CN110382404B - 纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及包括来源于等离子体的纳米颗粒在内的纳米颗粒，及其在缀合物形成中的用途。纳米颗粒可与多种第二物质稳定缀合，形成例如可用于治疗、诊断和实验方法中的缀合物。

Description

纳米颗粒
相关申请案
本申请要求2016年12月21日提交的澳大利亚临时专利申请No2016905306的优先权，所述专利申请的内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
本申请涉及纳米颗粒，包括来源于等离子体的纳米颗粒，及其在缀合物形成中的用途。
发明背景
能够在同一结构中传递多种分子货物的多功能纳米载体预期能大大提高在多种疾病中的治疗和诊断结果。然而，目前基于纳米颗粒的治疗和诊断仍利用本身并非生物活性而且经论证不允许与药剂发生直接且简单缀合的材料。纳米颗粒(例如，金、氧化铁、聚合物、量子点等)的功能通常是复杂的，而且通常依赖于耗时的多步骤方案来实现纳米载体表面与相关货物之间的牢固缀合。
尽管纳米医学研究近期快速发展，但仍需要具有改善的性能、功能并且对患者安全的能够传递新药物的新的纳米制造策略。例如，在人体药物传递领域中，目前商业上批准的药物纳米载体是基于被动靶向的概念。在被动靶向中，载剂依赖于其小尺寸渗透病理部位(诸如肿瘤或发炎区域)的异常渗漏血管。尽管这些纳米颗粒药物***有时增强治疗效果，但与其它治疗替代方案相比，在药物的生物分布和部位累积方面仍存在缺陷。药物副作用减少和耐受剂量增加的期望尚未实现。就此而言，已付出相当大的努力来研发在耐受剂量增加的情形下可能提供主动靶向和选择性传递的纳米载体平台。
为了在多种治疗应用中实现特异性的靶向传递，纳米颗粒可由识别且结合至在靶细胞上表现的特异性表面标记的不同靶配体来功能化。多因性疾病(诸如癌症)中不同信号通路的复杂性为研究可规避耐治疗现象的基于多药物抑制剂的疗法开辟了道路。重要的是，当在同一纳米载体内或同一纳米载体上合并不同药物时，多药物方法的功效得以增强。此外，也希望借助于医学成像在治疗期间对纳米颗粒***实现良好的控制和监测，意味着对于纳米颗粒而言有利的是也合并有适当的显像剂。因此，强烈要求研发具有实现不同功能定制混合的能力的多功能纳米颗粒，将靶向治疗、诊断和成像整合在同一纳米结构中。然而，在同一纳米载体上结合多种分子货物的能力在本领域中尤为遥不可及。
另外，治疗上传递核酸(包括DNA、mRNA和siRNA)来调节疾病中的异常蛋白表达具有很大的发展空间。这种方法在体外已展示出大有前途，但在临床上尚未充分转化，即用于体内程序中。在全身施用时，这些分子尤其存在几项缺点：在血液中高度不稳定；被肾脏和肝脏滤出；而且其高度带电状态妨碍在细胞膜之间的迅速传输。此外，一旦穿过细胞膜，mRNA和siRNA需要逃离核内体以到达细胞质来获得活性，而DNA需要进入细胞核。纳米颗粒平台，包括脂质体纳米颗粒已用于促进传递，中间获得了成功，但这又受到毒性和在细胞中长期留存问题的阻碍。具备运载这类货物穿过细胞膜，优选以靶向方式运载至细胞质或细胞核的能力的纳米颗粒平台将代表了此领域的一项重大进步。
具有能够提供稳固化学缀合位点的表面的纳米颗粒将成为此领域的一项重大突破。在目前的平台中，在单一构筑体中在纳米颗粒上合并多种功能的限制之一在于纳米颗粒的实际表面化学性质。为实现对纳米载体的不同功能的良好控制，通过化学键连接优于较弱的非共价策略。为了克服这一难点，许多商业平台常采用的策略是将纳米颗粒与聚合物接枝，诸如聚(乙二醇)(PEG)。然而，这些涂布和功能化策略涉及多步骤、耗时而且复杂的方案，所述方案常涉及到存在安全或处理困难的溶剂。此外，通过这些缀合方法通常难以实现最优化、再现以及对PEG的表面浓度和厚度的控制。涂层配体的末端基团通常也限制了可固定的生物分子的范围。其它缀合策略涉及到通过自组装方法使分子与纳米颗粒材料预缀合。然而，这些后来提到的方法也依赖于使用有机溶剂和多个纯化步骤，这使分子货物的天然构象和功能受损。使用多个合成步骤也可减少功能化纳米颗粒的最终产量。
因此，需要一种改良的方法用于生产经过活化以供与治疗和/或显像部分缀合的纳米颗粒。理想的是，活化的纳米颗粒应能够使用诸如用包含生物分子的溶液直接培育的简单方法，由多个功能性分子来功能化。
本说明书中包括的关于文献、动作、材料、装置、物品等的任何论述都并非视为承认任何或所有这些事项构成现有技术的部分基础或是本领域中与本公开相关的公知常识，如同在本申请的每项权利要求的优先权日之前已存在的一样。
发明概要
第一方面，本文中公开一种纳米颗粒聚合物，其特征在于具备一个或多个以下特点：
●以约3470G至约3520G范围为中心和/或对应于约2.001至约2.005范围内的g因子的宽电子顺磁共振峰；
●在合成后约0小时至约2小时内，通过电子顺磁共振测量的自旋密度在约1019至约1015转/cm3范围内。
●在合成后约0小时至约240小时内，通过电子顺磁共振测量的自旋密度在约1017至约1015转/cm3范围内。
●在红外光谱中以下列范围为中心的一个或多个吸收带：
□约3680至约2700cm-1范围内；
□约1800至约1200cm-1范围内；
□约2330至约2020cm-1范围内；
□约1200至约1010cm-1范围内；和/或
□约1010至约700cm-1范围内；
●在红外光谱中以下列范围为中心的一个或多个吸收带：
□约3600至3100cm-1范围内；和/或
□约3100至2700cm-1范围内；
●ζ-电位在约-100mV至约+100mV范围内；
●在约2至约10的pH范围内的溶液中测量，ζ-电位在约-80mV至约+80mV范围内；或
●氮：碳元素比为约0.01:1至约2:3。
第二方面，本文中公开一种聚集体，其包含两种或更多种第一方面中的纳米颗粒聚合物。
第三方面，本文中公开一种缀合物，其包含：
●第一方面中的纳米颗粒聚合物，或第二方面中的聚集体；和
●至少一种第二物质。
第四方面，本文中公开一种药物组合物，所述药物组合物包含第一方面中的纳米颗粒聚合物、第二方面中的聚集体或第三方面中的缀合物以及药学上可接受的载剂、赋形剂或粘合剂。
第五方面，本文中公开一种衬底，其包含第一方面中的纳米颗粒聚合物、第二方面中的聚集体或第三方面中的缀合物。
第六方面，本文中公开：
●第一方面中的纳米颗粒聚合物；
●第二方面中的聚集体；或
●它们的混合物，
在缀合物形成中的用途。
第七方面，本文中公开一种制备纳米颗粒聚合物或聚集体的方法，所述方法包括：
i)在反应室中提供至少一种气体；
ii)向第一电极供电以在所述反应室中产生等离子体；
iii)在所述反应室中向第二电极施加电压；以及
iv)收集得到的纳米颗粒聚合物或聚集体；
其中所述至少一种气体包含有机气体。
第八方面，本文中公开一种制备纳米颗粒聚合物或聚集体的方法，所述方法包括：
i)在反应室中提供至少一种气体；
ii)在所述反应室中向第一电极提供射频(rf)电源以在所述反应室中产生电容耦合等离子体；
iii)在所述反应室中向第二电极施加电压；以及
iv)收集得到的纳米颗粒聚合物或聚集体，
其中所述至少一种气体包含有机气体。
第九方面，本文中公开一种制备纳米颗粒聚合物或聚集体的方法，所述方法包括：
i)在反应室中提供至少一种气体；
ii)提供射频(rf)电源以在所述反应室中产生电感耦合等离子体；
iii)在所述反应室中向第二电极施加电压；以及
iv)收集得到的纳米P3材料，
其中所述至少一种气体包含有机气体。
第十方面，本文中公开一种由根据第八或第九方面的方法产生的纳米颗粒聚合物或聚集体。
第十一方面，本文中公开一种形成缀合物的方法，所述方法包括：
●提供：
i)第一方面中的纳米颗粒聚合物、第二方面中的聚集体、或第十方面中的纳米颗粒聚合物或聚集体；和
ii)至少一种第二物质；以及
●使所述纳米颗粒聚合物或聚集体与所述至少一种第二物质接触以使得所述纳米颗粒聚合物或聚集体与所述至少一种第二物质在物理上或化学上相互缔合。
第十二方面，本文中公开一种由第十一方面的方法产生的缀合物。
第十三方面，本文中公开一种治疗罹患疾病、病症或病况，易感所述疾病、病症或病况或表现出所述疾病、病症或病况的一种或多种症状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用以下各物的步骤：第一方面中的纳米颗粒聚合物；第二方面中的聚集体；第三方面或第十二方面中的缀合物；第四方面中的药物组合物；或第十方面中的纳米颗粒聚合物或聚集体。
第十四方面，本文中公开第一方面中的纳米颗粒聚合物、第二方面中的聚集体、第三方面或第十二方面中的缀合物；或第十方面中的纳米颗粒聚合物或聚集体在形成用于治疗受试者疾病、病症或病况的药物中的用途。
第十五方面，本文中公开一种对受试者体内区域成像的方法，所述方法包括向所述受试者施用第三方面或第十二方面中的缀合物或第四方面中的药物组合物的步骤，其中至少一种第二物质为显像剂。
第十六方面，本文中公开第一方面中的纳米颗粒聚合物、第二方面中的聚集体、第三方面或第十二方面中的缀合物、第四方面中的药物组合物或第十方面中的纳米颗粒聚合物或聚集体用于治疗受试者的疾病、病症或病况。
第十七方面，本文中公开一种稳定药剂的方法，所述方法包括使所述药剂与第一方面中的纳米颗粒聚合物、第二方面中的聚集体、第三方面或第十二方面中的缀合物或第十方面中的纳米颗粒聚合物或聚集体缀合。所述药剂可与如本文中所述的第二物质相同。
应了解，本公开中各个方面的实施方案在细节上作必要的修改，可同样应用于各个其它方面。
附图说明
尽管应了解可使用本发明的各种实施方案，但下文中我们参考以下图式描述本发明的多个实施例：
图1-纳米P3颗粒的规模化生产及其作为治疗剂和诊断剂供临床使用的用途。
图2-描绘在等离子体放电中形成、生长和收集纳米P3颗粒的示意图。
图3-可用于生产纳米P3材料的设备示意图。
图4-可用于使用不同收集容器获得纳米P3材料的设备示意图。
图5-说明在收集孔内外作用于纳米P3的力的示意图。
图6-说明在不同尺寸的收集孔中形成纳米P3的示意图。
图7-光谱，说明：等离子体的光发射谱(A)；分子发射带的时域剖面线(B)；以及与分子离子和其它不带电物质相关的发射强度之间的比率的时域剖面线(C)。
图8-曲线图，描绘：每单位面积收集器的纳米颗粒数量和在纳米颗粒形成期间不同时间点在380nm下测量的发射强度(A)；以及通过动态光散射测量的在放电不同时间点收集的纳米颗粒的粒度分布(B)。
图9-描绘团簇凝聚(阶段2)和颗粒去除(阶段3)的持续时间随对纳米颗粒收集器施加的偏压而变化的曲线图(B)。
图10-纳米颗粒和聚集体产物的尺寸分析以及获得的颗粒材料的形态。
图11-曲线图，展示：使用2sccm的乙炔流速制造并通过XPS测量的纳米颗粒的典型C1s峰(A)和N1s峰(B)；以及纳米颗粒的FTIR光谱(C)。
图12-纳米颗粒聚合物和聚集体的EPR光谱(A)以及自由基在不同介质中的动力学(B)。
图13-监测对于各种工作压力以及与等离子体耦合的功率而言，在产物形成期间与CN自由基分子和N2 +分子离子相关的发射强度的时域剖面线。
图14-监测如图13中的时域剖面线，但是对于在与放电体耦合的固定50W下的各种乙炔流速值而言。
图15-监测如图14中的时域剖面线，但是在与放电体耦合的固定75W下。
图16-监测如图14中的时域剖面线，但是在与放电体耦合的固定100W下。
图17-随乙炔流速而变化以及对于50、75和100W而言的振荡周期(A和B)和纳米颗粒产率(C)。
图18-在50、75和100W下，在1-8sccm单体流速范围内的纳米颗粒聚合物和聚集体生产期间，CN自由基分子和N2 +分子离子的最大和最小发射强度。
图19-对于各种氮气流速值而言，在纳米颗粒聚合物和聚集体形成期间，与CN自由基分子和N2 +分子离子相关的发射强度的时域剖面线。
图20-在纳米颗粒聚合物和聚集体产生期间，N2对振荡周期、尺寸和ζ-电位的影响。
图21-纳米P3颗粒的ζ-电位随含有所述颗粒的溶液的pH而变化。
图22-放电体的耦合功率对纳米颗粒尺寸(A)和产率(B)的影响。
图23-在不同耦合功率和单体流速下制备的纳米颗粒的碳、氮和氧的分数。
图24-在不同储存时间下对纳米颗粒的FTIR测量值。
图25-对在只有乙炔和氩气的放电体中制得的纳米颗粒的FTIR测量。
图26-UV-VIS-NIR范围内的纳米P3自发荧光。
图27-纳米P3荧光的强度随时间而增加。
图28-对于各种货物分子量而言，每单位表面积纳米P3的货物分子的数量。
图29-与纳米P3结合的总货物质量随在培育过程中添加至溶液中的质量而增加。
图30-使用吲哚菁绿(ICG)的结合动力学实验。
图31-以ICG为例的纳米P3的货架期。
图32-游离吲哚菁绿(ICG)和结合纳米P3的ICG的动力学。
图33-纳米P3的结合能力可通过改变pH来调节。
图34-聚集的纳米颗粒聚合物在不同介质中的聚集行为。
图35-在连续稀释纳米颗粒聚合物和聚集体存在下的细胞毒性。
图36-用抗体单重功能化纳米P3的示意图。
图37-用药物单重功能化纳米P3的示意图。
图38-示意图说明用抗体和药物对纳米P3进行双重功能化。
图39-次级电子(A)和反向散射模式(B)对用金标记的IgG抗体培育的纳米颗粒聚合物形成的扫描电子显微镜图像。
图40-使用通过扫描电子显微镜检测次级电子进行成像的纳米P3和不同尺寸的两种金抗体(实线箭头20nm，斜纹箭头6nm)。
图41-在荧光成像之前，用人冠状动脉内皮细胞(hCAEC，上面一行)和乳癌细胞系MCF7(下面一行)培育的抗体功能化纳米P3。
图42-多柔比星(Dox)在与纳米颗粒缀合时的荧光损失(A)；以及细胞活力分析(B)。
图43-纳米P3与IgG-488和IgG-594缀合。
图44-示意图说明用抗体和药物对纳米P3进行双重功能化。
图45-对纳米P3与紫杉醇-488和IgG-594缀合的细胞研究。
图46-IgG-488、IgG-Cy5和IgG-Cy7与纳米P3的缀合以及对MCF7细胞的细胞研究。
图47-研究在使用纳米P3的人冠状动脉细胞中运载质粒。
图48-研究在结合有不同尺寸纳米P3的人胚肾细胞中运载质粒。
图49-小鼠传递纳米P3材料及其缀合物的体内成像***(IVIS成像)。
图50-与纳米P3材料缀合的小鼠传递吲哚菁绿(ICG)的体内成像***(IVIS成像)。
图51-小鼠传递纳米P3材料及其缀合物的体内成像***(IVIS成像)。
图52-纳米P3在人冠状动脉内皮细胞内部的SEM图像(A)；以及切片的3D重构显示纳米P3在细胞质中的均匀分布(B)。
图53-对于HCAEC(1)、MCF-10A(2)和MCF-7(3)而言，在纳米P3存在下的细胞活力(C)；以及用肌动蛋白-鬼笔环肽染色的细胞的代表性图像(D)。
图54-测定与以下各物结合的荧光素酶：无载剂；金纳米颗粒载剂；聚苯乙烯珠；以及纳米P3。
图55-示意图显示纳米P3材料结合多种第二物质的能力(A)并计算纳米P3与IgG488抗体之间的结合能力(B)。
图56-高分辨率SEM成像显示用以下各物功能化纳米P3：大小为40nm的一种IgG-金二级抗体(如虚线圆形轮廓所示)；大小为40nm和20nm的两种IgG-金二级抗体(分别如虚线圆形和三角形轮廓所示)；以及大小为40nm、20nm和6nm的三种IgG-金二级抗体(分别如虚线圆形、三角形和矩形轮廓所示)(C)；以及对单独的纳米P3和在用紫杉醇、IgG-Cy5和IgG-Cy7功能化后进行的ζ-电位测量(D)。
图57-用MCF10A细胞以及经单重、双重和三重功能化的纳米P3材料进行细胞研究。
图58-用包含纳米P3颗粒和核定位序列的缀合物进行处理后的染色人脐静脉内皮细胞。
图59-与抗VEGF的siRNA缀合的纳米P3。
图60-用包含纳米P3颗粒和抗VEGF的siRNA的缀合物进行处理后的染色人脐静脉内皮细胞。
图61-辣根过氧化物酶(HRP)与纳米P3和金纳米颗粒缀合。
图62-在原代小鼠成纤维细胞中传递与纳米P3缀合的抗荧光素酶的小干扰性RNA(siLuci)。
图63-在源自IPSC的人内皮细胞中传递抗荧光素酶的小干扰性RNA(siLuci)纳米P3。
图64-电纺聚氨酯(图像a、b和c)以及连接有纳米P3的电纺聚氨酯(图像d、e和f)在渐增放大率下的SEM图像。
图65-经免疫荧光CD31处理并在第14天在包括纳米P3的各种材料存在下染色的内皮细胞(a)；以及在暴露于材料后，囊中新生血管的平均数(b)。
图66-纳米P3在丝质电纺支架上的SEM图像。
具体实施方式
发明人已展示纳米颗粒材料的生产，本文中描述为“纳米P3(nanoP3/NanoP3)”或“纳米P3材料(nanoP3material/NanoP3material)”。这些纳米P3材料可充当可易于功能化的一类通用且多功能的纳米载体。纳米P3材料可通过与嵌埋在纳米P3材料中的扩散至纳米P3材料表面的自由基反应和/或通过与在纳米P3材料或其缀合物表面上形成的部分/官能团反应来与多种生物分子和药物缀合。
本文所述的纳米P3材料的一个关键优势在于其可长期保留嵌埋在其中的自由基。随着时间流逝，这些自由基扩散至表面并与邻近的物质反应。当材料储存在适当条件下时(例如：在惰性气氛下；通过在收集后即刻在真空条件下将含有材料的小瓶密封在等离子体室中；和/或在低温下)，自由基可保留数周、数月或可能保留数年。自由基的寿命延长意味着纳米P3材料可储存直到特定的诊断试验或治疗方法需要缀合物的时刻。这意味着纳米P3材料的生产不需要与特定应用或治疗方案需要缀合物同时发生。
有利的是，可通过一锅法来制备纳米P3与一种或多种第二物质(例如，药品、显像剂和/或肽)之间的缀合物。据认为，在活性等离子体-气相中产生的较小碳基团簇(纳米颗粒聚合物)合并形成聚集体的快速生长阶段期间，自由基形成并保留在纳米结构中。纳米P3可维持其表面上的固定生物分子的生物活性，且可易于被不同的细胞类型内化而不诱发细胞毒性。相反，当与纳米P3缀合时，诸如多柔比星的细胞毒素药物能杀死癌细胞。另外，纳米P3能在细胞内部传递静默RNA，导致蛋白表达在细胞摄取48小时后显著降低。此外，纳米P3的共价结合能力和固定生物分子的生物活性在冷冻干燥储存后维持至少数月。
本文公开的方法，例如所述的基于等离子体的方法，可用于有效地制造和收集具有有利且可调的物理、化学和形态学特性的纳米颗粒，所述特性能够整合多种功能以用于各种纳米医学应用。
定义
在本说明书上下文中，词汇“包含”或其变化形式将理解为暗示涵盖所述要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的群组，但不排除任何其它的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的群组。
在本说明书上下文中，术语“基本上由……组成”欲排除实质上将影响所主张组合物的特性的要素，而可包括不实质上影响特性的要素。
关于本文中提供的定义，除非另外说明或上下文暗示，否则定义的术语和短语包括所提供的含义。除非另外明确说明或由上下文显而易见，否则下文的术语和短语不排除所述术语或短语由相关领域技术人员所获取的含义。提供定义有助于描述具体的实施方案，但并非打算限制所主张的发明，因为本发明的范畴仅受权利要求书的限制。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语将包括复数形式，且复数术语将包括单数形式。
在本说明书上下文中，本发明的各个方面和组分可呈现为范围格式。包括范围格式以图方便，且不应解释为对本发明范畴的硬性限制。因此，除非特定指示，否则范围描述将视为具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的个别数值。例如，诸如1至5的范围描述应视为具体公开了诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至5、3至5等子范围以及所述范围内的个别和部分数值，例如1、2、3、4、5、5.5和6，除非上下文中要求或暗示整数。无论所公开范围的宽度如何，这都适用。当要求具体值时，这些将在说明书中指出。
“约”
本文中，术语“约”涵盖与此术语相关的任意值的10％容差。
“烃”
本文公开的烃单体应理解为仅由氢和碳原子组成的单体。烃的实例包括：烯烃、炔烃、环烯烃、芳香族化合物或其混合物。
“聚集体”
如本文所用，术语“聚集体”意思是包含多个纳米颗粒聚合物且尺寸在5nm至100μm范围内，例如尺寸在约5nm至约500nm范围内的颗粒，除非另外说明或在其所使用的上下文中明确得知。
“缀合物”
本文中，术语“缀合物”指的是由一种或多种化合物与纳米颗粒聚合物或包含纳米颗粒聚合物的聚集体连接形成的分子。“一种或多种化合物”可为如本文定义的第二物质。连接可通过共价键或静电相互作用。
“单体”
除非另有说明，否则术语“单体”将理解为意思是可通过一个或多个可在等离子体中通过片段化和反应过程产生的反应性官能团反应形成聚合物的单体化合物。
“纳米P3”
除非另外说明或在其所使用的上下文中明确得知，否则术语“纳米P3”指的是尺寸小于100微米的纳米颗粒材料，例如纳米P3可具有约5nm与500nm之间的尺寸。除非上下文说明或暗示，否则术语“纳米P3”涵盖如本文定义的“纳米颗粒聚合物”和“聚集体”，除非另外说明或在其所使用的上下文中明确得知。术语“纳米P3”与“纳米颗粒材料”可互换使用。在一个优选的实施方案中，纳米颗粒材料包含等离子体聚合物。等离子体聚合物可通过等离子体中的片段缩合而形成，所述材料能够共价偶合一种或多种化合物，例如一种或多种“第二物质”，包括有机物质或有机金属物质。
“纳米颗粒聚合物”
本文中，术语“纳米颗粒聚合物”指的是由本文定义的单体形成的聚合物，其中所述纳米颗粒聚合物具有约1nm至约50nm范围内的粒度。在一个优选的实施方案中，纳米颗粒聚合物通过等离子体中的片段缩合而形成，所述材料能够共价偶合包括有机物质或有机金属物质的一种或多种化合物。
“聚合物”
术语“聚合物”指的是通过聚合过程产生的由可为异质和/或排列成无序结构的重复结构单元组成的化合物或化合物的混合物。适用于本发明的合适聚合物在全文中均有描述。在一个实施方案中，聚合物为其中重复单元组合成相对无序的结构的等离子体聚合物。
“等离子体”
术语“等离子体”通常指的是包含离子、电子、不带电物质以及辐射的混合物的(部分)离子化类气体物质。本文中提到的等离子体包含至少一种单体。
“等离子体聚合物”
本文中，“等离子体聚合物”为衍生自包含一种或多种单体的等离子体的聚合物。
单体
本文所述的纳米P3材料衍生自一种或多种单体。
在一个实施方案中，一种或多种单体以气态形式用于形成纳米P3材料。
单体可为烃。烃的实例包括烯烃、炔烃、环烯烃和环炔烃。
合适烯烃单体的实例包括但不限于：乙烯、丙烯、1-丁烯、1-戊烯、1-己烯、1-庚烯、1-辛烯、1-壬烯、1-癸烯、其异构体或其混合物。
合适炔烃单体的实例包括但不限于：乙炔、丙炔、1-丁炔、1-戊炔、1-己炔、1-庚炔、1-辛炔、1-壬炔、1-癸炔、其异构体或其混合物。
合适环烯烃单体的实例包括但不限于：环丙烯、环丁烯、环戊烯、环己烯、环庚烯、环辛烯、1,3-环己二烯、1,4-环己二烯、1,5-环辛二烯、其异构体或其混合物。
合适环炔烃单体的实例包括但不限于：环庚炔、环辛炔、环壬炔、其异构体或其混合物。
在一个实施方案中，使用烯烃作为单体。烯烃可为用于形成纳米颗粒聚合物的唯一单体，或其可在至少一种其它单体存在下使用以形成共聚物，例如另一种烯烃和/或炔烃、环烯烃或环炔烃。
在一个实施方案中，使用炔烃作为单体。炔烃可为用于形成纳米颗粒聚合物的唯一单体，或其可在至少一种其它单体存在下使用以形成共聚物，例如另一种炔烃和/或烯烃、环烯烃或环炔烃。在另一个实施方案中，单独或在至少一种其它单体存在下使用乙炔作为单体。
在另一个实施方案中，乙炔作为单体与至少一种其它单体组合使用，例如烯烃、炔烃、环烯烃或环炔烃的至少一种其它单体。
在一个实施方案中，使用环烯烃作为单体。环烯烃可为用于形成纳米颗粒聚合物的唯一单体，或其可在至少一种其它单体存在下使用以形成共聚物，例如另一种环烯烃和/或烯烃、炔烃或环炔烃。
在一个实施方案中，使用环炔烃作为单体。环炔烃可为用于形成纳米颗粒聚合物的唯一单体，或其可在至少一种其它单体存在下使用以形成共聚物，例如另一种环炔烃和/或烯烃、炔烃或环烯烃。
可用于形成纳米P3的其它单体包括全氟化碳、醚、酯、胺、醇或羧酸。
合适全氟化碳的实例包括但不限于：全氟烯丙基苯。
合适醚的实例包括但不限于：二乙二醇乙烯基醚、二乙二醇二乙烯基醚、二乙二醇单烯丙基醚或其混合物。
合适胺的实例包括但不限于：烯丙胺、环丙胺、聚(乙烯胺)或其混合物。
合适醇的实例包括但不限于：聚(乙烯醇)、烯丙醇、乙醇或其混合物。
合适羧酸的实例包括但不限于丙烯酸。
纳米P3
纳米P3材料可为均聚物或共聚物。在一个实施方案中，纳米P3材料为均聚物。在另一个实施方案中，纳米P3材料为共聚物。
在一个实施方案中，纳米P3衍生自如本文所述的包含一种或多种最初以气态形式存在的单体的等离子体。一种或多种惰性气体(例如氦气、氖气或氩气)可视情况与一种或多种单体一起存在。
纳米颗粒聚合物可在元素周期表15、16或17族的气体(诸如氮气)存在下形成。该气体片段可掺入纳米颗粒聚合物中。例如，氮气的存在可在胺、亚胺或腈基或其混合物存在下产生纳米颗粒聚合物或纳米P3材料。因此，本文公开的纳米颗粒聚合物可包含氮气。
已发现氮气不仅只适合作为载剂，而且适合作为反应性的不可聚合气体。这意味着氮气也可掺入纳米颗粒材料中，为得到的功能化纳米颗粒材料赋予特定的物理-化学特性。此外，氮气也被认为能以不同的模式形成纳米颗粒，所述形成模式若不使用氮气是不可能的。预期包括诸如氮同族的其它气体也将为调节纳米颗粒形成机制和物理-化学特性提供额外的自由度。
在一个实施方案中，纳米P3材料衍生自如本文所述的包含至少一种单体的等离子体。纳米P3材料视情况在例如氮气的气体存在下形成，其中气体片段掺入纳米颗粒聚合物中。
纳米P3材料可具有约0.01:1至约2:3的氮:碳元素比。例如，纳米颗粒聚合物可具有约0.05至约1、或约0.1至约1、或约0.15至约1、或约0.2至约1、或约0.25至约1、或约0.3至约1、或约0.35至约1、或约0.4至约1、或约0.45至约1、或约0.5至约1、或约0.55至约1、或约0.6至约1、或约0.65至约1的氮:碳元素比。或者，纳米颗粒聚合物可具有约0.1至约1:2的氮:碳元素比。
本文所述的纳米P3材料优选地包含至少一个能结合一种或多种化合物的结合位点，所述化合物例如有机化合物或有机金属化合物或如本文中定义的第二物质。
在一个实施方案中，本文所述的纳米P3材料至少包含能结合一种或多种化合物的结合位点，其中所述结合位点包含能结合有机化合物或有机金属化合物或如本文定义的第二物质的未配对电子。
纳米P3材料可包含聚合物中的未配对电子。这些未配对电子可位于纳米颗粒的表面上或表面附近。未配对电子可位于纳米颗粒材料颗粒内的40nm或40nm以内深度处，或位于表面的约30、20或10nm以内，或可位于距表面约10与约40nm之间，或位于距表面约10与30之间、20与40之间或20与30nm之间，或位于距表面约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40nm处。其可位于约0至约40nm的各种深度处。在一些情况下，其可位于大于40nm深度处。其可遍布整个纳米颗粒材料的体积。其可使材料能够与诸如有机物质或有机金属物质的第二物质反应以使所述物质与纳米颗粒聚合物共价偶合并形成缀合物。
在一个实施方案中，提供一种纳米P3材料，其颗粒具有约5nm至约500nm的平均直径，所述纳米P3材料包含有机等离子体聚合物且所述纳米P3(纳米颗粒聚合物或其聚集体)包含未配对电子，由此能够与有机物质或有机金属物质共价偶合。
在另一个实施方案中，纳米颗粒材料或纳米P3材料包含至少一个能化学或物理偶合第二物质的官能团部分。
纳米P3材料可具有约1nm至小于约1000nm的平均直径。例如，纳米P3材料可具有约5nm至约500nm或约5至500、50至500、100至500、200至500、5至200、5至100、5至50、5至20、20至100、100至300或200至400nm的平均直径，例如约5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500nm，或在约5至约400nm、或约5至约300nm、或约5至约200nm、或约5至约100nm、或约100至约500nm、或约100至约400nm、或约100至约300nm、或约100至约200nm、或约200至约400nm、或约200nm至约300nm或其混合范围内。
纳米P3材料的尺寸可通过扫描电子显微镜法、透射电子显微镜法、小角激光光散射、光子相关光谱法、微分迁移率分析或一些其它合适的技术来测量。纳米P3材料的颗粒可具有窄尺寸分布或宽尺寸分布。粒度分布的标准偏差可在平均粒度的约1％与约500％之间，或在约1％与200％之间、1％与100％之间、1％与50％之间、1％与20％之间、1％与10％之间、1％与5％之间、1％与2％之间、10％与500％之间、20％与500％之间、50％与500％之间、100％与500％之间、200％与500％之间、10％与100％之间、10％与50％之间或50％与100％之间，例如约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％。在一些情况下，其可大致为单分散的，即所有颗粒可大致为相同尺寸(例如，在同一直径的约10％或约5％或约2％以内)。
纳米P3材料可包含有机等离子体聚合物。等离子体聚合物的特征在于异质、紧密、高度交联的网状物。其可为无定形的。这种等离子体聚合物可通过在等离子体中由气体混合物中的有机气体和其它反应性气体产生的活性物质反应(例如，离子化和片段化)而产生，或由等离子体/气体混合物中由气体混合物中的气体的离子化和片段化产生的反应性物质产生。
纳米P3材料可通过多种方法来表征，所述方法包括但不限于：电子顺磁共振(EPR)光谱法、红外光谱法(诸如傅里叶变换红外光谱法)、拉曼光谱法(Raman spectroscopy)、UV-VIS光谱法、元素分析(例如，X射线光电子光谱法)、软X射线光谱法、确定ζ-电位、核磁共振(NMR)光谱法、质谱法、凝胶渗透色谱法、扫描电子显微镜法(SEM)、透射电子显微镜法(TEM)、小角激光光散射、光子相关光谱法、微分迁移率分析、弹性反冲探测分析(ERDA)或中子散射。
纳米P3材料(例如，纳米颗粒聚合物或聚集体)的特征在于具备一个或多个以下特点：
●以约3470G至约3520G范围为中心和/或对应于约2.001至约2.005范围内的g因子的宽电子顺磁共振峰；
●通过电子顺磁共振测量在合成后约0小时至约2小时内自旋密度在约1019至约1015转/cm3范围内。
●通过电子顺磁共振测量在合成后约0小时至约240小时内自旋密度在约1017至约1015转/cm3范围内。
●在红外光谱中以下列范围为中心的一个或多个吸收带：
□约3680-约2700cm-1范围内；
□约1800-约1200cm-1范围内；
□约2330-约2020cm-1范围内；
□约1200-约1010cm-1范围内；和/或
□约1010-约700cm-1范围内；
●在红外光谱中以下列范围为中心的一个或多个吸收带：
□约3600-3100cm-1范围内；和/或
□约3100-2700cm-1范围内；
●ζ-电位在约-100mV至约+100mV范围内；
●在约2至约10的pH范围内的溶液中测量的ζ-电位在约-80mV至约+80mV范围内；或
●氮:碳元素比为约0.1:1至约2:3。
在一个实施方案中，使用EPR光谱法来表征纳米P3材料、纳米颗粒聚合物或聚集体。纳米颗粒聚合物或聚集体可展示以约3470G至约3520G范围为中心和/或对应于约2.001至约2.005范围内的g因子的宽电子顺磁共振峰。
在一个实施方案中，纳米P3材料、纳米颗粒聚合物或聚集体通过EPR光谱法测量在合成后约0小时至约2小时内具有约1019至约1015转/cm3范围内的自旋密度。可在合成后约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约105、约110、约115或约120分钟进行测量。
在一个实施方案中，纳米P3材料、纳米颗粒聚合物或聚集体通过电子顺磁共振测量在合成后约0小时至约240小时内具有约1017至约1015转/cm3范围内的自旋密度。可在合成后约0.5、约1、约2、约4、约5、约6、约8、约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150小时、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230或约240小时进行测量。
在另一个实施方案中，使用红外光谱法(诸如傅里叶变换红外光谱法)来表征纳米P3材料、纳米颗粒聚合物或聚集体。例如，纳米颗粒聚合物或聚集体在红外光谱中可展示以下列范围为中心的一个或多个吸收带：
●约3680-约2700cm-1范围内；
●约1800-约1200cm-1范围内；
●约2330-约2020cm-1范围内；
●约1200-约1010cm-1范围内；
●约1010-约700cm-1范围内；
●约3600-3100cm-1范围内；
●约3100-2700cm-1范围内；和/或
●其混合范围。
在另一个实施方案中，使用纳米颗粒聚合物或聚集体的ζ-电位来表征纳米P3材料、纳米颗粒聚合物或聚集体。例如，纳米P3材料、纳米颗粒聚合物或聚集体可具有约-100mV至约+100mV范围内的ζ-电位。例如，ζ-电位可在约-50mV至约60mV范围内。
在另一个实施方案中，当在约2至约10的pH范围内的溶液中测量时，纳米P3材料、纳米颗粒聚合物或聚集体具有约-80mV至约+80mV范围内的ζ-电位。
纳米P3材料可具有粗糙花椰菜样的表面形态。这可能是由于它们是通过纳米颗粒聚合物聚集形成的。因此，纳米P3材料可为纳米颗粒聚合物的聚集体。纳米P3材料和聚集体可为球形或大体为球形。纳米颗粒聚合物可具有约1至约50nm、或约5至10、5至10、10至50、20至50或10至30nm的直径，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50nm。聚集体(以及缔合的纳米颗粒聚合物)可嵌有高度反应性的自由基，自由基的量随时间流逝而减少。纳米P3材料在不受位置限制的碳团簇轨道中还可嵌有长寿命且稳定的自由基。所述稳定自由基(次级自由基)可来源于涉及到高度反应性自由基(初级自由基)的反应。纳米P3材料可具有亲水性表面。因此表面可使得纳米P3材料易于分散在水中。这使得可保留表面固定的生物活性分子的生物活性。亲水性表面可能是在形成期间或形成之后通过使表面暴露于空气而使自由基氧化的结果。在与一种或多种第二物质缀合后，纳米P3材料缀合物可为亲水性或疏水性的。或者，纳米P3材料缀合物可展示出两亲性特性。
视在聚合期间使用的单体或应用的条件而定，纳米P3材料可为交联的。术语“交联”在本文中指的是含有分子内和/或分子间键的聚合物组合物。这些交联键的性质可为共价或非共价。非共价键结包括氢键结、静电键结和离子键结。
由交联获得的一种潜在的优势在于得到的纳米P3材料以及可能由所述材料形成的缀合物的稳定性。例如，与未交联的类似组合物相比，交联可减小纳米P3材料(或得到的缀合物)的溶解度。另外，纳米P3材料(或其形成的缀合物)的交联性质可增加纳米颗粒材料或所得缀合物的化学抗性。
纳米P3可掺杂有其它无机元素或化合物或有机金属化合物，其在医学成像技术中充当图像增强造影剂。纳米P3可掺杂有磁共振成像(MRI)造影剂，诸如氧化铁或钆化合物。图像增强造影剂的实例包括：荧光染料(例如，Alexa 680、吲哚菁绿和Cy5.5)；同位素和放射性核素，诸如：11C、13N、15O、18F、32P、51Mn、52mMn、52Fe、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、72As、73Se、75Br、76Br、82mRb、83Sr、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、110In、111In、120I、123I、124I、125I、131I、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、177Lu、186Re、188Re和223Ra；顺磁离子，诸如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)；金属，诸如镧(III)、金(III)、铅(II)和铋(III)；铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)；金属、诸如镧(III)、金(III)、铅(II)和铋(III)的氧化物，包括氧化铁和氧化钆；超声波造影增强剂，诸如脂质体；以及X射线造影剂，诸如钡、镓和铊化合物。图像增强造影剂可直接合并到纳米P3材料上或通过使用中间官能团(诸如，螯合剂)间接地合并到纳米P3材料上。
聚集体
可在生产纳米P3材料期间由本文所述的纳米颗粒聚合物形成聚集体。
在一个实施方案中，聚集体具有约5nm至约100μm，例如约5nm至约500nm范围内的尺寸。
缀合物
本文所述的纳米颗粒聚合物、聚集体或纳米P3材料可缀合一种或多种化合物，例如本文中所定义的有机化合物、有机金属化合物或第二物质，以形成缀合物。当第二物质携带表面电荷时，可通过在缀合过程期间改变反应条件的pH来调节带电的第二物质与纳米P3的结合。溶液的pH通过表面官能团(诸如胺和羧酸基团)的质子化或去质子化来调节纳米P3的电荷。例如，可通过增加含有纳米P3材料和第二物质的溶液的pH来改善带正电缀合物与纳米P3材料的缀合。在高碱性介质中，纳米P3通过去质子化羧酸表面基团而带负电，这也由于带负电颗粒之间的排斥力而使纳米颗粒稳定。或者，可通过减小含有纳米P3材料和第二物质的溶液的pH来改善带负电缀合物与纳米P3材料的缀合。如本文中表明，许多第二物质都可以在不改变反应条件的pH的情形下缀合至本文中所述的纳米P3材料，而与第二物质上的任何表面电荷无关。
本文中公开纳米P3材料(例如：纳米颗粒聚合物、聚集体或其混合物)在缀合物形成中的用途。
缀合物可只包含单一的第二物质。或者，缀合物可包含两种或更多种不同的第二物质，例如两种、三种或四种第二物质。
纳米P3材料通常能够例如通过共价偶合或离子性偶合与第二物质(诸如，有机或有机金属物质)直接偶合。当纳米颗粒聚合物或聚集体为等离子体聚合物时，偶合过程通常快速并且能够在温和的条件下进行。偶合可借助于聚合物结构中的未配对电子(即，自由基位点)，或借助于在纳米P3材料上产生的或通过添加适当的第二物质或通过与纳米P3材料所暴露的空气(或另一种气体)或一些其它流体反应而合并到所得缀合物上的官能团。纳米P3材料可包括包含能够化学偶合第二物质的官能团部分的单体单元。一种或多种第二物质与纳米P3材料的缀合可在得到的缀合物上或其内部引入官能团，所得的缀合物可用于进一步的化学反应或用作诸如在体外或体内条件下发生的生物化学/生物过程等过程中的结合位点。
本文中，官能团部分(或“官能团”)指的是单体、纳米P3材料或包含纳米P3材料的缀合物上存在的原子团，其可与其它互补的官能团，例如第二物质上存在的其它官能团反应。官能团包括但不限于以下部分：羧酸(-(C＝O)OH)、羰基、一级或二级胺(-NH2、-NH-)、一氧化氮、马来酰亚胺、硫醇(-SH)、磺酸(-(O＝S＝O)OH)、碳酸酯、氨基甲酸酯(-O(C＝O)N<)、羟基(-OH)、醛(-(C＝O)H)、酮(-(C＝O)-)、肼(>N-N<)、异氰酸酯、异硫氰酸酯、磷酸(-O(P＝O)OHOH)、膦酸(-O(P＝O)OHH)、卤代乙酰基、烷基卤化物、丙烯酰基、芳基氟化物、羟基胺、二硫化物、乙烯砜、乙烯酮、重氮烷、环氧乙烷和氮杂环丙烷或其混合物。
本文中，“第二物质”为可物理吸附至纳米P3材料(即，纳米颗粒聚合物或其聚集体)上或与纳米P3材料(即，纳米颗粒聚合物或其聚集体)化学结合以形成缀合物的化合物。
第二物质可选自：成像试剂、生物分子、药物、酶、抗体、靶向配体、多核苷酸、siRNA、RNA、RNA构筑体、DNA、DNA构筑体、载体、质粒、碳水化合物、催化剂及其混合物。另外，诸如全细胞、细胞片段、胶束、脂质体、水凝胶、蛋白质(电纺蛋白，诸如丝线)和聚合物、半导体、陶瓷或金属颗粒的物质可通过此方式与纳米P3材料共价连接。在一个实施例中，第二物质为荧光染料。例如，荧光染料可为吲哚菁绿(4-[2-[(1E,3E,5E,7Z)-7-[1,1-二甲基-3-(4-磺酸根基丁基)苯并[e]亚吲哚-2-基]庚-1,3,5-三烯基]-1,1-二甲基苯并[e]吲哚-3-锭-3-基]丁烷-1-磺酸钠；CAS编号3599-32-4)。
如本文所用的术语“抗体”将视为涵盖包含由一个或多个免疫球蛋白链组成的可变区的蛋白质，例如包含VL的多肽和包含VH的多肽。抗体还可包含恒定结构域，其中一些可排列成恒定区或恒定片段或可结晶片段(Fc)。VH与VL相互作用形成包含能够特异性结合一个或少量密切相关抗原的抗原结合区的Fv。通常而言，来自哺乳动物的轻链为κ轻链或λ轻链，且来自哺乳动物的重链为α、δ、ε、γ或μ。抗体可为任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。术语“抗体”还涵盖人源化抗体、去免疫抗体、非消耗性抗体、非活化性抗体、灵长源抗体、人抗体和嵌合抗体。如本文所用，术语“抗体”还打算包括除全长、完整或完全抗体分子以外的形式，诸如能够结合表观决定子的Fab、F(ab')2和Fv。这些形式可称为抗体“片段”。这些抗体形式保留了选择性结合靶蛋白的一些能力，其实例包括但不限于以下：
(1)Fab，其为含有抗体分子的单价结合片段且可由木瓜蛋白酶消化全抗体产生完整轻链和一个重链的一部分而产生的片段；
(2)Fab'，其为可由胃蛋白酶处理全抗体，接着还原以产生完整轻链和一部分重链所获得的抗体分子的片段；每个抗体分子获得两个Fab'片段；
(3)(Fab')2，其为通过用胃蛋白酶处理全抗体，随后不进行还原而获得的抗体片段；F(ab)2为由两个二硫键连接在一起的两个Fab'片段的二聚体；
(4)Fv，定义为含有轻链可变区和重链可变区(表达为两个链)的基因工程片段；
(5)单链抗体(“SCA”)，定义为含有由基因融合单链分子形式的合适多肽连接子连接的轻链可变区、重链可变区的基因工程分子；所述单链抗体可为多聚体的形式，诸如双链抗体、三链抗体和四链抗体等，其可为多特异性或可为非多特异性的；以及
(6)单域抗体，其通常为不含轻链的可变重结构域。
因此，如本文所述的抗体可包括单独的重链、轻链、Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、不含任何重链的轻链可变区、不含轻链的重链可变区以及Fv。这些片段可由重组DNA技术或通过酶促或化学分离完整的免疫球蛋白而产生。本文所述以及另外在本领域中已知的任何抗体或其片段都可与本文中公开的纳米P3颗粒缀合。
第二物质可为多核苷酸。如本文所用的术语“多核苷酸”将视为涵盖DNA、RNA、反义多核苷酸、核酶、干扰性RNA、siRNA、微小RNA以及本领域中已知的任何其它多核苷酸。多核苷酸可编码蛋白质或功能性RNA(诸如，干扰性RNA)。因此，多核苷酸可为多核苷酸载体或质粒。因此，本文公开的纳米P3材料可用于将多核苷酸转运至受试者体内所关注的靶位点，所述多核苷酸本身发挥功能性作用或提供蛋白质或功能性RNA的表达，这随后对受试者的细胞产生功能性作用。
第二物质的实例包括：靶向配体、药品、显像剂、氨基酸、肽、天然生物活性分子的合成类似物、合成肽模拟物、蛋白质(诸如，酶或抗体)、受体靶向配体、基因靶向剂、多核苷酸、RNA、光敏染料、可裂解的连接分子(诸如，pH敏感性连接子)、烃、全细胞、细胞片段、胶束、脂质体、水凝胶、聚合物颗粒、半导体颗粒、陶瓷颗粒、金属颗粒、生长因子、细胞因子、抗血栓形成剂和/或纤维溶解剂或其混合物。
例如，抗体可连接至纳米P3材料以使纳米颗粒靶向特定的细胞类型，且治疗分子可连接至相同的纳米颗粒聚合物以向那些细胞传递治疗效应。另外或或者，成像分子可连接至纳米P3材料以使所述细胞类型可成像。
本发明的纳米P3不仅可固定多种分子，而且可使连接的物质在固定后保持其功能性和活性。发明人已同时通过与纳米P3材料连接的一种以上类型的生物分子证实此特征。
纳米P3材料(纳米颗粒聚合物和/或其聚集体)能够与一种以上的第二物质反应。不同类型的分子以及那些不同分子内的排列可在纳米P3材料内或在纳米P3材料上同时或相继反应和固定。偶合物质在固定于纳米P3材料和得到的缀合物上后可保持其未偶合活性，例如生物活性和功能性。
可与纳米P3材料结合的第二物质的实例展示在Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第21版；Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,PA,2005的第1262至1739页上，其内容以引用的方式并入。
第二物质的实例包括但不限于：诊断药物和试剂；局部药物；胃肠和肝脏药物；血液、流体、电解质和血液学药物；心血管药物；呼吸道药物；拟交感神经药物；类胆碱药物；肾上腺素能拮抗剂和肾上腺素能；神经元阻断药物；抗毒蕈碱和止痉挛药物；骨骼肌松弛剂；利尿药物；子宫和抗偏头痛药物；激素和激素拮抗剂；全身麻醉；局部麻醉；抗焦虑剂和催眠药；抗癫痫药；心理药物药剂；镇痛、退热和消炎药物；组胺和抗组胺药物；中枢神经***刺激剂；抗肿瘤药物；免疫活性药物；杀虫剂；免疫剂和变应原浸液；抗感染药；酶；营养素和相关物质或其混合物。
本文中，术语“靶向配体”指的是与靶分子结合或与靶分子相互作用的分子。相互作用或结合的性质通常为非共价的，例如通过氢、静电或范德瓦尔斯(van der Waals)相互作用，然而结合也可以是共价的。
如本文所用的术语“配体”指的是靶向生物标记的化合物。配体的实例包括但不限于：蛋白质、肽、抗体、抗体片段、糖类、碳水化合物、聚糖、细胞因子、趋化因子、核苷酸、凝集素、脂质、受体、类固醇、神经递质、团簇指定/分化(Cluster Designation/Differentiation，CD)标记、印迹聚合物等。
靶向配体的实例包括但不限于：核定位信号(例如KR[PAATKKAGQA]KKKK)、RGD、NGR、叶酸、转铁蛋白、GM-CSF、半乳糖胺、抗VEGFR、抗ERBB2、抗CD20、抗CD22、抗CD19、抗CD33、抗CD25、抗腱生蛋白、抗CEA、抗MUC1、抗TAG72、抗HLA-DR10或其混合物。
药品的实例包括但不限于：抗癌药物(诸如：多柔比星、紫杉醇、长春新碱、环磷酰胺和托泊替康)；哮喘药物(例如，氟替卡松和沙美特罗-其包括类固醇和支气管扩张剂)；抗-HIV逆转录病毒(例如，阿巴卡韦(Ziagen)、依非韦伦/恩曲他滨(emtriacitabine)/富马酸替诺福韦二吡呋酯(Atripla)、拉米夫定/齐多夫定(双汰芝(Combivir))、恩曲他滨/利匹韦林/富马酸替诺福韦二吡呋酯(Complera)、恩曲他滨(Emtriva)、拉米夫定(Epivir)、阿巴卡韦/拉米夫定(Epzicom)、齐多夫定(Retrovir))；调节细胞复制/增殖的药剂：雷帕霉素靶(target of rapamycin，TOR)抑制剂(包括西罗莫司、依维莫司和ABT-578)；紫杉醇和抗肿瘤剂(包括烷基化剂，例如环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、异环磷酰胺、丙卡巴肼(procarbazine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺、六甲蜜胺(altretamine)、顺铂、卡铂和奥沙利铂)；抗肿瘤抗生素(博莱霉素、放线菌素D、光辉霉素(mithramycin)、丝裂霉素C、依托泊苷、替尼泊苷、安吖啶(amsacrine)、托泊替康、伊立替康、多柔比星、柔红霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌(mitoxantrone)和米托蒽醌(mitoxantrone))；抗代谢药(包括：去氧助间霉素(deoxycoformycin)、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2-氯脱氧腺苷、羟基脲、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、胞嘧啶***糖苷(cytosine arabinoside)、氮杂胞苷(azacytidine)、吉西他滨、磷酸氟达拉滨和天冬酰胺酶(aspariginase))；抗有丝***剂(包括：长春新碱、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨、多西他赛、雌莫司汀)；分子靶向药物(包括：伊马替尼、维甲酸(tretinoin)、蓓萨罗丁(bexarotene)、贝伐珠单抗、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ogomicin)和地尼白介素-毒素连接物(denileukin diftitox))；消炎药；皮质类固醇；***；雄激素；孕激素和肾上腺雄激素；抗生素、镇痛剂；类***或其混合物。
显像剂的实例包括但不限于：荧光素酶；荧光标记染料及抗体、造影剂(包括：碘帕醇、碘海醇和碘昔兰(ioxilan))；硫酸钡；MRI造影剂(例如：基于钆、氧化铁和锰的显像剂)；吲哚菁绿(ICG)及其混合物。
如本文所用，术语“肽”欲意味着包含由肽键连接的氨基酸的任何聚合物。术语“肽”欲包括使用核糖体组装的聚合物以及由酶(即，非核糖体肽)组装的聚合物和通过合成组装的聚合物。在各种实施方案中，术语“肽”可认为与“蛋白”或“多肽”同义。在各种实施方案中，术语“肽”可限制为大于50个氨基酸、或者50个或50个以下氨基酸的聚合物。在各种实施方案中，术语“肽”欲只包括氨基酸作为用于聚合物的单体单元，而在各种实施方案中，术语“肽”包括其它组分和/或对氨基酸主链的修饰。例如，在各种实施方案中，术语“肽”可适用于氨基酸的核聚合物以及核聚合物的衍生物，诸如具有侧接聚乙二醇基团的核聚合物或在氨基酸链的氨基或羧基末端具有酰胺基团的核聚合物。
氨基酸的实例包括但不限于：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
肽的实例包括但不限于：包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个选自以下的氨基酸的多肽：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
“肽模拟物”可为诸如肽、修饰肽的分子或在生物学上模拟激素、细胞因子、酶底物、病毒或其它生物分子的活性配体的任何其它分子。这种肽模拟物可对抗、刺激或以其它方式调节天然配体的生理活性。长度为14至20个氨基酸的肽可充当研发治疗活性剂的先导化合物。由于它们通常比母体分子小得多，因此它们可能展示较少副作用且更易于传递至标靶的机率较高。合成肽模拟物的重点在于模拟受体的肽或蛋白质配体。然而，此技术也适用于酶抑制作用。由于术语“肽模拟物”相对广泛，因此诸如天然产生的类***生物碱的天然化合物也是肽模拟物的实例。实际上，小肽以及类***有时可靶向相同受体。
本文中，术语“蛋白质”指的是链长度足以产生更高级别的三级和/或四级结构的氨基酸序列。蛋白质可具有约300Da至约150kDa范围内的分子量。蛋白质可具有大于150kDa的分子量或小于300Da的分子量。
本文定义中涵盖的蛋白质的实例包括哺乳动物蛋白质，诸如生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；副甲状腺激素；核糖体失活蛋白质，诸如皂草素；甲状腺刺激激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降血钙素；黄体化激素；胰高血糖素；凝血因子，诸如VIIIC因子、因子、组织因子和血管性假血友病因子(von Willebrands factor)；抗凝血因子，诸如蛋白质C；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活剂，诸如尿激酶或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；棉纱；凝血酶；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(调节活化正常T-细胞表达与分泌)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，诸如人血清白蛋白；苗勒氏管抑制物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠***相关肽；DNase；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子受体；整合素；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子，诸如骨源神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子，诸如NGF-β；血小板源生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，诸如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；***-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)；***结合蛋白；CD蛋白，诸如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；红细胞生成素(EPO)；血小板生成素(TPO)；骨生成诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子(DAF)；病毒抗原，诸如AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；免疫粘附素；抗体；以及生物活性片段或上文列举的任何多肽的变化形式。
基因靶向剂的实例包括但不限于：DNA(gDNA、cDNA)、RNA(正义RNA、反义RNA、mRNA、tRNA、rRNA、小干扰性RNA(siRNA)、短发夹RNA(ShRNA)、微小RNA(miRNA)、小核仁RNA(SnoRNA、小核(snRNA))核酶、适配体、DNA酶、反义寡核苷酸、载体、质粒、其它核糖核酸酶型复合物及其混合物。
光敏染料的实例包括但不限于：吲哚菁绿(ICG)。
可裂解的连接分子(诸如，pH敏感性连接子)的实例可见于Leriche等人,“Cleavable linkers in chemical biology”Bioorganic&Medicinal Chemistry,20,571-582,2012中，其内容以引用的方式包括在内。连接子和化合物的示范群组包括但不限于：pH可裂解、可光解(例如，可通过激光或红外线裂解)、可激光裂解、可热裂解以及可蛋白酶裂解(包括通过如调血管激素和凝血酶的血液蛋白酶的作用)的连接子和化合物。
细胞的实例包括但不限于：祖细胞(包括：内皮祖细胞、CD34+、CD133+、KDR+或VCAM-1+单核细胞、造血干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞)、分化细胞(包括内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞)或其混合物。
水凝胶的实例包括但不限于：包括共价或声波交联的多糖基水凝胶，诸如海藻酸、果胶、羧甲基纤维素、肝素、透明质酸以及来自甲壳素、壳聚糖、普鲁兰糖(pullulan)、结冷胶(gellan)、黄原胶和羟丙基甲基纤维的水凝胶的多价金属盐。
聚合物、半导体、陶瓷或金属颗粒的实例包括但不限于：半导体量子点、荧光纳米颗粒、金纳米颗粒、银纳米颗粒、氧化铁、其它磁性颗粒或其混合物。
生长因子的实例包括但不限于：血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、***生长因子、胎盘源生长因子、血管生成素-1和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
细胞因子的实例包括但不限于：白介素，诸如白介素-1、白介素-4、白介素-10；GM-CSF；TNF-α；干扰素-γ；TGF-β；或其混合物。
抗血栓形成剂和纤维溶解剂的实例包括但不限于：糖蛋白IIb/IIIa抑制剂、直接凝血酶抑制剂、肝素、低分子量肝素、血小板二磷酸腺苷(ADP)受体抑制剂、纤维溶解剂(包括链激酶、尿激酶、重组组织纤溶酶原激活剂、瑞替普酶(reteplase)和替奈普酶(tenecteplase))、酶(包括：链激酶、尿激酶、组织纤溶酶原激活剂(tPA)和血纤维蛋白溶酶)或其混合物。
在一个实施方案中，缀合物只包含一种第二物质。
在另一个实施方案中，缀合物包含两种第二物质。
在另一个实施方案中，缀合物包含三种第二物质。
在另一个实施方案中，缀合物包含更多种第二物质。
第二物质可与纳米P3材料直接物理或化学结合，或第二物质可经由连接部分连接。第二物质可经修饰以包含此连接部分。连接分子可由于诸如pH、热量或光线的环境变量变化而发生体外或体内降解以释放第二物质。或者，连接子可由细胞中天然存在的酶裂解。例如，可裂解的连接分子，诸如pH可降解连接子，可释放第二物质，所述第二物质在体内为药物分子。
缀合物的尺寸使得能够通过通透性增强与滞留(EPR)效应被动靶向肿瘤细胞或肿瘤组织。通过这种EPR效应，缀合物可由于血管生成肿瘤血管的内皮不连续的紊乱病理学而在实体肿瘤中被动积聚，导致对大的高分子渗透性过高且缺乏有效的肿瘤淋巴引流。
药物组合物
本文公开包含如本文定义的纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物以及药学上可接受的载剂、赋形剂或粘合剂的药物组合物。在一个实施方案中，纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物是药学上可接受的。在本文公开的药物组合物中，第二物质可为治疗剂或诊断剂。
如本文所用，“药学上可接受的载剂、赋形剂或粘合剂”包括赋形剂或在生理学上相容且对如本文所述的化合物或其用途无害的药剂，诸如溶剂、稀释剂、分散介质、涂料、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。所述载剂和药剂用于制备药物活性物质组合物的用途在本领域中熟知(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版；Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,PA,2005)。
药学上可接受的组合物可在使用前进行稀释。合适的稀释剂可选自例如：林格氏溶液(Ringer’s solution)、哈特曼氏溶液(Hartmann’s solution)、葡萄糖溶液、盐水溶液和无菌注射用水。
如本文所用的术语“组合物”欲涵盖包含规定量的规定成分的产物，以及由规定量的规定成分的组合直接或间接产生的任何产物。
本文中，“药学上可接受的”意思是纳米P3材料(即，纳米颗粒聚合物或聚集体)或其缀合物以及载剂、稀释剂或赋形剂必须与药物组合物的其它成分相容，且对其接受者无害。纳米P3材料(即，纳米颗粒聚合物或聚集体)或其缀合物应能够接触接受者的组织，而无过度毒性、刺激、过敏反应或与医学专业技术人员或兽医所识别的合理效益/风险比相当的其它潜在并发症。另外，纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物应与将作为药物传递给个体，例如传递给动物或人类的任何组合物中的载剂和/或赋形剂相容。
应了解，在某些情形下，纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物非药学上可接受的且这些在本发明的范畴内。然而，为了用于医药制剂中，在一些实施方案中，纳米P3材料(即，纳米颗粒聚合物或聚集体)或其缀合物是药学上可接受的化合物。非药学上可接受的纳米P3材料(即，纳米颗粒聚合物或聚集体)或其缀合物可适用于制备药学上可接受的纳米P3材料(即，纳米颗粒聚合物或聚集体)或其缀合物。
本发明的组合物可含有如下文所述的其它治疗剂，且可例如根据诸如药物制剂领域熟知的技术，通过采用常规的固体或液体媒剂或稀释剂以及适合所需施药模式的类型的药物添加剂(例如，赋形剂、粘合剂、防腐剂、稳定剂、调味剂等)来配制。
本文定义的纳米P3材料(即，纳米颗粒聚合物或聚集体)或其缀合物可通过任何合适的方式来施用，例如肠道外，诸如通过皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或脑池内注射或输注技术(例如，以无菌可注射水溶液或非水溶液或悬浮液的形式)。
药物制剂包括供口服、直肠、经鼻、局部(包括口腔和舌下)、肠道外施药(包括肌肉内、腹膜内、皮下和静脉内)或以适合通过吸入或吹入施药的形式的那些药物制剂。因此，纳米P3材料(即，纳米颗粒聚合物或聚集体)或其缀合物可与常规的佐剂、载剂或稀释剂一起呈药物组合物及其单位剂型的形式，且在所述形式中可采用诸如药片或填充胶囊的固体形式或如溶液、悬浮液、乳液、酏剂或其填充的胶囊形式的液体，全部用于口服或以无菌注射溶液的形式供肠道外(包括皮下)使用。
在一个实施方案中，缀合物可设计为用于缓释应用。例如，缀合物可包含第二物质(诸如，药品或诊断剂)，其可通过可降解的连接子连接至纳米颗粒聚合物或聚集体。连接分子可由于诸如pH或热量的环境变量的变化而体外或体内降解以释放第二物质。例如，可降解的连接子可为光敏性的且允许在适当波长的光作用下，例如通过红外线或激光辐射释放第二物质(诸如，药物、siRNA或RNA)。或者，连接子可由细胞中天然存在的酶裂解。连接子降解可导致稳定或恒定释放药品，以使得可长期和/或相对恒定地治疗病况；或使得可体外或体内追踪受试者体内的诊断剂。
或者，掺入缀合物中的第二物质可为直接与纳米颗粒聚合物或聚集体连接或通过可降解连接子与纳米颗粒聚合物或聚集体连接的前药。本文中，前药为在缀合物中与纳米颗粒聚合物或聚集体结合(使用或不使用连接子)的非活性形式的化合物。在施用于受试者后，非活性形式可代谢为药物活性形式，而前药仍连接至纳米颗粒聚合物或聚集体或已由纳米颗粒聚合物或聚集体释放。
或者，纳米颗粒聚合物、聚集体或其缀合物可掺入局部使用的材料中。例如，纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物可掺入绷带中。
纳米颗粒聚合物、聚集体或其缀合物可掺入适当的支架中以用于切口/伤口或诸如牛皮癣或湿疹等病况的皮肤治疗。
纳米颗粒聚合物、聚集体或其缀合物可用在种植体(诸如心脏补片、血管移植物、种植体)上或用在所述种植体中来促进骨头和其它组织损伤的愈合。
用于施用本发明化合物的药物组合物可便利地呈现为单位剂型且可由医药领域中熟知的任何方法来制备。所有方法都包括使活性成分，例如本文所定义的缀合物与构成一种或多种助剂的载剂缔合的步骤。一般来说，通过使活性成分(例如，缀合物)与液体载剂或细粉状的固体载剂或两者均匀且密切缔合，且随后如果需要，则使产品成形为所需制剂来制备药物组合物。在药物组合物中，包括足以对疾病的进程或情况产生所需作用的量的活性目标化合物。
药物组合物可为无菌注射水性或油质悬浮液的形式。此悬浮液可根据已知技术，使用上文提及的那些合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂来配制。无菌注射制剂也可以是在无毒的肠道外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受媒介物和溶剂为水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，常规采用无菌的不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可采用任何温和的不挥发性油，包括合成的单酸甘油酯或甘油二酯。另外，发现诸如油酸的脂肪酸可用于制备注射制剂。
本文公开的药物组合物和方法可进一步包含通常用于治疗公开的病症或病况的其它治疗活性化合物。可由本领域一般技术人员根据常规的医药原则来选择用于组合治疗的适当药剂。治疗剂的组合可协同作用来实现治疗或预防本文公开的各种病症或病况。使用此方法，能够以较低剂量的每种药剂实现治疗功效，因此降低不良作用的可能性。
当其它治疗剂与纳米颗粒聚合物、聚集体或其缀合物组合采用时，其可例如以医生案头参考手册(Physician Desk Reference，PDR)中所述的量或以本领域一般技术人员确定的量来使用。
然而应了解，用于任何特定患者的具体剂量水平和给药频率可不同且将取决于各种因素，包括所采用的具体化合物的活性、所述化合物的代谢稳定性和作用长度、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施药模式和时间、***速率、药物组合、特定病况的严重程度、以及宿主经历的治疗。
治疗方法
本文中公开一种治疗罹患疾病、病症或病况，易感所述疾病、病症或病况或表现出所述疾病、病症或病况的一种或多种症状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文定义的纳米颗粒聚合物、聚集体或其缀合物或如本文定义的药物组合物的步骤。术语“治疗”在本文中用于涵盖治疗性和预防性治疗。因此，本文公开的治疗方法可涵盖预防疾病、病症或病况的一种或多种症状的方法。应了解，“治疗”可解释为实现疾病、病症或病况的任一种或多种症状的减轻。本文中还公开如本文定义的纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物在制造用于治疗或预防受试者病况的药物中的用途。
此外，本文中还公开一种对受试者体内区域成像的方法，所述方法包括向受试者施用如本文中定义的纳米颗粒聚合物、聚集体、缀合物或药物组合物的步骤，其中至少一种第二物质为显像剂。例如缀合物或药物组合物可包含可由诸如但不限于：磁共振成像(MRI)、X-光、超声波、正电子发射断层扫描(PET)或光声成像的诊断技术检测的造影剂。
在一个实施方案中，如本文中定义的纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物用作药物或用于形成药物。
纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物可按“有效量”提供，例如在向药物组合物中加入适当化合物时。短语“有效量”意思是将对组织、***、动物或人引发施用化合物或包含所述化合物的组合物的研究人员、兽医、医师或其他临床医生所寻求的所需生物学或医学反应的纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物的量。
“有效量”将取决于多种因素，包括特定纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物的功效。受试者的体重和年龄也是本领域技术人员在确定受试者应接受的化合物浓度时考虑的因素。
短语“施用”化合物应理解为意思是向需要治疗的受试者提供如本文定义的纳米颗粒、聚集体或缀合物或包含纳米颗粒、聚集体或缀合物的药物组合物。
纳米颗粒、聚集体或缀合物或包含纳米颗粒、聚集体或缀合物的药物组合物的接受者可为男人或女人。
或者，纳米颗粒、聚集体或缀合物或包含纳米颗粒、聚集体或缀合物的药物组合物的接受者也可以为非人动物。“非人动物”指的是除人类以外的动物界，且包括雄性或雌性脊椎动物和无脊椎动物，且包含：温血动物，包括哺乳动物(包含但不限于灵长类动物、狗、猫、牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、豚鼠、马或其它牛科、绵羊科、马科、犬科、猫科、啮齿类或鼠科动物)、鸟类、昆虫、爬行动物、鱼类和两栖动物。
化合物和药学上可接受的组合物的接受者在本文中称为互换术语“患者”、“接受者”、“个体”和“受试者”。这四种术语可互换使用且指的是如本文定义的任何人类或动物(除非另外说明)。
可使用纳米P3或其缀合物治疗的疾病、病症或病况包括但不限于：急性冠脉综合征、年龄有关性疾病或病症；变应性疾病或相关病况；阿尔茨海默病、siRNA传递、哮喘、HIV、抗生素抗性、动脉粥样硬化、自体免疫性疾病；细菌感染、癌症；痴呆、抑郁症或相关病况；糖尿病；血脂异常、高脂血症、高血压、鱼鳞癣、免疫性疾病；代谢性疾病或病症；神经性疾病或病症；肥胖症；帕金森氏病；疼痛、类风湿性关节炎或增殖性疾病，包括癌症。癌症类型包括：***癌、石棉肺病(间皮瘤)、胆管癌、膀胱癌、骨癌(肉瘤)、肠癌(结肠直肠)、脑和脊髓肿瘤、乳腺癌、类癌瘤(神经内分泌)、***、内分泌癌(甲状腺)、眼癌、胆囊癌、头颈癌(口、鼻和喉)、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤(非霍奇金(non-Hodgkin)和霍奇金(Hodgkin))、黑素瘤、多发性骨髓瘤、食道癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、腹膜癌、腹膜间皮瘤、胸膜间皮瘤、***癌、皮肤癌(非黑素瘤)、软组织癌症、脊柱肿瘤、胃和食道癌、睾丸癌、甲状腺癌、胸腺癌、子宫癌(子宫内膜癌)以及外阴和***癌。
本文所述的纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物可用于诊断测试。例如，缀合物可包含ssDNA的探针序列或其它可杂交分子、抗体、荧光剂、磁性颗粒、酶或可参与特定诊断测试的检测步骤的其它可检测标记，由此识别杂交伴侣的存在。
本文所述的等离子体技术使得能够以完全可控的方式生产和收集纳米P3以供随后作为治疗剂/诊断剂或功能化药剂用于临床用途，或用于非临床用途(例如：作为研究工具用于传递遗传物质；经酶功能化的纳米P3也可用于流化床型流通反应器中以用于食物或化学品加工；对细胞区室成像，合并一级抗体和二级抗体以增加组织学生产量，在动物模型中进行细胞/药物追踪，除此之外还有其它应用)。确定的工艺参数窗口定义纳米颗粒产率、尺寸、表面形态和化学性质。纳米颗粒在活性等离子体气相中产生，使得可直接收集到无菌的临床小瓶中(图1)。等离子体处理是一种广泛使用的杀菌方法，且因此等离子体放电可具有形成纳米颗粒聚合物和聚集体以及对含有颗粒的小瓶进行杀菌的双重作用。得到的含有纳米P3的小瓶随后可以现成的方式用于临床中。每个小瓶中的纳米P3浓度可一致且易于由等离子体沉积参数来控制。在简单的一步法中，临床医师可易于根据患者病况来制备定制的治疗和/或诊断。也可以选择每个小瓶中的纳米P3浓度来优化与适当第二物质的结合及其传递。
衬底
本文中公开一种衬底，其包含如本文定义的纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物。
衬底可由选自但不限于以下的材料形成：玻璃、聚合物、金属和复合物。衬底可来源于天然或合成材料。
衬底可包含生物可降解材料。
纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物可在衬底形成期间掺入衬底中。例如，包含聚合物形成(诸如，聚氨酯)或蛋白质(诸如丝线)以及缀合物的组合物可用于通过电纺的方式形成支架形式的衬底。
纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物可在衬底形成期间或在衬底形成后的后期修饰过程中掺入衬底中或合并至衬底上。
如本文定义的缀合物可合并至衬底或水凝胶上(例如，在伤口部位或组织/骨缺损处)。缀合物可与衬底形成共价键，省略了对衬底进行修饰的任何需要。
衬底可以是不可降解或生物可降解的。当支架为衬底时，与缀合物连接的第二物质可经历缓慢释放，使得可控地传递一种或多种第二物质。
纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物可物理性地陷入衬底中或与衬底化学结合。例如，纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物表面上的化学部分可与衬底上存在的互补部分(例如：醇基、胺基、羧酸基和/或醛基)组合，或可通过纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物内或上的自由基与衬底表面上的基团直接反应或通过中间反应进行反应的共价偶合来进行键结。
或者，纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物可存在于衬底的至少一个表面上。例如，可向衬底施加包含纳米颗粒聚合物、聚集体或缀合物的涂层。
产生纳米P3材料
本文中公开一种制备纳米P3材料(包括纳米颗粒聚合物及其聚集体)的方法，所述方法包括：
i)在反应室中提供至少一种气体；
ii)在所述反应室中向第一电极供电以产生等离子体；
iii)在所述反应室中向第二电极施加电压；以及
iv)收集得到的纳米P3材料；
其中所述至少一种气体包含有机气体。存在的至少一种气体充当单体。
本文中还公开一种制备纳米P3材料(包括纳米颗粒聚合物及其聚集体)的方法，所述方法包括：
i)在反应室中提供至少一种气体；
ii)在所述反应室中向第一电极提供射频(rf)功率以在所述反应室中产生电容耦合等离子体；
iii)在所述反应室中向第二电极施加电压；以及
iv)收集得到的纳米P3材料；
其中所述至少一种气体包含有机气体。存在的至少一种气体充当单体。
本文中还公开一种制备纳米P3材料(包括纳米颗粒聚合物及其聚集体)的方法，所述方法包括：
i)在反应室中提供至少一种气体；
ii)提供射频(rf)功率以在所述反应室中产生电感耦合等离子体；
iii)在所述反应室中向第二电极施加电压；以及
iv)收集得到的纳米P3材料；
其中所述至少一种气体包含有机气体。存在的至少一种气体充当单体。
本文中还公开一种由如本文所述的方法产生的纳米颗粒聚合物或聚集体。
图1显示一种扩大规模生产如本文定义的纳米颗粒聚合物或聚集体及其在生产用于临床用途的治疗剂和诊断剂中的用途的实施例。在第1部分中，所述方法可对纳米颗粒聚合物和聚集体的数量和尺寸提供控制，从而允许明确的且可调节的表面化学和活性。由于在其生产期间存在无菌环境，因此纳米颗粒聚合物和聚集体可直接收集到临床小瓶中。在步骤2和3中，可进行一步式的直接且快速的功能化，因此省略了对复杂的湿式化学步骤以及清洗或纯化步骤的需要。有利的是，选择第二物质意味着可调整产物用于多种治疗和/或诊断。另一优势在于能够扩大工艺的规模(生产纳米颗粒聚合物、聚集体和/或与第二物质的缀合物)。
本文中还公开一种由如本文中定义的方法产生的纳米P3材料。
有机气体可包含烃。烃可为不饱和烃或可包含不饱和烃。
纳米P3可在惰性气体存在下产生。本文中，“惰性气体”指的是在一组给定条件下，诸如在用于制备如本文所述的纳米颗粒聚合物或其聚集体的那些条件下不发生化学反应的气体。惰性气体包括：氦气、氖气和氩气。
在一个实施方案中，步骤i)中的至少一种气体为两种或更多种气体的混合物。一种气体可为不掺入纳米颗粒聚合物或其聚集体中的惰性气体。
步骤i)中的至少一种气体可包含元素周期表中15、16或17族的元素，例如氮气。该气体的片段可掺入纳米P3材料中。例如，氮气的存在在胺、亚胺或腈基或其混合物的存在下可产生纳米P3材料。
气体可在约1至约1500Pa的绝对压力下，例如约6Pa至约67Pa范围内。
反应室可接地。rf频率可为约1至约50MHz。rf功率可为约5W至约500W。可向第一电极、第二电极或向两个电极都施加rf功率。向第一电极施加的rf功率可为脉冲形式或连续形式。向第二电极施加的脉冲偏压可为约-1000V至约1000V。这可以是相对于反应室而言的。向第二电极施加的脉冲偏压可具有约1Hz至约50kHz的频率。其可为脉冲rf偏压。脉冲偏压可具有约1至约150微秒的脉冲持续时间。其可为AC或可为DC。第二电极可接地或可电隔离且使得可获取通过在放电时对电极充电所确定的浮动电位。
第一电极与第二电极之间的距离可为约5至约60cm。
步骤i)可包括对反应室进行排气。其可包括使气体或其个别气体流经反应室。排气步骤可以是达到低于进行步骤ii)和iii)的压力。
此过程可包括将纳米颗粒聚合物和/或聚集体收集在收集器中。收集器可安置于第一电极与第二电极之间。其可接近第二电极。收集器可为可密封的小瓶。其可由导电物质或非导电物质制成。
此过程可包括使纳米颗粒聚合物和/或聚集体暴露于气体。气体可包含氮气、氧气和水蒸气中的一种或多种，或可基本上由氮气、氧气和水蒸气中的一种或多种组成。气体可为空气。气体可为氮气。气体可为与纳米颗粒材料反应的气体。
在一个实施方案中，提供一种制备纳米P3材料的方法，所述方法包括：
i)在反应室中提供约1至约1500Pa绝对压力的气体；
ii)在所述反应室中向第一电极提供约1至约50MHz和5-500W的射频(rf)功率以在所述反应室中产生等离子体；
iii)在所述反应室中向第二电极施加频率为约1Hz至约50kHz且脉冲持续时间为约1至约150微秒的脉冲负偏压，所述第二电极距所述第一电极约5至约20cm；以及
iv)收集得到的纳米颗粒材料；其中所述气体包含烃气体、氮气和稀有气体。
在一个实施方案中，步骤iii)中的电压为自给偏压，其中所述电极通过积聚来自等离子体的电荷而获得浮动电位。
在一个实施方案中，步骤iii)中的电压为脉冲偏压。
在另一个实施方案中，提供一种制备纳米P3材料的方法，其包括：
i)在反应室中提供约6Pa至约67Pa绝对压力的气体；
ii)在所述反应室中向第一电极供应约60至约20MHz和5-200W的射频(rf)功率以在所述反应室中产生等离子体；
iii)在所述反应室中向第二电极施加频率为约1至约5kHz且脉冲持续时间为约10至约30微秒的脉冲负偏压，所述第二电极距所述第一电极约5至约20cm；
iv)将纳米颗粒材料收集在可密封小瓶中，所述可密封小瓶安置在第一电极与第二电极之间且靠近第二电极；以及
v)使可密封小瓶中的纳米颗粒材料暴露于有机物质以使所述有机物质与纳米颗粒材料共价键结且由此产生功能化的纳米颗粒材料，
其中所述气体包含烃气体、氮气和稀有气体。
在另一个实施方案中，提供一种制备纳米P3材料的方法，其包括：
i)在反应室中提供约6至约67Pa绝对压力的气体；
ii)在所述反应室中向第一电极供应约10至约15MHz和5-200W的射频(rf)功率以在所述反应室中产生等离子体；
iii)使第二电隔离电极在所述反应室中获得在放电时由对电极充电所确定的浮动电位，所述第二电极距所述第一电极约5至约20cm；
iv)将纳米颗粒材料收集在可密封小瓶中，所述可密封小瓶安置在第一电极与第二电极之间且靠近第二电极；以及
v)使可密封小瓶中的纳米颗粒材料暴露于有机物质以使所述有机物质与纳米颗粒材料共价键结且由此产生功能化的纳米颗粒材料，
其中所述气体包含烃气体、氮气和稀有气体。
本文中还公开一种用于生产纳米P3材料的设备，所述设备包含：可排气的反应室；安置在所述反应室中且与rf电源耦合的第一电极；安置在所述反应室中且与脉冲发生器耦合或与腔室电隔离的第二电极；与反应室耦合以对所述腔室进行至少部分排气的真空泵；以及用于向反应室中供应一种或多种气体或其混合物的至少一个气体入口。脉冲发生器可为DC或可为AC。
设备另外可包含用于收集纳米P3材料的收集器。收集器可安置在第一电极与第二电极之间。第一电极与第二电极可相距约5与约60cm之间。
图4概括出一种可用于收集纳米P3材料的设备的示意图。示意图例示在维持在C2H2、N2和Ar气态混合物中的电容耦合射频等离子体中收集纳米颗粒的机制。左侧，带负电的纳米颗粒保留在等离子体正电位中并通过离子曳力与衬底相排斥，且电位沿等离子体壳层下降。在此实施方案中，在由底部电极支撑的平坦衬底上沉积薄膜等离子体涂层，而未发现纳米颗粒(参见下方插图)。右侧，与底部电极耦合的外形匀称的纳米颗粒收集器改变等离子体电位。等离子体正电位渗入收集器中，使得可在孔内捕获纳米颗粒(参见下方插图)。在一个实施方案中，例如使用如图4中所示的收集器将纳米P3材料收集在如本文所述的设备中。
本文中还公开本文定义的设备用于生产如本文定义的纳米P3材料的用途。
在制备纳米P3材料的方法的一个实施方案中，对第一电极供应rf(射频)功率以在反应室内产生等离子体且使第二电极浮动并在所述反应室中达到通过其在放电时自发充电所确定的浮动电位。施加给第一电极的rf功率应足以产生和维持等离子体放电。其应足以片段化、解离或电离气体，例如烃气体、反应性不可聚合气体和另一种气体(诸如氮气)的混合物，其片段可掺入得到的聚合材料中。其应足以在由气体解离和片段化产生的等离子体放电中产生自由基物质。其应足以在反应室中形成纳米颗粒材料期间在反应室中维持等离子体放电。
图3概括出可用于形成纳米P3材料的设备。图中显示底部电极(1)、电极支柱(2)、用于底部电极的高压电源接线(3)、外形匀称的纳米颗粒收集器(4)、顶部电极(5)和用于顶部电极的高压电源接线(6)。本文中可使用(3)和(6)的组合。在一个实施方案中，(3)应连接至脉冲高压电源或处于浮动电位(即，不连接电源)，且(6)应连接至射频电源。
rf频率可为约1至约200MHz或约1至25、1至50、1至75、1至100、1至125、1至150或1至175MHz，例如约1、约2、约3、约4、约5、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190或约200MHz。
其可具有约5至约500W或约5至100、5至200、5至300或5至400W，例如约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500W的功率。
脉冲偏压可具有约1Hz至约50kHz或约1Hz至20kHz、1Hz至10kHz、1Hz至5kHz、5Hz至50kHz、10Hz至50kHz、20Hz至50kHz、10Hz至20kHz或20Hz至30kHz的频率。
偏压可为约-1000V至约1000V或-500至500、-200至200、-100至100、-50至50、-1000至0、-500至0、-200至0、-100至0、-50至0、0至50、0至100、0至200、0至500或0至1000V，例如约-1000、-900、-800、-700、-600、-500、-400、-300、-200、-100、-50、0、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000V。
在一些实施方案中，偏压非零。因此其可为正值或负值，且在每种情形下可具有10至1000或20至100、50至1000、100至1000、200至1000、500至1000或100至500V的绝对值。脉冲电压可为关于腔室而言的。
腔室可接地。第二电极可接地。或者，电压可为自给偏压，此为对由等离子体壳层上的电位下降所定义的浮动电极进行充电的结果。脉冲持续时间可为约1至约150微秒、或约1至100、1至50、1至20、1至10、10至150、20至150、50至150、100至150、10至100、10至50或50至100微秒，例如约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150微秒。
脉冲的休止时间与开启时间之间的比率为可为约10(即，10:1)至约20或约10至15、15至20或13至17，例如约10、13、15、17或20。在一些情况下，其可大于10，任选地高达100或高达90、80、70、60、50、40或30。
第一电极与第二电极适当分开，例如相距约5至约60cm、或约5至50、5至40、5至30、5至20、5至10、10至60、20至60、30至60、40至60、10至30或20至40cm，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60cm。第一电极通常将安置在第二电极的上方。
在等离子体产生期间，反应容器内的压力通常在约1至约1500Pa绝对压力之间(约7.5毫托至约115托)、或约10至1500、100至1500、200至1500、500至1500、600至1500、700至1500、800至1500、900至1500、1000至1500、1100至1500、1200至1500、1300至1500、1400至1500Pa，例如约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400或1500Pa。通常为达到此压力，初始时将反应容器抽空至低于此压力，例如低于约10mPa或小于约5、2、1、0.5、0.2或0.1mPa。随后通过使气体或其个别组分气体以充足的速率渗入腔室来实现所需的压力，所述速率与抽速一起调节以在腔室中达到所需的压力和所需的单体停留时间。气体分子在腔室中的停留时间决定了单体和其它气体分子在等离子体中的片段化程度。应了解，所需的流速将取决于反应室的大小，然而通过监测反应室内的压力(例如，通过与腔室内部空间耦合的压力计)，调节流速和抽速来实现所需的压力和气体停留时间是一件简单的事。气体可由个别组分气体在被引入腔室之前来制备，或者气体的个别组分气体可单独地引入腔室中。在后一种情形中，可通过控制不同组分的不同流速来控制气体中组分气体的比率。在气体包含更多种个别组分的情况下，引入腔室的至少一种气体本身可为混合物，或者每种单独的组分气体可离散引入。组分气体包括有机气体，而且也可包含一种或多种载气、一种或多种不可聚合气体以及任选的其它组分气体。
气体包含至少一种有机气体，即含有碳，但并非二氧化碳。至少一种气体为如本文所定义的单体。其可包含碳碳双键和/或碳碳三键。其可为烯烃或炔烃。其可为所述气体的混合物。有机气体在所述方法的条件下为可聚合的。气体可包含一种以上的有机气体。在本发明的情形下，气体视为在反应室中时盛行的温度和压力下呈气态的物质。因此，例如在标准温度和压力下的戊烷为液体，然而在本发明方法的减压下视为气体。在某些情形下，气体也可以是在标准温度和压力下的气体，例如乙炔。
有机气体的流速(或所有有机气体的流速总和)可为约0.1至约4000sccm(标准立方厘米/分钟)或约1至4000、10至4000、50至4000、100至4000、500至4000、1000至4000、2000至4000、0.1至2000、0.1至1000、0.1至500、0.1至200、0.1至100、0.1至50、0.1至10、0.1至1000、0.1至100、0.1至10或0.1至1sccm，例如约0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500或4000sccm。随后可调整载剂和反应性不可聚合气体的流速以实现反应室内所需的压力和停留时间。收集时间可为小于1分钟至约30分钟或1至20、1至10、1至50、5至30、10至30、20至30、5至20、5至10或10至20分钟，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30分钟或可长于30分钟。收集时间可在约30秒钟至约一分钟范围内。
应了解，流速、压力和功率中的任一者都可根据将生产的纳米P3材料的特定所需特性而变化。因此，本文中关于流速、压力和功率中任一者例示的任何数值或范围均可以任意组合一起使用。例如，在一个实施方案中，可使用约0.5至约10sccm的流速、约20Pa的压力和约50W至约100W的功率。本文中设想所有其它可能的组合。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括在步骤i)中引入有机金属化合物。有机金属化合物的实例包括：氧化铁和钆化合物。
在一个实施方案中，如上文所述由等离子体产生的纳米P3材料可收集在一个或多个收集器中，例如如图4中所述的收集器。收集器可靠近第二电极安置。其可安置在第一电极下方。其可安置在第一电极与第二电极之间的第一电极垂直下方。其使得可在活性等离子体区域中捕获纳米颗粒材料。这很重要，因为它控制颗粒聚集。收集器使得可将纳米颗粒材料收集在活性辉光等离子体区域中。在一个实施方案中，收集器为小瓶或多个小瓶，或包含小瓶或多个小瓶。或者或另外，收集器为一个或多个孔，或包含一个或多个孔。所述多个小瓶可为盘中的孔形式。在另一个实施方案中，小瓶或孔可具有约2至约20mm或约2至10、2至5、5至20、10至20或5至10，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mm的深度。在一些情况下，小瓶可比20mm深。
收集器的底部可为完全平面的，或可大体上为平面的(例如，底部边缘可在其与收集器侧壁的接触点处为圆形，或可聚拢形成收集器的侧壁)。收集器底部的表面积可视需要调整以收集优选几何形状的纳米P3材料。类似地，收集器侧壁的高度(即，距收集器底部的距离)可视需要调整以收集优选几何形状的纳米P3材料。
在一个实施例中，收集器侧壁的高度可为1mm至50mm，诸如1mm至40mm，诸如1mm至30mm，诸如1mm至20mm。因此，收集器侧壁的高度可为3mm至17mm。或者，收集器侧壁的高度可为2mm至20mm、或5mm至15mm、或7mm至12mm或任何其它合适范围。在另一个实施例中，收集器壁的高度可为约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm、约15mm、约16mm、约17mm、约18mm、约19mm或约20mm。在一个优选的实施方案中，收集器侧壁的高度为约17mm。根据纳米P3材料所需的几何特性，可选择其它高度。侧壁的高度可根据用于合成纳米P3材料的单体来选择。
孔形收集器的周边形状也可根据纳米P3材料所需的几何特性来调整。孔形收集器的周边形状也可根据用于合成纳米P3材料的单体来调整。仅举例来说，孔形收集器的周边形状可为圆形、正方形、椭圆形、长方形、三角形、五边形、六边形等，或为大体上圆形、大体上正方形、大体上椭圆形、大体上长方形、大体上三角形、大体上五边形、大体上六边形等。
当收集器底部通常为圆形时，可基于预期纳米P3所需的尺寸和产量来选择半径。在一个实施例中，半径可为1mm至50mm，诸如1mm至40mm、或1mm至30mm、或1mm至20mm、或1mm至10mm、或2mm至8mm、或3mm至7mm、或4mm至6mm。或者，半径可为约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm、约15mm、约16mm、约17mm、约18mm、约19mm、约20mm。
收集器侧壁的高度与收集器半径的比率可根据纳米颗粒材料所需的尺寸和产量来调整。在一个实施例中，收集器侧壁的高度与收集器半径的比率为约5:1至0.1:1。例如，收集器侧壁与收集器半径的比率可为约3:1至1:1、或约1.8:1至1:1、或约1.6:1至1:1。收集器侧壁与收集器半径的比率可为约5:1、或约4:1、或约3:1、或约2:1、或约1:1、或约0.8:1、或约0.6:1、或约0.4:1、或约0.2:1。
收集器可为可密封的。因此，小瓶或孔可为可密封的。由于使小瓶或孔暴露于等离子体使其有效杀菌，因此将纳米颗粒材料直接收集在小瓶或孔中提供了在单一步骤中同时收集和对小瓶或孔进行杀菌的一种便利的方式。由于如本文其它处所论述，纳米颗粒材料可用于治疗目的或可用于形成供治疗用途的缀合物和药物组合物，因此杀菌对于其最终用途而言是重要的。收集器可由非导电材料制得，或其可由导电材料制得。其可由能够承受等离子体的材料制得。其可例如由玻璃制得。
在产生并收集纳米P3材料后，反应室可通氮气(即，达到约周围压力)。随后可使纳米P3材料暴露于反应性气体。这可通过将其从等离子体腔室中去除或使反应性气体进入腔室来实现。纳米P3材料，通常是纳米颗粒材料中的自由基部位随后可与反应性气体反应。这可导致形成可用于使纳米P3材料与有机物质(诸如，如本文中所定义的第二物质)反应以使那些有机物质与纳米P3材料连接的官能团。气体通常将为空气或氮气，然而也可使用其它气体。气体可为含有氧气的气体。其可为含有水蒸气的气体。其可含有水蒸气和氧气。或者或另外，纳米P3材料可与第二物质反应，诸如有机物质或有机金属物质，例如显像剂、蛋白质、siRNA、RNA、生物分子、催化剂、药物、全细胞、细胞片段、胶束、脂质体、水凝胶、聚合物颗粒、半导体颗粒、陶瓷颗粒、金属颗粒或其中任意两种的混合物，以使第二物质与纳米P3材料连接，例如共价连接。
本公开提供一种便利的方式来获取多种功能化纳米颗粒。纳米颗粒的尺寸和功能密度可通过调整产生其的条件来调整。例如，通过在等离子体腔室中产生和收集纳米P3材料，可将颗粒密封在无菌的容器中。随后其可随意地由合适的第二物质，诸如有机物质，任选地在使用前不久通过向密封小瓶中注入含有有机物质的合适试剂来功能化。
当在真空室中合成纳米P3材料颗粒时，其中使用含有至少一种烃前体和至少一种缓冲(或载剂)气体的反应性气体混合物来产生低压和低温等离子体放电。通过电感或电容耦合由诸如诸如射频(rf)发生器、dc电源或脉冲dc电源的电源或电源组合所产生并传递至***的功率来产生等离子体放电。等离子体气态放电中的异常功率传递连同缓冲气体的高能激发阈值一起提供了一种通过烃前体分子与等离子体中存在的其它物质(带电物质，诸如电子和离子，或不带电物质，包括由缓冲气体可获得的原子和分子)之间的碰撞来使烃前体分子电离和解离的极为有效的机制。前体分子与另一种物质之间的相互作用引发一系列化学反应，导致形成自由基和高级烃，且最终导致通过成核和聚集过程形成纳米颗粒。使用含烃等离子体放电产生碳基纳米颗粒考虑到确定的可控且可扩展的工艺窗口，其中通过调节各种工艺参数-输入功率、等离子体激发频率、气体混合物、前体停留时间、***压力和放电时间来定义纳米颗粒的尺寸、生产速率、表面化学、形态和自由基浓度。另外，包括诸如氮气的气体不仅可调整纳米颗粒的表面化学性质，而且可调节水溶液中的颗粒分散和聚集。
发明人认为，纳米P3材料由单体(例如烃)和其它气体(诸如氮气)在等离子体放电中解离和片段化而产生。由所述解离机制产生的自由基物质在等离子体体积中重组形成含有未配对电子的纳米P3材料。纳米颗粒结构中捕获的未配对电子随后可用于共价固定生物分子。
本公开包括一种利用脉冲偏压纳米颗粒收集器的收集方法，其中可密切控制纳米颗粒的生长和去除阶段、收集产量和尺寸单分散性。提供给纳米颗粒收集器的电脉冲可由各种时域剖面线和大范围的负值和正值外加电压来调节。脉冲时域剖面线包括方波。这些方波可具有至少1％的占空比。其可具有1Hz至3kHz范围内的频率和-1000V至1000V范围内的外加电压。另外，收集器的特征在于易于在活性辉光等离子体区域中有效且高产率地回收纳米颗粒的孔状几何结构。不同孔的形状、深度及其之间的间距决定了纳米颗粒的收集产率和聚集。具体来说，使用特征为孔半径为0.8cm的24圆形孔的收集器或使用特征为孔半径为0.635cm的96圆形孔的收集器可实现14.4g/hr m2的纳米颗粒产率。可视需要选择其它合适的孔板。
图2简单描绘在纳米颗粒的形成和生长中所涉及的建议机制。在制造过程期间，在不同生长阶段形成具有不同尺寸范围的两组颗粒：第一组颗粒的尺寸达约10nm，且第二组包含直径在约100nm约500nm范围内的颗粒。通过扫描电子显微镜(SEM)成像(参见图2中的插图)分析颗粒形态表明，第二组颗粒(较大的球形颗粒)是第一组纳米颗粒聚合物的聚集体。在初始阶段形成纳米颗粒聚合物，且通过等离子体化学制约其生长(阶段1)。后者基本上取决于单体的类型和目前用于产生放电的其它气体以及由物质停留时间所示的片段化程度和对等离子体放电的能量输入。这些初始纳米颗粒聚合物的形成机制可遵循不同路径且可通过涉及中性自由基或负离子或正离子的生长反应来控制。这些初始纳米颗粒聚合物在等离子体中的数量密度通常超过电子和离子密度。根据准中性原则，这可表明纳米颗粒聚合物的平均电荷接近零。
当纳米颗粒聚合物在等离子体中达到临界尺寸(约5nm至约10nm)时，带负电和带正电的团簇开始聚集在一起形成第二组的较大颗粒，聚集体(阶段2)。在此阶段期间，所有生长颗粒如同等离子体中存在的电子和离子的沉槽，其中由等离子体壳层动力学支配带电物质向其扩散。这种现象在图5中得到证实(图像B和C)，其中与分子离子和其它不带电物质相关的发射带之间的比率的时间演化显示与总的等离子体光谱呈反相。具体来说，在聚集和生长阶段观察到离子群体快速减少，表明在阶段2期间可进一步消耗离子物质。在聚集和快速生长阶段期间，在生长的颗粒周围形成球形壳层。这种球形壳层的发展最可能是导致形成诸如图2中所示的具有球形形状的聚集体的原因。由于电子较高的移动性，电子比正离子更快速地向颗粒扩散。因此，生长的颗粒带负电且通过吸引更多带正电的团簇和正离子来增强其生长。在达到临界尺寸(这取决于等离子体参数)和临界密度后，颗粒表面上聚集的负电荷抑制纳米颗粒聚合物进一步聚集。
由于颗粒带负电，因此由于静电力而使其局限在正等离子体电位区。一旦颗粒达到临界尺寸和质量，作用在颗粒上的其它力变得更占优势(例如，离子曳力、热泳力、气体粘滞力和重力)并克服静电力，迫使颗粒被从其产生和生长区中推出。颗粒的去除导致形成无颗粒区且为新的产生和生长循环以及后续去除和收集新形成的颗粒留出空间(第3阶段)。在此阶段期间，放电的总发射强度减小。另外，等离子体中的相对离子比例再次增加，表明由于离子向颗粒扩散而不再被消耗。
在纳米P3收集器中施加的电压可调节颗粒形成和去除阶段的动力学。尽管如果不施加偏压，聚集和去除阶段具有相同的持续时间，但是将负电压增加至高达-500V促使纳米颗粒的去除阶段更长。增加偏压增强了对生长中的纳米颗粒施加的电力。因此，有必要进一步增加纳米颗粒质量以使重力克服持续的电力并将颗粒推离放电体。因此，聚集阶段更长导致纳米颗粒聚合物进一步聚集且因此导致其消耗，从而形成更大的纳米P3材料。控制纳米颗粒收集器的偏压提供一种从收集器滤除较小纳米颗粒聚合物的方法，因此增强所收集的纳米P3材料的尺寸单分散性。如聚集和去除阶段突然减少以及纳米颗粒产率减少所示，进一步增加施加的偏压阻止纳米颗粒聚合物聚集和后续的颗粒形成。
纳米P3的形成可显示为是一个周期性过程，其中在单次运行期间可产生并连续收集具有相同特征的颗粒的连续产生。如图5中所示，例如通过收集等离子体发射的辐射并通过光发射光谱法(OES)对其进行分析来直接观察颗粒形成的这种周期性行为。
本文公开的方法可使用特征为24个圆孔且孔半径为0.8cm的收集器回报14.4g/hrm2的纳米颗粒产率。
产生缀合物
本文中公开一种形成缀合物的方法，所述方法包括：
●提供：
i)纳米颗粒聚合物、聚集体或其混合物；和
ii)至少一种第二物质；以及
●使纳米颗粒聚合物或聚集体与至少一种第二物质接触以使得所述纳米颗粒聚合物或聚集体与所述至少一种第二物质在物理上或化学上相互缔合。
纳米颗粒和/或聚集体可由本文所述的方法制得。
在缀合物形成期间，至少一种第二物质可与纳米颗粒聚合物或聚集体共价或静电结合。
形成缀合物的方法可包括使纳米颗粒聚合物或聚集体与至少一种第二物质(诸如，有机物质或有机金属物质)反应以使所述第二物质与所述纳米颗粒聚合物或聚集体键结，例如共价键结，且由此产生功能化纳米P3材料形式的缀合物。使纳米颗粒聚合物或聚集体反应的步骤可包括使纳米颗粒聚合物或聚集体在0至约30℃的温度下暴露于所述第二物质。该方法可包括使纳米颗粒材料暴露于所述第二物质持续约1分钟至约24小时的时间。可将纳米颗粒材料收集在收集器中，在此情形下反应步骤可包括将第二物质引入收集器中。第二物质可呈溶液或分散液或悬浮液的形式。
在一个实施方案中，通过一锅式反应形成包含纳米P3材料和至少一种第二物质的缀合物。
一种以上的第二物质可与纳米P3材料组合形成缀合物。向纳米P3材料中加入两种或更多种第二物质可通过单次的一锅式反应或相继的单独反应来进行。在一个实施方案中，通过一锅式反应在纳米P3材料与至少两种第二物质之间形成缀合物。在另一个实施方案中，通过可连续的两次单独反应在纳米P3材料与至少两种第二物质之间形成缀合物。
在缀合物形成后，能够结合一种或多种其它第二物质的其它位点可例如以未结合电子或功能性部分的形式保留在缀合物上，所述未结合电子或功能性部分可通过连接第二物质被引入至缀合物上。如果两种第二物质由于诸如迥然不同的溶解度概况的不同化学特性而无法通过单一步骤引入，或在需要保护基化学来维持特定部分时，这是有利的。
一旦形成缀合物，掺入纳米颗粒单体中的官能团或在缀合物形成后引入的第二物质上存在的官能团可能可在后续步骤中用于连接其它第二物质。
纳米颗粒聚合物或聚集体与第二物质的偶合可为快速的且可在温和条件下进行。偶合条件暂时改变以促进带电物质的结合。因此，反应可基本上在30分钟内或在20、25、10、5分钟、1分钟或小于1分钟内完成(例如，完成90％、95％或99％)。反应可在周围条件下进行，或在约0℃与约50℃之间、或在约0℃与30℃之间、在0℃与20℃之间、在10℃与50℃之间、在20℃与50℃之间、在30℃与50℃之间、在10℃与30℃之间或在20℃与30℃之间，例如约0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或50℃的温度下进行。应意识到，较高温度将促进更快速的反应；然而，反应应在第二物质(对于诸如生物分子的有机物质而言)稳定的温度下进行。此温度将取决于用于缀合过程中的第二物质或第二物质混合物的性质。
因此，本文中描述一种针对特定应用的功能需求定制的允许多种不同分子货物化学缀合的基于纳米颗粒的技术。通过使分子货物与颗粒中嵌埋的自由基和/或官能团部分直接键结可易于实现纳米P3材料的功能化。将生物分子固定到纳米P3材料上可为一步过程，通过简单培育来实现，而不需要中间涂层、预先功能化以及使用有机分子或其它化学中间物的钝化步骤。因此，本文公开的产生纳米P3材料的方法可不包括任何涂层、预先功能化、钝化步骤或这些步骤的任何混合形式。纳米P3材料的有利表面化学是等离子体放电制造过程的结果，涉及在放电体体积中的形成和生长阶段期间将单体自由基和官能团扩散并聚集到生长颗粒上。此外，建议的制造和收集方法使得可控制纳米P3材料的特性，具体来说可通过调整等离子体参数来控制其尺寸、自由基含量、形态、表面化学、聚集和生产收益率。
本文公开的工艺和方法可包括设定等离子体参数(气体压力、功率、频率、脉冲长度、电压等)的步骤来实现纳米P3材料的所需特性或特性组合。
固定的生物分子可在固定于纳米P3材料的表面上之后保持其生物活性。裸的纳米颗粒和生物分子缀合的纳米颗粒均可易于由各种细胞类型内化，且在所有测试的浓度下在细胞中均未诱发细胞毒性。另外，药物缀合的纳米颗粒在由癌细胞内化后可保持细胞毒性能力。重要的是，纳米颗粒的共价固定能力和生物分子缀合的纳米P3材料的生物活性证实在长期冷冻干燥储存例如至少约1个月或至少约2、3或6个月或至少约1、2、5或10年后仍保持。本文公开的工艺和方法是生产和使用等离子体纳米颗粒作为新一类的多功能和通用纳米载体供纳米医学应用的便利方式。
目前的纳米颗粒功能化策略依赖于几种用于增加活性表面化学的表面修饰方法，主要包含非离子性聚合物和用于靶向药物传递的特异性靶向配体。然而，这代表着制造方法中需要额外中间、复杂、耗时且昂贵的步骤。此外，目前在纳米载体上使用的涂层只提供了极差的药物负载能力。如本文所述的纳米P3材料的独特表面化学性质使得能够与货物强烈共价键结，而不需要中间的功能化策略。这意味着所定义的纳米P3材料具有极大潜能来克服目前可用平台的主要限制之一。由本文列举的方法产生的颗粒可在制造后直接通过简单的一步法来功能化，且以适合治疗、成像和诊断的特定应用的定制功能来出售。
已证明纳米P3可通过自由基连接和/或通过官能团部分来共价固定不同的分子货物，同时维持分子的生物活性。已进行进一步的体外分析来评估不同类型细胞的吸收。结果显示纳米P3可易于被细胞吸收，而不需要任何特定的细胞渗透剂。纳米P3材料为生物相容的且具有良好耐受性，在吸收后长达4天后无细胞毒性迹象，而药物缀合的纳米P3有效诱发癌细胞的细胞毒性。另外，纳米P3可在细胞内传递siRNA，在细胞吸收48小时后显著减少蛋白表达。
包含分子混合物的缀合物可包含诸如抗体或蛋白的靶向配体来靶向患病组织；包含显像剂使得颗粒可实时追踪靶组织和/或包含治疗性蛋白或小分子，诸如药物，使得可形成多功能的纳米载体。本文公开的纳米P3材料的自由基介导的结合能力以使所有配体与纳米颗粒结合的方式导致蛋白质和药物浓度注入纳米P3材料小瓶中，不留下游离的蛋白质或药物。5分钟快速培育后，得到的药物负载缀合物溶液可通过不耗时的湿式化学、预缀合、清洗或纯化步骤注入患者体内。这促进了此技术提升并转化供医院临床使用。
发明人证实，可能在纳米颗粒制造至少2个月后使生物分子与空气中(室温下)储存的纳米颗粒成功缀合且纳米P3固定货物的能力在室温空气中储存的前6个月期间实际上保持不变。储存长达16个月的纳米P3样本还保留了结合大量货物的能力，并且在所述储存时间后观察到的结合效率的任何轻微降低均可简单地通过增加溶液中的货物浓度来克服。当储存在水中(室温下)时，纳米颗粒中的自由基密度在制造1至2周后减小70％。如果在制造后将纳米P3材料储存在室温空气中1至2周，纳米颗粒的自由基密度仅减小44％。通过在收集后即刻在真空条件下将小瓶密封在等离子体腔室中并将纳米颗粒储存在低温下，可将预缀合的货架期显著改善至多个月或几年。
实施例
现通过以下非限制性实施例进一步描述本公开。
材料和方法：
纳米P3的合成
使用图2中概述的程序来合成纳米颗粒。
在圆柱形不锈钢电容耦合射频(rf)反应器中合成纳米P3颗粒。使用由EbaraPDV250和涡轮分子泵(Edwards NEXT400)组成的双干式真空泵***将反应器抽气至约10-6托的基准压力。使用氩气、氮气和乙炔的反应性气态混合物来维持等离子体放电并通过位于腔室顶部的喷头状设备引入。由Allicat Scientific质量流控制器个别地控制每种气体的流速，并由满量程计量器(PFEIFFER PKR251)来测量工作压力，除非另有说明，之后将等离子体产生恒定维持在150毫托。在腔室和抽气***之间安置蝶式阀，并进行调节来控制抽气效率且因此控制物质在活性等离子体中的停留时间。通过使用目的构建的匹配网络使由13.56MHz(Eni OEM-6)频率发生器供应的rf功率与顶部电极耦合来产生和维持等离子体放电。将纳米颗粒收集器安置在第二电极(距rf电极10cm)中，所述第二电极电连接至DC高电压脉冲发生器(RUP 6-25)以提供-1000V至0V范围内的特定偏压。脉冲频率和时间宽度分别选择为3kHz和20μs。
光学发射光谱法
由安置在直接位于纳米颗粒收集器上方的等离子体区域视线范围内的光纤来捕获等离子体发射的辐射。由UV-VIS-NIR分光计(光谱分辨率为约0.2nm的Ocean Optics HR4000)监控放电光谱并由覆盖200-1000nm波长范围的个人电脑来记录。为改良信噪比，将积分时间设定为300ms，扫描10次以对每个获取值进行平均值。使用装配有1200个凹槽mm-1光栅的Acton SpectraPro 2750分光计(Princeton Instruments,USA)获得高分辨率光谱，对于在50μm下开启的入射狭缝产生0.014nm的标称分辨率。通过与分光计的出口平面光耦合的具有1024x 1024-像素阵列PI-MAX(Princeton Instruments,USA)增强型电荷耦合装置(ICCD)来捕获放电发射光谱。ICCD的曝光时间为300μs且平均获取数在25和150之间。整个光学设置在整个实验期间保持不变。进行特定测量以获得与等离子体中涉及几种物质的特定辐射跃迁相关的强度时域剖面线(图2)。
X射线光电子光谱法
使用装配有半球形分析仪和Al Kα单色X射线源的SPECS-XPS(德国)，通过X射线光电子光谱法(XPS)来研究对纳米颗粒的化学表征。在约10-9托的恒定压力下，以90°的射出角在200W的功率下操作***。使用1eV的能阶和30eV的能量通量，在50eV-1400eV的能量范围内扫描样本的勘测光谱。以0.03eV的能阶和23eV的能量通量记录C1s、N1s和O1s的高分辨率扫描。使用CasaXPS软件进行峰值分析。通过计算C1s、N1s和O1s峰的积分面积并假定其总和为100％(即，忽略氢和痕量的其它元素)来确定这些元素在颗粒中的原子分数。通过采用Shirley背景和每个组分具有相同半值全宽的回旋状洛伦兹(Lorentzian)(30％)-高斯(Gaussian)(70％)线形来进行峰拟合。在所有光谱中，通过对C1s峰中的C-C/C-H组分指定约285eV的结合能来施加电荷补偿。
傅里叶变换光谱法
使用整合在Vertex v70***中且装配有具有锗晶体的20×ATR物镜的BrukerHyperion FTIR显微镜，通过傅里叶变换光谱法以衰减全反射模式(FTIR-ATR)记录红外光谱。在4000cm-1至750cm-1的波数范围内，在4cm-1的光谱分辨率下对总计500次扫描进行平均得到每个光谱。应用谱减法和基线从潜在的基底中消除背景信号。
扫描电子显微镜法和能散X射线光谱法。
在3kV-10kV范围的加速电压和4mm与8.5mm之间的工作距离下，使用Zeiss ULTRAPLUS扫描电子显微镜法对纳米颗粒成像。
电子自旋共振光谱法
通过使用Bruker EMXplus X波段分光计的ESR光谱法对纳米颗粒中的未配对电子进行检测。以3490G的中场、90ms的采样时间、3G的调制幅度、105Hz的调制频率以及分别9.8GHz的微波频率和25mW的功率收集光谱。将纳米P3材料悬浮在超纯水中且以150μL的样本体积容量在石英玻璃Suprasil扁平细胞内部转移。通过将纳米颗粒的双重整合光谱与已知自旋线密度(约1013转/cm)的标准样本相比较来进行定量EPR分析。
ζ-电位
通过使用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments,Germany)测量一次性折叠毛细血管细胞(Malvern,DTS1070)中的ζ-电位来确定纳米P3和缀合纳米P3材料的表面电荷。计算平均值和相应的标准偏差(S.D.)；n＝3。
体内成像
在4℃下，使纳米P3在不含核酸酶的水中以2.5μg/ml与来自北美萤火虫(Photinuspyralis，abcam，L9506)的荧光素酶缀合持续1小时，使用Bio RS-24微型旋转器轻微搅动。以相同的方式进行荧光素酶与200nm金纳米颗粒(Cytodiagnostics；G-200)的缀合。培育后，将纳米P3样本通过以16,100g离心清洗3次，每次在不含核酸酶的水中清洗5分钟，而同样根据制造商说明将金纳米颗粒清洗3次。随后将每种样本再悬浮于100μl盐水中且转移至1ml的注射器中。
动物分成4个不同的组：
(1)无干预；
(2)只有纳米P3；
(3)金纳米颗粒和荧光素酶，以及
(4)纳米P3和荧光素酶。
随后在小鼠背部切开伤口，之后进行尾静脉注射。为检测荧光素酶，在每个测定时间点，向每只动物皮下注射D-荧光素(Sigma-Aldrich；A1888)。随后通过IVIS***在伤口侧检测生物发光(曝光时间：3min)。
合成缀合物的通用方法
在具有RT-PCR级别水(Life technologies,4387936)的组织培养罩中，在无菌条件下由纳米颗粒收集器收集纳米P3。由NanoSight NS300测量纳米P3的浓度。在4℃下将纳米P3以所需第二物质培育1小时以形成缀合物，且使用Bio RS-24微型旋转器轻微搅动。培育后，通过以16,100g离心将样本清洗5min。
实施例1-纳米P3的合成
使用上文“纳米P3的合成”部分中概述的方法制备纳米颗粒聚合物和聚集体。应了解，其它纳米颗粒聚合物和聚集体可由除乙炔以外的其它单体形成。
通过控制烃单体在等离子体体积中的聚合，例如通过使用炔烃放电，发明人能够设计和收集功能性的纳米颗粒聚合物和聚集体并证明其固定能力，促进多功能的纳米载体。在一个实施例中，纳米颗粒聚合物和聚集体可在先前研发的用于沉积等离子体聚合物薄膜的等离子体聚合反应器中合成(M.Santos等人,ACS Appl.Mater.Interfaces,8,9635-9650,2016；G.Yeo等人,ACS Biomater.Sci.Eng.,2(4),662-676,2016；其内容以引用的方式并入本文中)。可使用非侵入性原位光学发射光谱法来实时监控纳米颗粒聚合物和聚集体的形成(图2)。初始时由总等离子体发射强度增加32％揭示小纳米颗粒聚合物(约10nm)的形成(图2“团簇凝聚之前”)。当静电悬浮于放电体中时，纳米颗粒聚合物随后快速凝集形成高度球形的聚集体(约100nm)。聚集阶段与放电发射的快速增涨以及收集的聚集体密度增加5倍相一致(图2“团簇凝聚期间”)。当作用于颗粒上的净力将其推出等离子体时，放电发射恢复到在生长周期开始时记录的基线值。在此去除阶段期间，落下的颗粒被吸引到外形匀称的脉冲偏压收集器中，使得可控地收集具有明确的且单分散性尺寸的纳米P3。尽管先前报道炔烃放电特征中的振荡随时间而衰减(J.Winter等人,Plasma SourcesSci.Technol.,18034010(8pp),2009)，但发明人通过向反应器中加入N2(参见方法)来稳定纳米颗粒形成，从而使得可不间断地形成和收集纳米颗粒。
图2描绘显示在等离子体/气相中形成、生长和收集纳米颗粒聚合物和聚集体的示意图。插图显示等离子体在纳米团簇凝聚之前和在此期间的图像以及所收集的聚集体的SEM显微图。
为调节纳米颗粒聚合物和聚集体的特性并优化收集率，将等离子体维持在一系列不同的气流、rf功率和压力的条件下。发明人通过调节以下因素使纳米颗粒聚合物和聚集体的产率最大化：
(i)与放电体耦合的功率；
(ii)放电体压力；
(iii)单体流速；和/或
(iv)收集器尺寸。
在较高单体流速下由于初始形成的纳米颗粒聚合物凝集形成球形、固体状且无定形的聚集体而尺寸减小，因此纳米颗粒聚合物和聚集体表面积/体积比最大化。增加rf功率也使得可产生较高产率的纳米颗粒和较小的聚集体，同时保持低的多分散指数。图5中说明被理解为在纳米P3合成期间在收集孔外部和内部作用于纳米P3上的力。左侧的颗粒示意图假定垂直平衡位置接近在衬底支架上方形成的等离子体壳层。此位置由静电力和重力、中性曳力与离子曳力的垂向分量之间的平衡来定义。离子曳力的水平分量，即朝向反应器侧壁的应有离子通量最终在纳米颗粒到达衬底表面之前将其从活性等离子体中拉出。相反，右侧的颗粒由于等离子体正电位渗入孔中而被捕获。重力和曳力随着颗粒尺寸增加克服静电力，将其拖向孔的底部。离子曳力的水平分量在孔中相互抵消。
颗粒聚集可由孔的高度(h)和半径(r)来调节。图6的A部分显示等离子体正电位无法完全渗入整个孔。尽管颗粒在活性等离子体中通过库仑排斥(Coulomb repulsion)相互排斥，但孔中出现的余辉区域在颗粒到达底部之前触发颗粒聚集。插图显示孔中收集的纳米P3聚集体的SEM图像，其中h1＝17mm且r1＝7.8mm。图6的B部分显示孔中余辉区域的延伸范围减小，其中h1＝11mm且r1＝3.4mm，使得可收集具有最小程度聚集的纳米P3。因此，可改变收集器的尺寸以产生优选尺寸的纳米颗粒和聚集体。
图7图像A显示在制造纳米P3期间获得的等离子体的总体光发射谱。本文中，在电容耦合射频反应器中，在13.56MHz的激发频率、50W的输入功率和80毫托的总气压下，使用乙炔(碳前体)、氮气和氩气的反应性混合物产生颗粒。在-500V的电压和3kHz的频率下，使用20μs脉冲使颗粒收集器偏压。
图7的图像B中显示与放电体中的几种辐射相关的分子发射带和原子谱线的时域剖面线。等离子体光谱的时间演化不遵循稳态行为，而是表现出明确的长期尺度波动。观察到的振荡与纳米颗粒的形成和生长周期以及其后续从等离子体体积中去除有关(数量对应于图2中描绘的不同阶段)。与分子离子和其它不带电物质相关的发射强度之间的比率的时域剖面线显示与等离子体光谱的时域剖面线反相(图7，图像C)。这表明在团簇凝聚和快速生长阶段可进一步消耗离子。
图8图像A显示收集器中每单位面积的纳米颗粒数量以及在放电体体积中在纳米颗粒形成和生长期间的不同时间点在380nm下测量的发射强度。纳米颗粒密度和发射强度在76秒和85秒之间(图2中的阶段2)突然增加表示快速聚集阶段，其中小团簇成核而形成更大的球形纳米颗粒。发射强度在去除阶段(3)期间减小，其中如由所收集的纳米颗粒的数量不变所表明，不再产生颗粒。图8图像B显示由动态光散射测量的，在不同时间点收集的纳米颗粒在放电体中的尺寸分布。在快速聚集阶段(≥76秒)期间和之后收集的纳米颗粒的特征在于尺寸分布较窄，这是由于较小的团簇完全成核。
图9也显示团簇凝聚(阶段2；生长阶段)和颗粒去除(阶段3；去除阶段)的持续时间随纳米颗粒收集器中的外加偏压而变化。
使用本文所述的方法产生纳米颗粒使得可视一个或多个工艺参数和在点燃等离子体后收集颗粒的时间来精细控制颗粒的生长速率。图10图像A显示由SEM测量的随单体流速变化的颗粒直径。因此，本文公开的纳米颗粒聚合物和聚集体的尺寸可通过改变其制造工艺的一个或多个参数来调节。例如可通过减小流速来增加本文公开的纳米颗粒聚合物和聚集体的尺寸。相反，可通过增加流速来减小本文公开的纳米颗粒聚合物和聚集体的尺寸。应了解，本文公开的纳米颗粒聚合物和聚集体的尺寸可通过改变其制造工艺的一个或多个其它参数来调节。例如，可通过减小射频功率来增加本文公开的纳米颗粒聚合物和聚集体的尺寸。相反，可通过增加射频功率来减小本文公开的纳米颗粒聚合物和聚集体的尺寸。
控制纳米粒度对于特定定制用于不同纳米医学应用而言是重要的。例如，已知颗粒注入后的生物分布和药物动力学取决于纳米颗粒的尺寸。在图10的图像B中进一步例示使用脉冲偏压颗粒收集器对所收集的纳米颗粒的尺寸分布的重要性。与在无偏压收集器中获取的纳米颗粒的更具多分散性的尺寸相比(图10，图像C)，发现使收集器偏压(图10，图像B)改良了所收集的纳米颗粒的尺寸选择性。本文定义的产物的另一有利特征在于紧密调节纳米颗粒材料的尺寸分布的能力。SEM成像显示，纳米颗粒具有极窄的尺寸分布，全部具有大致相同的直径(图10，图像D)。颗粒的单分散尺寸分布是由本发明所述方法产生的纳米颗粒的固有特征。
另外，纳米颗粒的特征在于与目前可用的球形纳米颗粒平台(例如，球形金纳米颗粒和其它球形金属或聚合物平台)相比，表面积容积比大。与光滑的球形表面相比，表面积增加直接源于涉及小团簇聚集形成较大的球形花椰菜样颗粒的制造工艺。通过调整等离子体参数，可能调节纳米颗粒的表面积。图10的图像D显示在使用不同碳前体流速的不同等离子体运行中合成的纳米颗粒。在此实验中，所有其它等离子体参数(例如，缓冲气体的压力、功率和流速)保持恒定。单体流速增加(从左向右)导致产生具有更粗糙表面的纳米颗粒，即表面积更大的颗粒。因此，本文公开的纳米颗粒聚合物和聚集体的表面粗糙度可通过改变其制造工艺的一个或多个参数来调节。例如，本文公开的纳米颗粒聚合物和聚集体的表面粗糙度可通过增加单体流速而增加。相反，本文公开的纳米颗粒聚合物和聚集体的表面粗糙度可通过减小单体流速而减小。
增加碳源分子的流速导致其密度增加，这导致更高的中性曳力拖曳团簇离开等离子体。另外，这些碳物质的解离和离子化减少也预期是由于其在等离子体中的停留时间减少。因此，初始团簇的生长在允许其聚集且形成更大的颗粒之前的早期阶段受到抑制。因此，更高流速的方案引起团簇甚至更快速地聚集形成特征在于尺寸更小但团簇量更高的纳米颗粒。应了解，如本文中公开的较小纳米颗粒或聚集体和/或具有更粗糙表面的纳米颗粒或聚集体可增加纳米颗粒和/或聚集体的表面积/容积比。因此，本文公开的纳米颗粒和/或聚集体的表面积/容积比可通过改变其制造工艺的一个或多个参数来调节。例如，本文公开的纳米颗粒和/或聚集体的表面积/容积比可通过改变单体流速来调节。
大的表面积容积比对于纳米颗粒而言是一种有利特征，尤其是在治疗应用中，允许每个纳米颗粒具有更高的药物负载能力，增加药物效率且因此减小毒性。改善纳米颗粒的有效表面也为以用于识别靶细胞的靶向配体、用于控制传递、成像的刺激物敏感剂以及治疗剂或甚至单一稳定构筑物中的多种药物进一步表面功能化(而不损害药物负载)留有额外的空间。例如在医学成像领域，对于多模态成像的需求日益增加。多模态成像技术目的在于将解剖学成像技术(关于结构细部)与功能性成像技术(关于功能和形态细部)组合成一种用于在时间和空间上同步获取图像的独特平台。因此，需要将所有必要的成像造影剂掺入单一平台中。纳米颗粒聚合物或聚集体的表面可由几种造影剂来功能化，而且由于其表面积较大，因此可实现增强的信号和解析度。最后，可通过选择适当的收集器几何结构来控制去除和收集阶段期间的纳米颗粒聚集。当使用孔深度为17mm的收集器时，发现形成微米尺寸的聚集体(图10，图像E，右手侧)，而若使用只有3mm的孔深度，则收集到无聚集体的样本(图10，图像E，左手侧)。
分析表面化学性质和化学缀合能力
结果表明，对于在乙炔/氮气/氩气等离子体放电体中产生的纳米颗粒而言，在氮气存在下使用乙炔产生的纳米颗粒和聚集体主要包含碳和氮(图11)。预期也存在氢气，然而其使用此技术无法检测。使用X射线光电子能谱更详细分析纳米颗粒的表面元素组合物和键结构型。结果显示存在相对浓度分别为65.6％、27.6％和6.8％的碳、氮和氧。因此，本文公开的纳米颗粒和/或聚集体可包含相对浓度分别为60-70％、20-30％和5-10％(例如，如由X射线光电子能谱测定)的碳、氮和氧。
图11中的图像A和B分别详示高分辨率的XPS C1s和N1s芯能级及其相应的去卷积。四个分量可指定为C1s峰位于284.9eV、286.3eV、287.8eV和289.4eV处。对应于最低能量电子结合能的第一峰对应于无定形网状物中的纯碳构型以及C-H键，第二和第三峰对应于在各种环境下与氮和氧原子的不同碳杂化，诸如C-O、C＝O、C-N、C＝N和腈基，且第四峰对应于各种COO化合物。XPS N1s峰(图11B)也可去卷积为4个不同分量。第一峰位于398eV处且指定为与两个碳原子键结的氮，诸如在吡啶-N形式化合物中发现的那些；或指定为与sp3-杂化碳原子键结的sp3氮原子。峰以399.2eV为中心的第二分量指定为腈基和胺基。峰以400.4eV为中心的第三峰归为与三个sp2碳原子三角键结的氮，如同在石墨-N结构中，或归为在无定形CN网状物中与两个sp2和一个sp3碳原子键结的氮原子。位于402.0eV处的第四峰归为一氧化氮化合物。
以衰减全反射模式测量的傅里叶变换红外光谱(FTIR-ATR)证明由XPS获得的结果。图11中的图像C显示在3750cm-1-750cm-1波数范围内获得的典型红外光谱。此光谱的特征为位于3600cm-1-2800cm-1之间和位于1750cm-1与1050cm-1之间的两个宽的吸收谱带。第一个谱带可归为O-H(约3500cm-1)、N-H(约3300cm-1和约3200cm-1)以及C-H(约2880cm-1、约2935cm-1和约2970cm-1)伸缩振动，而第二个较宽的谱带指定为C＝O(约1715cm-1)、C＝C(1640cm-1-1680cm-1)、C＝N(1640cm-1-1690cm-1)伸缩振动以及N-H(约1500cm-1)和C-H(约1450cm-1和约1380cm-1)弯曲振动、芳环中的C-C伸缩振动(约1450cm-1)以及N-O(约1340cm-1)、C-N(约1250cm-1)和C-O(1200cm-1-1000cm-1)伸缩振动。位于约2170cm-1处的峰归为腈基的伸缩振动且位于约900cm-1处的峰归为不饱和碳总成中的平面外振动。
关于纳米颗粒测量的XPS和FTIR光谱与对在金属衬底上沉积并生长且以类似的工艺条件制备的碳基薄膜测量的光谱类似。这些薄膜已沉积在各种可植入的生物医学装置上并用于掩盖外来材料，增强以此方式涂布的种植体的生物相容性。此外，也表明这些薄膜能够通过嵌埋的自由基来共价固定生物活性蛋白和其它生物分子。
通过在等离子体中形成的离子、单体自由基和官能团的流入量来增强颗粒生长。此外，CO、NO和OH基团的存在表明大气中的氧在纳米颗粒一从真空中去除并暴露于实验室空气后即与活性自由基反应。因此发明人假设在纳米颗粒的CN:H无定形结构中存在未配对电子。图12图像A展示使用2sccm的乙炔流速时制造的纳米颗粒的典型EPR光谱。以3495G为中心(g因子为2.004)的宽共振峰证明在纳米颗粒内存在未配对电子(自由基)。图12图像B显示在不同周围条件下储存的纳米颗粒的自由基动力学。在24℃水中储存的纳米颗粒显示50％的自由基在自等离子体收集后的前24小时内衰变。当在4℃的水中储存时，只在150小时后观察到同样50％的自由基衰变。结果表明，当纳米颗粒储存在空气中，甚至储存在周围温度下时，具有更高的自由基稳定性，其中在自等离子体收集240小时后，初始自由基密度仅减半。因此，本文公开的纳米颗粒和聚集体尤其适合储存在液体中。
结果表明，聚集体的表面化学可通过自由基介导的反应和/或部分介导的反应来转变。自由基扩散是温度激活的并且在与氧反应时达到顶峰。通过在等离子体腔室中在较高的基准压力下生产纳米颗粒，或通过将纳米颗粒暴露且随后储存在空气中来触发表面氧化作用。可通过在C2H2/Ar等离子体中简单加入N2来进一步功能化聚集体的表面。以CN杂交的形式、以在等离子体/气相中发现的自由基分子形式以及以表面胺官能团的形式向纳米颗粒中掺入氮。
未配对电子的存在为使用纳米P3材料作为通用的且生物相容的纳米载体铺平了道路，通过使得可与活性形式的各种生物分子牢固共价缀合，而不需要使用化学连接子分子和多步骤的湿式化学方法来实现缀合。这代表了一种重要的工艺简化、减少环境影响以及就商业环境而言显著减少成本。有趣的是，纳米颗粒聚合物和聚集体中的未配对电子是在磁共振成像(MRI)情形下可通过超极化技术探索的角动量的内在来源。超极化通过将高自旋极化的未配对电子的角动量转移到特定的核来利用高自旋极化的未配对电子，使化合物适合用作MRI造影剂。因此，本文公开的纳米P3材料可用作造影剂，而无需任何其它造影剂与其进一步缀合。另外，本发明采用等离子体放电的生产方法的通用性使得可易于引入各种烃前体，其可用于视具体应用而定向纳米颗粒中引入其它磁性要素或其它战略性要素。
为调整纳米颗粒聚合物和聚集体的特征，可改变许多变量并检验其对所得材料的影响。
在图13中，显示对于与等离子体耦合的各种工作压力和功率而言，在纳米颗粒形成期间与CN自由基分子和N2 +分子离子相关的发射强度的时域剖面线。所有其它参数在这组实验中都是固定的。在N2 +分子离子的最大发射强度和CN群体的最小发射强度时发生聚集。结果表明，在纳米颗粒形成期间进一步消耗CN自由基分子。总之，振荡频率随功率和压力增加而增加，表明以更高的速率产生纳米颗粒。类似的条件用于进一步试验，但是：使用各种值的乙炔流速(1-8sccm)、150毫托且Ar和N2气体的固定流速为3和10sccm，以及与放电体分别耦合固定的50W、75W或100W，sccm(分别对于图14、15和16而言)。
图17显示对于50、75和100W的耦合射频功率而言，随乙炔流速(图像A)和压力(图像B)而变化的振荡周期。所有其它等离子体参数保持恒定。通过将氮气分子离子发射强度的3个连续最大值之间的时间差平均来计算每次合成运行的时间。在较低的乙炔流速下，通过耦合功率来高度调节振荡周期。随着单体流速增加，纳米颗粒产率的差异较不明显，表明单体进一步过量对纳米颗粒的产量并无贡献。
总之，结果表明描述纳米颗粒生产的相关宏观参数为∝W/F，其中W为与放电体耦合的功率且F为单体流速。另外，在较高的单体流速下，前体分子在等离子体中的停留时间减少，也导致片段化单体分子的比例较低。气体阻力随流速增加而增加也将导致快速生长周期，因为颗粒被更快速地从等离子体中推出。可通过改变在纳米颗粒合成期间维持放电的压力来进一步调节振荡周期。纳米颗粒产率在图17(图像C)中显示为单体流速和与等离子体耦合的rf功率的函数。总之，结果表明产率随施加的rf功率而增加，对于100W和6sccm而言，在14.4g/hr m2时达到最大值。对于所有研究的rf功率而言，产率剖面线的特征在于在其在较高单体流速下减至较小值之前达到最大值。在较高单体流速下收集的纳米颗粒数量减少与放电体跃迁有关，其中体积聚合被抑制为表面聚合。影响此跃迁的重要参数是单体在放电体体积中的停留时间。在低于最大屈服点的流速下，每个单体具有足够的能量来使供应的所有单体有效地片段化，且增加的气流使放电体体积中可用的反应性片段的数量增加。然而，在超过最大屈服点的流速下，此功率不再足以进行有效的片段化，因此在放电体体积中的反应性足以形成纳米颗粒的片段群体的比例减小，且非反应性片段群体的存在增加使体积中的颗粒形成速率减小。
图18显示在50、75和100W下，在1-8sccm单体流速范围内，在纳米颗粒产生期间CN自由基分子和N2 +分子离子的最大和最小发射强度。总之，振荡幅度随流速增加而减小。
图19显示对于各种氮气流速值而言，在纳米颗粒形成期间与CN自由基分子和N2 +分子离子相关的发射强度的时域剖面线。所有其它参数在这组实验中都是固定的。
在图20图像A中显示在纳米颗粒聚合物和聚集体产生期间N2对振荡周期的影响。振荡周期随N2包含量显著下降，表明CN自由基在纳米颗粒生长中具有重要作用。图像B显示由于在等离子体反应器中，在纳米颗粒上作用的较高气体阻力，纳米粒度随氮气流速增加而减小。因此，可通过改变载气(诸如氮气)的流速来调节本文公开的纳米颗粒和聚集体的尺寸。图像C还显示纳米颗粒的ζ-电位随等离子体反应器中的氮气比例升高而增加。在较高的氮气比例下，掺入纳米颗粒结构中的总氮气(以CN键或胺官能团的形式)增加。带正电的胺表面官能团(例如，如图24中所示)应对在较高的氮气比例下观察到的ζ-电位增加作出解释。图22中还显示放电体的耦合功率对纳米粒度(上图)和产率(下图)的影响。
图21显示纳米P3颗粒的ζ-电位随包含所述颗粒的溶液的pH而变化。结果表明纳米P3材料周围的电荷可易于通过调整溶液中正离子和负离子的浓度来调节。在制造纳米P3材料与高度带电的第二物质之间的缀合物或具有强偶极矩的缀合物时，此特征尤其适用。也可以通过在不同的等离子体参数下制造纳米P3材料来调整等电点。因此，本文公开的方法可包括在使第二物质与如本文公开的纳米颗粒或聚集体缀合时调节pH。视将要缀合的第二物质的电荷而定，可增加或减小pH。
图23显示由不同耦合功率和单体流速制备的纳米颗粒上的碳、氮和氧的比例。图像A显示在固定乙炔流速(例如，2sccm)下由100W和75W制备的纳米颗粒具有实际上相同的元素比例。结果表明具有相同化学结构的纳米颗粒可按不同的产率来制造，其尺寸变化范围为12.5％(图20)。结果还显示纳米颗粒内的碳/氮比在单体流速较高时增加。图像B至G显示纳米颗粒在其合成后不同时间阶段的元素比例。总之，结果显示氮含量随储存时间而减少(例如，在图23图像C中，从第1天的最大值38.2％减少至第9天的34.2％)，且碳和氧的比例增加，后者是由于表面氧化(图25)。
图24显示在不同储存时间对纳米颗粒聚合物和聚集体的FTIR测量值，表明由XPS观察到的氮下降主要是由腈(C≡N)键减少引起的。3250cm-1处的宽峰表示存在表面胺官能团。
图25中显示对在只有乙炔和氩气放电(无氮气)中制得的纳米颗粒的进一步FTIR测量值。测量值证明CO键随储存时间而显著增加，这也与纳米颗粒自由基密度衰减相一致。
实施例2-纳米P3的荧光特性
使用稳态发射光谱，发明人发现分散在水性溶液(或细胞培养基)中的纳米P3在UV-VIS-NIR范围内自发荧光。使用读板仪来测量干燥(如合成时的)和再悬浮(PCR级别水或细胞培养基)纳米P3的荧光发射/激发光谱。图26图像A显示发射剖面图取决于激发能且图26图像B显示强度随溶液中的纳米P3浓度而显著增加。图26图像C显示如合成时的干燥纳米P3在孔式收集器中的荧光分布。通过以映射模式扫描每个孔来测量纳米P3在孔中的分布。使用30x 30的矩阵，产生900个点/孔的解析度。激发和发射单色仪分别设定为360和430nm，增益为2200且焦重量为9mm。图26图像D显示通过在蓝色、绿色、黄色和红色通道测量的共聚焦荧光显微镜证明纳米P3的荧光特性。对于此实验而言，合成参数设定为对于乙炔、氮气和氩气而言，Q＝3、10和3sccm，工作压力为150毫托且射频功率为50W。
实施例3-纳米P3的荧光特性，第2部分
使用读板仪来测量干燥(如合成的)和再悬浮(PCR级别水或细胞培养基)纳米P3的荧光发射/激发光谱。图27图像A显示对于360nm的激发波长而言，最大的斯托克位移(Stoke’s shift)为80nm，对于600nm的激发而言减小至25nm。通过激发波长减去相应的发射波长来计算斯托克位移。图27图像B显示纳米P3荧光的强度在溶液中随时间而增加，这与自由基扩散至颗粒表面所驱动的连续表面氧化有关。对于此实验而言，合成参数设定为对于乙炔、氮气和氩气而言，Q＝3、10和3sccm，工作压力为150毫托且射频功率为50W。
实施例4-定量与纳米P3结合的分子货物
本发明的纳米P3提供多种优势。纳米P3所赋予的优势的一种实例在于可通过用于运载有效载荷的聚集体的数量来适应或优化有效载荷。发明人发现，与纳米P3表面结合的分子总数最终取决于纳米P3表面积与货物分子量之间的比率(图28)。使用纳米P3的吸光度和/或荧光测量值计算在培育后与纳米P3结合的分子货物的量-货物样本及其相应清洗液(货物＝2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)、吲哚菁绿(ICG)、紫杉醇-俄勒冈绿(Oregon Green)488(紫杉醇)、CY5-CPKKKRKV-NH2(siRNA)和山羊抗大鼠IgG-Alexa647(IgG))。总之，与纳米P3结合的分子数量随分子量增加显著减少。对于此实验而言，等离子体参数设定为对于乙炔、氮气和氩气而言，Q＝3、10和3sccm，150毫托和50W。在室温下，在RT-PCR级别水(pH＝7)中用货物培育纳米P3(109个纳米P3/mL)持续1小时。
实施例5-定量与纳米P3结合的分子货物
图29证实结合货物的量随其在溶液中的浓度而增加。以药物(紫杉醇)、显像剂(吲哚菁绿；“ICG”)和靶向配体(IgG)举例证实表面饱和度分别为2.3μg、2.9μg和0.8μg。对于此实验而言，等离子体参数设定为对于乙炔、氮气和氩气而言，Q＝3、10和3sccm，150毫托和50W。在室温下，在RT-PCR级别水(pH＝7)中持续1小时进行用货物培育纳米P3(109个纳米P3/mL)。
实施例6-纳米P3的结合动力学
通过在不同培育时间点和温度下测量结合货物的量来评估与简单纳米P3结合过程相关的缀合动力学。纳米P3材料与实施例5中计算的确切量的吲哚菁绿(ICG)缀合以使纳米颗粒表面单层饱和，即单一纳米P3颗粒上1.9x 106个ICG分子(99nm半径)。图30证实在24℃下培育后的前30秒内，总货物的90％固定在纳米P3的表面上，而在低温下(4℃)培育导致同一时间点结合60％。对于两种条件而言，在培育后小于5分钟内达到表面饱和。对于此实验而言，等离子体参数设定为对于乙炔、氮气和氩气而言，Q＝3、10和3sccm，150毫托和50W。在室温下，在RT-PCR级别水(pH＝7)中持续1小时进行用ICG培育纳米P3(109个纳米P3/mL)。
实施例7-纳米P3的货架期
长的货架期和易于功能化是纳米颗粒平台可应用于临床用途的必然要求。纳米P3提供一种节约成本和时间的纳米颗粒平台，它不需要连接子化学或长的培育时间。使用吲哚菁绿(ICG)作为模板分子来测量长时间储存的纳米P3的结合效率。图31证实纳米P3固定货物的能力在室温下的空气中储存的前6个月期间实际上保持恒定(图31)。对于储存长达16个月的样本而言，观察到结合效率减少28％(不明显)。然而，仍可能通过增加溶液中的ICG浓度来使纳米P3的表面完全饱和。可能通过采用替代的储存方式，包括低温、真空或另一种非反应性环境来实现货架期延长。等离子体参数设定为对于乙炔、氮气和氩气而言，Q＝3、10和3sccm，150毫托和50W。在室温下，在RT-PCR级别水(pH＝7)中持续1小时进行用ICG培育纳米P3(109个纳米P3/mL)。
实施例8-与纳米P3结合的货物保持其活性
吲哚菁绿(ICG)为分别具有805nm发射波长和830nm激发波长的荧光染料。由于组织在此光谱窗中的低吸光度特性，ICG在临床中广泛用于医学诊断。然而，ICG的特征在于体内循环半衰期短。
图32显示如果与纳米P3结合，ICG在水溶液中显著更长时间地保持其活性。与溶液中的游离ICG相比，证明ICG与纳米P3表面结合时吸收峰红移60nm，从780nm移至840nm。游离ICG与缀合纳米P3的ICG的VIS/NIR剖面线证明小货物(<1000Da)的降解在固定于纳米P3上后显著延迟。等离子体参数设定为对于乙炔、氮气和氩气而言，Q＝3、10和3sccm，150毫托和50W。在室温下，在RT-PCR级别水(pH＝7)中持续1小时进行用ICG培育纳米P3(109个纳米P3/mL)。
实施例9-可通过改变pH来调节货物与纳米P3的结合
还使用与用于检测的Cy-5荧光标记结合的带正电荷的肽序列(Cy-5-CPKKKRKV-NH2)来研究纳米P3与高电荷货物的结合。
此肽序列常用作能靶向细胞核的核定位序列。这种核靶向能力主要由存在多种极性(阳离子性)氨基酸(包括赖氨酸(K)和精氨酸(R))来驱动。图33显示在中性pH下以肽初始培育纳米P3并未导致关于更中性货物所观察到的预期的牢固结合。对于与高度带正电荷的肽结合而言，需要将溶液的pH增加至10。随着pH增加，纳米颗粒的表面基团逐步去质子化，且在pH>8下，当溶液转变为高碱性介质时，颗粒达到其等电点且随后逐步带负电荷。在所述条件下，肽被吸引至纳米P3的表面且随后通过物理接触固定。当含有结合肽的溶液的pH恢复为中性时，肽保持结合。这些结果通常证实操纵溶液的pH可用于增强带电配体的结合，且如果它们具有偶极矩，则可能确定其在表面上的方向。
实施例10-纳米颗粒聚合物的聚集和溶解度
如下在不同pH的磷酸盐缓冲液(PB)中测试纳米颗粒聚合物的聚集。
在具有pH 2.5至pH 12范围内的不同pH下的过滤PB(0.2μM注射器过滤器)的组织培养罩中，在无菌条件下由颗粒收集器收集纳米颗粒材料。使用过滤水收集对照纳米颗粒材料。使用流式细胞术(Beckman-Coulter FACSVerse)，分析样本3分钟或直到达到10,000个事件的总数。通过观察正向和侧向光散射，通过针对未聚集纳米颗粒聚合物的单独验证样本闸控适当的视野来定量纳米颗粒聚合物的聚集。每次测量值都标准化为100％的纳米颗粒总数。
在水中以及在pH 2.5至pH 12范围内不同pH值的各种缓冲剂中测试纳米颗粒的溶解度和溶出度。通过流式细胞术进行分析，其中基于对再悬浮于10％SDS水溶液中的纳米颗粒的单独验证单分散性群体来闸控“无聚集”至“主要聚集”群体。对不同纳米颗粒悬浮液的分析揭示水是用于纳米颗粒单分散性的最佳溶液(图34，图像A)。测试的所有含盐溶液都显示明显更聚集，在pH 2.5下观察到良好的单分散性(图34，图像A)。不希望受理论束缚，驱动此行为的特定机制可能是由于加入了纳米颗粒以及其在缓冲溶液中与离子盐的相互作用。也对纳米颗粒曾经在溶液中的稳定性进行分析。
纳米颗粒材料在水中的结果显示甚至在溶液中26天后纳米颗粒的单分散性群体(图34，图像B)。
实施例11-细胞毒性研究
在初始的研究中，评估3种不同细胞类型的细胞毒性：
1)人冠状动脉内皮细胞(hCAEC，第4代，Cell Applications，300-05a)；
2)人冠状动脉平滑肌细胞(hCASMC，第5代，Cell Applications，350-05a)；以及
3)乳癌细胞(MCF7，第15代，Sigma-Aldrich，86012803)。
计数大约5,000个细胞/cm2并接种在平底的96孔培养板中，并在37℃下在5％CO2培育器中培育24小时。24小时后，随后向培养基中加入连续稀释的纳米颗粒聚合物，从每孔5百万个颗粒至每孔9,766个颗粒，对于每种浓度的纳米颗粒聚合物而言n＝5次重复。培育72小时后，使用MTS细胞增殖和细胞毒性分析试剂盒(Promega,G3580)进行细胞毒性评估。根据制造商说明向每个孔中加入MTS试剂并且进一步培育2小时。通过测量490nm下的吸光度来定量由活细胞产生的甲臜染料。使用未经处理的细胞(无纳米P3)和经雷帕霉素(100nM,Sigma-Aldrich,R8781)处理的细胞作为对照物。
图35显示在人冠状动脉内皮细胞(图像A)、人冠状动脉平滑肌细胞(图像B)和乳癌细胞系MCF-7(图像C)存在下，在连续稀释的纳米颗粒聚合物和聚集体存在下的细胞毒性研究的结果。
人冠状动脉内皮细胞显示相对于不含颗粒的细胞对照物而言，即使在每孔存在5百万个纳米颗粒的情况下，活力并无显著减小。这由人冠状动脉平滑肌细胞的结果得以反映。对于乳癌细胞系MCF-7而言，所有浓度的纳米P3均适度减小总体细胞活力，但未达到雷帕霉素阳性对照物的程度。
实施例12-缀合研究第1部分
图36显示用抗体单重功能化纳米P3的示意图。图37显示用药物单重功能化纳米P3的示意图。图38概括出用抗体和药物对纳米P3进行功能化的示意图。
尤其是，发明人已成功地使荧光标记的(例如，Alexa488、Alexa594、Cy5、Cy7)和金属标记的抗体(例如，金和银)与本文公开的纳米P3共价结合。
使用以下程序来评估纳米P3与二级抗体、药物和/或蛋白质的缀合：
在具有RT-PCR级别水的组织培养罩中，在无菌条件下由纳米颗粒收集器收集纳米P3。由NanoSight LM10来测量纳米颗粒的浓度。随后使纳米颗粒在4℃下与需要的抗体(山羊抗大鼠IgG-Cy5；abcam ab6565；和山羊抗兔IgG；abcam ab150089，以1:100稀释)、药物(多柔比星：Sigma-Aldrich，D1515在100μg/ml下以及紫杉醇-俄勒冈绿488，InvitrogenP22310，在5μg/mL下)或蛋白质(来自辣根的过氧化物酶；Sigma-Aldrich HRP；P6782，在0.5μg/mL下)缀合长达16小时，避光保存。以相同的方式进行HRP与150nm金纳米颗粒的缀合(Cytodiagnostics；G-150)。使用Bio RS-24微型旋转器轻微搅动样本。培育后，将测试样本和适当的对照物通过以16,000g离心同等地清洗5次，前4次清洗5分钟，且第5次清洗15分钟。使用读板仪来测量荧光强度，根据每个抗体或药物上的荧光染料标记来设定Ex/Em。例如，Alexa 488和俄勒冈绿488，Ex/Em为494/517，而Cy5Ex/Em为650/667nm。多柔比星的Ex/Em为470/585。为检测HRP，用ABTS(Sigma-Aldrich；A1888)和过氧化氢(Merck；386790)培育缀合的纳米颗粒和各自的对照物直到颜色可见，并在405nm下进行测量。
进行初步试验来评估与纳米颗粒接触时的细胞行为。将二级FITC缀合抗体用纳米颗粒培育2小时以允许缀合。在将抗体缀合的纳米颗粒在水中充分清洗后，将此材料加入单层的内皮细胞(hCAEC)、平滑肌细胞、单核细胞(J774A)和肺癌细胞(LLC)中并使其培育24小时。在活细胞成像设备上的明视野中以5分钟的间隔获取图像以用于细胞形态，且使用绿色荧光滤光器检测纳米颗粒。结果表明，在实验的前2个小时内，纳米颗粒被所有细胞类型完全吸收。如先前在我们的细胞毒性研究中所证实，在吸收荧光标记的纳米颗粒后，细胞在实验的整个24小时内保持活性，而未显示任何明显的应激或毒性迹象。此外，尽管在细胞核周围和细胞质中含有大量纳米颗粒，但仍易于将细胞分开。染色体凝集和分离、胞质***以及细胞与组织培养板的后续再连接均不受阻，表明具有所测试细胞类型的纳米颗粒的良性性质。
图39显示以金标记IgG抗体培育且使用扫描电子显微镜成像的纳米颗粒聚合物的扫描电子显微镜图像。在图像中，每个中的最大圆形为纳米颗粒材料，而抗体则小得多(箭头)，以次级电子(图像A)和反向散射电子(图像B)的模式显示。
实施例13-缀合研究第2部分
方法和材料
肌动蛋白染色
固定后，将实施例11中列举的细胞类型在PBS中以0.1％的x-triton 100渗透5分钟。随后将样本在PBS中清洗3次。随后将细胞在肌动蛋白红555ReadyProbes试剂(Lifetechnologies,R37112)中培育30分钟，稀释度为20μl试剂对500μl PBS。
DAPI染色
固定后，将细胞以DAPI溶液(在PBS中1:1000稀释，SAPBIO,NBP2-34422R)在室温下培育5分钟。将样本在PBS中清洗3次，之后安装水性荧光屏蔽安装培养基。盖玻后，在24小时内在荧光显微镜下获取图像。
纳米颗粒与多柔比星缀合来计算荧光淬灭
在具有RT-PCR级别水的组织培养罩中，在无菌条件下由颗粒收集器收集纳米颗粒。对于无多柔比星的纳米颗粒对照物而言，向孔中加入等体积的水作为多柔比星的替代物。类似地，在多柔比星对照孔中，添加水作为纳米颗粒的替代物。当向含有50μg/mL多柔比星(Sigma-Aldrich，D1515)的孔中加入纳米颗粒时，从0分钟开始至5分钟，每隔30秒钟通过读板仪(Ex/Em：470/585)即刻开始时间进程的测量。计算针对0时刻的多柔比星荧光损失。
在实验前一天，将MCF7细胞以8,000个细胞/cm2接种在96孔板上。接种后24小时，将多柔比星缀合的纳米颗粒(如前文所述制备)添加至孔中且进一步再培育24小时。使用MTS细胞增殖分析试剂盒(Promega；G3580)测量细胞活力。根据制造商说明向每个孔中加入MTS试剂且再培育2小时。通过测量490nm时的吸光度来定量由活细胞所产生的甲臜染料。未经处理的细胞和经未清洗多柔比星处理的细胞用作对照物。
结果
实验证明，纳米颗粒渗透所有测试细胞类型的细胞壁，而不需要细胞渗透剂。此外，浓度高达1500万个纳米颗粒/mL的非缀合纳米颗粒显示对内皮细胞和平滑肌细胞无毒，而对乳癌细胞的增殖具有轻度抑制性。
为评估纳米颗粒的药物缀合能力，用两种常用的化学治疗药物紫杉醇和多柔比星进行培育。还测试纳米颗粒与抗体缀合的能力。与抗体的缀合代表了用于治疗应用以及颗粒追踪和成像的重要方面。
为与紫杉醇缀合，将纳米颗粒在4℃下用荧光标记的紫杉醇培育过夜。在清洗纳米颗粒以确保去除所有游离的紫杉醇后，将颗粒加入乳癌细胞的上清液中。培育24小时后，将细胞固定且用鬼笔环肽对比染色以用于可视化细胞骨架。有趣的是，此实验突出表明，在不存在任何缀合物的情况下，颗粒在绿色通道是自发荧光的。
在一个单独实验中，使Cy5二级抗体与纳米颗粒缀合并加入到单层乳癌细胞(MCF-7)中持续24小时。
将MCF7细胞以5,000至8,000个细胞/cm2之间的密度接种在适合细胞培养物成像的Lab-Tek玻璃室载玻片(Lab-Tek、154534和155380)上。细胞接种24小时后，用MCF7培育测试纳米颗粒样本和对照物并进一步再培育24小时。随后将细胞在室温下用3.7％的多聚甲醛固定10分钟。随后将样本用PBS清洗3次，之后进行细胞染色。
接着将细胞固定并用DAPI对比染色以使细胞核可视化来观察纳米颗粒在细胞内的分布。在细胞质内看上去分布均匀，然而在细胞核周围轻微更集中。核内无可见的纳米颗粒。Cy5抗体对照物在细胞内任意处均显示无荧光，证明需要纳米颗粒缀合以使其能够细胞渗透。用冻干的纳米P3和Cy5抗体重复此实验，且结果类似地表明易于吸收Cy5缀合的纳米颗粒。此实验表明可能长期储存单独的或通过冻干与生物活性分子缀合后的纳米颗粒。
图41显示在荧光成像之前用人冠状动脉内皮细胞(hCAEC，上面一行)和乳癌细胞系MCF7(下面一行)培育的抗体功能化纳米P3。用DAPI将细胞核染成蓝色(清楚起见，某些细胞核用圆形框勾出)且用Alexa 488将抗体标记成绿色(清楚起见，这些抗体中的一些用三角形框勾出)。将肌动蛋白纤维染成红色(清楚起见，这些纤维中的一些用矩形框勾出)。在集中在两种细胞类型的细胞核周围的细胞质中观察来自纳米P3与Alexa 488抗体缀合物的荧光。
图40提供使用在SEM中检测次级电子成像的纳米P3和2种不同尺寸的金抗体(实线箭头20nm的IgG-金二级抗体，斜纹箭头6nm的一种IgG-金二级抗体)的SEM图像。
为证明缀合分子对纳米颗粒的生物活性，发明人缀合辣根过氧化物酶(HRP)，这是一种已知在固定时对构型改变尤其敏感的含血红素酶。为此，以0.5μg/mL的HRP溶液培育纳米颗粒并使其均质化4小时。还进行相同浓度的单独纳米颗粒和单独HRP的对照实验，后者显示低于背景水平的活性。为了与纳米颗粒目前的金标准相比较，也用HRP培育市售的金纳米颗粒并根据纳米颗粒测试组进行处理。在充分清洗纳米颗粒(和对照物)以去除所有的游离HRP后，用ABTS培育样本，所述ABTS是一种已充分描述的经催化产生绿色产物的HRP底物。在405nm下测量的吸光度显示HRP产物形成的明显信号，证明缀合HRP的纳米颗粒维持生物活性。市售的金纳米颗粒也显示某种水平的HRP活性，尽管是在显著较低的水平。这可能是由于与金纳米颗粒相比，纳米颗粒上的HRP负载较高，或者是由于缀合HRP的纳米颗粒的较高活性，因为有据可查在与金纳米颗粒缀合后，HRP活性受损。
为了使多柔比星可视化，发明人希望观察药物的固有自发荧光，而不需要单独的荧光团缀合物。
然而，发现多柔比星的自发荧光在经纳米颗粒培育时淬灭，这是此药物与其它颗粒或甚至与自身缀合时不常见的一种现象。因此通过在以纳米颗粒培育药物时测量自发荧光的损失来实现对多柔比星与纳米颗粒缀合的检测(图42，图像A)。结果显示在以纳米颗粒培育多柔比星时，荧光逐渐损失，所述损失稳步增加且在约3分钟时达到稳定阶段，展示一种难以置信的快速缀合。多柔比星对照物的荧光不减少，证明所述损失并非是由于药物聚集以及随之发生的淬灭。有趣的是，观察到多柔比星自发荧光增加。这被认为是由于多柔比星在最初储备溶液中的初始聚集(以及随之发生的淬灭)。在水中稀释至50μg/mL后，聚集的多柔比星开始解聚，由此导致荧光瞬时增加。不含药物的纳米颗粒对照物也显示荧光未减少。在一个单独的实验中，将多柔比星缀合的纳米颗粒在水中充分清洗以去除所有的游离多柔比星且随后加入单层乳癌细胞中并使其培育24小时。MTS分析的结果显示在以多柔比星缀合纳米颗粒培育24小时后，细胞活力显著增加，证明药物缀合以及后续药物诱发细胞死亡的生物利用度(图42，图像B)。显示纳米P3材料和多柔比星(Dox)与添加到培养基中的游离多柔比星(25ug/ml)同等程度地杀死MCF-7细胞，而纳米颗粒对细胞活力无影响。此实验显示细胞毒性药物多柔比星在简单培育后可缀合纳米颗粒，且可有效杀死MCF-7乳癌细胞。
通过向纳米P3材料上引入多个生物活性组来证明缀合物的负载能力。图43显示IgC-488与IgG-594两者在研究中与hCAEC细胞的缀合。用DAPI显示细胞核(清楚起见，图43中的核用圆形框来标记)。两种接合体用纳米P3和Alexa 488抗体以及纳米P3和Alexa 594抗体来检测。纳米P3、Alexa 488和Alexa 594似乎共存于人冠状动脉内皮细胞(hCAEC)的细胞质中，主要在核周围。
缀合物上可放置不同类型的第二物质，例如可使用药物和抗体(图44)。在图45中，通过MCF7细胞的细胞研究来描绘紫杉醇-488与IgG-594的缀合；用DAPI显示细胞核(清楚起见，图45中的一些核用圆形框来标记)。两种接合体都由纳米P3和紫杉醇-488以及纳米P3和Alexa 594抗体来检测。纳米P3、紫杉醇-488和Alexa 594似乎共存于MCF7乳癌细胞的细胞质中。
在图46中，通过MCF7细胞的细胞研究来描绘IgG-488、IgG-Cy5和IgG-Cy7与纳米P3的缀合；用DAPI显示细胞核(清楚起见，图46中的核用圆形框来标记)。所有三种接合体都由纳米P3和Alexa 488以及纳米P3、Alexa Cy5和Alexa Cy7抗体来检测。纳米P3和所有三种缀合物似乎共存于MCF7乳癌细胞的细胞质中。
使用传统方法向细胞中运载双链DNA(包括质粒)需要细胞穿透方法(例如，电穿孔)或试剂(例如，脂质体)。在一个实验中，发明人使用质粒产生绿色荧光蛋白，使得成功转染的细胞呈现荧光绿。使用人冠状动脉细胞(hCAEC)，发明人加入了质粒、单独的纳米P3或纳米P3和质粒，但无额外的细胞穿透步骤(图47)。只用质粒或只用纳米P3培育不产生作用。在鲜明的对比中，纳米P3和质粒条件经24小时时间都显示许多成功转染的细胞。
在另一个实验中，发明人将用于产生与40、100或200nm纳米P3结合的绿色荧光蛋白的质粒成功传递至人胚肾细胞(HEK293)。转染后72小时，在荧光显微镜下观察到转染细胞(绿色)(图48)，说明细胞成功转染且保留了本文所公开的由纳米P3材料所实现的货物(例如，DNA质粒)功能。这些结果证实纳米P3可运载DNA跨越细胞膜且保留其活性。
在初始的动物实验中，对小鼠在其背部切开小切口(即，伤口)。随后通过尾静脉注射对四组给予：
1)无干预；
2)只有纳米P3；
3)市售的金纳米颗粒和荧光素酶；或
4)纳米P3和荧光素酶。
只有第4组(纳米P3和荧光素酶)在伤口区域由IVIS成像显示正信号(图49)。这表明只有纳米P3以生物活性方式共价保留荧光素酶，且纳米P3可回到损伤部位—对体内成像和治疗具有显著影响。
用于纳米治疗学的典型材料是生物活性惰性的，且通常需要与诸如PEG的低聚物的进一步功能化策略来实现医药剂与纳米颗粒表面之间的稳定缀合。在此项工作中，发明人报道了一种新颖的等离子体活化纳米载体，其提供了一种直接且由自由基介导的各种生物分子的缀合，而不损害固定生物分子的生物活性。纳米颗粒的合成和收集在气相的活性等离子体中进行，涉及到纳米尺寸的碳基团簇的快速聚集。纳米颗粒的生产收益率和物理化学特性易于通过选择适当的工艺参数窗口根据应用要求相应地调整。已在各种细胞类型和颗粒浓度方面证实纳米颗粒的无毒性质。本文产生的纳米颗粒进一步显示被动进入细胞，促进诸如药物、抗体和多核苷酸的分子货物的移动。已证实，等离子体放电为合成和设计一类新的真正多功能的纳米载体提供了一个稳固的平台，所述纳米载体可潜在地推进在基于纳米颗粒的治疗学和诊断学中的现有成果。
实施例14-缀合研究第3部分
在另一个动物实验中，小鼠被随机分为3组：
1)只有纳米P3；
2)纳米P3和ICG；或
3)只有ICG。
对于每组而言，如图50中所示，在小鼠背部切开小切口(5mm)。在用丝线缝合切口后，通过尾静脉注射向每只小鼠施用100μL相应的样本组：纳米P3对照物(9x 109个纳米P3)、纳米P3-ICG(9x 109个纳米P3和2.5μg的ICG/109个纳米P3)或ICG对照物(22.5μg)。使用IVIS进行非侵入性成像以在Ex/Em＝780nm/820nm下检测荧光。对于研究的所有时间点而言，在只有纳米P3和只有ICG的对照组中不存在荧光，表明在经过体内循环后，ICG的活性显著损失。相反，对于所有时间点而言，在纳米P3-ICG组上检测到信号，表明在与纳米P3结合后，ICG的体内活性显著延长(半衰期增加300倍)。
实施例15-缀合研究第4部分
在另一个动物实验中，如图51图像A所示，在每只小鼠的背部切开总计4个切口(5mm)以供局部传递各种样本组：盐水对照物(切口1)、只有纳米P3(切口2)、纳米P3-VEGF-ICG(切口3)和纳米P3-VEGF(切口4)。每个伤口施用的总样本体积为5μL。对于含有纳米P3的组而言，施用的剂量如下。切口2：5x109个纳米P3；切口3：5x109个纳米P3和0.058μg的VEGF/109个纳米P3以及1.25μg的ICG/109个纳米P3；切口4：5x109个纳米P3和0.115μg的VEGF/109个纳米P3。图51图像B显示只有含有经ICG功能化的纳米P3的样本组产生正荧光信号。荧光强度随时间而减小(定量直到切口后的第14天)且仍局限在伤口部位。如图51图像C中所示，通过免疫组织化学对伤口组织进一步分析表明，与只有盐水和只有纳米P3的对照组相比，纳米P3-VEGF-ICG组和纳米P3-VEGF组中的内皮化增强(后者显著)。这些结果证实，固定在纳米P3上的功能货物可体内传递，同时可对纳米P3在宿主组织中的分布同步成像。
实施例16-缀合研究第5部分
方法和材料
细胞活力分析
评估3种不同细胞类型的细胞毒性：
1)人冠状动脉内皮细胞(hCAEC，第4代，Cell Applications，300-05a)；
2)人乳细胞系(MCF10A，第20代)；以及
3)乳癌细胞(MCF7，第15代，Sigma-Aldrich，86012803)。
计数大约5,000个细胞/cm2并接种在平底的24孔培养板中，并在37℃下在5％CO2培育器中培育4小时。细胞接种四小时后，随后向培养基中加入10倍稀释的纳米P3，从每孔1千万个颗粒至每孔100个颗粒，对于每种浓度的纳米P3而言n＝3次重复。培育3天和5天后，使用阿尔玛蓝(alamarBlue)细胞活力和细胞毒性分析试剂盒(Life technologies，DAL1100)进行细胞毒性评估。根据制造商说明向每个孔中加入阿尔玛蓝试剂并且进一步培育2小时(对于hCAEC和MCF10A而言)和3小时(对于MCF7而言)。通过测量Ex/Em530-560/590nm下的荧光来定量由活细胞产生的刃天青染料。使用未经处理的细胞(无纳米P3)和经多柔比星(500nM,Sigma-Aldrich,44583)处理的细胞作为对照物。
纳米P3与缀合金纳米颗粒的二级抗体缀合
在4℃下以所需抗体(山羊抗兔-IgG-40nm金；abcam、ab119180、山羊抗小鼠-IgG-20nm金；abcam、ab27242和/或山羊抗大鼠-IgG-10nm金；abcam、ab41512)培育纳米P3持续1h，且使用Bio RS-24微型旋转器轻微搅动。培育后，将样本通过以16,100g离心清洗5分钟。随后收集样本且使其在300目铜(Proscitech,GSCu300C)上的组织培养罩中风干，并使用Zeiss Sigma HD FEG SEM(SMM Facilities,Sydney)可视化。
纳米P3与二级抗体和/或药物的缀合
在4℃下使纳米P3与二级抗体(驴抗山羊IgG-Alexa488；abcam、ab6881；山羊抗大鼠IgG-Alexa647；abcam、ab150159、山羊抗兔IgG-750；abcam、ab175733)和/或药物(紫杉醇-俄勒冈绿488，Invitrogen P22310)缀合1小时，避光保存且使用Bio RS-24微型旋转器轻微搅动。培育后，将测试样本和适当的对照物通过以16,100g离心同样地清洗3次，每次清洗持续5min。使用读板仪测量荧光强度，根据每种抗体或药物上的荧光染料标记来设定Ex/Em。
细胞中缀合抗体的纳米P3
将hCAEC、MCF10A和MCF7细胞以10,000-15,000个细胞/cm2之间的密度接种在适合细胞培养物成像的Lab-Tek玻璃室载玻片(Lab-Tek、154534和155380)上。细胞接种四小时后，将测试纳米P3样本和对照物所有细胞类型培育24小时。随后将细胞在室温下用3.7％的多聚甲醛固定10分钟。随后将样本用PBS清洗3次，之后进行细胞染色。
肌动蛋白和DAPI染色
固定后，将细胞在PBS中以0.1％的x-triton 100渗透5分钟。随后将样本在PBS中清洗3次。随后将细胞在肌动蛋白红555ReadyProbes试剂(Life technologies,R37112)中培育15分钟，稀释度为20μl试剂对1000μl PBS。随后将样本在PBS中清洗3次。在室温下将细胞以DAPI溶液(在PBS中以1:1000稀释，SAPBIO，NBP2-34422R)培育5分钟。将样本在PBS中清洗3次，之后安装一种水性的荧光屏蔽封片剂(Cat.)。盖玻后，24小时内在荧光显微镜(Zeiss Microscope)下获取图像。
功能化分析：纳米P3与荧光素酶的缀合
在4℃下使纳米P3与来自北美萤火虫(Photinus pyralis)的荧光素酶以2.5μg/ml(abcam,L9506)缀合1小时，使用Bio RS-24微型旋转器轻微搅动。以相同方式进行荧光素酶与200nm聚苯乙烯(ThermoFisher Scientific；R200)和200nm金纳米颗粒(Cytodiagnostics；G-150)的缀合。培育后，将纳米P3样本通过以16,100g离心清洗3次，每次清洗5分钟，而将适当的对照物根据制造商的说明同样清洗3次。收集所有清洗液。为检测荧光素酶，将缀合的纳米颗粒和各自的对照物及其所有清洗液都用含有70mM ATP-Mg2+的D-荧光素(Sigma-Aldrich；A1888)培育。然后通过IVIS***检测生物发光(曝光时间：30sec.)。
结果
纳米P3中存在自由基表明可能通过简单培育来直接共价固定生物分子，这给与其优于竞争平台的内在优势。使用3视野横截面SEM观察，未功能化的纳米P3穿透人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)的膜并积聚在细胞质中(图52，图像A)。这些图像的3维渲染显示在细胞膜(由矩形框勾出)内、在细胞核(由椭圆形框勾出)外分布的纳米P3(这些中的一些由三角形框勾出)(图52，图像B)。用HCAEC、成纤维细胞(MCF10A)或人乳腺癌细胞(MC7)培育的纳米P3在每孔高达1x108个颗粒下不显著影响细胞活力(图53，图像C)。在培养3天或5天后，细胞形态也不受影响(图53，图像D)。在不存在其它化学连接子的情况下培育荧光素酶，接着进行三次离心清洗步骤(W1-W3)，说明纳米P3的生物分子固定能力。选择生物发光酶荧光素酶来同时研究功能活性，因为它在打开时是构型敏感性且非活性的。也在无颗粒的情况下或用市售的金(GNP)或聚苯乙烯纳米颗粒进行分析来与纳米P3比较(图54)。只有纳米P3在全部清洗步骤期间对荧光素酶的活性提供不可逆的固定和保留。实验突出表明，本文关于金和聚苯乙烯纳米颗粒所示的所有其它商业平台都需要化学连接中间物来使功能分子牢固缀合。
在无化学中间物的情况下运载多种共价结合货物(包括靶向配体、显像剂和药物)的潜能(图55，图像A)是纳米P3的一个重要方面。用荧光标记抗体(IgG488)示范表明可实现与致密表面单层相一致的结合浓度(图55，图像B)。通过SEM观察的与纳米P3结合的金标记抗体表明由1、2或3种配体功能化，通过包括抗体浓度以及培育时间和等级的溶液参数来控制表面密度(图56，图像C)。在图56，图像C中，三种IgG-金二级抗体的尺寸为40nm、20nm和6nm(分别如虚线圆形、三角形和矩形轮廓线所示)。使用紫杉醇-488、IgG-Cy5和IgG-Cy7作为MCF10A中的单重、双重或三重功能性纳米P3来证实多种货物功能性转移至细胞中(图57)。尽管关于三种相对大的功能进行示范，但纳米P3的结合能力只受表面积限制，因为表面积与货物的尺寸相关。
实施例17-缀合研究第6部分
使纳米P3与核定位序列(NLS)缀合，具体来说使用H-CPKKKRKV-OH的NLS。得到的缀合物穿透人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的核膜(图58)。如在用细胞培育纳米颗粒时通常所观察到的，在培育后24小时，大部分的纳米P3-NLS缀合物积聚在细胞核周围。然而，在48小时后，在细胞的核区域中存在正荧光信号，表明纳米颗粒-NLS追踪至此细胞器。此实验证实可通过形成合适的缀合物来靶向不同的细胞器。
实施例18-缀合研究第7部分
如西方墨点法分析所证明，与抗VEGF的siRNA缀合的纳米颗粒(如上文实施例12中通常所述缀合)成功地使HUVECS中的VEGF表达在48小时后减少高达40％(图59)。通过使用以Cy-5标记的siRNA-VEGF的荧光显微镜法来证明纳米颗粒-siRNA缀合物在HUVEC细胞中的传递(图60)。此实验证实本文公开的纳米P3材料可成功地将siRNA分子运载至细胞中，同时保持siRNA的生物活性。
实施例19-缀合研究第8部分
使纳米P3和金的纳米颗粒(GNP)与辣根过氧化物酶(HRP)缀合。通过用2,2'-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)培育来检测这些缀合物。在405nm下进行产物检测(图61)，显示显著量的HRP与纳米P3材料缀合。此实验提供生物活性蛋白与本文公开的纳米P3材料成功缀合的另一实例。
实施例20-使用纳米P3的siRNA敲低
在原代小鼠成纤维细胞中研究与(a)100nm和(b)200nm(直径)纳米P3结合的抗荧光素酶的小干扰性RNA(siLuci)的传递作用。在图62中，与未经处理的细胞对照物相比，通过传递浓度为每孔1010个颗粒的具有100nm纳米P3的siLuci，荧光素酶的表达在72小时时显著降低至39.74±6.42％。传递杂乱的siRNA和未功能化的纳米P3无显著作用。在所有纳米P3测试组中均未观察到细胞活力的显著降低。在源自IPSC的人内皮细胞中研究与(a)100nm和(b)200nm(直径)纳米P3结合的抗荧光素酶(SiLuci)的小干扰性RNA的传递作用。在图63中，与未经处理的细胞对照物相比，通过传递浓度为每孔107个颗粒的具有200nm纳米P3的siLuci，荧光素酶的表达在72小时时显著降低至48.96±1.24％。传递杂乱的siRNA和未功能化的纳米P3无显著作用。在所有纳米P3测试组中均未观察到细胞活力的显著降低(图63)。
实施例21-合成用于运载纳米颗粒的支架
发明人已利用电纺聚氨酯支架来运载如本文定义的纳米P3材料。
使用15kV以1mL/hr将聚氨酯(Elast-Eon E2A；9％(v/w)在六氟异丙醇中电纺至2.5mL的总体积且使用旋转收集器(500rpm)收集。
随后将6×4cm的薄片切割成一百个3mm的圆片，随后使用紫外线杀菌(每侧15min)。将所述圆片分为4个处理组(每组25个圆片)且在37℃下伴随搅拌在溶液中培育过夜：
●第1组-聚氨酯(未经处理)
●第2组-聚氨酯和纳米颗粒(1x109mL-1)
●第3组：聚氨酯和具有血管内皮生长因子(VEGF)的纳米颗粒(1.5μg/mL，在4℃下负载4小时)
●第4组-聚氨酯和具有***(dexamethasone，DEX)的纳米颗粒(10μg/mL，在4℃下负载4小时)
培育后，将圆片充分清洗三次。
图64提供电纺聚氨酯纤维的SEM图像(图像a、b和c)。图像d、e和f显示合并有纳米P3与VEGF的缀合物。
图65中显示体外研究的结果，其中在图像a)中显示在内皮细胞中产生新生血管。图像b)中显示对结果的定量。使用单因素方差分析(one-way ANOVA)计算显著性(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001)。在图65中：PU＝只有聚氨酯平台(第1组)；NP＝连接有纳米颗粒的聚氨酯支架(第2组)；VEGF＝聚氨酯支架加上经VEGF功能化的纳米颗粒(第3组)；以及DEX＝聚氨酯支架加上经DEX功能化的纳米颗粒(第4组)。
纳米P3材料可应用于多种不同衬底。例如，发明人利用丝质支架，且能够表明可获得纳米P3的均匀分布(图66)。
本领域技术人员应了解，如具体实施方案中所示，在不偏离广泛描述的本发明范畴的情况下，可对本发明进行多种改变和/或修改。因此本发明的实施方案在各个方面均认为是说明性而非限制性的。

Claims (34)

1.一种缀合物，其包含：
●平均直径为1nm至50nm且由包含N2以及选自下组的至少一种单体的等离子体形成的纳米颗粒聚合物：烯烃、炔烃、环烯烃、环炔烃及其混合物；或包含两种或两种以上所述纳米颗粒聚合物的聚集体，其中所述聚集体具有5nm至500nm的平均直径；以及
●至少一种第二物质。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述纳米颗粒聚合物或聚集体通过共价键、氢键结、静电键结、离子键结或它们的混合方式交联。
3.如权利要求1所述的缀合物，其中所述纳米颗粒为球形或大体为球形。
4.如权利要求1所述的缀合物，其中所述聚集体为球形或大体为球形。
5.根据权利要求1所述的缀合物，其中至少一种单体选自下组：乙烯、丙烯、1-丁烯、1-戊烯、1-己烯、1-庚烯、1-辛烯、1-壬烯、1-癸烯、乙炔、丙炔、1-丁炔、1-戊炔、1-己炔、1-庚炔、1-辛炔、1-壬炔、1-癸炔、环丙烯、环丁烯、环戊烯、环己烯、环庚烯、环辛烯、1,3-环己二烯、1,4-环己二烯、1,5-环辛二烯、环庚炔、环辛炔、环壬炔及其混合物。
6.如权利要求1所述的缀合物，其中至少一种单体是炔烃。
7.如权利要求1所述的缀合物，其中至少一种单体是乙炔。
8.如权利要求1所述的缀合物，其中所述等离子体进一步包含选自氦、氖和氩及其混合物的惰性气体。
9.如权利要求1所述的缀合物，其中所述纳米颗粒聚合物包含至少一个选自以下的取代基：胺基、亚胺基、一氧化氮基团或腈基及其混合物。
10.如权利要求1所述的缀合物，其中所述第二物质选自下组：靶向配体、药品、显像剂、氨基酸、肽、天然生物活性分子的合成类似物、合成肽模拟物、蛋白质、受体靶向配体、基因靶向剂、多核苷酸、RNA、光敏染料、可裂解的连接分子、烃、全细胞、细胞片段、胶束、脂质体、水凝胶、聚合物颗粒、半导体颗粒、陶瓷颗粒、金属颗粒，及其混合物。
11.如权利要求1所述的缀合物，其中所述缀合物包含两种或更多种不同的第二物质。
12.根据权利要求1所述的缀合物，其中至少一种第二物质通过静电相互作用结合至所述纳米颗粒聚合物。
13.一种药物组合物，其包含如权利要求1至12中任一项所述的缀合物，以及药学上可接受的载剂、赋形剂或粘合剂。
14.一种衬底，其包含如权利要求1至12中任一项所述的缀合物。
15.如权利要求14所述的衬底，其中所述缀合物存在于所述衬底的至少一个表面上。
16.如权利要求14所述的衬底，其中所述缀合物掺入所述衬底中。
17.如权利要求14所述的衬底，其中所述缀合物与所述衬底共价偶合。
18.根据权利要求14所述的衬底，其中所述衬底是可生物降解的。
19.以下物质在与第二物质形成缀合物中的用途：
●平均直径为1nm至50nm且由包含N2和至少一种选自下组的单体的等离子体形成的纳米颗粒聚合物：烯烃、炔烃、环烯烃、环炔烃及其混合物；或
●包含两种或两种以上所述纳米颗粒聚合物的聚集体，其中所述聚集体具有5nm至500nm的平均直径。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述第二物质选自下组：靶向配体、药品、显像剂、氨基酸、肽、天然生物活性分子的合成类似物、合成肽模拟物、蛋白质、受体靶向配体、基因靶向剂、多核苷酸、RNA、光敏染料、可裂解的连接分子、烃、全细胞、细胞片段、胶束、脂质体、水凝胶、聚合物颗粒、半导体颗粒、陶瓷颗粒、金属颗粒及其混合物。
21.根据权利要求19所述的用途，其中至少一种单体是炔烃，并且所述炔烃任选地是乙炔。
22.根据权利要求19所述的用途，其中所述纳米颗粒聚合物包含选自下组的至少一种取代基：胺基、亚胺基、一氧化氮基、腈基及其混合形式。
23.根据权利要求19所述的用途，其中将两种或更多种第二物质偶合至所述纳米颗粒聚合物或聚集体。
24.一种形成缀合物的方法，所述方法包括：
●提供：
i)平均直径为1nm至50nm且由包含N2和至少一种选自下组的单体的等离子体形成的纳米颗粒聚合物：烯烃、炔烃、环烯烃、环炔烃或其混合物；或包含两种或两种以上所述纳米颗粒聚合物的聚集体，其中所述聚集体具有5nm至500nm的平均直径；和
ii)至少一种第二物质；以及
●使所述纳米颗粒聚合物或聚集体与所述至少一种第二物质接触以使得所述纳米颗粒聚合物或聚集体与所述至少一种第二物质在物理上或化学上相互缔合。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述至少一种第二物质与所述纳米颗粒聚合物或聚集体共价结合。
26.根据权利要求24所述的方法，其中至少一种单体是炔烃，并且所述炔烃任选地是乙炔。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述纳米颗粒聚合物包含选自下组的至少一种取代基：胺基、亚胺基、一氧化氮基、腈基及其混合形式。
28.根据权利要求24所述的方法，其中两种或更多种第二物质偶合至所述纳米颗粒聚合物或聚集体。
29.一种由如权利要求24-28中任一项所述的方法产生的缀合物。
30.权利要求1至12中任一项所述的缀合物或包含权利要求1至12中任一项所述的缀合物以及药学上可接受的载剂、赋形剂或粘合剂的药物组合物在制备用于治疗罹患疾病、病症或病况，易感所述疾病、病症或病况或表现出所述疾病、病症或病况的一种或多种症状的受试者的药物中的用途。
31.如权利要求30所述的用途，其中所述疾病、病症或病况选自下组：急性冠脉综合征、年龄有关性疾病或病症、变应性疾病或相关病况、阿尔茨海默病、哮喘、HIV、抗生素抗性、动脉粥样硬化、自体免疫性疾病、细菌感染、癌症、痴呆、抑郁症或相关病况、糖尿病、血脂异常、高脂血症、高血压、鱼鳞癣、免疫性疾病、代谢性疾病或病症、神经性疾病或病症、肥胖症、帕金森氏病、疼痛、类风湿性关节炎和增殖性疾病。
32.如权利要求1至12中任一项所述的缀合物在形成用于治疗受试者的疾病、病症或病况的药物中的用途。
33.如权利要求32所述的用途，其中所述疾病、病症或病况选自下组：急性冠脉综合征、年龄有关性疾病或病症、变应性疾病或相关病况、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、自体免疫性疾病、细菌感染、癌症、痴呆、抑郁症或相关病况、糖尿病、血脂异常、高脂血症、高血压、鱼鳞癣、免疫性疾病、代谢性疾病或病症、神经性疾病或病症、肥胖症、帕金森氏病、疼痛、类风湿性关节炎或增殖性疾病。
34.一种对受试者体内区域成像的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1至12中任一项所述的缀合物或包含权利要求1至12中任一项所述的缀合物以及药学上可接受的载剂、赋形剂或粘合剂的药物组合物的步骤，其中至少一种第二物质为显像剂。
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