CN110382533B - 特异性结合CD66c的抗体及其用途 - Google Patents

特异性结合CD66c的抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110382533B
CN110382533B CN201780070516.5A CN201780070516A CN110382533B CN 110382533 B CN110382533 B CN 110382533B CN 201780070516 A CN201780070516 A CN 201780070516A CN 110382533 B CN110382533 B CN 110382533B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
amino acid
antibody
acid sequence
antibodies
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201780070516.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110382533A (zh
Inventor
尹相淳
洪权杓
金素雪
池吉龙
林英勋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinhu Ht Co ltd
Original Assignee
Jinhu Ht Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinhu Ht Co ltd filed Critical Jinhu Ht Co ltd
Publication of CN110382533A publication Critical patent/CN110382533A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110382533B publication Critical patent/CN110382533B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Abstract

本发明涉及抗CD66c抗体及其用于癌症治疗的用途，更具体地，涉及可以通过使用特异性识别CD66c的抗体来诱导T细胞活化或体液免疫应答、识别并结合于CD66c的抗体；编码该抗体或抗原结合片段的核酸分子；包含该核酸分子的载体和宿主细胞；以及该抗体或抗原结合片段用于缓解、预防、治疗或诊断CD66c相关疾病例如实体癌的用途。

Description

特异性结合CD66c的抗体及其用途
技术领域
本发明涉及抗CD66c抗体及其用于治疗癌症的用途，更具体地，可以使用特异性识别CD66c的抗体诱导T细胞活化或体液免疫应答。特异性识别CD66c的抗体或其抗原结合片段、编码该抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包含该核酸分子的载体和宿主细胞用于CD66c相关疾病例如实体癌症的缓解、预防、治疗或诊断。
背景技术
CD66c被称为CEACAM6(癌胚抗原相关细胞粘附分子6)或NCA(非特异***叉反应糖蛋白抗原)-90，并且在肺癌、胰腺癌、乳腺癌、直肠癌和肝癌患者的血液中具有较高的浓度。上述CD66c是细胞粘附的重要蛋白质，并且在中性粒细胞的情况下参与由细胞因子活化的内皮细胞的粘附。
此外，如果阻止细胞粘附，正常细胞会自行毁灭。这个过程叫做失巢凋亡(anoikis)。然而，肿瘤细胞对这种失巢凋亡具有抗性，因此促进癌症的发作和癌症的转移。有报道称上述CD66c阻止失巢凋亡，并且还有报道称在癌细胞中恶性表型通过调节CD66c的表达而发生变化。此外，当通过使用小干扰RNA使CD66c基因沉默来抑制蛋白质表达时，通过增强失巢凋亡来抑制体内转移。总之，可以通过抑制CD66c的功能来预防转移。
发明内容
技术问题
根据一种实施方式，本发明提供了结合于CD66c的抗体及其抗原结合片段。
本发明的另一种实施方式提供了编码该抗体或抗原结合片段的核酸分子、携带该核酸分子的载体和包含该核酸分子的宿主细胞。
本发明的另一种实施方式提供了检测或诊断CD66c相关疾病的方法或试剂盒，该试剂盒包含抗体、核酸分子、载体和/或宿主细胞。
本发明的又一种实施方式提供了包含抗体、核酸分子、载体和/或宿主细胞，用于预防、治疗或缓解CD66c相关疾病的组合物，或抗体、核酸分子、载体和/或宿主细胞在预防、治疗或缓解碳酸酐酶相关疾病中的用途。
本发明的再一种实施方式提供了预防、治疗或缓解CD66c相关疾病的方法，包括将含有抗体，核酸分子，载体和/或宿主细胞的组合物施用于患有碳酸酐酶相关疾病的受试者。
本发明的又另一种实施方式提供了用于预防或治疗癌症或癌症转移相关疾病的组合物或方法。
技术方案
本发明涉及识别和结合CD66c的抗体、编码该抗体或抗原结合片段的核酸分子、携带该核酸分子的载体、包含该核酸分子或载体的宿主细胞、以及该抗体或其抗原结合片段在缓解、预防、治疗或诊断CD66c阳性实体瘤中的用途。
分化簇66c(CD66c)是被称为癌胚抗原相关细胞粘附分子6(CEACAM 6)或非特异***叉反应糖蛋白抗原(NCA)-90的蛋白质，并且是细胞粘附的重要蛋白质。CD66c可以优选地表示为但不限于SEQ ID No：1的氨基酸序列(基因库蛋白质编号AAH05008)。
一种实施方式提供了特异性识别CD66c的抗CD66c抗体。根据本发明的抗CD66c抗体诱导体液免疫应答和细胞介导的免疫应答。根据本发明的抗CD66c抗体特异性识别CD66c(分化簇66c)的表位，并且可以有效地检测CD66c抗原。
如本文所用，术语“抗体”是指通过刺激免疫***中的抗原产生的物质，其种类没有特别限制。抗体可以以非天然方式产生，例如，重组或合成产生。抗体可以是动物抗体(例如小鼠抗体等)、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
此外，除非另有说明，否则本文中抗体可以理解为包括具有抗原结合能力的抗体的抗原结合片段。在本说明书中，术语“互补决定区(CDR)”是指抗体可变区中赋予抗体对抗原的结合特异性的抗体区域。上述抗体的抗原结合片段可以是包含至少一个互补决定区的抗体片段。
本发明的实施方式提供了特异性识别或特异性结合CD66c的抗CD66c抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的抗CD66c抗体特异性识别和/或结合CD66c，并且抗体包括小鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。本发明中的嵌合抗体是可变区的序列来源于一个物种并且恒定区的序列来源于其他物种的抗体，例如，可变区来源于小鼠并且恒定区来源于人类。本发明中的人源化抗体是在人体中具有低免疫原性并具有非人抗体活性的抗体。例如，人源化抗体可以通过保持非人CDR区并用人对应物替换该区域的其余部分来制备。例如，参考文献：Morrison等人，Proc.Natl.Acad.ScL USA，81：6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.，28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.，31(3)：169-217(1994)。
本发明中的抗体片段不受限制，只要该抗体片段特异性识别CD66c表位并包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)即可。抗体片段可以选自由Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、dsFv和CDR组成的组。特别地，scFv是通过用接头多肽将重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)连接而制备为单链的抗体片段。
根据本发明的小鼠抗体或嵌合抗体的实例可以是抗体或其抗原结合片段，其包括选自由包含SEQ ID NO：1至3的氨基酸序列的VH CDR的氨基酸序列和包含SEQ ID NO：4至6的氨基酸序列的VL CDR的氨基酸序列组成的组中的至少一种。小鼠抗体或嵌合抗体的实例的CDR和可变区总结于下表1中。
具体地，本发明的抗体的实例可包括作为VH CDR的SEQ ID NO：1(CDR1)、SEQ IDNO：2(CDR2)和SEQ ID NO：3(CDR3)和/或作为VL CDR的SEQ ID NO：4(CDR1)、SEQ ID NO：5(CDR2)和SEQ ID NO：6(CDR3)。
小鼠抗体或嵌合抗体可包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的VH区以及含有SEQID NO：8的氨基酸序列的VL区。
本发明涉及预防或治疗选自癌症和癌症转移的疾病的药物组合物、试剂盒或方法，该药物组合物、试剂盒或方法包括小鼠抗体或嵌合抗体作为活性成分。本发明还涉及预防或治疗选自癌症和癌症转移的疾病的药物组合物，该药物组合物包含小鼠抗体或嵌合抗体作为活性成分，例如由以保藏号KCLRF-BP-00230保藏的杂交瘤细胞产生的包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的抗CD66c抗体或其抗原结合片段。该杂交瘤细胞于2010年2月22日在韩国细胞系研究基金会(KCLRF)保藏为′8F5′，并且以保藏号为KCLRF-BP-00230接收，该杂交瘤细胞已在KR 10-1214177中详细描述。
癌症可以为CD66c阳性实体癌，例如CD66c阳性肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌或***癌，优选为结肠癌、胃癌或肝癌。癌症和癌症转移的预防、抑制或治疗的用途可以例如减小实体癌或实体癌的细胞大小，或诱导或促进肿瘤消退。
本发明可以通过使用小鼠抗体或嵌合抗体中的抗CD66c抗体8F5的氨基酸序列和人的构架序列来制备人源化抗体。从重组人源化抗体的候选物中，基于表达程度、聚集和细胞结合程度，选择其中表达正常发生，由于蛋白质本身不稳定性小而蛋白质聚集很少，并且对靶抗原阳性细胞的结合能力与嵌合抗体相似的重组人源化抗体。具体而言，细胞结合谱与嵌合抗体相似，通过将抗体阳性率(％门控)乘以平均荧光(平均值)得到细胞结合谱，然后将细胞结合谱与嵌合抗体进行比较，以选择±20％范围内的候选抗体(实施例2)。因此，在制备人源化抗体时，当将小鼠抗体的CDR区序列***人抗体的构架区中时，由于原始蛋白结构的改变，所制备的抗体的结合能力迅速降低。考虑到制备的抗体的结合能力的降低，本发明中所选择的人源化抗体是非常优异的抗体。
优选地，选择基于细胞结合能力与嵌合抗体相比表现出高结合亲和力的五种类型的重组人源化抗体，并通过ELISA对该重组人源化抗体进行针对CD66c抗原或CD66抗原类似的抗原的结合测定。
此外，与嵌合抗体相比，根据本发明的人源化抗体显示出优异的稳定性，例如，具有反映为ANS反应性变化小于200％的稳定性的抗体。ANS反应性变化小于200％被认为是非常小的变化，并且变化值高于200％可以解释为由于蛋白质的显著结构变化而观察到ANS反应性。因此，根据本发明的人源化抗体具有与嵌合抗体相似的抗原结合活性和细胞结合能力，以及抗体蛋白本身的增加的物理稳定性，该人源化抗体在治疗性抗体的治疗剂方面可以是非常优异的。
抗体对ANS试剂的荧光变化率可以通过在低温条件(例如，4℃)下测量的荧光值与在高温条件(例如，62℃)下测量的荧光值之间的差除以低温条件下测量的荧光值来测量。
[数学等式]
荧光变化率＝(高温条件下测量的荧光值-低温条件下测量的荧光值)/(低温条件下测量的荧光值)
作为获得抗体的特定荧光变化的方法，在冷藏条件(4℃)和62℃的温度下放置4小时后，通过荧光读数器测量ANS试剂的反应性，并表示为荧光值，可以使用该等式获得荧光变化率。
根据本发明的人源化抗体的实例可包括选自由决定包含SEQ ID NO：9至13的氨基酸序列的重链可变区或轻链可变区的CDR的氨基酸序列组成的组中的一种或多种氨基酸序列。小鼠抗体和嵌合抗体的实例可包括选自由决定包含SEQ ID NO：1至3的氨基酸序列的重链可变区的CDR或包含SEQ ID NO：4至6的氨基酸序列的轻链可变区的CDR的氨基酸序列组成的组中的一种或多种氨基酸序列。
具体地，人源化抗体的实例包括决定包含SEQ ID NO：1或9的氨基酸序列的VH区的CDR1的氨基酸序列、决定包含SEQ ID NO：2或10的氨基酸序列的VH区的CDR2的氨基酸序列、和决定包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH区的CDR3的氨基酸序列。
人源化抗体的实例包括决定包含SEQ ID NO：4、11或12的氨基酸序列的VL区的CDR1的氨基酸序列、决定包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的VL区的CDR2的氨基酸序列、和决定包含SEQ ID NO：6或13的氨基酸序列的VL区的CDR3的氨基酸序列。
人源化抗体的实例包括选自由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：14至18的氨基酸序列组成的组中的重链可变区和选自由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：19至21的氨基酸序列组成的组中的轻链可变区，但不包括包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的抗体。
根据人源化抗体的实例的CDR序列和可变区序列总结于下表1中。
[表1]
根据本发明的人源化抗体的一个实例的构架序列显示在下表3和4中，其中所述抗体可包括选自由重链可变区的构架1至4和构架轻链可变区的构架1至4组成的组中的至少一种，并且可以是包含一个或多个构架的抗体。
具体地，重链可变区中构架1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：23至27，构架2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：32至37，构架3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：43至47，构架4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：53至57。
在轻链可变区中，构架1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：29至31，构架2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：39至41，构架3的氨基酸序列可对应于SEQ ID NO：49至51的氨基酸序列，构架4的氨基酸序列可包含SEQ ID NO：59至61。根据人源化抗体的实例的构架序列示于下表中。
[表2]
[表3]
人源化抗体可包括选自由SEQ ID NO：14至18的氨基酸序列组成的组中的VH区和选自由SEQ ID NO：19至21的氨基酸序列组成的组中的VL区。具体地，人源化抗体的实例包括：包括含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VL区的抗体(Vk8+VH6)、包括含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VL区的抗体(Vk8+VH11)、包括含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VL区的抗体(Vk5+VH7)、包括含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的VL区的抗体(Vk7+VH6)、包括含有SEQ IDNO：15的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的VL区的抗体(Vk7+VH10)、包括含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的VL区的抗体(Vk7+VH7)、包括含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的VL区的抗体(Vk7+VH5)、以及包括含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VL区的抗体(Vk8+VH7)。抗体的具体组合和氨基酸序列示于下表6中。抗体的优选实例包括：包括含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的VH区和含有SEQ IDNO：21的氨基酸序列的VL区的抗体(Vk8+VH6)、包括含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VL区的抗体(Vk8+VH11)、包括含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VL区的抗体(Vk5+VH7)、包括含有SEQID NO：17的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的VL区的抗体(Vk7+VH6)、以及包括含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的VL区的抗体(Vk7+VH10)。
与小鼠抗体或嵌合抗体不同，人源化抗体在施用于人体时显示出的稳定性为嵌合8F5抗体的10倍以及免疫原性降低的差异。具体而言，该抗体具有高稳定性，其在高温下(例如，在62℃的温度下)由ANS结合引起的荧光变化率小于200％。
在特定的严格条件下，嵌合8F5抗体显示ANS反应性的变异率为1406％，而人源化抗体显示出约114％和133％的相对小的变异率，表明人源化抗体在蛋白质上是稳定的。
嵌合8F5抗体和人源化抗体通过T细胞活化因子增加T细胞的活化并增加T细胞的活性，甚至在由使源自不同人的相同种类的树突细胞和T细胞引起的T细胞活化条件下。当T细胞与癌细胞共培养时，这种T细胞活化的诱导诱导癌细胞的死亡，并在与各种癌细胞的共培养条件下诱导T细胞活化。
根据本发明的实施方式的抗体或其抗原结合片段表现出肿瘤消退活性和对肿瘤细胞系的直接抑制作用。如本文所用，术语“肿瘤消退”旨在包括诱导或促进肿瘤大小的减小和/或肿瘤细胞生长的抑制、中断或减少。肿瘤大小的减小意味着，当施用根据本发明的抗体或其片段时，肿瘤大小降低至施用前肿瘤大小的例如97％或更低、95％或更低、90％或更低、85％或更低、80％或更低、或75％或更低。
根据本发明的抗体表现出抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。
术语“CDR(互补决定区)”是指免疫球蛋白的轻链和重链的高变区的氨基酸序列。重链和轻链可各自包含三个CDR(CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL1、CDRL2、CDRL3)。抗体的CDR可以提供与抗原或表位结合的必需接触残基。
在整个说明书中，术语“特异性结合”或“特异性识别”具有相同的含义，如本领域普通技术人员通常已知的，表明抗原和抗体彼此特异性地相互作用并导致免疫应答。
术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白的完整结构的片段，其是包含抗原可结合的域的部分多肽。例如，它可以是scFv、(scFv)2、scFv-Fc、Fab、Fab′或F(ab′)2，但不限于此。
抗CD66c抗体或其片段可以与各种标记试剂、毒素或抗肿瘤药物偶联。对于本领域技术人员显而易见的是，本发明的抗体可以通过本领域熟知的方法与标记试剂、毒素或抗肿瘤药物偶联。这种偶联可以在抗体或抗原表达后在连接位点上化学地进行。可供选择地，可以在DNA水平上将偶联产物工程化到本发明的抗体或抗原中。接下来，然后在如下文所述的合适宿主***中表达DNA，并收集表达的蛋白质，并且如果需要，使蛋白质复性。偶联可以通过本领域已知的接头实现。特别地，在该技术中可以使用在酸性或碱性条件下或在暴露于特定蛋白酶时释放毒素的不同接头或抗肿瘤药物。在一些实施方式中，可能需要将标记试剂、毒素或抗肿瘤药物以各种长度连接到间隔区臂上以减少潜在的空间位阻。
标记试剂可选自由放射性同位素、半抗原、荧光、色原和染料组成的组。特别地，标记试剂可选自FLAG、GFP、YFP、RFP、dTomato、樱桃红、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、DNP、AMCA、生物素、异羟基洋地黄毒苷、塔姆拉(Tamra)、德克萨斯红、罗丹明、Alexa fluors、FITC和TRITC。可供选择地，标记试剂可以是放射性同位素，例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I或131I。合适的标记试剂的其他实例包括酶基团(例如辣根过氧化物酶、辣根半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光基团、生物素基团或由次级报告分子识别的预定多肽表位。
只要是对细胞或生物体具有毒性的任何毒素都可用于本发明。例如，放射性同位素、小分子、肽或蛋白质可用作毒素。抗体或其片段可以与毒素偶联以形成融合蛋白。作为毒素蛋白质，可以使用蓖麻毒素、皂草素、白树毒素、苦瓜蛋白、白喉毒素或假单胞菌毒素。至于放射性同位素，其实例包括131I、188Rh和90Y，但不限于此。
如本文所用，术语“抗肿瘤剂”指定能够阻止或减缓组织异常生长的药物。因此，抗肿瘤剂特别适用于治疗癌症。抗肿瘤剂可以是血管生成抑制剂、DNA嵌入剂或DNA交联剂、DNA合成抑制剂、DNA-RNA转录调节剂、酶抑制剂、基因调节剂、微管抑制剂或其他抗肿瘤剂。
本发明进一步涉及编码本发明抗体的核酸分子。编码本发明抗体的本发明的核酸分子可以是例如，单独或组合的DNA、cDNA、RNA、合成产生的DNA或RNA、或包含任何这些核酸分子的重组产生的嵌合核酸分子。核酸分子也可以是对应于整个基因或其实质部分、或其片段或衍生物的基因组DNA。核酸分子的核苷酸序列可以是修饰的核苷酸序列，其中在一个或多个核苷酸残基上发生取代、缺失或添加，并且所述取代、缺失或添加引起抗体的氨基酸序列的至少一个氨基酸残基的取代或突变。在本发明的具体实施方式中，核酸分子是cDNA分子。
本发明的一种实施方式还涉及包含可表达形式的核酸分子的载体。本发明的载体可以是例如噬菌体、质粒、病毒载体或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以是可复制型的或复制缺陷型的。在后一种情况下，病毒繁殖通常会发生在互补宿主/细胞中。
可以将上述核酸分子***载体中，使得发生与另一种多核苷酸的翻译融合。通常，载体可含有一个或多个复制起点(ori)和用于克隆或表达的遗传***、一个或多个用于在宿主中选择的标记例如抗生素抗性、以及一个或多个表达盒。合适的复制起点(ori)的实例包括Col E1、SV40病毒和M13复制起点。
在本发明中，核酸分子可以被设计为用于直接或通过脂质体、噬菌体载体或病毒载体(例如腺病毒载体、逆转录病毒载体等)导入宿主。另外，杆状病毒***或基于痘苗病毒或塞姆利基森林病毒的***可用作本发明的核酸分子的真核表达***。
本发明的另一种实施方式涉及包含本发明的载体的非人宿主。宿主可以是原核的或真核的。存在于宿主细胞中的本发明的多核苷酸或载体可以整合到宿主细胞的基因组中，或可以保持在染色体外。
此外，本发明涉及可用于产生本发明的抗体的转基因非人动物，所述本发明的抗体包含一种或多种本发明的核酸分子。抗体可以从山羊、牛、马、猪、大鼠、小鼠、兔、仓鼠或其他哺乳动物的组织或体液(例如牛奶、血液或尿液)中产生和回收。
此外，本发明提供了产生选择性识别CD66c的抗原决定区的物质的方法，以及产生选择性识别CD66c的抗原决定区的抗体的细胞系。抗CD66c或其片段的抗原决定区的抗体可以使用CD66c蛋白、CD66c的抗原决定区、含有CD66c的抗原决定区的CD66c的一部分、或表达作为抗原的CD66c的抗原决定区的细胞以典型方法产生。例如，通过产生产生抗CD66c抗体的细胞系的方法可以实现产生抗CD66c抗体的方法，所述方法包括(a)用CD66c蛋白、CD66c的抗原决定区、含有CD66c的抗原决定区的CD66c的一部分、或表达CD66c的抗原决定区的细胞注射和免疫动物，(b)获得产生对CD66e特异性的抗体的脾细胞，和(c)将脾细胞与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞并选择产生抗CD66c抗体的杂交瘤细胞。可以通过体外培养细胞系或通过体内引入细胞系来分离抗体。例如，可以将细胞系经腹膜内注射到小鼠中，然后从腹水中分离和纯化抗体。单克隆抗体的分离和纯化可以通过使用抗免疫球蛋白柱或蛋白A柱对培养物上清液和腹水进行离子交换层析(DEAE或DE52)或亲和层析来实现。
本发明的抗体结合的抗原决定区表现出实体瘤特异性的表达。因此，抗CD66c抗体不仅可以有效地用于检测肿瘤细胞，而且当CD66c抗体携带有毒物质时也可以仅对肿瘤细胞发挥细胞毒性。
本发明的进一步的实施方式提供了CD66c的用途，特别是位于CD66c的非催化域的抗原决定区在检测实体瘤中的用途。此外，提供了用于检测实体瘤中的癌症干细胞的组合物，该组合物包含与抗原决定区相互作用的物质。相互作用的物质可以是能够与CD66c相互作用，特别是与位于CD66c非催化域的CD66c的抗原决定区相互作用的任何物质。特别地，相互作用的物质可选自由小分子化学物质、抗体、抗体的抗原结合片段、适体或其组合。
在另一种实施方式中，本发明涉及诊断组合物，该诊断组合物包含本发明的抗体、本发明的核酸分子、本发明的载体或本发明的宿主。如本文所用，术语“诊断组合物”是指包含本发明的抗体、核酸分子、载体和/或宿主中的至少一种的组合物。
通过使样品与本发明的抗体接触并确定样品中CD66c的存在，本发明的诊断组合物可用于检测各种细胞、组织或其它合适样品中CD66c的不希望的表达或过表达。因此，本发明的诊断组合物可用于评估疾病的发作或状态，如下文所定义。特别地，可以用本发明的抗体或其片段或衍生物靶向能够表达CD66c的恶性细胞，例如癌细胞。结合了本发明抗体的细胞可能被免疫***功能如补体***或被细胞介导的细胞毒性攻击，从而减少显示CD66c的不希望的表达或过表达的细胞的数量或完全根除显示CD66c的不希望的表达或过表达的细胞。
在另一种实施方式中，本发明的抗体或其片段或衍生物与标记试剂偶联。此类抗体特别适用于诊断应用。
本发明的诊断组合物可以作为活性剂单独或与其他药剂组合施用。
本发明的又一种实施方式涉及用于检测肿瘤细胞的方法，该方法包括(a)使抗CD66c抗体与包含肿瘤细胞的样品反应，和(b)如果样品对抗体呈阳性，则确定样品是肿瘤。样品可包括但不限于淋巴液、骨髓、血液和血细胞。肿瘤细胞可以优选为乳腺癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、***癌细胞或肝癌细胞。
当用于筛选肿瘤细胞时，抗CD66c抗体可以与能够指示抗原-抗体反应性的标记缀合。用于此目的的有用的标记可包括放射性同位素、荧光物质、发光物质、色原和染料。
而且，可以提供本发明的抗CD66c抗体用于诊断实体瘤的试剂盒。
除了抗CD66c抗体之外，诊断试剂盒可以包括用于检测抗原-抗体反应的手段。检测手段可以是用于进行选自由流式细胞术、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)，酶免疫测定(EIA)，荧光免疫测定(FIA)和发光免疫测定(LIA)组成的组中的技术的试剂。在这种情况下，标记可以是诸如HRP(辣根过氧化物酶)的酶；诸如FITC(异硫氰酸荧光素乙二胺)的荧光物质；诸如鲁米诺、异鲁米诺和光泽精的发光物质；或诸如125I、3H、14C和131I的放射性同位素，但不限于此。可以使用用于测量与底物的酶促反应、荧光、发光或辐射的手段来确定与标记的缀合。例如，可以制备抗CD66c抗体用于ELISA试剂盒或条带试剂盒。
根据本发明的实施方式，本发明提供了包含本发明的抗体、核酸分子、载体或宿主的药物组合物。本发明的抗体、核酸分、载体或宿主用于治疗或消退实体癌。实体瘤的治疗或消退可以通过以有效剂量向有需要的受试者施用本发明的核酸分子、载体或宿主来实现。
如本文所用，术语“实体瘤”定义了通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性的(不是癌症)或恶性的(本领域通常称为癌症)。适用于根据本发明的抗体的实体瘤的实例包括肉瘤、胶质瘤、恶性肿瘤、间皮瘤、淋巴瘤、肾癌、肺癌、乳腺癌、***、卵巢癌、结肠直肠癌、肝癌、***癌、胰腺癌和头颈部癌，优选乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、***癌或肝癌。乳腺癌可能是三阴性乳腺癌(TNBC)，其通过使用HER2、***受体(ER)和孕酮受体(PR)的三种诊断标志物可被检测为阴性，因此很难被检测到。
根据本发明的实体瘤的治疗效果包括对癌细胞(特别是癌症干细胞)或包含癌细胞的组织的迁移、侵袭和转移的抑制作用并因此缓解癌症的恶性，以及生长抑制(定量减小)和细胞凋亡。
为了使与阻断PD-1或PD-L1的结合环的抑制剂组合的本发明的抗体的作用最大化，如实施例7，当癌细胞和免疫细胞共培养时，T细胞活化的诱导分泌细胞因子并增加癌细胞和免疫细胞的表面上的PD-L1蛋白水平。当PD-1或PD-L1结合抑制剂与本发明的抗体组合使用时，可以预期这将提供更高的抗癌作用。PD-1和PD-L1的抗体治疗剂作为免疫检查点抑制剂已被批准并应用于临床试验。该组合物可进一步包含PD-1或PD-L1结合抑制剂。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指患有或可能患有实体瘤或症状并且因此需要减轻、预防和/或治疗实体瘤的哺乳动物，所述哺乳动物包括灵长类动物(例如人、猴等)以及啮齿类动物(例如小鼠、大鼠等)。
根据本发明的抗体或其片段的施用可以以任何可接受的方式进行。例如，包含抗CD66c抗体作为活性成分的治疗剂通过口服或肠胃外施用于受试者，优选肠胃外施用于受试者，例如具有肿瘤细胞的人或动物。治疗剂可以包括药学上可接受的赋形剂，并且治疗剂的剂量可以根据患者的状况而变化，并且可以为例如每天3mg至6,000mg。治疗剂可以采取诸如液体、粉末、乳液、悬浮液或注射剂的形式，但不限于此。
此外，本发明提供了一种治疗急性或慢性髓性或淋巴细胞白血病的方法，该方法使用选自抗CD66c的抗原决定区的抗体、抗体的片段(F(ab′)2、Fab、Fv等)和抗CD66c的抗原决定区的配体中的至少一种。
抗体或其片段可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且可以来源自人或动物。抗CD66c抗体或其片段可以进一步包含上述毒素。可以使用熟知的技术使毒素与抗体融合、偶联、缀合或连接。
本发明的药物组合物可以作为单一活性剂施用，或与任何其他优选用于治疗目标疾病的药剂联合施用。另外，本发明的抗体可以与其他抗癌疗法例如化学疗法、放射疗法、细胞疗法等联合使用。可以在化学疗法或细胞疗法中使用各种熟知的抗癌剂。
本发明的另一种实施方式提供筛选实体瘤的治疗剂或抑制剂的方法，包括使候选化合物与CD66c接触，特别是与位于CD66c的非催化域的抗原决定区接触，以及如果确定候选化合物结合于抗原决定区，则将候选化合物分类为实体瘤的潜在治疗剂。本发明的另一种实施方式提供了用于治疗实体瘤的药物组合物，该药物组合物包含筛选的实体瘤治疗剂作为活性成分。
候选化合物可以是选自由各种合成或天然存在的化合物、多肽、寡肽、肽或蛋白质构建体(例如抗体、抗原结合片段、肽体、纳米抗体等)、多核苷酸、寡核苷酸、反义RNA、shRNA(短发夹RNA)、siRNA(小干扰RNA)、适体和天然产物提取物组成的组中的至少一种。
候选化合物和抗原决定区之间的结合可以通过检测复合物的形成来确定，这可以使用本领域已知的各种方法进行。举例来说，可以检测典型的酶反应、荧光、发光和/或辐射以确认候选化合物与抗原结合区的结合。详细地，可用于检测复合物的技术包括但不限于免疫层析、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、发光免疫测定(LIA)和蛋白质印迹。
有益效果
提供了识别和结合CD66c的抗体、编码该抗体的核酸分子或该抗体的抗原结合片段、携带该核酸分子的载体、包含该载体或该核酸分子的宿主细胞，以及该抗体或其抗原结合片段在减轻、预防或诊断与CD66c相关的疾病如实体瘤中的应用。
附图说明
图1示出了从小鼠8F5抗体克隆抗体的基因并将该基因表达为嵌合重组抗体并与CD66c抗原阳性A549细胞表面结合的结果。
图2a至2c示出了在96种重组人源化抗体中首先选择的8种重组人源化抗体的HPLC分析结果。左侧示出了在OD 220nm处测量每种抗体的结果，右侧示出了在OD 280nm处测量每种抗体的结果。结果表示抗体和源自抗体的杂质如片段的聚集是否存在。
图3a至3e示出了重组人源化抗体与嵌合抗体相比的细胞表面结合的相似程度，这是由于证实了首先在96种重组人源化抗体中选择的8种重组人源化抗体的CD66c抗原阳性细胞表面结合。
图4a和4b示出了选自96种重组人源化抗体的5种重组人源化抗体与CD66c抗原的结合能力的ELISA分析结果。图4a示出了作为抗原的CECACAM6(CD66c)的结果，图4b示出了CEACAM1(CD66a)抗原的结果。
图5a和5b示出了在严苛温度条件下确认选自96种重组人源化抗体的5种重组人源化抗体的抗体稳定性的结果。
图6a至6d示出了CD66c抗原阳性细胞A549与CHO细胞中表达的重组人源化抗体的细胞表面结合。
图7a示出了当在人结肠直肠癌LS174T细胞和人CD8+T细胞的共培养条件下处理嵌合8F5抗体时，通过活化CD8+T细胞而分泌IFN-γ和穿孔素的结果，图7b示出在与图7a相同的条件下用嵌合8F5抗体处理时，结肠直肠癌细胞LS174T的细胞死亡增加。
图8示出了仅在CD8+T细胞和各种癌细胞的共培养条件下处理嵌合8F5抗体时IFN-γ分泌的选择性增加，并示出了胃癌细胞NCI-N87细胞和SNU-719细胞和肝癌PLC/PRF/5细胞的结果。
图9a至9c示出了CD66c抗原可以抑制T细胞活性。图9a示出了用流式细胞仪测量作为T细胞活性因子的IFN-γ的细胞内水平的结果，图9c是通过ELISPOT测量IFN-γ分泌的结果。在图9b和9c的情况下，当CD66c抗原由不同来源提供时，T细胞活性被类似地抑制。
图10a和10b是示出在由附着的OKT3抗体引起的T细胞活化条件下嵌合8F5抗体增加T细胞的活化并增加各种活化的细胞的表面标志物蛋白如CD69、CD107和CD25的结果。
图11a和11b示出了在树突细胞和PBMC彼此混合的MLR(混合淋巴细胞反应)条件下嵌合8F5抗体活化CD4和CD8阳性细胞。
图12a示出了在将从胃癌患者的腹水中分离的人胃癌细胞与人PBMC共培养时，当处理嵌合8F5抗体时，IFN-γ分泌增加的ELISPOT分析的结果。图12b和12c示出了对三名患有CD66c抗原阳性胃癌的患者进行另外的ELISPOT实验的类似结果。
图13a和13b示出了通过与人PBMC和A549非小细胞肺癌细胞共培养并处理嵌合8F5抗体，PBMC和A549癌细胞各自表面上的PD-L1抗原的表达增加。
图14a和14b显示了重组人源化抗体通过以类似于嵌合8F5抗体的模式增加人PBMC与A549癌细胞的共培养物中的IFN-γ分泌而具有相似程度的抗体功能。
图15a和15b是示出当LS-174-T结肠直肠癌细胞或A549非小细胞肺癌细胞与人PBMC共培养时，人源化8F5抗体具有癌细胞死亡功能的结果。
图16a至16g示出了使用具有嵌合8F5抗体的NOD/SCID小鼠的动物模型的体内抗癌功效的结果。图16c示出了使用具有人源化8F5抗体的NOD/SCID小鼠的动物模型的体内抗癌功效的结果。图16d和图16e至16g示出了通过使用不同的人PBMC作为NSG免疫缺陷小鼠中的效应细胞，人源化8F5抗体的体内抗癌功效的结果。
具体实施方式
通过以下实施例可以更好地理解本发明，这些实施例用于说明，但不应解释为限制本发明。
实施例1：抗CD66c嵌合抗体的制备
1.1.抗CD66c抗体的基因序列克隆
使用小鼠Ig-引物集(Millipore，目录号：69831)克隆8F5抗体基因。使用小鼠Ig-引物集对从8F5杂交瘤中分离的RNA进行PCR，并***pGem-T载体(Promega，目录号：A3600)，测序以确认DNA序列，并通过IMGT网站(www.imgt.org)鉴定小鼠抗体基因。分析的8F5抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列如下。
[表4]
1-2.嵌合抗体的产生
基于构建的抗CD66c小鼠抗体8F5的氨基酸序列，制备抗CD66c嵌合抗体。
1-2-1.质粒的产生
为了表达抗CD66c嵌合抗体，分别制备重链表达质粒和轻链表达质粒。使用POptiVEC(Invitrogen)载体作为轻链表达质粒，使用pcDNA3.3(Invitrogen)载体作为重链表达质粒。
为了将每个抗体的可变区编码cDNA和恒定区编码cDNA表达为连续的氨基酸序列而没有额外的氨基酸***，合成克隆的可变区的编码序列和已知的人IgG1恒定区(重链)和κ恒定区(轻链)编码序列(Bioneer)。用限制酶Xho I和Sal I切割合成的重链基因和轻链基因，分别将轻链基因片段连接到pOptiVec载体上并将重链基因片段连接到pcDNA3.3载体上，以构建完整的抗体表达质粒(pcDNA3.3-抗-CD66c重链表达质粒和pOptiVEC-抗-CD66c轻链表达质粒)。
1-2-2.转染
将制备的pcDNA3.3-抗-CD66c重链表达质粒和pOptiVEC-抗-CD66c轻链表达质粒转染到CHO细胞衍生的DG44细胞(Invitrogen)中。
转染前3天，使悬浮的DG44细胞适应含有5％FBS的MEMS培养基以使其转化为贴壁细胞并提高转染效率。使用ViaFect转染试剂(Promega，目录号：E4981)在6孔板上进行转染。在转染前一天，通过以1×105个细胞/孔的浓度传代培养来制备适合于贴附状态的DG44细胞。抗CD66c重链表达质粒的pcDNA3.3和抗CD66c轻链表达质粒的pOptiVEC分别以2.0μg和1.5μg并以1.0∶0.75的比例用于转染。
转染进行48小时。用流式细胞术分析转染的细胞群。如图1所示，通过A549非小细胞肺癌细胞系证实嵌合抗体的表达。图1示出了从小鼠8F5抗体克隆抗体的基因并将该基因表达为重组嵌合抗体并与CD66c抗原阳性A549细胞表面结合的结果。
实施例2：人源化抗CD66c单克隆抗体的制备
2.1通过计算机人源化选择重组抗体序列
保持与小鼠抗CD66c抗体8F5(重链氨基酸序列：SEQ ID NO：7；重链编码DNA：SEQID NO：62；轻链氨基酸序列：SEQ ID NO：8；编码轻链的DNA：SEQ ID NO：63)的重链、轻链各自的CDR(CDRH1：ASGYSFTDYTMN)SEQ ID NO：1，CDRH2：SEQ ID NO：2(LINPFHGGTVSNQRFKV)；CDRH3：SEQ ID NO：3(VRGDPVRHYYALAY)；CDRL1：SEQ ID NO：4(GASENVYGTL)；CDRL2：SEQ IDNO：5(GATNLAD)；CDRL3：SEQ ID NO：6(VATYYCQNVLSAPYT)尽可能类似，如果抗原结合亲和力相等或更高，则基于编码人抗体基因的种系序列，通过计算机方法来选择基于构架区序列的重组人源化抗体序列。与小鼠CD66c抗体8F5的重链和轻链分别最相似的用作重组人源化抗体序列骨架的人抗体种系基因如表5所示。小鼠CD66c抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列和核酸序列以及重链可变区和轻链可变区的CDR序列示于表6中。
[表5]
选择12个重链可变区和8个轻链可变区作为使用人抗体种系基因序列选择的人源化8F5抗体序列，如表3所示。所选择的人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列、CDR序列和构架序列示于表6至8中。嵌合抗体和人源化抗体的重链可变区和轻链可变区如表1所示。小鼠抗体和人源化抗体具有相同的重链CDR3和轻链CDR2的氨基酸序列。表6中的粗体和下划线部分是抗体的CDR序列。表7中的粗体和下划线部分表示修饰的氨基酸。
[表6]
/>
[表7]
[表8]
/>
2.2重组人源化抗体的表达和分析
通过分别连接人IgG1重链恒定区和κ轻链恒定区，选择的抗体的序列以人IgG1的形式在293细胞中表达。转染后7天，使用KanCap A树脂(Kaneca)纯化重组人源化抗体。
通过在OD 280nm处测量来定量纯化的抗体，并进行SDS-PAGE。通过使用SepaxZenix-C SEC-300尺寸排阻柱(Sepax Technologies)的HPLC通过以280nm和220nm分析来分析抗体的纯度和聚集(图2A至2C)。
2.3重组人源化抗体的细胞结合和抗原结合分析
2-3-1细胞结合试验
将每种表达的96重组人源化抗体倒入含有相同量(1μg)CD66c阳性A549非小细胞肺癌细胞系的试管中并在试管中于4℃下反应30分钟，用PBS洗涤，用FITC缀合的山羊抗人IgG(DiNona Inc，韩国)处理，并在4℃温育15分钟。用PBS洗涤后，用流式细胞仪(Stratedigm，S1000EXi)分析细胞，结果如下所示。
在96种重组人源化抗体候选物中，首先基于表达程度、聚集的存在和细胞结合程度选择8种(表9和表10，图3A至3E)。表9和10是初次选择的抗CD66c人源化抗体和嵌合8F5的分析结果，表10显示了流式细胞仪分析的结果。
[表9]
[表10]
表9显示了8种选择的抗体的表达程度、存在或不存在聚集以及细胞结合程度。具体地，总结了8种选择的抗体的表达水平和分子量。另外，根据表10中的流式细胞术的结果，证实8种重组人源化抗体显示出±20％的细胞结合强度，这显示出与嵌合抗体非常相似的细胞结合强度。结果，首先从96种人源化候选抗体中选择正常表达、很少由于蛋白质本身的不稳定性而形成聚集、并且对靶抗原阳性细胞的结合亲和力与嵌合抗体类似的8种抗体。
如图3所示，实际细胞结合谱与嵌合抗体相似，通过将抗体阳性率(％门控)乘以平均荧光(平均值)，并通过选择与嵌合抗体相比在20％内的人源化抗体，确定8种人源化抗体。通常，在产生人源化抗体时，当将小鼠抗体CDR区序列***人源化抗体的构架区时，由于原始蛋白质结构的改变，抗体结合亲和力急剧下降。考虑到人源化抗体的一般性质，在本发明中选择了非常好的人源化抗体。
2-3-2抗原结合试验
在8种选择的重组人源化抗体中，选择5种与嵌合抗体相比显示出高结合亲和力的重组人源化抗体，并分别通过ELISA分析它们对CD66c抗原和类似CD66抗原的结合亲和力。
[表11]
蛋白质ID HC&LC组合
3043 VK8+VH6
3058 VK8+VH11
2938 VK5+VH7
3007 Vk7+VH6
3019 Vk7+VH10
将抗原CD66c(CEACAM6；Sino Biological，Inc.)和CEACAM1抗原(SinoBiological，Inc.)以100ng/孔包被在96孔板上，然后封闭。将一抗从初始浓度10μg/ml连续稀释三倍，并在37℃下结合1小时，并将作为二抗的山羊抗人Ig-HRP缀合物(JacksonImmunoResearch)以1∶10000稀释，在37℃下孵育30分钟。在每个步骤之间进行三次洗涤，进行TMB反应，在相同量的TMB溶液(100μl)下用1N H2SO4溶液终止，然后在450nm下测量OD值。
作为实验的结果，选自96种重组人源化抗体中的5种重组人源化抗体对CD66c抗原的结合亲和力示于图4a、表12、图4b和表13中。图4a和表12示出了抗体与CECACAM6(CD66c)抗原的结合能力，图4b和表13是CEACAM1(CD66a)抗原的结果。
根据图4a、表12、图4b和表13中抗体与抗原的结合亲和力，所有抗CECACAM6抗体都显示出与抗CEACAM6嵌合抗体相似的结合谱，并且被分成不结合CEACAM1的组或弱结合CEACAM1的组。
[表12]
[表13]
2.4重组人源化抗体的稳定性分析
通过将通过与抗原和细胞结合的特征选择的实施例3.3的5种重组人源化抗体放在高温条件下，进行实验以确定抗体的稳定性。
通过使用8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS，Sigma)进行结合实验来确定稳定性。ANS是一种可以在蛋白质变性时通过测量结合于或不结合于暴露的疏水位点之间的荧光波长的变化来检测蛋白质变性的化合物。
使用PBS(磷酸盐缓冲盐水)将重组人源化抗体调节至0.2mg/ml的浓度，并在严苛条件下在50℃下放置4小时。将20μl 0.2mg/ml ANS溶液与500μl待分析的抗体稀释溶液混合以用于测量，5分钟后用荧光读取器在360nm激发和460nm发射条件下分析。此外，再在70℃的温度下放置30分钟，测量ANS试剂反应。
图5a和5b示出了在严苛温度条件下证实表11中所示的5种重组人源化抗体的抗体稳定性的结果。即，将抗体在严苛条件下在50℃下放置4小时后，并进一步在70℃下放置30分钟，通过荧光测量ANS试剂的反应性。如图5a的实验结果所示，当抗体在50℃的温度下放置4小时时，5种抗体中大多数显示出很小的ANS反应，但是当抗体另外在70℃下放置30分钟时，抗体的荧光值大大增加。其中，蛋白质ID为3058的重组抗体荧光值增加最小，并因此在温度变化方面在五种重组人源化抗体中表现出最稳定的性质。
为了测量ANS试剂反应性的变化率，将抗体放置在冷藏条件(4±2℃)和62℃的温度下4小时后，用荧光读数器以与上述相同的方式分析ANS试剂反应性。抗ANS试剂的抗体的荧光值变化性可以通过获得在低温条件(例如，4℃)下测量的荧光值与在高温条件下(例如，62℃)测量的荧光值之间的差并除以在低温条件下测量的荧光值来确定。
[数学等式]
荧光值变化性＝(在高温条件下测量的荧光值-在低温条件下测量的荧光值)/(在低温条件下测量的荧光值)
如图5b所示，在从温度(50℃)稍微升高到62℃的温度下使反应进行4小时，然后确认ANS试剂的反应性。5种重组人源化抗体和嵌合抗体在冷藏条件下几乎没有ANS反应，但随温度升高而增加。然而，通过将温度条件保持在62℃，嵌合8F5抗体显示ANS试剂的反应性增加至1406％，沉淀物发生而变得不稳定。然而，五种人源化抗体显示出比嵌合抗体显著更低的ANS试剂反应性的变化性，并且没有产生沉淀物。特别是，人源化抗体蛋白ID 3019和蛋白ID 3058具有的ANS试剂反应性的变化性分别为114％和133％，因此被认为是最稳定的抗体。ANS试剂反应性增加的含义是指位于蛋白质结构内的疏水性氨基酸的暴露增加，疏水性氨基酸负责蛋白质结构的变性并且所得蛋白质聚集体即沉淀物形成。根据本发明的人源化抗体被认为是ANS反应性变化率小于200％的稳定抗体。ANS反应性变化小于200％的变化率被认为是非常低的，并且超过该值，则认为蛋白质结构更显著变化并观察到ANS的反应性。因此，根据本发明的人源化抗体具有与嵌合抗体相似的抗原结合和细胞结合能力以及抗体蛋白本身的增加的物理稳定性，这些事实对于治疗性抗体的可药性是非常优异的特征。
2.5 CHO细胞表达和重组人源化抗体的分析
在实施例2.3中选择的5种重组人源化抗体在用于表达大多数治疗性抗体的CHO细胞中表达并对所述5种重组人源化抗体进行分析。将构建所选择的5种重组人源化抗体的轻链可变区DNA序列和重链可变区DNA序列进行密码子优化，合成，并通过重叠PCR方法与人IgG1恒定区基因连接。用XhoI和EcoRI切割产物，并连接到pcDNA3.4载体(LifeTechnology)中。表11示出了选择用于CHO细胞表达的人源化抗体的轻链和重链组合。
用于可变区和恒定区基因的PCR的DNA引物序列示于下表14中。
[表14]
使用ExpiCHO(商标)表达***试剂盒(ThermoFisher，目录号A29133)瞬时转染5种重组人源化抗体，将表达的抗体与CD66c阳性A549非小细胞肺癌细胞系一起培养，并用流式细胞仪分析，如图6a至6c所示。所有五种重组人源化抗体显示出与嵌合抗体相似的结合亲和力。将测量的流式细胞仪的荧光值除以CHO培养基的抗体表达量，以获得抗体与抗体表达量的相对结合亲和力，如图6d所示。因此，证实重组人源化抗体在CHO细胞中正确表达。抗体与细胞表面的结合亲和力确定为100％，相对变化示于图6d中。
实施例3：嵌合8F5抗体导致T细胞活性和癌细胞死亡
3.1.在CD8+T细胞和癌细胞LS174T的共培养后，T细胞活性细胞因子分析和癌细胞 活力分析
使用MagniSort(注册商标)人CD8+T细胞富集试剂盒(Ebioscience，目录号：8804-6812-74)从人血细胞中分离CD8+T细胞。将1×106个CD8+T细胞和2×105个LS174T结肠直肠癌细胞放入6孔板的每个孔中，并向每个孔中添加10％FBS/RPMI培养基，使其最终体积为每孔2ml并培养。此时，将嵌合8F5抗体处理为20μg/ml。在培养后第3天和第5天，取每种培养上清液100μl，用人CD8+T细胞磁珠板(Millipore，目录号：HCD8MAG-15K)试剂盒测量培养上清液的IFN-γ和穿孔素的分泌量。温育7天后，分离结肠直肠癌细胞LS174T并用7-AAD染色，并通过流式细胞仪测量细胞活力。图7a示出了当在共培养LS174T细胞和人CD8+T细胞的条件下处理嵌合8F5抗体时，活化的CD8+T细胞分泌IFN-γ和穿孔素的结果。图7b示出了在与图7a相同的条件下，用嵌合8F5抗体处理后结肠直肠癌细胞LS174T的细胞死亡增加。
如图7a的图所示，当在共培养LS174T细胞和人CD8+T细胞的条件下处理嵌合8F5抗体时，活化的CD8+T细胞增加IFN-γ和穿孔素的分泌并且LS174T的细胞死亡增加。
3.2.CD8+T细胞和各种癌细胞共培养后的T细胞活性的分析
如实施例3.1中那样分离CD8+T细胞，并且在与各种癌细胞的共培养条件下，通过ELISPOT方法通过嵌合8F5抗体确认T细胞活性。用人IFNγELISPOT Ready-SET-Go！(Ebioscience；目录号：88-7386-21)分析IFN-γ。分别向每个孔中加入含有2.5×104个CD8+T细胞和5×103个癌细胞的每孔100μl的体积，将细胞培养3天，然后根据试剂盒中描述的方法来检测表达IFNγ的细胞斑点。
图8示出了只有在共培养CD8+T细胞和各种癌细胞如NCI-N87、SNU-719或PLC/PRF/5细胞的条件下处理嵌合8F5抗体时，IFN-γ分泌才选择性地增加。
如图8所示，只有在共培养CD8+T细胞和各种癌细胞的条件下处理嵌合8F5抗体时，IFN-γ分泌才被选择性地增加。
实施例4：CD66c抗原抑制T细胞活性
为了确认8F5抗体的T细胞活性是否归因于作为8F5抗体的抗原CD66c抗原，当人CD8+T细胞和癌细胞共培养时，我们检查了人PBMC活化是否被CD66c抗原抑制。
具体地，使用细胞内IFN-γ(内皮细胞染色)染色和ELISPOT测定来测量T细胞活化状态。
以1μg/ml处理OKT3抗体，以10μg/ml使用CD66c抗原。
为了染色T细胞内的IFN-γ，将布雷菲德菌素A溶液(1000倍)(EBioscience，目录号：00-4506-51)稀释1倍并预处理3小时，然后染色，用抗人IFNγPE(EBioscience，目录号：12-7319-41)和FITC小鼠抗人TCR-α/β(BD Biosciences；目录号：347773)染色，并用流式细胞术分析。
图9a至9c示出了CD66c抗原可以抑制T细胞活性。图9a示出了用流式细胞仪测量作为T细胞活性因子的IFN-γ的细胞内水平的结果，图9c是通过ELISPOT测量IFN-γ分泌的结果。在图9b和9c中，当使用不同来源的CD66c抗原时，T细胞活性被类似地抑制。
如图9a所示，当共处理CD66c抗原时，IFN-γ阳性T细胞从15.55％降低至8.87％，从而抑制CD66抗原对T细胞的活性。
根据实施例3.2的相同方法通过ELISPOT进一步证实人PBMC中IFN-γ产生的增加或抑制，以10μg/ml施用由DINONA公司内部生产以及外部购买(Sino BiologicalInc.，目录号10823-H08H-50)的两种CD66c抗原。在两个实验中，用CD66c抗原处理的两个病例显示IFN-γ阳性斑点的数量显著减少(图9b和9c)。
实施例5：嵌合8F5抗体诱导T细胞活化
5.1.T细胞活化增加
为了确定嵌合8F5抗体对OKT3抗体活化T细胞的影响，在以0.3mg/ml的浓度固定OKT3抗体的条件下，将2×106个人PBMC细胞置于35-mm培养皿中培养3天。此时，将嵌合8F5抗体处理为20μg/ml浓度。3天后，将CD4+T细胞和CD8+T细胞用抗人CD69PE(Ebioscience，目录号：12-0699-41)、抗人CD107a(LAMP-1)PE(Ebioscience，目录号：12-1079-41)和抗人CD25APC(Ebioscience，目录号：17-0259-41)染色。用DINONA公司(韩国)制造的试剂染色抗CD4-APC和抗CD8-FITC，在流式细胞仪上对CD4和CD8阳性组各自进行门控。图10a和10b是示出在附着的OKT3抗体活化T细胞的条件下嵌合8F5抗体增加T细胞活化并增加各种活化的细胞表面标志蛋白如CD69、CD107、CD25等的结果。
如图10a所示，当将嵌合8F5抗体施用于CD4和CD8阳性细胞时，T细胞活化的CD69标记的阳性率增加。如图10b所示，CD8阳性细胞中T细胞活化的CD107和CD25标记的阳性率增加。在这些T细胞活化条件下由嵌合8F5抗体引起的T细胞活化增加的结果表明，实施例3的结果反映为T细胞自身活化的结果。如实施例4中所述，CD66c抗原引起的T细胞活性抑制可以通过抗CD66c抗体恢复，从而维持或增强T细胞活性，从而使得癌细胞死亡。
5.2.MLR中T细胞活化增加
进行MLR(混合淋巴细胞反应)实验以通过嵌合8F5抗体的处理进一步证实T细胞活化。首先，分离人PBMC，并且用IL-4(5×103个单位/ml，JWCreagene)和GM-CSF(5×103个单位/ml，JWCreagene)仅对贴附的PBMC处理两次，每次间隔3天，以分化为树突状细胞。然后，以5∶1的PBMC与DC混合比将DC与其他人的PBMC混合，并培养5天。在12孔板的情况下每孔中PBMC细胞的个数为1.4×106个细胞。5天后，分离细胞并用CD4-FITC/CD107-PE/CD25-APC或CD8-FITC/CD107-PE/CD25-APC染色，并通过流式细胞仪分析。图11a和11b示出了在混合来自不同来源的树突细胞和PBMC的MLR(混合淋巴细胞反应)条件下嵌合8F5抗体活化CD4和CD8阳性细胞。
如图11a和11b所示，即使在MLR条件下，通过施用嵌合8F5抗体，CD4和CD8阳性细胞中CD107和CD25的阳性率显著增加。
结果显示在OKT3引起的T细胞活化和同种异体免疫细胞引起的T细胞活化的两种情况下，嵌合8F5抗体本身可以增加T细胞活化，从而嵌合8F5抗体导致T细胞杀伤癌细胞。
实施例6：通过嵌合8F5抗体在患有胃癌的患者中活化PBMC
为了评估在PBMC与胃癌细胞共培养中嵌合8F5抗体引起的PBMC活化，所述癌细胞从实际胃癌患者的腹水中分离但不从实验室中培养的癌细胞系中分离，测试当施用嵌合8F5抗体时免疫细胞的活化。胃癌患者的腹水样品得自韩国首尔峨山医疗中心，并且从腹水样品确认了CD66c阳性的胃癌细胞的同一患者的血液样品中分离PBMC，然后将该PBMC如实施例3.2中的方法用ELISPOT进行测试。
图12a示出了当在从患有胃癌的患者的腹水中分离的人胃癌细胞与人PBMC共培养的条件下处理嵌合8F5抗体时，IFN-γ分泌增加的ELISPOT分析结果。图12b和12c示出了对CD66c抗原阳性胃癌患者进行额外ELISPOT实验的类似结果。
当施用嵌合8F5抗体时，IFN-γ阳性斑点增加到类似于作为T细胞活化抗体阳性对照而施用的OKT抗体的水平(图12a)。该结果表明嵌合8F5抗体的处理已诱导了自身免疫细胞的活化。
另外从不同胃癌患者的腹水中分离CD66c阳性胃癌细胞，与从正常人血液中分离的PBMC混合，并以与实施例3.2相同的方式进行ELISPOT试验。如图12b所示，用嵌合8F5抗体处理后IFN-γ阳性增加，尽管程度有些不同。
实施例7：嵌合8F5抗体导致PD-L1表达水平增加
共培养癌细胞和PBMC以评估嵌合8F5导致PD-L1表达增加。
为了分析在PBMC与LS-174-T(结肠直肠癌细胞系)、NCI-N87(胃癌细胞系)或A549(非小细胞肺癌细胞系)共培养物中嵌合8F5抗体导致的免疫检查点相关蛋白的变化，观察细胞表面的PD-L1。将每种癌细胞与PBMC以1∶3的比例(每孔：0.5×106个细胞：1.5×106个细胞)在6孔板中混合，并在20μg/ml抗体处理下温育24小时。癌细胞和PBMC细胞表面上的PD-L1用抗人CD274(PD-L1，B7-H1)和PE(Ebioscience，目录号：12-5983-41)染色，并用CD45-FITC(DINONA公司)同时染色，以便区分癌细胞和PBMC细胞。
图13a描述了当共培养人PBMC和A549非小细胞肺癌细胞时，PBMC和A549癌细胞的每个细胞表面上PD-L1抗原增加的结果。图13b描述了在A549、NCI-N87和LS-174-T细胞系的表面上PD-L1抗原表达增加。
如图13a和13b所示，通过施用嵌合8F5抗体，在癌细胞和PBMC中PD-L1细胞表面水平均增加。这间接证明了嵌合8F5抗体对免疫细胞的活化，表明将来可能与PD-1/PD-L1的抑制剂进行共同治疗。
实施例8：人源化8F5抗体导致PBMC活化
测试了在癌细胞和PBMC的共培养物中人源化8F5抗体导致PBMC活化。即，选择如表11所示确定的5种人源化8F5抗体，并如实施例3.2进行ELISPOT试验。A549非小细胞肺癌细胞系(肺腺癌细胞系)用于共培养的癌细胞，施用的抗体的浓度为20μg/ml。三天后，鉴定出IFN-γ阳性斑点，发现如图14所示测试的所有五种人源化8F5抗体使IFN-γ阳性斑点增加至与嵌合8F5抗体相同的水平。因此，证实人源化8F5抗体与嵌合8F5抗体的功能非常相似。
图14a和14b示出了重组人源化抗体通过以类似于嵌合8F5抗体的模式增加人PBMC与A549癌细胞的共培养物中的IFN-γ分泌而具有相似程度的抗体功能。
实施例9：人源化8F5抗体导致的癌细胞死亡
9-1：癌细胞和CD3+T细胞的共培养
评估在癌细胞和CD3+T细胞共培养时人源化8F5抗体导致的癌细胞的凋亡。当细胞与LS-174-T细胞、结肠癌细胞系和人CD3阳性T细胞共培养时，体外证实癌细胞是否被活化的T细胞杀伤。
具体而言，在96孔板中以每孔100μl的体积将癌细胞和T细胞(或PBMC)以1×104个细胞：1×105个细胞的比例共培养，并用10μg/ml的抗体处理。3天后，通过Ez-Cytox(DaeilBiotech，EZ-1000)测定试剂盒来测量癌细胞的细胞死亡程度。使用的抗体是人源化8F5抗体(蛋白ID：3019(表11，E3)，PD-1(帕博利珠单抗相同序列抗体)、PD-L1(阿特珠单抗相同序列抗体)、CEACAM6(具有与拜耳的抗CEACAM6抗体相同的序列的抗体)。图15a是细胞死亡实验的结果，根据本发明的人源化8F5抗体显示出最高的癌细胞死亡效果。
9-2：癌细胞和PBMC的共培养
评估了在癌细胞和PBMC共培养中人源化8F5(蛋白ID：3019)抗体导致的癌细胞凋亡。
具体地，以与实施例9-1基本相同的方式进行评价，不同之处在于使用A549(肺腺癌细胞系)细胞系和两种不同的PBMC(供体1、供体2)，而不是共培养结肠癌细胞系的LS-174-T细胞和人CD3阳性T细胞的条件。如图15b的实验结果所示，用人源化8F5抗体(蛋白质ID：3019；E3，IgG1)处理的孔中的癌细胞在两种类型的PBMC条件下显示出最高的癌细胞死亡效果(图15b)。
实施例10：使用小鼠动物模型评估抗癌功效
10-1：使用NOD/SCID小鼠模型评估嵌合8F5抗体的抗癌功效
为了证实嵌合8F5抗体的体内抗癌作用，使用免疫缺陷小鼠NOD/SCID小鼠。在专利(US 10-1214177；US：8404812)中，通过使用裸鼠评估抗癌作用。然而，在使用裸鼠的动物试验组中，显示抗癌作用的免疫细胞是作为效应细胞的小鼠免疫细胞，而不是人免疫细胞。因此，在证明候选抗体可以在实际的人体中表现出治疗功效的方面存在限制。因此，为了通过实质性人免疫细胞在动物试验中评估抗体针对癌细胞死亡的抗癌作用，将缺乏包括小鼠T细胞的免疫细胞的NOD/SCID小鼠用于动物实验。
在施用癌细胞和人PBMC的前一天施用Asialo GM1抗体以消耗小鼠自然杀伤(NK)细胞。第二天，将癌细胞和PBMC注射到小鼠体内。每只小鼠以5×106个细胞皮下注射结肠癌细胞LS-174-T细胞，并以1×107个细胞腹膜内注射PBMC。注射细胞4天后，以10mg/kg的剂量静脉内注射抗体，然后观察并测量皮下注射癌细胞的肿瘤质量。
图16a使用LS-174-T细胞作为结肠癌细胞，图16b使用作为非小细胞肺癌细胞用于NOD-SCID小鼠移植模型的A549细胞以及嵌合8F5抗体。
图16a示出了在人PBMC用嵌合8F5抗体注射的人源化条件下使用小鼠动物模型的体内抗癌功效的结果。嵌合8F5抗体处理组显示出肿瘤生长抑制(TGI)最高，而PBMC供体没有个体差异。
在第一实验组中，抗癌作用为40％。第二实验组显示抗癌作用为46％。图16a示出了使用结肠癌细胞LS-174-T细胞的移植模型，图16b示出了使用非小细胞肺癌细胞A549细胞的移植模型。在两种情况下，嵌合8F5抗体处理组显示出最高的抗癌作用。通过PD-1抗体(具有与纳武单抗相同的序列的抗体)施用的组具有很小的抗癌作用或没有抗癌作用，表明癌细胞表面上的PD-L1抗原表达非常弱，因此不能响应。
结果，证实8F5嵌合抗体可以在体内人免疫细胞移植的结肠直肠癌和肺癌动物模型中诱导抗癌作用。
10-2：使用NOD/SCID小鼠LS-174-T模型评估人源化8F5抗体的抗癌功效
使用动物模型以与实施例10-1基本相同的方式评价抗癌功效，除了使用LS-174-T细胞作为结肠癌细胞以及使用人源化8F5抗体(蛋白ID：3019，表11)的NOD-SCID小鼠移植模型以外。实验结果如图16c所示。
在实验组中也证实了相同类型的抗癌作用，在实验组中将人源化8F5抗体(蛋白ID：3019)施用于在结肠癌细胞LS-174-T细胞系移植模型中的相同NOD-SCID小鼠(图16c)。
10-3：使用NSG小鼠LS-174-T模型评估人源化8F5抗体的抗癌功效
使用具有比实施例10-1和10-2中使用的NOD/SCID小鼠更严重的免疫缺陷的NSG小鼠进行动物实验。NSG小鼠是通过诱导NOD/SCID小鼠中IL2受体γ(IL2Rγ)基因的突变，使得NOD/SCID小鼠中保留的NK细胞活性被完全去除，从而完全去除略微保留的小鼠免疫细胞并用于评估仅人源免疫细胞的作用的小鼠。
使用结肠癌细胞LS-174-T细胞、人源化8F5抗体(蛋白ID：3019，表11)、拜耳的CEACAM6抗体和默克的默克的CEACAM1抗体的NSG小鼠移植模型。图16d和16g示出了通过使用不同的人PBMC作为NSG免疫缺陷小鼠中的效应细胞的人源化8F5抗体的体内抗癌效果。
施用于NSG小鼠LS-174-T模型的抗体是人源化8F5抗体(蛋白ID：3019)、拜耳的CEACAM6抗体和默克的CEACAM1抗体，并比较它们的抗癌作用。当与具有与人源化8F5抗体相似靶标的其他抗体相比时，人源化8F5抗体显示出最优异的抗癌作用。
图16d示出了五种不同的人PBMC用作效应细胞的实验结果的平均值。与对照组相比，用人源化8F5抗体(蛋白ID：3019)施用的组显示出最高的对肿瘤生长的抑制作用。图16e至16g是显示当在实验中用来自三名不同的人(3人)的PBMC注射时每个人的每种抗体的抗癌作用的图。用人源化8F5抗体(蛋白质ID：3019；P+E3)施用的组显示在三个不同的PBMC处理组中的最高的抗癌作用，并且在另外两个实验组中证实了类似的结果。
(翻译文本)
基于原始保藏的接收证明
收件人：泰华公司
韩国全北益山市金马面东古都里253-6番地
(邮编)570-912
上述翻译文本与原文没有相违之处

Claims (13)

1.一种抗CD66c(分化簇66c)抗体或其抗原结合片段，包括以下互补决定区(CDR)：
(1)CDR-H1，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列构成，
CDR-H2，由SEQ ID NO:2的氨基酸序列构成，
CDR-H3，由SEQ ID NO:3的氨基酸序列构成，
CDR-L1，由SEQ ID NO:12的氨基酸序列构成，
CDR-L2，由SEQ ID NO:5的氨基酸序列构成，以及
CDR-L3，由SEQ ID NO 13的氨基酸序列构成；
(2)CDR-H1，由SEQ ID NO:9的氨基酸序列构成，
CDR-H2，由SEQ ID NO:10的氨基酸序列构成，
CDR-H3，由SEQ ID NO:3的氨基酸序列构成，
CDR-L1，由SEQ ID NO:12的氨基酸序列构成，
CDR-L2，由SEQ ID NO:5的氨基酸序列构成，以及
CDR-L3，由SEQ ID NO 13的氨基酸序列构成；
(3)CDR-H1，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列构成，
CDR-H2，由SEQ ID NO:2的氨基酸序列构成，
CDR-H3，由SEQ ID NO:3的氨基酸序列构成，
CDR-L1，由SEQ ID NO:11的氨基酸序列构成，
CDR-L2，由SEQ ID NO:5的氨基酸序列构成，以及
CDR-L3，由SEQ ID NO 13的氨基酸序列构成；
或者
(4)CDR-H1，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列构成，
CDR-H2，由SEQ ID NO:2的氨基酸序列构成，
CDR-H3，由SEQ ID NO:3的氨基酸序列构成，
CDR-L1，由SEQ ID NO:4的氨基酸序列构成，
CDR-L2，由SEQ ID NO:5的氨基酸序列构成，以及
CDR-L3，由SEQ ID NO 13的氨基酸序列构成。
2.根据权利要求1所述的抗CD66c抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的重链可变区包含选自由包含SEQ ID NO:23、24、25、26或27的氨基酸序列的构架序列(V-FR1)、包含SEQ ID NO:33、34、35、36或37的氨基酸序列的构架序列(V-FR2)、包含SEQ ID NO:43、44、45、46或47的氨基酸序列的构架序列(V-FR3)和包含SEQ ID NO:53、54、55、56或57的氨基酸序列的构架序列(V-FR4)组成的组中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的抗CD66c抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的轻链可变区包含选自由包含SEQ ID NO:29、30或31的氨基酸序列的构架序列(L-FR1)、包含SEQ IDNO:39、40或41的氨基酸序列的构架序列(L-FR2)、包含SEQ ID NO:49、50或51的氨基酸序列的构架序列(L-FR3)、包含SEQ ID NO:59、60或61的氨基酸序列的构架序列(L-FR4)组成的组中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的抗CD66c抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:14、15、16、17或18的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:19、20或21的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗CD66c抗体或其抗原结合片段，其中，由ANS结合引起的荧光变化率在62℃下小于200％。
6.根据权利要求1所述的抗CD66c抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段是抗CD40抗体的scFv、(scFv)2、Fab、Fab'或F(ab')2。
7.一种用于预防或治疗选自癌症和癌症转移的疾病的药物组合物，包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗CD66c抗体或其抗原结合片段。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述癌症是CD66c阳性实体癌。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述实体癌是CD66c阳性的肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌或***癌。
10.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述组合物还包含PD-1或PD-L1结合抑制剂。
11.一种核酸分子，编码权利要求1所述的抗CD66c抗体或其抗原结合片段。
12.一种重组载体，包含根据权利要求11所述的核酸分子。
13.一种重组细胞，包含根据权利要求12的重组载体。
CN201780070516.5A 2016-11-14 2017-11-14 特异性结合CD66c的抗体及其用途 Active CN110382533B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20160151359 2016-11-14
KR10-2016-0151359 2016-11-14
PCT/KR2017/012891 WO2018088877A2 (ko) 2016-11-14 2017-11-14 CD66c에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110382533A CN110382533A (zh) 2019-10-25
CN110382533B true CN110382533B (zh) 2023-09-22

Family

ID=62110206

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780070516.5A Active CN110382533B (zh) 2016-11-14 2017-11-14 特异性结合CD66c的抗体及其用途

Country Status (13)

Country Link
US (1) US11220543B2 (zh)
EP (1) EP3560957A4 (zh)
JP (2) JP2019535319A (zh)
KR (1) KR102019032B1 (zh)
CN (1) CN110382533B (zh)
AU (1) AU2017358359B2 (zh)
BR (1) BR112019009771A2 (zh)
CA (1) CA3043691C (zh)
IL (1) IL266516B (zh)
MX (1) MX2019005491A (zh)
PH (1) PH12019501050A1 (zh)
SG (1) SG11201903800XA (zh)
WO (1) WO2018088877A2 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT3274370T (lt) 2015-03-23 2020-02-10 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antikūnai prieš ceacam6 ir jų panaudojimas
KR102373502B1 (ko) * 2018-05-14 2022-03-11 주식회사 금호에이치티 골수유래억제세포 관련 질환의 예방 및 치료 용도
WO2019221574A1 (ko) * 2018-05-14 2019-11-21 다이노나(주) 골수유래억제세포 관련 질환의 예방 및 치료 용도
BR112021007448A2 (pt) * 2018-11-14 2021-10-26 Bayer Aktiengesellschaft Combinação farmacêutica de anticorpos anti-ceacam6 e anti-pd-1 ou anti-pd-l1 para o tratamento de câncer
KR102027248B1 (ko) * 2018-12-14 2019-10-01 건양대학교 산학협력단 유방암 줄기세포 검출용 바이오마커 및 이의 용도
CN112521509B (zh) * 2020-12-23 2022-07-08 姚雪英 一种抗ceacam5人源化抗体、其缀合物及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110098593A (ko) * 2010-02-26 2011-09-01 다이노나(주) ＣＤ66ｃ의 폐선암 특이적 에피토프 및 이를 인식하는 항체
US20140099254A1 (en) * 2012-08-14 2014-04-10 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
WO2016150899A2 (en) * 2015-03-23 2016-09-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Anti-ceacam6 antibodies and uses thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2561073C (en) 2004-03-27 2014-01-14 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Composition and method for cancer treatment
US8883162B2 (en) * 2005-10-19 2014-11-11 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antibody complexes targeting IGF-1R show potent toxicity against solid tumors
US8748356B2 (en) * 2007-10-19 2014-06-10 Janssen Biotech, Inc. Methods for use in human-adapting monoclonal antibodies
US8404812B2 (en) 2010-02-26 2013-03-26 Dinona Inc. Epitope of CD66C specific to lung adenocarcinoma and antibody recognizing the same
MX361929B (es) * 2010-11-19 2018-12-19 Eisai R&D Man Co Ltd Star Anticuerpos anti-ligando de quimiocina cc 20 (ccl20) neutralizantes.
US9856320B2 (en) 2012-05-15 2018-01-02 Bristol-Myers Squibb Company Cancer immunotherapy by disrupting PD-1/PD-L1 signaling
CN105744955B (zh) 2013-11-25 2020-03-20 希凯姆生物治疗有限公司 用于癌症治疗的包含抗ceacam1抗体和抗pd抗体的组合物
KR101710936B1 (ko) 2014-09-12 2017-02-28 전영권 태양전지 및 그 제조방법
KR101783907B1 (ko) * 2016-03-15 2017-10-10 다이노나(주) ＣＤ66ｃ에 대한 항체와 화학치료제를 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학조성물
WO2017209318A1 (ko) 2016-05-30 2017-12-07 다이노나(주) 탄산탈수소화 효소에 결합하는 항체 및 이의 용도

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110098593A (ko) * 2010-02-26 2011-09-01 다이노나(주) ＣＤ66ｃ의 폐선암 특이적 에피토프 및 이를 인식하는 항체
US20140099254A1 (en) * 2012-08-14 2014-04-10 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
WO2016150899A2 (en) * 2015-03-23 2016-09-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Anti-ceacam6 antibodies and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017358359A1 (en) 2019-05-30
WO2018088877A3 (ko) 2018-10-04
BR112019009771A2 (pt) 2019-09-17
CN110382533A (zh) 2019-10-25
KR102019032B1 (ko) 2019-09-06
SG11201903800XA (en) 2019-05-30
US20190263905A1 (en) 2019-08-29
WO2018088877A9 (ko) 2018-11-08
US11220543B2 (en) 2022-01-11
CA3043691C (en) 2022-11-29
KR20180054492A (ko) 2018-05-24
EP3560957A2 (en) 2019-10-30
MX2019005491A (es) 2019-08-12
IL266516B (en) 2021-12-01
WO2018088877A2 (ko) 2018-05-17
EP3560957A4 (en) 2020-10-21
IL266516A (en) 2019-08-29
PH12019501050A1 (en) 2019-12-11
JP2021177770A (ja) 2021-11-18
CA3043691A1 (en) 2018-05-17
JP2019535319A (ja) 2019-12-12
AU2017358359B2 (en) 2021-04-01
JP7450585B2 (ja) 2024-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110382533B (zh) 特异性结合CD66c的抗体及其用途
JP6063494B2 (ja) 抗体及びその用途
US9409994B2 (en) High-affinity monoclonal antibodies to glypican-3 and use thereof
KR20190112040A (ko) Cd47 항원 결합 유닛 및 그것의 사용
CA2669731A1 (en) Anti-human dlk-1 antibody showing anti-tumor activity in vivo
JP2021507877A (ja) Ｃｄ１３７リガンドを抗ｃｄ１３７抗体を用いた治療向けのバイオマーカーとして使用するための方法
JP2020125352A (ja) 抗−ｃｄ４３抗体およびその癌治療用途
KR102107963B1 (ko) 탄산탈수소 효소에 결합하는 항체 및 이의 용도
AU2019268959B2 (en) Use for preventing and treating myeloid-derived suppressor cell-related diseases
US20190194319A1 (en) Anti-ascl1 antibodies and methods of use
WO2022247905A1 (zh) 抗cd40抗体及其用途
WO2022002887A1 (en) Humanized antibodies against lewis y
WO2019221574A1 (ko) 골수유래억제세포 관련 질환의 예방 및 치료 용도
TW201910350A (zh) 特異性結合至ｐａｕｆ蛋白質的抗體及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220401

Address after: Kwangju, South Korea

Applicant after: Jinhu HT Co.,Ltd.

Address before: Special city, Seoul, Korea

Applicant before: Taihua Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant