滤液。
6)加入500ul缓冲液GD到吸附柱CB3,13400×g/12000rpm,30s离心,弃滤液。
7)加入600ul缓冲液PW到吸附柱CB3,13400×g/12000rpm,30s离心,弃滤液,重复一次。
8)吸附柱CB3放入干净离心管中,13400×g/12000rpm,2min离心,弃滤液,室温静置3分钟,晾干。
9)加100ulddH2O,室温孵育2-5min,13400×g/12000rpm,2min离心,收集洗脱产物,-20℃保存。
三、提供所述试剂盒,取出适量PCR反应液,将所述PCR反应液与适量所述PCR模板混匀:
从试剂盒中取出所需数量PCR反应液8连管(每检测位点的PCR管数=样本数+1个空白对照+3个阳性对照)。
PCR反应液室温融解后,瞬时离心,揭开管盖。
从待检样本DNA(或对照品)中取2μL加至PCR反应液中。
振荡混匀后,瞬时离心10s,将其移至扩增区。
四、进行PCR扩增反应:95℃变性5min;95℃10sec,60℃40sec(采集荧光),45cycles。
使用的PCR仪器为ABI StepOnePlus,反应体系为25ul;
PCR反应条件如下表2所示:
表2qPCR反应条件
五、PCR结果判定:在所述试剂盒的阳性对照品和空白对照品符合规定的情况下,根据荧光扩增曲线及Genotyping基因分型散点图进行结果判定,得到用于瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因的基因型。
结果有效性判定,如下表所示:
表3不同检测位点对照品基因分型
空白对照结果为阴性(No Ct或Ct值≥38)。
PCR结果判定,根据荧光扩增曲线及Genotyping基因分型散点图区分各基因位点野生型、杂合型及突变型,详见说明书附图。
ABCG2(rs2231142)CC型样本57例,其中1例检测结果如图1所示,ABCG2(rs2231142)CA型样本36例,其中1例检测结果如图2所示,ABCG2(rs2231142)AA型样本7例,其中1例检测结果如图3所示;其中39个的Genotyping基因分型散点图如图4所示;
SLCO1B1(rs4149056)TT型样本84例,其中1例检测结果如图5所示,SLCO1B1(rs4149056)TC型样本13例,其中1例检测结果如图6所示,SLCO1B1(rs4149056)CC型样本3例,其中1检测结果如图7所示;其中15个的Genotyping基因分型散点图如图8所示;
六、本发明的试剂盒检测结果在指导瑞舒伐他汀药物用药中的应用
根据荧光定量PCR中的结果判定得出ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)各位点的基因型。基因型与瑞舒伐他汀药物个体化用药关系对应表如下表4所示:
表4基因型与瑞舒伐他汀药物关系对应:
对比例1
改变引物组合序列信息检测人抗凝血组织样本的基因分型。
1材料与方法
1.1样本来源
本发明所采用的生物材料均来自公司内部。为2018年9-12月期间在公司内部检测的100例剩余人群抗凝血。
1.2取待检测样本抽提的DNA,作为qPCR模板:
DNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的提取试剂盒《血液基因组DNA提取试剂盒》进行提取(货号:DP318),具体抽提步骤同实施例2中的人DNA抽提步骤。
1.3合成PCR扩增引物
利用生物信息学知识和DNAstar等相关生物信息学软件,对Genbank数据库中所能检索到的ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)基因核酸序列进行基因序列比对分析,选定目标区域的特异性序列,设计出针对各个区域的相应特异性基因片段的PCR引物和探针(见下表5)。
表5不同基因位点本申请保护的特异性引物探针和对比引物探针序列和长度信息
1.4准备qPCR反应液
对ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)不同的引物,探针组合进行分组,具体的引物和探针序列见表5:
第一组添加基因位点为ABCG2(rs2231142)的引物探针,引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2,探针序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4;
第二组添加基因位点为ABCG2(rs2231142)的引物探针,引物序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10,探针序列为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12;
第三组添加基因位点为SLCO1B1(rs4149056)的引物探针,引物序列为SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6,探针序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8;
第四组添加基因位点为SLCO1B1(rs4149056)的引物探针,引物序列为SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14,探针序列为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16;
上述qPCR反应液还包括NuHi SNP Mix(2×)PCR预混液及无核酸酶水;
所述qPCR反应液成分的终浓度为:
1×NuHi SNP Mix
0.5μM特异性引物
0.2μM探针
无核酸酶水适量(将体系补充至23ul)。
1.5进行qPCR扩增反应:95℃变性5min;95℃10sec,60℃40sec(采集荧光),45cycles。
使用的qPCR仪器为ABI StepOnePlus,反应体系为25ul;
qPCR反应条件如表2所示。
2结果
2.1对比引物组合1的分型图如图1,2,3,4所示,图1,2,3为组合1临床样本ABCG2(rs2231142)CC、CA、AA共3种分型的qPCR扩增曲线图,图4为组合1临床样本ABCG2(rs2231142)的3种基因分型散点图,扩增曲线及基因分型散点图均区分良好。
2.2对比引物组合2的分型图如图9,10,11,12所示,图9,10,11为组合2临床样本ABCG2(rs2231142)CC、CA、AA共3种分型的qPCR扩增曲线图,图12为组合2临床样本ABCG2(rs2231142)的3种基因分型散点图,扩增曲线及基因分型散点图区分效果不佳;
2.3对比引物组合3的分形图如图5,6,7,8所示,图5,6,7为组合3临床样本SLCO1B1(rs4149056)TT,TC,CC共3种分型的qPCR扩增曲线图,图8为组合3临床样本SLCO1B1(rs4149056)的3种基因分型散点图,扩增曲线及基因分型散点图均区分良好。
2.4对比引物组合4的分型图如图13,14,15,16所示,图13,14,15为组合4临床样本本SLCO1B1(rs4149056)TT,TC,CC共3种分型的qPCR扩增曲线图,图16为组合4临床样本SLCO1B1(rs4149056)的3种基因分型散点图,扩增曲线及基因分型散点图区分效果不佳。
由此可见本申请的引物探针的效果良好,且本申请的引物探针是通过申请人通过大量创造性劳动而获得的。
本发明的原理在于:该方法通过设计针对不同基因位点区域,包括:ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)检测主要的影响瑞舒伐他汀疗效基因位点的突变类型,通过设计引物组合对目标序列直接进行qPCR扩增,时间上和检测成本上都有效降低,同时在检测位点上,通过2个反应体系,完成影响瑞舒伐他汀疗效的基因位点的检测。
序列表
<110> 上海派森诺生物科技股份有限公司
<120> 用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物组合及试剂盒及方法
<130> 20190515
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 1
gctatttgcc ttaaggatga tgttg 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 2
tgaatgaccc tgttaatccg ttc 23
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 3
tgacggtgag agaaaactta cagttctc 28
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 4
ctgacggtga gagaaaactt aaagttctc 29
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 5
gaaacactct cttatctaca taggttgt 28
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 6
ccttctttag cgaaatcatc aa 22
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 7
cccatgaaca catata 16
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> homo spaiens
<400> 8
acccatgaac gcatata 17
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 9
gtctcattaa aatgctattt gcctt 25
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 10
agacctaact cttgaatgac cctg 24
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 11
acggtgagag aaaacttaca gt 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 12
tgagagaaaa cttaaagttc 20
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 13
atgaaacact ctcttatcta cataggttgt 30
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 14
gtccttcttt agcgaaatca tcaatg 26
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 15
acccatgaac acatatatc 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 16
tacccatgaa cgcatatatc 20
Claims (6)
1.一种用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物组合,其特征在于,所述引物组合包括针对ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)基因位点的特异性引物及探针,如下:
ABCG2(rs2231142)正向引物:
5'-GCTATTTGCCTTAAGGATGATGTTG-3'(SEQ ID NO.1);
ABCG2(rs2231142)反向引物:
5'-TGAATGACCCTGTTAATCCGTTC-3'(SEQ ID NO.2);
ABCG2(rs2231142)野生型探针:
5'FAM-TGACGGTGAGAGAAAACTTACAGTTCTC-TAMRA3'(SEQ ID NO.3);
ABCG2(rs2231142)突变型探针:
5'VIC-CTGACGGTGAGAGAAAACTTAAAGTTCTC-TAMRA3'(SEQ ID NO.4);
SLCO1B1(rs4149056)正向引物:
5'-GAAACACTCTCTTATCTACATAGGTTGT-3'(SEQ ID NO.5);
SLCO1B1(rs4149056)反向引物:
5'-CCTTCTTTAGCGAAATCATCAA-3'(SEQ ID NO.6);
SLCO1B1(rs4149056)野生型探针:
5'FAM-CCCATGAACACATATA-MGB3'(SEQ ID NO.7);
SLCO1B1(rs4149056)突变型探针:
5'VIC-ACCCATGAACGCATATA-MGB3'(SEQ ID NO.8)。
2.如权利要求1所述的一种用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的试剂盒,其特征在于,包括含有所述的特异性引物及探针的PCR反应液,所述PCR反应液分别为ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1 PCR反应液,其分别包括:
ABCG2(rs2231142)正向引物、ABCG2(rs2231142)反向引物、ABCG2(rs2231142)野生型探针及ABCG2(rs2231142)突变型探针;
SLCO1B1(rs4149056)正向引物、SLCO1B1(rs4149056)反向引物、SLCO1B1(rs4149056)野生型探针及SLCO1B1(rs4149056)突变型探针;
所述的PCR反应液当中还包括NuHi SNP Mix(2×)PCR预混液及无核酸酶水。
3.如权利要求2所述的一种用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的试剂盒,其特征在于,所述PCR反应液的成分终浓度为:1×NuHi SNP Mix,0.5μM的各特异性引物及0.2μM探针。
4.如权利要求2所述的一种用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阳性对照品一、阳性对照品二及阳性对照品三;
所述阳性对照品一分别为ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)基因位点野生型质粒;
所述阳性对照品二分别为ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)基因位点野生型与突变型按1:1数量比杂合的质粒;
所述阳性对照品三分别为ABCG2(rs2231142)、SLCO1B1(rs4149056)基因位点突变型质粒。
5.如权利要求2所述的一种用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括空白对照品,所述空白对照品为无核酸酶水。
6.如权利要求1所述一种用于指导瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因检测的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一:取待检测样本抽提的DNA,作为PCR模板;
步骤二:提供所述的试剂盒,取出适量PCR反应液,将所述PCR反应液与适量所述PCR模板混匀;
步骤三:进行PCR扩增反应:95℃变性5min;95℃10sec,60℃40sec下采集荧光,45cycles;
步骤四:PCR结果判定:在所述试剂盒的阳性对照品和空白对照品符合规定的情况下,根据荧光扩增曲线及Genotyping基因分型散点图进行结果判定,得到用于瑞舒伐他汀药物个体化用药相关基因的基因型。
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