CN110386971A - 一种斑点叉尾鮰β-防御素重组蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种斑点叉尾鮰β‑防御素重组蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还提供了所述重组蛋白的制备方法和用途。本发明通过酵母表达***，成功构建斑点叉尾鮰β‑防御素重组蛋白表达载体并将其大量表达、纯化，获得的β‑防御素重组蛋白表达量、纯度均高，而且对革兰氏阴性菌具有广泛的抑菌活性，应用前景良好。

Description

一种斑点叉尾鮰β-防御素重组蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种斑点叉尾鮰β-防御素重组蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是一种多肽，在宿主固有免疫防御中具有非常重要的作用，能够抵抗外界微生物的感染。由于传统抗菌素的滥用和耐药菌株的不断产生，严重影响了感染性疾病的临床治疗效果。而抗菌肽具有杀菌强、不易引起耐药性等优点，成为抗菌药物新的研究热点。

β-防御素(β-defnsin)作为脊椎动物中较古老的一类抗菌肽，具有抗菌活性、免疫调节、化学趋化等多种生物学活性，是目前颇具吸引力的一类新型候选抗菌药物。

斑点叉尾鮰也被称为斑鮰和沟鲶，属于鲇形目，鮰科鱼类，是一种重要的经济鱼类，同时也是无鳞鱼的典型代表。因为这种鱼具有生长速度比较快、肉喷细嫩、销售价格比较高的特点，受到了广大消费者和水产养殖业者的欢迎。但是，近年来斑点叉尾鮰的各种疾病发生与流行，对斑鮰养殖生产的威胁正在日益增加。斑点叉尾鮰能分泌多种抗菌物质，若能利用其自身的抗菌物质，提高其抗病能力，将对水产养殖业的健康发展产生重要意义。

但目前尚未见文献报道从斑点叉尾鮰中分离β-防御素抗菌肽，也未见通过基因工程方法从斑点叉尾鮰中获得高产量、高活性β-防御素抗菌肽的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种斑点叉尾鮰β-防御素重组蛋白及其制备方法和用途。

本发明提供了一种斑点叉尾鮰β-防御素重组蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了编码上述重组蛋白的核苷酸序列。

其中，序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了含有上述核苷酸序列的重组载体；

进一步地，所述重组载体为重组的pPICZαA载体。

本发明还提供了含有上述核苷酸序列的重组菌；

进一步地，所述重组菌为重组酵母菌，更进一步地，为重组毕赤酵母X33菌株。

本发明还提供了上述重组蛋白的制备方法，它包括如下步骤：

a、取上述重组菌，接种到BMGY/BMMY培养基中，30℃，培养至OD600为0.6时，离心，取沉淀；

b、在步骤a的沉淀中加入BMGY/BMMY培养基，重悬，加入甲醇诱导培养；

c、离心，收集上清液，纯化，即可。

其中，步骤b中，重悬至OD₆₀₀为1.0；

甲醇诱导培养的方法为：加入终浓度为1％的甲醇，培养48小时；

其中，步骤c中，纯化用镍离子金属鳌合亲和层析法。

本发明还提供了上述重组蛋白、上述编码基因、上述重组载体、重组菌在在制备抗菌药物中的用途。

其中，所述菌为大肠杆菌、嗜水气单胞菌和/或维氏气单胞菌。

本发明通过酵母表达***，成功构建斑点叉尾鮰β-防御素重组蛋白表达载体并将其大量表达、纯化，获得的β-防御素重组蛋白表达量、纯度均较高，其中，纯度高达80％，浓度高达14-20mg/L，而且本发明β-防御素重组蛋白对革兰氏阴性菌具有广泛的抑菌活性，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1ccBD酵母表达基因序列：红色部分为限制性酶切位点EcoRI/KpnI；下划线示引物序列。

图2ccBD酵母表达氨基酸序列：红色部分为6×His标签序列。

图3线性化质粒片段，M：marker 1000；1：线性化的空质粒；2：线性化的pPICZαA–ccBD片段。

图4菌落PCR检测pPICZαA–ccBD片段阳性的毕赤酵母菌落，1-30：毕赤酵母菌落；M：marker 2000；-：阴性对照；+：阳性对照。

图5重组载体pPICZαA-ccBD在毕赤酵母中的表达检测，未诱导酵母细胞；未转化重组载体酵母细胞；1-20：阳性克隆子；+:阳性对照；MW：蛋白质marker。

图6Wstern-blot分析，未诱导酵母细胞；未转化重组载体酵母细胞；1-20：阳性克隆子；+:阳性对照；MW：蛋白质marker。

图7蛋白纯化后SDS PAGE分析，MW：蛋白质marker；IN：上样液；FT；穿流液收集；W1-3：洗涤液收集；E1-8：洗脱液收集。

图8蛋白大量纯化后样品检测，MW：蛋白质marker；12#：12号克隆子蛋白纯化结果；16#：16号克隆子蛋白纯化结果。

图9平板法检测细菌个数，1：大肠杆菌；2：嗜水气单胞菌；3：维氏气单胞菌。

图10平板法检测细菌个数，1：大肠杆菌；2：嗜水气单胞菌；3：维氏气单胞菌。

图11对照组大肠杆菌扫描电镜观察40000×。

图12测试组大肠杆菌扫描电镜观察40000×。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1本发明斑点叉尾鮰β-防御素重组蛋白的制备

一、实验方法

1、表达序列片段和引物设计

采用DNAstar和Preimer 5.0软件，以斑点叉尾鮰β-防御素(Channel catfishβ-defensin,ccBD)CDS区域设计引物进行毕赤酵母表达。

在表达之前，通过在线表达分析工具EMBOSS(http://genopole.toulouse.inra.fr/bioinfo/emboss)对序列进行密码子偏好分析，然后针对酵母表达***进行密码子优化。采用SignalP 4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行信号肽分析。

2、毕赤酵母真核表达***构建

根据设计的引物对ccBD基因序列进行克隆，克隆后分别用限制性内切酶处理ccBD克隆片段和甲醇诱导型酵母表达载体pPICZαA，然后将酶切后的ccBD与pPICZαA进行连接，构建酵母表达载体pPICZαA-ccBD。采用限制性内切酶BstX I将构建的载体pPICZαA-ccBD线性化，并通过电转化仪将线性化的pPICZαA-ccBD转入毕赤酵母表达菌株X33。然后将电转化后的毕赤酵母进行培养，长出的菌落采用PCR进行鉴定，鉴定引物为5'AOX:5'gactggttccaattgacaagc 3'和3'AOX:5'gcaaatggcattctgacatcc 3'。

3、蛋白表达及western-blot检测

挑选20个PCR鉴定为阳性的毕赤酵母克隆子进行蛋白表达筛选。将阳性克隆子在30℃条件下培养至OD₆₀₀0.6左右，离心收集菌体，并重悬于BMGY/BMMY培养基中，使其浓度为OD₆₀₀1.0，然后加入1％的甲醇诱导48h，收集培养基上清进行SDS-PAGE分析。

为了进一步确定表达的蛋白为6×His标签融合蛋白，将SDS PAGE分析的结果进行western-blot检验。首先将分析的PAGE胶上的蛋白转至PVDF膜，采用3％BSA封闭1h后，再用鼠抗6×His标签抗体孵育2h，然后加入HRP标记羊抗鼠二抗进行孵育，最后用ECL进行显色反应。根据SDS-PAGE结果和western-blot结果选择表达量高的两个克隆子进行大量诱导表达。

4、蛋白大量表达和纯化

将上一步鉴定出的表达量高的两个克隆子分别进行100ml诱导表达。按照3中的方法，将克隆子分别培养后，调整浓度达到OD₆₀₀1.0，然后加入1％的甲醇诱导48h，收集培养基上清，然后用pH8.0的TBS在4℃条件下透析3天。透析后的蛋白通过0.22μm的微孔滤膜过滤后，随后采用Ni²⁺-NTAresin进行纯化。操作步骤如下：将过滤后的蛋白以0.5ml/min的流速进行上样，收集穿流液；平衡后用低浓度咪唑(30mM)进行杂蛋白洗涤，收集洗涤液；最后用200mM的咪唑洗涤目的蛋白，收集洗脱液。然后用SDS-PAGE检测纯化蛋白情况，用蛋白质分析仪测定蛋白质浓度，并收集高纯度的蛋白用于后续实验。

二、结果与分析

1、表达序列片段及引物设计

通过信号肽分析和密码子偏好性分析，将斑点叉尾鮰ccBD去信号肽后的基因序列进行表达，表达基因序列片段如图1，其中基因序列片段长159bp，红色部分为酶切位点EcoRI/KpnI，下划线示引物序列。采用DNAstar软件将基因序列翻译为氨基酸序列，氨基酸序列片段长度为51AAs，蛋白大小为5.42kDa，C-端具有一个6×His标签序列(红色表示，图2)。

ccBD酵母表达基因序列：阴影部分为限制性酶切位点EcoRI/KpnI；下划线示引物序列

ccBD酵母表达氨基酸序列：阴影部分为6×His标签序列

2、毕赤酵母真核表达***构建

构建的毕赤酵母表达载体pPICZαA–ccBD线性化后的片段大小约4.0kb，而空质粒片段大小小于pPICZαA–ccBD线性化后的片段(图3)。随后将线性化载体片段电转化入毕赤酵母表达菌株X33中，通过PCR对长出的30个阳性菌落进行鉴定，结果显示只有两个菌落为阴性，其余均为阳性(图4)，然后挑选20个具有较强阳性信号的菌落进行诱导表达。

3、蛋白表达及western-blot分析

将PCR鉴定为阳性的20个克隆子进行甲醇诱导表达后，收集上清进行SDS-PAGE分析。结果显示，20个克隆子均有不同程度表达(如箭头所示目的蛋白，约6KDa左右)，但是表达量较低(如图5)。为了进一步确定蛋白质表达情况，将表达产物进行western-blot分析。结果显示，20个克隆子均有不同程度表达(如箭头所示)，其中12和16号克隆子表达量最高，因此作为下一步大量表达克隆子。

4、蛋白大量表达及纯化

通过Ni2+-NTA resin亲合层析纯化后，收集不同组分纯化液进行SDS-PAGE分析。结果显示，目的蛋白主要存在于200mM咪唑洗涤的洗脱液中(图7箭头所示)。随后根据以上结果，分别选择目的蛋白浓度高，杂蛋白少的洗脱组分E6进行大量收集，目的蛋白约6KDa左右(图8)。经蛋白质分析仪测定后，12号菌株100ml表达的蛋白量为2mg，纯度为80％，产量为20mg/L；16号菌株100ml表达的蛋白量为1.4mg，纯度为80％，产量为14mg/L。进一步采用聚乙二醇浓缩至1.8mg/ml，-80℃保存用于后续检测实验。

可见，本发明获得了高纯度的斑点叉尾鮰β-防御素重组蛋白。

实施例2本发明斑点叉尾鮰β-防御素重组蛋白的活性检测

一、抑菌活性检测方法

1、平板法检测细菌生长情况

将大肠杆菌(ATCC 25922)、嗜水气单胞菌(16S rRNAGenBank：GQ331029.1)、维氏气单胞菌(ATCC 51106)从保菌管中复苏，使用LB肉汤培养过夜。分别吸取1mL菌体于离心管中离心除去上清，随后使用无菌PBS洗涤2次；采用麦氏比浊管法，将菌液稀释至1×10⁷CFU/mL。随后将菌液进行100倍稀释，分别取25μL菌液于无菌离心管中与25μL待测ccBD混合终浓度为(0.9mg/ml)为测试组，以Amp终浓度100mg/mL为阳性对照，以水为阴性对照，每组3个重复，并置于37℃培养箱中孵育2h。孵育结束后，取1μL液体于LB平板铺菌，培养16h，细菌计数。

2、分光光度法检测细菌生长情况

采用麦氏比浊管法将大肠杆菌、嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌菌液稀释至1×10⁷CFU/m L。随后将菌液进行100倍稀释，分别取100μL菌液于无菌离心管中与100μL待测ccBD混合终浓度为(0.5mg/ml)为测试组，以Amp终浓度100mg/mL为阳性对照，以水为阴性对照，每组3个重复，并置于37℃培养箱中孵育8h。同时设立仅含培养基和药物的较正组。待细菌孵育结束后，轻微震荡混匀，采用酶标仪读取各组OD₆₀₀的吸光度值，OD_样品＝OD_测试组-OD校正组。

3、扫描电镜观察表达多肽与大肠杆菌作用后形貌变化

取大肠杆菌500μl于无菌离心管中，处理多肽使其终浓度为25μg/ml(1×MIC)，处理PBS作为对照，37℃培养，处理组于2h后取样，对照组于0.5h时取样。将样品4000×g离心5min，收集沉淀，向沉淀中加入1ml 2.5％戊二醛溶液混匀，4℃固定2h。固定时间到达2h后将样品4000×g离心5min，随即脱水：依次用30％、50％、70％、85％、95％、100％乙醇进行梯度脱水，每个梯度脱水10min。样品置于100％乙醇中保存，随后进行CO₂干燥，喷金，上机，照相。

二、实验结果

1、采用平板法检测大肠杆菌、嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌分别混合孵育2h后的细菌数量(图9)。

阴性对照组的细菌数分别为108±4.18CFU/uL，284±9.85CFU/uL和229.33±5.18CFU/uL；

而Amp的阳性对照组分别为53.33±6.03CFU/uL，60.00±15.72CFU/uL和88.33±15.01CFU/uL，均明显低于阴性对照组；

本发明斑点叉尾鮰β-防御素抗菌肽的测试组略高于Amp阳性对照组，但明显低于阴性对照组，分别为73.67±5.03CFU/uL，152.33±7.23CFU/uL和146.00±11.53CFU/uL。

可见，本发明斑点叉尾鮰β-防御素抗菌肽具有抑制包括大肠杆菌、嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌在内的革兰氏阴性菌生长的活性。

2、采用分光光度法检测：

阴性对照组OD₆₀₀分别为0.41，0.36和0.96；

Amp阳性对照组OD₆₀₀分别为-0.39，-0.22和0.26明显低于阴性对照组；本发明斑点叉尾鮰β-防御素抗菌肽作用于三种细菌后OD₆₀₀分别为0.20、0.16和0.59虽不及阳性对照组低，但明显低于阴性对照组(图10)。

可见，本发明斑点叉尾鮰β-防御素抗菌肽具有包括大肠杆菌、嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌在内的革兰氏阴性菌生长的活性。

3、为了了解表达多肽对细菌细胞膜的作用，采用扫描电镜观察表达多肽处理大肠杆菌后菌体形貌损伤的情况。

结果显示，对照组菌体表面光滑、边缘完整呈短小杆状(图11)；经表达多肽作用2h后菌体表面出现小泡状突起、表面皱褶，形态发生改变(图12)。可见，表达多肽可引起细胞膜表面变形扭曲，胞浆内容物外溢、堆积，形成小泡状、触手状突起。结果进一步证实表达多肽对大肠杆菌具有破坏作用。

综上，本发明成功表达纯化了斑点叉尾鮰β-防御素重组蛋白，并验证该重组蛋白具有较强的抑菌活性，应用前景良好。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种斑点叉尾鮰β-防御素重组蛋白及其制备方法和用途

<130> GY151-18P1164

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 43

<212> PRT

<213> 斑点叉尾鮰(Ietalurus Punetaus，β-防御素重组蛋白)

<400> 1

Val Ser Phe Pro Trp Ser Cys Ala Ala Leu Ser Gly Val Cys Arg Gln

1 5 10 15

Gly Ala Cys Leu Pro Ser Glu Leu Tyr Phe Gly Pro Leu Gly Cys Gly

20 25 30

Lys Gly Ser Leu Cys Cys Val Ser Tyr Phe Leu

35 40

<210> 2

<211> 159

<212> DNA

<213> 斑点叉尾鮰(Ietalurus Punetaus，β-防御素)

<400> 2

atggtctcct tcccctggtc ctgcgccgcc ctctccggcg tctgccgcca gggcgcctgc 60

ctcccctccg agctctactt cggccccctc ggctgcggca agggctccct ctgctgcgtc 120

tcctacttcc tcggctccca ccaccaccac caccactag 159

Claims (10)

1.一种斑点叉尾鮰β-防御素重组蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述重组蛋白的核苷酸序列。

3.根据权利要2所述的核苷酸序列，其特征在于：序列如SEQ ID No.2所示。

4.含有权利要求2或3所述核苷酸序列的重组载体；

进一步地，所述重组载体为重组的pPICZαA载体。

5.含有权利要求2或3所述核苷酸序列的重组菌；

进一步地，所述重组菌为重组酵母菌，更进一步地，为重组毕赤酵母X33菌株。

6.权利要求1所述重组蛋白的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：

a、取权利要求6所述的重组菌，接种到BMGY/BMMY培养基中，30℃，培养至OD600为0.6时，离心，取沉淀；

b、在步骤a的沉淀中加入BMGY/BMMY培养基，重悬，加入甲醇诱导培养；

c、离心，收集上清液，纯化，即可。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：

步骤b中，重悬至OD₆₀₀为1.0；

甲醇诱导培养的方法为：加入终浓度为1％的甲醇，培养48小时。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：

步骤c中，纯化用镍离子金属鳌合亲和层析法。

9.权利要求1所述重组蛋白、权利要求2或3所述编码基因、权利要求4所述重组载体、重组菌在在制备抗菌药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述菌为大肠杆菌、嗜水气单胞菌和/或维氏气单胞菌。