CN110387411A - 用于检测狼疮性肾炎或评估狼疮性肾炎风险的方法及其应用 - Google Patents

用于检测狼疮性肾炎或评估狼疮性肾炎风险的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于检测狼疮性肾炎或评估狼疮性肾炎风险的方法，该发法包含以下步骤：体外测定个体的测试样本选自以下至少一miRNA的表达水平，以及将测试样本中的至少一miRNA与无狼疮性肾炎的测试样本中的对应miRNA的表现量进行比较，其中当测试样本中的至少一miRNA的表达水平低于无狼疮性肾炎的样本中对应的miRNA时，则表示该个体患有狼疮性肾炎或具有罹患狼疮性肾炎的风险。

Description

用于检测狼疮性肾炎或评估狼疮性肾炎风险的方法及其应用
【技术领域】
相关申请案的交互参照
本申请案主张于2018年4月23日提出之美国临时申请案第62/661,499号之优先权效益，其全部内容于此并入作为参考。
本发明系关于一种用于检测狼疮性肾炎或评估狼疮性肾炎风险的方法及其应用。
【背景技术】
全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)为经常影响育龄妇女的自体免疫性疾病，虽然症状不同，但如果到达主要器官***，例如中枢神经***、心脏、肺脏或肾脏，则可能致命。此状况称为狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)。狼疮性肾炎会呈现有泡沫性尿液(foamy urine)及下肢水肿等症状，以及例如口腔溃疡、关节痛(arthralgia)与关节炎(arthritis)、淋巴腺病(lymphadenopathy)和皮疹(rashes)等其他全身性表现。
然而，这些症状可能表现轻微且非特异性。如果这些症状未被发现且延迟治疗，则近10％的狼疮性肾炎患者可能发展成不可逆的肾损害和末期肾病。在全身性红斑狼疮患者中，狼疮性肾炎是发病率甚至是死亡率的主要原因。成功检测到狼疮性肾炎和早期治疗可以显著降低肾衰竭的风险。因此，正确检测和早期治疗对于有效管理狼疮性肾炎是非常重要的。传统上，诊断狼疮性肾炎仅依赖于医生基于观察患者症状来进行判断，直到最近，仅发展了少数的基于细胞介质的生物标志平台。此外，许多传染性疾病表现出类似于狼疮性肾炎的症状，因此使狼疮性肾炎的诊断复杂化并导致狼疮性肾炎的最佳及时的治疗延迟。
先前研究已指出血液的微小RNA可具有作为疾病生物标志的功能。微小RNA(miRNA)是进化的保守且非编码RNA分子，其通常长度为21至25个核苷酸，且藉由结合至mRNA的3端未转译区(3’-untranslated regions,3’-UTRs)来作用，而可抑制蛋白质转译或促进mRNA降解(参照Griffiths-Jones S(2004).The微小RNA Registry.核酸s research32:D109-111)。然而，现今的miRNA生物标志的研究较少应用于临床诊断。因此，利用miRNA发展出早期检测和确认狼疮性肾炎的检测方法的需求仍未被满足，而本发明满足该需求和其他需求。
【发明内容】
有鉴于上述问题，本发明之目的就是在提供一种用于检测狼疮性肾炎或预测罹患狼疮性肾炎的风险之方法，以早期确认狼疮性肾炎或预测狼疮性肾炎的风险而避免狼疮性肾炎的治疗延迟。
在一实施例中，本发明揭露一种用于个体中的检测狼疮性肾炎或预测罹患狼疮性肾炎的风险之方法，其包含以下步骤：(a)自疑似患有狼疮性肾炎之个体取得测试样品，体外测定该测试样品中的至少一miRNA的表达水平，至少一miRNA系选自由miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p；以及(b)若测试样品中的至少一miRNA的表达水平相对于无狼疮性肾炎测试样本中的对应的miRNA的表达水平较低时，则识别该个体患有狼疮性肾炎或具有罹患狼疮性肾炎的风险。
较佳地，该测定步骤可包含测定miRNA-146a-5及miRNA-125a-5p的表达水平。
较佳地，该miRNA的表达水平可藉由实时PCR进行测定。
较佳地，该miRNA的表达水平可藉由特定于miRNA的寡核苷酸探针进行测定。
较佳地，该测试样品可选自由生物检体、血液、血浆、血清、淋巴液、骨髓、唾液及其组合所组成之群组。
本发明亦提供一种用以识别待测试治疗剂抑制狼疮性肾炎细胞的体外方法，其包含以下步骤：(a)在待测试治疗剂与一或多个狼疮性肾炎细胞接触之前，测定接触前的细胞中的至少一miRNA的表达水平，至少一miRNA系选自由miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p所组成的群组；以及(b)在待测试治疗剂与一或多个狼疮性肾炎细胞接触之后，测定接触后的细胞中的对应于步骤(a)的miRNA的表达水平，其中在待测试治疗剂与一或多个狼疮性肾炎细胞接触之后的miRNA中的一或多个的表达水平相对于待测试治疗剂与一或多个狼疮性肾炎细胞接触之前的对应的miRNA的表达水平增加时，则表示待测试治疗剂对于治疗狼疮性肾炎为有效的。
本发明更提供一种用以确定抑制所需个体的狼疮性肾炎的治疗有效性的方法，其包含以下步骤：(a)向一个体提供至少一部分治疗之前，测定自个体取得的第一样品中的至少一miRNA的表达水平，至少一miRNA系选自由miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p所组成的群组；以及(b)向个体提供至少一部分的治疗后，自个体取得第二样品，体外测定第二样品中的步骤(a)对应的miRNA的表达水平，其中在第二样品中的miRNA的一或多个的表达水平相对于第一样品中对应的miRNA的表达水平增加时，则表示该治疗对于狼疮性肾炎为有效的。
【具体实施方式】
如本文所使用，冠词“一(a)”以及“一(an)”指称冠词的语法对象的一个或一个以上(即，至少一个)。
在申请专利范围中用语“或(or)”是用于表示“及/或(and/or)”，除非明确指出仅涉及替代方案或替代方案是相互排斥的，否则本揭露支持仅涉及替代方案和“及/或(and/or)”的定义。
如在本说明书与申请专利范围中所使用的用语“包括(comprising)”(及任意形式的包括，例如“包括(comprise)”及“包括(comprises)”)、“具有(having)”(及任意形式的具有，例如“具有(have)”及“具有(has)”)、“包含(including)”(及任意形式的包含，例如“包含(includes)”及“包含(include)”)或“含有(containing)”(及任意形式的含有，例如“含有(contains)”及“含有(contain)”)是包容性或开放式的，而不排除额外未列举的组件或方法步骤。
如本文所使用的可互换用语“微小RNA(microRNA)”、“miR”或“miRNA”系指未处理的(例如，前体)或处理的(例如，成熟(mature))RNA转录形成的miR基因。微小RNA为内生性非编码的单股RNA，其负调节真核生物中的基因表达，且构成一类新颖的基因调节子(Chua,et al.(2009)Curr.Opin.Mol.Ther.11:189-199)。个别miRNA已在不同的生物体中进行识别和定序，并且其已被命名。本文提供了miRNA的名称及其序列。
本文所有数值可理解为由“约(about)”修饰。如本文所使用的用语“约”是指涵盖±10％的变异。
“较高(higher)”或“较低(lower)”miRNA表达为相对用语，且可藉由比较测试样品中的miRNA表达水平与已知的无狼疮性肾炎个体的参考库(亦即，对照个体)的miRNA表达水平来确定。
如本文所使用的用语“测试样品”系指包含miRNA的样品。样本可用于检测感兴趣的miRNA存在及/或表达水平。任何细胞、细胞群、细胞片段或细胞产物可以与本发明主张的申请标的的方法使用，尽管与正常对照相比，预测含有miRNA差异表达的生物流体和器官是最适合的。在一些实施例中，测试样品是相对容易获得的，例如血液或其成分。测试样品的非限制例包含生物检体(肾脏检体)、体液(例如，血液、血清、血浆、淋巴液、唾液或脑脊髓液)、骨髓、细胞(例如，血球细胞)及组织(例如，肾脏组织)。
在其他实施例中，可以建立预后或诊断的miRNA水平的阈值变化程度，并且可以简单地将患者测试样品中指标物的水平变化程度与水平的阈值变化程度进行比较。本揭露的申请标的的miRNA水平的较佳水平阈值变化为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约50％、约60％、约75％、约100％及约150％。
miRNA表达水平的测定系指定量存在于样品中的miRNA的量。特定或任何miRNA表达水平的测定可利用该当技术领域中已知的任何方法或本文所述的方法完成，例如藉由实时聚合酶连锁反应(real-time PCR)、北方墨点分析法。miRNA表达水平的测定包含测定成熟形式的miRNA或与miRNA表达相关的前体形式的表达。。
在特定实施例中，至少一miRNA的水平利用北方墨点分析法定量。例如，全细胞RNA可在核酸萃取缓冲液存在下藉由均质，接着离心而从细胞中纯化。沉淀核酸，并以DNase移除DNA并沉淀。接着，RNA分子根据标准技术藉由琼脂糖凝胶的凝胶电泳分离并转移至硝酸纤维素滤膜。RNA藉由加热以固定于滤膜上。特定RNA的检测和定量是利用适当的标志DNA或RNA探针与所探讨的RNA互补来完成。例如，参照Molecular Cloning:A LaboratoryManual,J.Sambrook et al.,eds.,2nd edition,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989,Chapter 7，其全部内容于此并入作为参考。
在部分实施例中，理想为使用微数组。微数组是核酸、蛋白质、小分子、细胞或其他物质的微观且有序的数组，可以对复杂的生化样品进行平行分析。该技术提供各种具有已知序列讯息的寡核苷酸或多核苷酸作为探针，以发现样品中的互补股并与之杂交，从而藉由选择性结合捕获互补股。探针包含与标靶miRNA的至少部分互补或实质上互补的寡核苷酸或多核苷酸序列。“互补(complementary)”系指两个核酸股的区域之间的序列互补性的广义概念。已知的是，如果残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，则第一核酸区域的腺嘌呤残基可与和第一区域反平行的第二核酸区域的残基形成特定的氢键(“碱基配对(base pairing)”)。相似地，已知的是，如果残基是鸟嘌呤，则第一核酸区域的胞嘧啶残基可与和第一区域反平行的第二核酸区域的残基进行碱基配对。核酸的第一区域与相同或不同核酸的第二区域互补，如果当两个区域以反平行方式排列时，则第一区域的至少一核苷酸残基可与第二区域的残基碱基配对。较佳地，第一区域包含第一部分且第二区域包含第二部分，因此当第一部分及第二部分以反平行方式排列时，第一部分的核苷酸残基的至少约50％、较佳地至少约75％、至少约90％或至少约95％可与第二部分的核苷酸残基碱基配对。更佳地，第一部分的所有核苷酸残基可与第二部分的核苷酸残基碱基配对。
miRNA的微数组分析例如可根据该当技术领域中已知的任何方法完成。在一实施例中，RNA是自例如白血球细胞或样本的细胞萃取，小RNA(small RNA)(18至26个核苷酸)是利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳从总RNA进行尺寸选择。将寡核苷酸连接符连接到小RNA的5'和3'末端，并将得到的连接产物使用作为10个扩增循环的RT-PCR反应的模板。义股(sensestrand)PCR引子具有连接至其5’端的荧光团，因而荧光标志PCR产物的义股。接着，将PCR产物变性并与微数组杂交。与数组上对应的miRNA捕获探针序列互补的标靶核酸的PCR产物将通过碱基配对与固定捕获探针的点杂交。当使用微数组雷射扫描仪激发时，该点将发出荧光。接着，使用许多阳性和阴性对照以及数组数据标准化方法，根据特定miRNA的拷贝数评估各点的荧光强度，其用以评估特定miRNA的表达水平。关于本文揭露的miRNA，该探针可与标靶miRNA或多核苷酸序列100％互补。然而，只要探针可与标靶多核苷酸特异性结合并从样品中捕获，则该探针不需沿着标靶多核苷酸的完整长度与标靶多核苷酸完全互补。
在一些实施例中，理想为使用定量的RT-PCR。定量的RT-PCR(qRT-PCR)是修饰之聚合酶链反应的修饰，其用于快速测定聚合酶链反应产物的量。qRT-PCR通常用于确定样品中是否存在基因序列，例如miRNA，以及若存在基因序列，则确定样品中的拷贝数。可以确定包括miRNA的核酸分子表达的任何PCR方法皆落入本揭露的范围内。该当技术领域中已知的qRT-PCR方法的几种变化包括但不限于通过琼脂糖凝胶电泳、使用SYBR Green(双股DNA染料)以及荧光报导探针的使用。
如本文所使用的“相同(identical)”系指相同核酸股的两个区域之间或两个不同核酸股的区域之间的相似性。当在两个区域中的核苷酸残基位置是由相同核苷酸残基所占有，则该区域在其位置是同源的。若各区域的至少一核苷酸残基位置是由相同残基所占有，则第一区域与第二区域同源。两个区域之间的同源性(homology)是以相同核苷酸残基占有的两个区域的核苷酸残基位置的比例表示。作为例子，具有核苷酸序列5'-ATTGCC-3'的区域与具有核苷酸序列5'-TATGGC-3'的区域分享50％同源性。较佳地，第一区域包含第一部分且第二区域包含第二部分，因而各部分的核苷酸残基位置的至少约50％、较佳地至少约75％、至少约90％或至少约95％由相同核苷酸残基占有。更佳地，各部分的所有核苷酸残基位置是由相同核苷酸残基占有。
根据本发明的实施例之用于检测狼疮性肾炎或预测罹患狼疮性肾炎的风险之miRNA包含miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p或miRNA-221-3p。
[表1]
miRNA名称 序列编号
miRNA-146a-5p SEQ ID NO:1
miRNA-125a-5p SEQ ID NO:2
miRNA-221-3p SEQ ID NO:3
用于检测狼疮性肾炎的方法
该检测方法包含自具有狼疮性肾炎或疑似患有狼疮性肾炎的患者的测试样本分离出总RNA、测定总RNA中的miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p中的一或多种的miRNA表达水平、以及当该miRNA的表达水平相对于无狼疮性肾炎测试样本中的对应miRNA的表达水平较低时，则识别个体患有狼疮性肾炎或具有罹患狼疮性肾炎的风险。
在另一实施例中，提供一种用于识别待测试治疗剂抑制狼疮性肾炎细胞的体外(in vitro)方法，其包含以下步骤：(a)将待测试治疗剂与一或多个狼疮性肾炎细胞接触之前，测定该细胞的miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p中的一或多种的miRNA表达水平，以及(b)在待测试治疗剂与一或多个狼疮性肾炎细胞接触之后，测定细胞的对应于该步骤(a)的miRNA的表达水平，当与待测试治疗剂接触后的细胞的miRNA中的一或多个的表达水平相对于与待测试治疗剂接触前的细胞的对应的miRNA的表达水平增加时，则表示待测试治疗剂对于治疗狼疮性肾炎为有效的。
在另一实施例中，提供一种用以确定抑制所需个体的狼疮性肾炎的治疗有效性的方法，其包含以下步骤：(a)向个体提供治疗之前，体外测定自个体取得的第一测试样品中的miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p中的一或多种miRNA的表达水平；以及(b)向个体提供至少一部分的治疗后，体外测定自个体取得的第二测试样品中的步骤(a)中对应的miRNA的表达水平，其中在第二测试样品中的miRNA的一或多个的表达水平相对于第一测试样品中对应的miRNA的表达水平增加时，则表示该治疗对于狼疮性肾炎为有效的。
本发明的部分实施例系关于基于测试样本中的miRNA的表达水平的识别来评估个体是否患有狼疮性肾炎或具有罹患狼疮性肾炎的风险的方法。
用于检测狼疮性肾炎或预测罹患狼疮性肾炎风险的套组
本发明亦提供一种套组用于检测狼疮性肾炎或预测罹患狼疮性肾炎风险，该套组包含用于测定个体的测试样本中的选自由miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p所组成的群组的至少一miRNA的表达水平的试剂，当该测试样本中的该至少一miRNA的表达水平低于无狼疮性肾炎样本中对应的miRNA的表达水平时，则表示该个体患有狼疮性肾炎或具有罹患狼疮性肾炎的风险。
本发明的实施例藉由以下范例进行描述，其不以任何方式解释为对其范围施加限制。反之，应清楚理解的是，在不脱离本发明的精神的情况下，对于所属领域技术中具有通常知识者而言，在阅读本说明书之后，可以想到其他各种实施例、修改及其等效物。除非另外说明，在下列范例所述的研究中，遵循常规程序。下文描述的部分程序用于说明性目的。
实例
本发明的研究分成两个部分。第一部分是关于将6位狼疮对照(LC)和6位狼疮性肾炎(LN)作为筛选组并用以开发潜在的miRNA生物标志模块标靶，其可经由次代定序(nextgeneration sequencing,NGS)区分LC与LN。“LC”表示为狼疮对照，其包含由患有狼疮但经医师诊断为不具有狼疮性肾炎的患者，而“LN”表示为患有狼疮性肾炎的患者，其包含患有狼疮且经医师诊断为患有由狼疮引起的肾炎的患者。所有12名SLE患者均服用类固醇和免疫修饰药物，且在整个研究期间不改变服用药物。为了进行比较，6位狼疮对照患者与其他6位狼疮性肾炎患者的年龄和性别匹配。
第二部分的研究招募了78位狼疮病患作为确认组，其中包含56位狼疮对照(LC)和22名狼疮性肾炎(LN)。除了来自第一部分研究NGS组的标靶miRNA数据之外，我们进行文献回顾并选定感兴趣的各种RNA靶标以在该确认组中进行测试。在此部分中，对每位狼疮患者测试选定的miRNA靶标，以确定可以区分LN患者和LC患者的任何特定靶标miRNA。任何患有SLE以外的自身免疫性疾病、发烧或其他可能影响肾脏传染性疾病的患者均被排除在外。
临床评估
78位个体在招募时收集补体水平和抗双股DNA水平，且接着定期收集。此外，为了进一步分析，亦收集了各种临床生物标志、例如人口数据、生化数据、尿蛋白水平和红血球沉降速率。
样品收集
我们利用2,500rpm(150×g)离心20分钟以将全血分离成血浆和血球细胞(即白细胞和红血球)。藉由4.5％葡聚醣(dextran)沉降以1：5的比例将白血球与红血球分离，以将白血球自红血球细胞(RBC)分离。接着，使用Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia Biotech)的密度梯度离心以2：1的比例在1500rpm离心30分钟，以将白血球分离成多形核细胞(olymorphonuclear cell,PMN)和单核细胞(MNC)。进一步地，使用Direct-zolTM RNAMiniPrep套组(ZYMO RESEARCH)处理收集的单核细胞，以萃取总RNA，接着进行NGS及/或qPCR分析。
确认选定的微小RNA水平
实时qPCR验证微小RNA表达丰度(abundances)
我们使用TaqManTM微小RNA逆转录套组(Applied Biosystems)来制备cDNA。每个反应需要来自外周血球单核细胞(PBMC)的总RNA 20ng。按照制造商的说明，使用Veriti 96孔热循环仪(Applied Biosystems)进行逆转录反应。接着，使用逆转录产物进行qPCR反应，并使用7500实时PCR***(Applied Biosystems)和不含UNG的TaqMan Universal PCR MasterMix II(Applied Biosystems)进行定量RT-PCR。实时PCR循环条件为95℃10分钟，接着以95℃15秒进行40个循环，最后为60℃1分钟。使用ΔCt值确定微小RNA表达丰度，并以小核仁RNA U6作为内源性对照。我们先前测量了样品中的U6、RNU24、RNU44及RNU48的Ct值，并观察到其标准偏差分别为0.77、1.05、1.21和0.81。因此，在目前的研究中，U6是测量到变化最小的内部对照基因。
统计分析
本研究中的所有数据以平均±标准误差(SD)或中位数(四分位数范围)表示。必要时，使用卡方检验(Chi-square test)或费雪精确性检定(Fisher's exact test)比较分类变量。使用Student’s t-test比较两组之间的连续变量。若p<0.05，则变量被认为具有统计学意义。所有统计分析计算利用SAS软件包，9.1版本(2002,SAS Statistical Institute,North Carolina)进行。
结果
第一部分研究由6位狼疮对照(LC)和6位狼疮性肾炎(LN)个体所组成。个体由以下标准确诊为狼疮(SLE):该个体在风湿病门诊(Rheumatology Out-patient Clinic)进行超过六个月的追踪，SLE的诊断标准基于1997年修订的1982年美国风湿病学会(ACR)的SLE分类标准，而SLE疾病活动的临床评估基于SLE疾病活动指数(SLEDAI)进行。
以NGS剖析微小RNA
将收集自6位LC个体和6位LN个体(性别及年龄匹配)的MNC的RNA样本平均地合并3位LN与3位LC，以产生两个LC与LN合并的RNA基因库。我们按照小RNA(Illumina)样品制备方案制备了合并的基因库，并使用Illumina MiSeq平台进行定序。如Kuo HC,Hsieh KS,Ming-Huey Guo M,Weng KP,Ger LP,Chan WC,Li SC.Next-generationsequencing identifies micro-RNA-based biomarker panel for Kawasaki disease.JAllergy Clin Immunol.2016；138:1227-30.doi:10.1016/j.jaci.2016.04.050所述，使用miRSeq分析分析生成的原始数据，评估整体定序质量并确定微小RNA表达谱。我们将狼疮性肾炎组与狼疮对照组之间的商数(quotient)维持在0.8至1.2，其确定了41个标靶miRNA(参照表2)。
[表2]使用次代定序比较狼疮性肾炎与无狼疮性肾炎患者
缩写：hsa-miR，miRNA或微小RNA；LN1，三个第一狼疮性肾炎患者的微小RNA混合物；LN2，三个第二狼疮性肾炎患者的微小RNA混合物；SLE，全身性红斑狼疮；SLE1，三个第一非狼疮性肾炎患者的微小RNA混合物；SLE2，三个第二非狼疮性肾炎患者的微小RNA混合物。
接着选定15个微小RNA标靶并使用实时qPCR于第二部分研究SLE个体进行测试。如表3所示，验证外周单核细胞(peripheral mononuclear cell)中的miRNA表达。mir-125a-5p、miR-146a-5p及mir-221-3p分别显示在NGS筛选研究和实时qPCR验证研究之间显示出显著相关性，并且三者皆在LN患者组与LC患者组之间显著差异(皆为p<0.05)。然而，虽然我们从文献回顾选择的miRNA中仅一个miR-193b显示在LN组与LC组之间存在显著差异(p<0.05)，但在此研究开始时所进行的NGS筛选研究证实该差异并未达到显著性。
[表3]确认患有狼疮性肾炎(β)与无狼疮性肾炎(α)的外周单核细胞中的所选定的微小RNA水平并比较其之间差异
缩写：SLE表示为全身性红斑狼疮；数据以平均±SD(标准偏差)表示；两组之间的连续变量利用Student’s T-test在α与β之间进行比较(α：无狼疮性肾炎的SLE，β：患有狼疮性肾炎的SLE)；*表示p值<0.05；使用费雪精确性检定对性别进行比较。
临床标志物与三种识别的微小RNA之间的相关性
临床白血球、嗜中性球、淋巴球及肌酸酐水平与mir-146a-5p显著相关(参照表6，皆为p<0.05)。此四种临床标志物是衍生自患有狼疮性肾炎与非狼疮性肾炎的狼疮病患之间具有显著差异的六种标志物(参照表4，所有皆为p<0.05)。白蛋白水平与尿蛋白/肌酸酐比与mir-146a-5p并不具相关性(表6)，其表示mir-146a-5p具有作为甚至以在白蛋白和尿蛋白/肌酸酐比例水平变化之前的标志物的作用(表4)。
[表4]临床实验室数据与使用NGS筛选的三种miRNA之间的相关性，并各别藉由实时PCR确认
γ：皮尔森相关，p：p值，当p＜0.05表示有显著性
*：表示p＜0.05
LN患者的初步纵向追踪研究
在LN患者接受治疗后，LN患者的mir-125a-5p显著地升高(p<0.05)，mir-146a-5p升高且非常接近统计学意义(n＝8，p＝0.053)。
微小RNA的协同效应：miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p
在此研究中，我们使用实时PCR以横截面方式(cross-sectional fashion)确认几种标靶miRNA水平，包括SMAD4、ZNF652、EIF5A2、TRAF6、ETS1及IRAK1可由mir-125a-5p、miR-146a-5p和mir-221-3p所抑制。
我们测定狼疮性肾炎或狼疮对照组患者中的mRNA水平。假设如果狼疮性肾炎患者的mRNA水平显著升高，则必定是导致狼疮性肾炎而不是狼疮对照组的活性基因。结果显示，从ZNF652基因和ETS1基因的测试，在狼疮性肾炎病患中mRNA表达较高(均为p<0.05)。此外，与狼疮对照组相比，TRAF6基因(p＝0.05)和IRAK1基因(p＝0.08)的狼疮性肾炎的临界显著较高。狼疮性肾炎与狼疮对照组之间，CD80mRNA水平并无差异(p>0.05)。
综合文献回顾，ZNF652可由所有三种mir-125a-5p、miR-146a-5p和mir-221-3p的miRNA抑制，并且狼疮性肾炎中的ZNF652水平显著更高，并且如结果所示，所有三种mir-125a-5p、miR-146a-5p和mir-221-3p的miRNA在狼疮性肾炎的PBMC中显著降低。三种微小RNA中的每一个的低力价的组合与显著较高水平的ZNF652mRNA相关(p<0.05)。此外，TRAF6可由miR-146a-5和mir-125a-5p所抑制，且在狼疮性肾炎病患中，TRAF6的mRNA水平显著较高(p＝0.05)。
由ZNF652和TRAF6mRNA表达水平证实，MiR-146a-5和mir-125a-5p的组合在狼疮性肾炎的检测中具有协同效应。
序列表
<110> 长庚医疗财团法人高雄长庚纪念医院
<120> 用于检测狼疮性肾炎或评估狼疮性肾炎风险的方法及其应用
<130> P19H41135
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<151> 2018-04-23
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 1
ugagaacuga auuccauggg uu 22
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 2
cccugagacc cuuuaaccug uga 23
<210> 3
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 3
agcuacauug ucugcugggu uuc 23

Claims (7)

1.一种用于检测狼疮性肾炎或预测罹患狼疮性肾炎的风险之方法，其包含以下步骤：
(a)自疑似患有狼疮性肾炎之一个体取得一测试样品，体外测定该测试样品中的至少一miRNA的表达水平，该至少一miRNA系选自由miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p所组成的群组；以及
(b)若该测试样品中的该至少一miRNA的表达水平相对于一无狼疮性肾炎测试样本中对应的miRNA的表达水平较低时，则识别该个体患有狼疮性肾炎或具有罹患狼疮性肾炎的风险。
2.如权利要求1所述的方法，其中该测定步骤包含测定miRNA-146a-5及miRNA-125a-5p的表达水平。
3.如权利要求1所述的方法，其中该miRNA的表达水平系藉由实时PCR进行测定。
4.如权利要求1所述的方法，其中该miRNA的表达水平系藉由特定于该miRNA的一寡核苷酸探针进行测定。
5.如权利要求1所述的方法，其中该测试样品系选自由生物检体、血液、血浆、血清、淋巴液、骨髓、唾液及其组合所组成之群组。
6.一种识别待测试治疗剂抑制狼疮性肾炎细胞的体外方法，其包含以下步骤：
(a)在一待测试治疗剂与一或多个狼疮性肾炎细胞接触之前，测定细胞中的至少一miRNA的表达水平，该至少一miRNA系选自由miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p所组成的群组；以及
(b)在该待测试治疗剂与一或多个狼疮性肾炎细胞接触之后，测定该细胞中该步骤(a)对应的miRNA的表达水平，
其中在该待测试治疗剂与一或多个狼疮性肾炎细胞接触之后的该miRNA的一或多个的表达水平相对于该待测试治疗剂与一或多个狼疮性肾炎细胞接触之前的对应的miRNA的表达水平增加时，则表示该待测试治疗剂对于治疗狼疮性肾炎为有效的。
7.一种用于确定抑制所需个体的狼疮性肾炎的治疗有效性的方法，其包含以下步骤：
(a)向一个体提供至少一部分治疗之前，自该个体取得一第一样品，体外测定该第一样品中的至少一miRNA的表达水平，该至少一miRNA系选自由miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p所组成的群组；以及
(b)向该个体提供至少一部分的该治疗后，自该个体取得一第二样品，体外测定该第二样品中的该步骤(a)对应的miRNA的表达水平，
其中，在该第二样品中的该miRNA的一或多个的表达水平相对于该第一样品中对应的miRNA的表达水平增加时，则表示该治疗对于狼疮性肾炎为有效的。
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