CN110386972B

CN110386972B - 抗菌多肽Pb2-1或PCL-1及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110386972B
Application number: CN201910787413.1A
Authority: CN
Inventors: 周长林; 吴皓旻; 黄亚; 马菱蔓; 窦洁
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2019-08-23
Filing date: 2019-08-23
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2039-08-23
Also published as: CN110386972A

Abstract

本发明公开了抗菌多肽Pb2‑1或PCL‑1及其制备方法和应用，该抗菌多肽Pb2‑1和PCL‑1的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。本发明从缅甸蟒Python bivittatu来源的多肽CATHPb2出发，通过构效关系研究，获得α‑螺旋程度高的多肽Pb2‑1，并在其N‑端共价连接一段具有胰蛋白酶抑制活性的十一环肽，得到24个氨基酸组成的新结构多肽PCL‑1。本发明制备所得的多肽Pb2‑1和PCL‑1，其药效模块的α‑螺旋程度和疏水性提高；此外，PCL‑1连接十一环肽序列使多肽在具有良好体外抗菌活性的同时，对胰蛋白酶的稳定性也显著提高，其可应用于细菌和真菌感染性疾病的治疗。

Description

抗菌多肽Pb2-1或PCL-1及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及抗菌多肽Pb2-1或PCL-1及其制备方法和应用。

背景技术

1928年青霉素被发现以来，人们逐渐进入控制和治疗细菌感染性疾病的时代。然而抗生素的滥用加速了致病菌的进化，使得近些年大量耐药细菌及多重耐药细菌不断出现。由于新型抗生素的研发并没有随着耐药细菌的迅速增加而加速，且由于抗生素经济效益低，报批难度大，很多制药公司都退出了抗生素药物的研发，导致抗生素药物的发现逐年减缓。多重耐药细菌的出现及抗生素药物的缺乏使得寻找新型抗菌药物迫在眉睫。

抗菌肽是大多数生物体天然免疫防御机制的重要组成部分，在自然界中普遍存在，目前从动物、植物、微生物中发现的抗菌肽数目已达2900多种。尽管抗菌肽来源及序列各不相同，但在结构上存在一些共性，它们一般由10～60个氨基酸残基组成，天然抗菌肽通常含有赖氨酸和精氨酸，能够与水中氢离子结合赋予多肽分子正电性，所以常见抗菌肽均为阳离子型多肽，其二级结构通常可分为α-螺旋结构、β-折叠结构和延展结构。大多数抗菌肽具有广谱的抗菌活性，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、原虫、真菌甚至病毒都具有良好的杀伤作用。除了拥有良好的抗菌活性，抗菌肽还具有抗肿瘤、免疫调节和促进伤口愈合等作用。阳离子抗菌肽独特的膜破坏杀菌机理不易诱导病原体产生耐药性，这相对于传统抗生素具有很大的优势，有望成为临床治疗感染性疾病的新型替代物；但其较差的稳定性，尤其是对胰蛋白酶的不稳定性，使其在临床应用受到限制。近年来，多肽类药物的稳定性问题成为了国内外研究的热点。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供抗菌多肽Pb2-1或PCL-1，本发明的多肽具有良好的体内外抗菌活性，而且对胰蛋白酶具有较好的稳定性，可以应用于各种普通感染及顽固感染性疾病，作为现有抗生素的优良替代药物或辅助药物。

本发明还提供抗菌Pb2-1或PCL-1的制备方法和应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种抗菌多肽Pb2-1，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1：GFRKFMRRLKKFF。

本发明所述抗菌多肽PCL-1，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2：CWTKSIPPKPCGFRKFMRRLKKFF。

本发明所述的抗菌多肽Pb2-1的制备方法，包括如下步骤:

以多肽CATHPb2为模板，对其序列保守且α-螺旋高度集中的区域进行截取，从N-端第3位开始截取将多肽氨基酸个数由29个减少为13个，得到多肽Pb2-1。

本发明所述的抗菌多肽PCL-1的制备方法，包括如下步骤:

(1)以多肽CATHPb2为模板，对其序列保守且α-螺旋高度集中的区域进行截取，从N-端第3位开始截取将多肽氨基酸个数由29个减少为13个，得到多肽Pb2-1；

(2)将一条序列为CWTKSIPPKPC(SEQ ID NO:3)的十一环肽，与Pb2-1的N-端共价连接，得到一条具有分子内二硫键的多肽PCL-1。

其中，所述序列CWTKSIPPKPC为二硫键成环、具有胰蛋白酶抑制活性的十一环肽。本发明十一环肽只有胰蛋白酶抑制活性，没有任何抗菌活性。

本发明所述的抗菌多肽Pb2-1或者所述的抗菌多肽PCL-1在制备抗病原菌感染药物中的应用。

其中，所述抗病原菌感染药物包括抗细菌和真菌感染药物。

进一步地，所述细菌为金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、痢疾杆菌和肺炎克雷伯菌；真菌为白色念珠菌和新生隐球菌。

其中抗菌多肽Pb2-1和PCL-1的合成采用常规的多肽固相合成法合成。

本发明涉及的病原性细菌和病原性真菌，包括：ATCC来源的标准菌株和临床分离的常规菌株。

本发明的抗菌多肽Pb2-1或PCL-1均以多肽CATHPb2(SEQ ID NO:4：KRNGFRKFMRRLKKFFAGGGSSIAHIKLH)为模板，CATHPbs是由缅甸蟒Python bivittatu肺组织中提取的cathelicidins家族阳离子多肽，共六条多肽，CATHPb2是其中一条，由29个氨基酸组成，具有抗菌效果。本发明通过构效关系研究，对其N-端的α-螺旋程度较好的13个氨基酸残基进行截取，所得的多肽Pb2-1虽正电荷数减少，但α-螺旋程度、疏水性及疏水力矩提高，氨基酸数量大幅减少，降低了多肽合成的成本，同时相比CATHPb2具有更强的抗菌效果；通过将十一环肽与Pb2-1的N-端共价连接，本发明还获得胰蛋白酶稳定性大幅提升的抗菌多肽PCL-1。本发明中的多肽PCL-1不仅具有良好的体外抗菌活性，而且对胰蛋白酶具有较好的稳定性，可以应用于各种普通感染及顽固感染性疾病，作为现有抗生素的优良替代药物或辅助药物。

本发明的抗菌多肽Pb2-1通过以多肽CATHPb2为模板，对其N-端氨基酸进行截取得到，同时于Pb2-1的N-端共价连接一段具有胰蛋白酶抑制活性的十一环肽得到PCL-1，采用固相合成法获得多肽Pb2-1和PCL-1。本发明抗菌多肽Pb2-1和PCL-1，氨基酸序列如SEQ IDNO.1和2所示。

本发明的抗菌多肽PCL-1的改造是以CATHPb2为模板进行的设计，从CATHPb2的N-端第3位开始截取13个氨基酸先得到Pb2-1，并在截取的序列N-端共价连接一段具有胰蛋白酶抑制活性的十一环肽，最终达到维持抗菌活性的同时提高胰蛋白酶稳定性的目的。全序列为半胱氨酸-色氨酸-苏氨酸-赖氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸-赖氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-精氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸。

体外抗菌试验结果表明，本发明的抗菌多肽Pb2-1通过截取CATHPb2-N末端的13个氨基酸得到，相比于母肽CATHPb2具有更好的广谱抗菌活性，且成本大大降低。本发明的抗菌多肽PCL-1在截取CATHPb2 N-端的13个氨基酸并与十一环肽进行共价连接的条件下仍能保持较好的广谱抗菌活性。与在Pb2-1的N-末端共价连接十一环肽得到的抗菌多肽PCL-1相比，在Pb2-1的C-末端共价连接十一环肽得到的多肽Pb2-1TI(GFRKFMRRLKKFFCWTKSIPPKPC)对各株细菌或真菌的抗菌活性较弱。同时杀菌曲线结果表明，多肽PCL-1对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和新生隐球菌临床分离株均显示出良好的杀菌活性，能在8h内将大肠埃希菌和新生隐球菌杀灭，而且对金黄色葡萄球菌的杀菌效果更为显著，能在1h内将其全部杀灭。

体外毒性研究表明，本发明的抗菌多肽Pb2-1和PCL-1对绵羊红细胞溶血活性低，在Pb2-1和PCL-1的有效作用范围内溶血活性可以忽略。

通过HPLC和抗菌试验研究本发明制备的抗菌多肽Pb2-1和PCL-1的体外稳定性。结果表明，在不同pH条件和不同温度下，Pb2-1和PCL-1的剩余量都没有发生明显的变化，能保持结构完整性，说明其具有pH稳定性和热稳定性；当NaCl浓度在200mM及以下时，Pb2-1和PCL-1对大肠埃希菌的抗菌活性保持不变，说明Pb2-1和PCL-1在高浓度盐离子条件下也能较好的保留抗菌活性；与十一环肽共价连接后的PCL-1在与胰蛋白酶孵育1h后仍具有较高的完整性，对大肠埃希菌的MIC值提高了4倍。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明制备的抗菌多肽Pb2-1相对于多肽CATHPb2具有更好的广谱抗菌活性，且成本大大降低。

2、本发明制备的抗菌多肽PCL-1在具有广谱抗菌活性的同时，相比于突变肽Pb2-1，胰蛋白酶稳定性明显提高。

3、本发明抗菌多肽Pb2-1和PCL-1的设计制备方法简单方便，设计新颖，原料来源易得，可以工业化生产应用。

4、本发明制备的抗菌多肽Pb2-1和PCL-1可以应用在制备抗细菌和抗真菌感染药物中，具有良好的体内外抗菌活性；其中，在连接一段具有胰蛋白酶抑制活性而没有抗菌活性的十一环肽后，PCL-1的仍然具有优良的抗菌活性，同时对胰蛋白酶的稳定性得到了很大的提升，可以应用于各种普通感染及顽固感染性疾病，作为现有抗生素的优良替代药物或辅助药物。

附图说明

图1是本发明抗菌多肽PCL-1的HPLC图谱；

图2是PCL-1的质谱图；

图3是本发明抗菌多肽Pb2-1的HPLC图谱；

图4是Pb2-1的质谱图；

图5是PCL-1、Pb2-1对金黄色葡萄球菌的杀菌曲线图；

图6是PCL-1、Pb2-1对大肠埃希菌的杀菌曲线图；

图7是PCL-1、Pb2-1对新生隐球菌的杀菌曲线图；

图8是PCL-1、Pb2-1对绵羊红细胞的溶血活性图；

图9是PCL-1、Pb2-1对温度的稳定性量化图；

图10是PCL-1、Pb2-1对pH的稳定性量化图；

图11是PCL-1、Pb2-1对胰蛋白酶的稳定性量化图；

图12是PCL-1对大肠埃希菌感染小鼠血液中细菌数量的影响。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1

抗菌多肽Pb2-1、PCL-1的制备：

(2)将一条序列为CWTKSIPPKPC、二硫键成环、具有胰蛋白酶抑制活性的十一环肽，与Pb2-1的N-端共价连接，得到一条具有分子内二硫键的多肽PCL-1。

(3)固相合成法合成多肽Pb2-1和PCL-1。

制备的Pb2-1的氨基酸序列为：甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-精氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸。

制备的PCL-1的氨基酸序列为：半胱氨酸-色氨酸-苏氨酸-赖氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸-赖氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-精氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸。

线性多肽Pb2-1或PCL-1的合成：C端到N端逐个进行后。将Rink amide AM Resin用二氯甲烷浸泡15min，待树脂膨胀，抽去二氯甲烷；加入体积比为1:4的六氢吡啶/DMF溶液(每克树脂10ml)，使用氮气鼓动，反应2次，时间为5min和15min，反应结束后用DMF洗涤树脂9次。取20～40颗树脂加入验色剂ABC各2-3滴(A液：茚三酮/无水乙醇溶液；B液：吡啶；C液：苯酚/无水乙醇溶液，A、B、C液均加2-3滴即可)在100℃下共热3min，溶液及树脂颜色变为蓝色，以脱除氨基保护。加入过量反应两倍摩尔数的Fmoc-Phe-OH和HOBT，用每克树脂10ml的DMF溶解，加入两倍摩尔数的DIC和Collidine，氮气鼓动，反应1h。反应结束后用DMF洗涤树脂6次，重复进行缩合反应，依次连接各Fmoc保护氨基酸，完成直链序列的合成，将树脂用二氯甲烷和***浸泡后抽干。加入TFA，在恒温摇床中反应2h，摇床转速110r/min，温度25℃。滤去树脂，向滤液中加入无水***，离心后获得固体，加入无水***洗涤，再离心，重复数次后烘干即可获得粗品多肽。

多肽PCL-1二硫键的环化：将粗品多肽用纯水溶解，浓度为1mg/ml。用稀氨水调节pH到8-9，常温反应24h。用HPLC和MASS检测反应终点。

多肽的纯化：取一定量的多肽Pb2-1或PCL-1水溶液用过滤器除去大颗粒杂质。同时采用制备型液相色谱仪过柱，分段收取样品。用分析色谱仪做梯度分析，将达到所需纯度样品进行保留。然后进行冷冻干燥处理得到多肽Pb2-1或PCL-1。

实施例2

多肽Pb2-1和PCL-1的纯度测定(HPLC法)及质谱分析结果：

实施例1多肽Pb2-1和PCL-1合成后经纯化得到成品，成品经高效液相色谱和质谱进行鉴定。

液相色谱分析条件：C18色谱柱(4.6×250mm,5μm)；流动相A为含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，流动相B为含0.1％三氟乙酸的纯净水。检测波长为220nm；流速为1.0ml/min；进样量10μl，进行梯度洗脱。洗脱条件为线性梯度浓度递增：有机相初始浓度为27％，25min时递增至52％，25min至30min用100％有机相冲洗色谱柱。

由附图1、3可以看出，本发明实施例1制备的多肽PCL-1和Pb2-1的纯度均大于98％。

由附图2、4可以确定，PCL-1的分子量为2999.78，Pb2-1的分子量为1761.23，与理论值相吻合。

实施例3

本发明多肽Pb2-1和PCL-1体外抗菌活性的测定

(1)菌种的复苏与活化

将冻存于-20℃的实验用菌种从甘油管转接至相应的琼脂斜面培养基(细菌转接至营养琼脂斜面、真菌转接至沙氏葡萄糖琼脂斜面)中。细菌置于37℃培养24h，真菌置于28℃培养48h，放置4℃的冰箱中备用。

(2)菌液的制备

取少量斜面上的菌体，转接至2ml相应的液体培养基中，细菌置于37℃、真菌置于28℃培养箱培养8h，用相应液体培养基稀释成10⁵CFU/ml的菌悬液，备用。

(3)药物的配制

称取实施例1制备的多肽Pb2-1或PCL-1分别溶解于生理盐水，将其均配制成1024μg/ml的母液，经0.22μm的水相滤头过滤除菌，EP管分装，保存于-20℃，备用。

(4)多肽Pb2-1和PCL-1对试验菌株的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定。

两个多肽的MIC和MBC检测方法相同。即多肽药物用液体培养基倍比稀释成不同浓度梯度后，各取50μl于96孔板中，并等体积接种50μl的10⁵CFU/ml的菌悬液，使药物终浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml，同时设100μl的液体培养基作为空白对照组，50μl菌悬液加入等体积的液体培养基作为阴性对照组。细菌置37℃培养16～18h，真菌置25℃培养48h，酶标仪在595nm处检测各孔的吸光度值。以能够完全抑制细菌或真菌生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。同时以Pb2-1TI和CATHPb2作为对比，Pb2-1TI和CATHPb2多肽的合成以及药物的配制及其最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定与多肽Pb2-1和PCL-1一致。

取上述MIC测定的96孔板中未见细菌或真菌生长的培养物100μl，加入900μl无菌培养基稀释后，转移至无菌培养皿中，加入约10.0ml温度为55℃培养基，细菌置37℃培养24h，真菌置28℃培养48h，观察并记录平板上的菌落数，菌落数小于5个的最低药物浓度，记为MBC值。结果见表1：

表1抗菌多肽PCL-1、Pb2-1TI和Pb2-1对不同细菌和真菌的MIC值和MBC值

续表1：

^a阿莫西林耐药菌株；^b庆大霉素耐药菌株。

由表1可看出，Pb2-1相对于母肽CATHPb2具有更好的广谱抗菌活性，对标准和临床的细菌和真菌均表现出较好的抗菌活性，MIC值在4～32μg/ml的范围内，MBC值在4～32μg/ml的范围内；通过在Pb2-1的N-端连接一段具有胰蛋白酶抑制活性而没有抗菌活性的十一环肽得到的多肽PCL-1，相比于Pb2-1虽抗菌活性略有下降，但其对细菌和真菌仍具有较好的抗菌活性，对标准和临床的细菌和真菌的MIC值在8～64μg/ml的范围内，MBC值在8～128μg/ml的范围内。而Pb2-1TI对细菌和真菌的抗菌活性都较弱，对细菌的MIC值是PCL-1的4倍。

(5)多肽Pb2-1和PCL-1的杀菌曲线

将营养肉汤或沙氏葡萄糖液体培养基稀释的菌悬液调节至细菌浓度约10⁵CFU/ml，加入多肽PCL-1、Pb2-1(终浓度：4×MIC)或阿莫西林(终浓度：1024μg/ml)，置37℃恒温培养。在0、1、2、4、8、12、24h时取出200μl培养液进行梯度稀释，然后进行平板计数。生理盐水组设为阴性对照组，多粘菌素组设为阳性对照组，每个稀释梯度均设三个平行，以菌落对数值为纵坐标，多肽作用时间为横坐标，绘制杀菌曲线。结果见附图5、6和7。

附图5、6和7分别表示多肽PCL-1、Pb2-1对各实验菌株的杀菌作用，PCL-1杀菌效果显著，能在8h内将大肠埃希菌和新生隐球菌杀灭，而且对金黄色葡萄球菌的杀菌效果更为显著，能在1h内将其全部杀灭。结果表明抗菌多肽PCL-1具有良好的杀菌作用。

实施例4

抗菌多肽Pb2-1和PCL-1对绵羊红细胞溶血活性的影响

取脱纤维绵羊血加至无菌EP管中，3000rpm离心10min，用PBS(pH 7.4)洗3次并重悬，制成3％(V/V)的红细胞悬液。分别吸取50μl的绵羊红细胞悬液加入96孔板中，并加入等体积倍比稀释的多肽溶液，使多肽的终浓度分别为512、256、128、64、32、16、8μg/ml。另设PBS处理组为阴性对照，终浓度1％Triton X-100处理组为阳性对照，每组3个复孔。加药处理后，将96孔板置于37℃恒温培养1h后取出，3000rpm离心10min。吸取上清，用酶标仪读取在450nm处各孔的OD值，并计算溶血率，公式如下：

溶血率＝(加药组OD₄₅₀-阴性对照组OD₄₅₀)/(阳性对照组OD₄₅₀-阴性对照组OD₄₅₀)×100％

由附图8可看出，即使当多肽浓度高达512μg/ml时，Pb2-1和PCL-1对绵羊红细胞的溶血率仍很低，不超过5％。综合MIC值的范围可看出：PCL-1在有效的作用范围内，其溶血活性比Pb2-1更低，在256μg/ml的浓度以下对红细胞的溶血率低于1％。

实施例5

本发明抗菌多肽Pb2-1和PCL-1的体外稳定性研究

(1)热稳定性

将浓度为1024μg/ml的多肽与等体积的PBS(pH 7.4)混合，分别置于0、20、37、50、70、90℃恒温水浴1h。将孵育后的样品用RT-HPLC检测，液相色谱分析条件：C18色谱柱(4.6×250mm,5μm)；流动相A为含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，流动相B为含0.1％三氟乙酸的纯净水。检测波长为220nm；流速为1.0ml/min；进样量20μl，进行梯度洗脱。洗脱条件为线性梯度浓度递增，其中Pb2-1的洗脱条件具体为：有机相初始浓度为22％，20min时递增至42％，20min至25min用100％有机相冲洗色谱柱；PCL-1的洗脱条件具体为：有机相初始浓度为25％，20min时递增至45％，20min至25min用100％有机相冲洗色谱柱。结果见附图9。

由附图9可以看出，PCL-1和Pb2-1在不同温度下孵育1h后，与0℃组相比，多肽的剩余量都没有发生下降，即使是孵育温度高达90℃，两个多肽仍能保持很高的完整性，说明两个多肽都具有较高的热稳定性。

(2)pH稳定性

用1M HCl配制pH 1、3、5的溶液，用1M NaOH配制pH 9、11的溶液。用不同pH的溶液配制多肽溶液，使多肽终浓度为512μg/ml，并置于37℃恒温孵育24h。将孵育后的样品用RT-HPLC检测，液相色谱分析条件同实施例5(1)。结果见附图10。

由附图10可以看出，在pH为1的极端酸性环境中孵育24h，PCL-1的剩余量没有发生明显的下降，而Pb2-1仍有90％保持完整，说明PCL-1可以在人胃酸(pH约为1.5)中稳定存在，而Pb2-1在胃酸中则有轻微的不稳定。而当pH高达11时，两个多肽的剩余量并没有发生明显下降，说明两个多肽在不同pH环境中都可以保持很高的完整性。

(3)盐稳定性

将大肠埃希菌培养至对数生长期，并用含不同浓度NaCl的MHB培养基将菌液稀释至10⁵CFU/ml。将多肽用MH培养基倍比稀释成不同浓度梯度后，各取50μl于96孔板中，并等体积接种50μl含不同浓度NaCl的10⁵CFU/ml的菌悬液，使药物终浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml，NaCl终浓度分别为0、50、100、150、200和400mM。同时设100μl的含不同浓度NaCl的MHB培养基作为空白对照组，50μl菌悬液加入等体积的含不同浓度NaCl的MHB培养基作为阴性对照组，置37℃培养16～18h，检测不同盐离子浓度对多肽抗大肠埃希菌的MIC值的影响。结果见表2：

表2不同浓度NaCl对多肽抗E.coli活性的影响

由表2可以看出，当NaCl浓度高达200mM时，PCL-1和Pb2-1对大肠埃希菌的MIC值并未发生变化，而人体中正常的NaCl约为150mM，说明即使NaCl浓度高于正常生理浓度时，两个多肽也能保持良好的抗菌活性，两个多肽都具有较高的耐盐性。

(4)胰蛋白酶稳定性

首先用液相色谱法检测多肽在胰蛋白酶溶液中的稳定性。将浓度为2048μg/ml的多肽与浓度为0.02mg/ml的胰蛋白酶(≥250N·F·u/mg)等体积混合，置于37℃恒温孵育0.5、1、2h，同时设不加酶组为空白对照。然后加入与孵育体系等体积的乙腈，置于4℃保存2h，使胰蛋白酶变性并沉淀，之后将样品10000rpm离心10min，取上清过滤，再用RT-HPLC检测，液相色谱分析条件同实施例5(1)。结果见附图11。

除用液相色谱法检测胰蛋白酶对多肽的影响，还进一步检测经胰蛋白酶处理后的多肽抗菌活性的变化。将大肠埃希菌培养至对数生长期，用MH培养基稀释至10⁵CFU/ml。将多肽与胰蛋白酶(≥250N·F·u/mg)按摩尔比300:1混合，置于37℃恒温孵育0.5、1、2、4、8h，同时设不加酶组为空白对照。然后沸水浴5min使胰蛋白酶失活，将各组多肽用MH培养基倍比稀释成不同浓度梯度后，各取50μl于96孔板中，并等体积接种50μl的10⁵CFU/ml的菌悬液，使药物终浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml，同时设100μl的液体培养基作为空白对照组，50μl菌悬液加入等体积的液体培养基作为阳性对照组置37℃培养16～18h，检测胰蛋白酶对多肽抗大肠埃希菌的MIC值的影响。结果见表3。

表3胰蛋白酶对多肽抗大肠埃希菌活性的影响

由附图11可以看出，在与胰蛋白酶共孵育0.5h后，多肽PCL-1仍有90％保持完整，在孵育时间延长至1h时，PCL-1分解了约40％，而当孵育时间长达2h时，多肽PCL-1的还有25％保持完整，说明仍有部分多肽未被降解。

同时，由表3可以看出，经胰蛋白酶处理0.5h后，多肽PCL-1对大肠埃希菌MIC升高了2倍，具有较好的胰蛋白酶稳定性。

由此可见，PCL-1在胰蛋白酶中的稳定性得到了极大的提升，可以有效避免胰蛋白酶对多肽抗大肠埃希菌活性的影响。

实施例6

本发明抗菌多肽PCL-1对菌血症模型小鼠的保护作用

取健康体重在20～22g的雌性ICR小鼠，随机分为6组，每组13只。取MLD菌浓的大肠埃希菌菌液腹腔注射到小鼠体内，每只0.5ml，建立败血症的模型。给药组分为5组，多肽PCL-1高剂量组(10mg/kg)、多肽PCL-1中剂量组(5.0mg/kg)、多肽PCL-1低剂量组(2.5mg/kg)、多粘菌素组(2.5mg/kg)、生理盐水组，其中PCL-1为实施例1制备。多肽给药组、生理盐水组在感染后0.5h、2h分别腹腔给药两次，多粘菌素组在感染2h后尾静脉给药一次。同时设置不给菌组为空白对照组。

小鼠在感染8h后，眼眶取血约400μl，用肝素钠抗凝。稀释至不同梯度，再取各稀释液1.0ml加入无菌培养皿中，加入麦康凯琼脂培养基，置于37℃恒温培养18～24h，观察并且记录平板上的菌落数，计算小鼠血液中细菌的存活数量。结果见附图12。

由附图12可以看出，感染8h后，小鼠血液中细菌数目约为10⁸CFU/ml，多粘菌素能显著降低小鼠血液中的细菌数，相对于模型组，多肽PCL-1中剂量组细菌数降低了1.6个log值，而高剂量组降低了将近2.5个log值，与模型组相比较有显著性差异，说明多肽PCL-1能显著性地清除感染小鼠血液中的细菌。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 抗菌多肽Pb2-1或 PCL-1及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Phe Arg Lys Phe Met Arg Arg Leu Lys Lys Phe Phe

1 5 10

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Gly Phe Arg Lys Phe

1 5 10 15

Met Arg Arg Leu Lys Lys Phe Phe

20

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys

1 5 10

<210> 4

<211> 29

<212> PRT

<213> 缅甸蟒(Python bivittatu)

<400> 4

Lys Arg Asn Gly Phe Arg Lys Phe Met Arg Arg Leu Lys Lys Phe Phe

1 5 10 15

Ala Gly Gly Gly Ser Ser Ile Ala His Ile Lys Leu His

20 25

Claims

1.一种抗菌多肽Pb2-1，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1：

GFRKFMRRLKKFF。

2.一种抗菌多肽PCL-1，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2：

CWTKSIPPKPCGFRKFMRRLKKFF。

3.一种权利要求1所述的抗菌多肽Pb2-1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

以多肽CATHPb2为模板，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4 ：KRNGFRKFMRRLKKFFAGGGSSIAHIKLH，对其序列保守且α-螺旋高度集中的区域进行截取，从N-端第3位开始截取将多肽氨基酸个数由29个减少为13个，得到多肽Pb2-1。

4.一种权利要求2所述的抗菌多肽PCL-1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:

（1）以多肽CATHPb2为模板，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4：KRNGFRKFMRRLKKFFAGGGSSIAHIKLH，对其序列保守且α-螺旋高度集中的区域进行截取，从N-端第3位开始截取将多肽氨基酸个数由29个减少为13个，得到多肽Pb2-1；

（2）将一条序列为CWTKSIPPKPC的十一环肽，与Pb2-1的N-端共价连接，得到一条具有分子内二硫键的多肽PCL-1。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述序列CWTKSIPPKPC为二硫键成环、具有胰蛋白酶抑制活性的十一环肽。

6.一种权利要求1所述的抗菌多肽Pb2-1或者权利要求2所述的抗菌多肽PCL-1在制备抗细菌和真菌感染药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、痢疾杆菌和肺炎克雷伯菌；真菌为白色念珠菌和新生隐球菌。