CN110376756A - 一种基于微球薄膜的超分辨显微镜*** - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***。在已有的普通光学显微镜的基础之上，通过成熟完备的薄膜制备工艺，提前制备含有微球的柔性薄膜，三维纳米控制台将制备好的微球薄膜高度集成到普通光学显微镜之上，精确控制微球薄膜与显微物镜以及样品的相对位置关系。样品表面亚衍射极限结构信息先经过薄膜中的微球，后进入显微物镜成像，薄膜中的微球能够显著增强普通显微镜的分辨能力，最终实现微纳结构的超分辨显微测量。本发明在实现微球操控的同时，还能实现远场大面积超分辨成像，实现特征尺寸50nm的微纳结构测量，有望替代传统显微镜应用于材料、生命科学等各种微纳检测领域。
Description
技术领域
本发明属于光学测量工程的技术领域，具体涉及一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***，利用带有微球薄膜的显微镜实现光学超分辨成像，主要用于纳米级别超分辨实时测量，包括材料、生命科学等领域。
背景技术
光学检测技术作为微纳检测技术的典型代表之一，在许多领域都有十分重要的应用。但由于光学衍射极限的存在，传统光学显微镜的横向分辨力受到极大限制，根据阿贝衍射原理，光学***最高横向分辨力仅为入射波长的1/2。分辨率受限来源于隐矢波的丢失，隐矢波中包含物体精细结构信息，其强度随着距离指数衰减，因此只存在于近场。如何实现超分辨光学测量，一直是科学界关注的热点与难点问题之一。
光学检测方法根据作用距离的远近，可以分为近场测量方法与远场测量方法两类。其中，近场测量方法作用距离极短、测量效率低，极大的限制了在实际中的应用。而远场超分辨测量方法，具有极强的可操作性。基于共聚焦原理结合光瞳滤波、超振荡等技术，能够提升横向分辨力，但由于是点测量方式，测量效率低。而基于结构光频域调制方法，能够大面积成像，但受限于测量原理，横向分辨力仅能提升一倍。为了进一步增强成像分辨率，各种新的测量方法被不断提出。这其中，受自然界液滴能够实现更高成像分辨力现象启发，2011年，王增波小组在《Nature Communications》上提出了基于介质微球的超分辨成像技术，将直径微米量级的微球，与传统显微镜结合，采用白光作为光源，实现超分辨成像。该方法具有低成本、高分辨力等优点，在众多远场超分辨测量技术中独具一格。目前使用介质微球用于测量仍然存在很多问题：测量视场狭窄；微球直接放置在样品表面，不能实现微球的操控，无法获得最佳成像质量。因此，为了促进微纳检测的发展，研究基于微球薄膜的超分辨显微镜具有十分重要的意义。
本方法在已有显微镜基础之上，采用薄膜操控微球，克服微球直接放置在样品表面的缺点，可获得最佳成像效果，提高测量效率，从而实现一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***，可以实现高灵活性、超分辨快速测量，测量精度可到纳米量级。
本发明所采用的技术方案是：一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***，以微球薄膜为核心，利用纳米控制台控制微球薄膜三维空间位置，获得最佳成像效果。在此基础上，利用白光照明，获得超分辨图像。
一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***，制备好的微球薄膜通过纳米控制台集成到已有的显微镜***之上，样品亚衍射极限结构信息先经过薄膜中的微球，后由显微镜成像，获得超分辨效果。
其中，利用薄膜实现微球的操控，薄膜的折射率小于微球的折射率，且具有很好的透明性。
其中，可使用的介质微球包括折射率为1.46的二氧化硅微球、折射率为1.59的PS微球、折射率为1.9的钛酸钡微球、折射率为2.2的二氧化钛微球。
其中，利用白光光源进行照明，微球可以收集物体更多的高频信息，从而获得超分辨效果，得到图像最清晰时即为调焦准确的位置。
其中，采用薄膜操控介质微球，利用白光光源进行照明，得到图像最清晰时即为调焦准确的位置，从而实现超分辨率成像，在实现微球操控的同时，还能实现远场大面积超分辨成像，实现特征尺寸50nm的微纳结构测量。
一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***实现超分辨光学检测方法，所述方法包括步骤为：
步骤S1：制备好的薄膜中包含多个微球，利用纳米控制台将微球薄膜集成到已有的普通显微镜之上，精确调整微球薄膜三维空间位置；
步骤S2：白光光源经过显微镜，再经过介质微球，对样品进行照明；
步骤S3：通过目镜观测图像，进行成像分析，评估超分辨能力。
其中，微球薄膜的厚度应大于微球直径，以保证良好的超分辨能力。可使用的介质微球包括折射率为1.46的二氧化硅微球、折射率为1.59的PS微球、折射率为1.9的钛酸钡微球、折射率为2.2的二氧化钛微球，微球直径范围为5um—200um。
其中，照明采用白光光源，通过显微镜照明样品，可使用的显微镜倍数为20倍—100倍不等，且数值孔径(NA)范围为0.3—0.9。
本发明与现有技术相比的优点在于：
(1)、本发明采用薄膜实现微球灵活操控，通过纳米控制台精确控制微球薄膜位置，实现最佳成像，提高检测效率。
(2)、本发明能够利用微球薄膜的成像特性，实现超分辨率光学测量。
附图说明
图1为本发明一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***的流程图。
图2为本发明基于微球薄膜的超分辨显微镜结构示意图。其中，1为目镜，2为白光光源，3为显微物镜，4为微球薄膜，5为纳米控制台，6为待测样品，7为样品台，8为显微镜支座。
图3为制备好的钛酸钡微球薄膜。
图4为基于钛酸钡微球薄膜的显微镜观测到的蓝光光碟超分辨图像。
具体实施方式
为使本发明的目的，技术方案和优点更加清楚明白，下面结合附图对本发明进一步说明。
如图1与图2所示，一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***，能够灵活操控微球的位置，实现超分辨光学检测。包括以下步骤：
步骤S1：利用纳米控制台将制备好的微球薄膜集成到已有的显微镜***之上，精确控制微球薄膜位置，获得的最佳微球薄膜—物镜相对位置；
步骤S2：白光光源经过显微镜，再经过薄膜中微球，对样品进行照明；
步骤S3：通过精确调焦，通过目镜观测样品图像，进行成像分析，评估超分辨能力；
其中，为了获得高质量的图像，白光光源需要经过扩束、准直，可使用临界照明、柯勒照明、环形照明等照明模式，以获得高对比度、高质量的成像效果。
因此，通过微球薄膜辅助，实现一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***。
本发明中，主要的器件包括：目镜1，显微物镜3，微球薄膜4，纳米控制台5，待测样品6，白光光源2，样品台7，显微镜支座8。白光光源2为测量***提供照明，先经过显微物镜3，再经过微球薄膜4对待测样品6进行照明。利用纳米控制台5将微球薄膜4集成到显微镜支座8上，并调节显微物镜3与微球薄膜4的相对位置，使得显微物镜3光轴与微球薄膜4中单个微球中心重合，且视场内微球形状清晰可见，固定两者位置关系，接着通过样品台7调节待测样品6的三维空间位置，待测样品6亚衍射极限结构信息由薄膜中微球收集，再经过显微物镜3，从目镜1中观测聚焦后的超分辨图像。使用的显微物镜放大倍数为20倍—100倍不等，且数值孔径(NA)范围为0.3—0.9。
本发明一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***首先实现了微球的控制，制备了小球薄膜，其次是能利用纳米控制台将小球薄膜集成到已有的显微镜***之上，小球薄膜位置在样品和物镜之间，三者相对位置可以灵活精确调节，获得更好的测量结果。一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***，可快速实现超分辨测量，在白光照明情况下，分辨率可达50nm。
Claims (9)
1.一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***，其特征在于：制备好的微球薄膜通过纳米控制台集成到已有的显微镜***之上，样品亚衍射极限结构信息先经过薄膜中的微球，后由显微镜成像，获得超分辨效果。
2.根据权利要求1所述的一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***，其特征在于：利用薄膜实现微球的操控，薄膜的折射率小于微球的折射率，且具有很好的透明性。
3.根据权利要求1所述的一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***，其特征在于：可使用的介质微球包括折射率为1.46的二氧化硅微球、折射率为1.59的PS微球、折射率为1.9的钛酸钡微球、折射率为2.2的二氧化钛微球。
4.根据权利要求1所述的一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***，其特征在于：利用白光光源进行照明，微球可以收集物体更多的高频信息，从而获得超分辨效果，得到图像最清晰时即为调焦准确的位置。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***，其特征在于：采用薄膜操控介质微球，利用白光光源进行照明，得到图像最清晰时即为调焦准确的位置，从而实现超分辨率成像，在实现微球操控的同时，还能实现远场大面积超分辨成像，实现特征尺寸50nm的微纳结构测量。
6.一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***实现超分辨光学检测方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
步骤S1：制备好的薄膜中包含多个微球，利用纳米控制台将微球薄膜集成到已有的普通显微镜之上，精确调整微球薄膜三维空间位置；
步骤S2：白光光源经过显微镜，再经过介质微球，对样品进行照明；
步骤S3：通过目镜观测图像，进行成像分析，评估超分辨能力。
7.根据权利要求6所述的一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***实现超分辨光学检测方法，其特征在于：微球薄膜的厚度应大于微球直径，以保证良好的超分辨能力，可使用的介质微球包括折射率为1.46的二氧化硅微球、折射率为1.59的PS微球、折射率为1.9的钛酸钡微球、折射率为2.2的二氧化钛微球，微球直径范围为5um—200um。
8.根据权利要求6所述的一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***实现超分辨光学检测方法，其特征在于：照明采用白光光源，通过显微镜照明样品，可使用的显微镜倍数为20倍—100倍不等，且数值孔径(NA)范围为0.3—0.9。
9.一种基于微球薄膜的超分辨显微镜***，其特征在于：包括目镜(1)，显微物镜(3)，微球薄膜(4)，纳米控制台(5)，待测样品(6)，白光光源(2)，样品台(7)和显微镜支座(8)，白光光源(2)为测量***提供照明，先经过显微物镜(3)，再经过微球薄膜(4)对待测样品(6)进行照明；利用纳米控制台(5)将微球薄膜(4)集成到显微镜支座(8)上，并调节显微物镜(3)与微球薄膜(4)的相对位置，使得显微物镜(3)光轴与微球薄膜(4)中单个微球中心重合，且视场内微球形状清晰可见，固定两者位置关系，接着通过样品台(7)调节待测样品(6)的三维空间位置，待测样品(6)亚衍射极限结构信息由薄膜中微球收集，再经过显微物镜(3)，从目镜(1)中观测聚焦后的超分辨图像；使用的显微物镜放大倍数为20倍—100倍不等，且数值孔径(NA)范围为0.3—0.9。
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