CN110373371B

CN110373371B - 过表达木糖转运蛋白基因提高1,2,4-丁三醇产量的方法及应用

Info

Publication number: CN110373371B
Application number: CN201910694865.5A
Authority: CN
Inventors: 诸葛斌; 祖金珊; 徐世文; 陆信曜; 宗红; 宋健
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-07-30
Filing date: 2019-07-30
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2039-07-30
Also published as: CN110373371A

Abstract

本发明公开了过表达木糖转运蛋白基因提高1,2,4‑丁三醇产量的方法及应用，属于基因工程技术领域。本发明应用基因工程方法，将带有E.coli W3110中xylE、xylFGH、araE基因的质粒转入到E.coli KXW3009中，从而提高其对木糖的转运能力，提高E.coli KXW3009中1,2,4‑丁三醇的产量。重组菌经48h摇瓶发酵，1,2,4‑丁三醇产量高达12.32g/L。此发明成功提高了工程菌E.coli KXW3009对木糖的转运能力，为选育1,2,4‑丁三醇高产菌株提供了崭新的思路。

Description

过表达木糖转运蛋白基因提高1,2,4-丁三醇产量的方法及应用

技术领域

本发明涉及过表达木糖转运蛋白基因提高1,2,4-丁三醇产量的方法及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

1,2,4-丁三醇(1,2,4-butanetriol，BT)是一种非天然、高价值的四碳化合物，其性质与甘油相似，是一种无色、无臭、透明的糖浆状液体，易溶于水和醇类物质，具有一定的稳定性与吸湿性，常用作溶剂、润湿剂、医药和***的中间体。目前，在军事上使用的固体推进剂、塑化剂正逐渐由传统的***油(NG)向高能材料1,2,4-丁三醇三硝酸酯(1,2,4-butanetriol trinitrate,BTTN)过度，该化合物即是以BT为前体硝化后产生的，具有热稳定性强，冲击感小，不易挥发，加工安全等优点，为美国海军能源部使用。在医药领域，BT可作为缓释剂，以及合成治疗胆固醇药物与艾滋病药物及抗癌药物的重要中间体。除此之外，1,2,4-丁三醇还可以作为抑菌剂、卷烟添加剂、高分子材料的交联剂、服装表面处理剂等。

1,2,4-丁三醇的生产曾尝试用木质纤维素水解液作为底物，但其中含有的葡萄糖抑制木糖的转运。目前，生产BT利用的是化学合成法，但是化学合成BT存在反应条件苛刻、环境污染严重等缺点。因此，反应条件温和、对环境友好的生物法得到了广泛关注。BT是一种非天然化合物，自然界中不存在任何一种生物可以天然合成BT，因此BT的合成是通过人工构建合成途径来完成。2003年，由Frost团队提出的以大肠杆菌为宿主菌，由木糖变成木糖酸再经过脱水、脱羧、醇脱氢四步反应得到BT(引用自文献：Niu W,Molefe,Mapitso N,Frost,J.W.Microbial Synthesis of the Energetic Material Precursor 1,2,4-Butanetriol[J].Journal of the American Chemical Society,2003,125(43):12998-9.)。而在宿主大肠杆菌中，缺乏木糖脱氢酶和催化脱羧反应的酶，目前的研究主要集中在两个酶的筛选上，另外，研究发现，大肠杆菌利用木糖大部分用于生长，为降低成本，提高BT产量，所以添加葡萄糖用于菌株生长，采用葡萄糖和木糖共底物发酵。但是大肠杆菌对碳源的利用存在分级制度，因此当葡萄糖存在时，会被菌株优先利用，从而影响菌株对木糖的利用。然而，在葡萄糖和木糖共底物发酵研究中发现木糖总是会有很多剩余，同时有木糖酸的积累。因此，提供一种提高木糖转运率、降低副产物积累的方法，对1,2,4-丁三醇的工业生产有重要的应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种重组大肠杆菌，是在大肠杆菌中转入带有木糖转运蛋白基因xylE、xylFGH或araE的质粒，所述xylE编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述xylFGH编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述araE编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。

所述重组大肠杆菌以E.coli KXW3009为宿主。

所述E.coli KXW3009的具体构建方法见“景培源.多策略强化1,2,4-丁三醇的生物合成[D].江南大学,2018”。

所述重组大肠杆菌以pCDFDuet-ara为表达载体。

所述pCDFDuet-ara是将质粒pCDFDuet-1与***糖启动子araBAD分别用限制性内切酶XbaI和EcoRI双酶切，随后将纯化后的***糖启动子基因与pCDFDuet-1连接构建出pCDFDuet-ara载体。

所述xylE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述xylFGH的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述araE的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第二个目的是提供一种生产1,2,4-丁三醇的方法，是应用上述任一的重组大肠杆菌进行发酵。

所述发酵条件为：(1)挑取转化成功的重组大肠杆菌单菌落接种到种子培养基摇瓶中，35-38℃，150-180rpm摇床中培养过夜，制备种子液；

(2)以1-5％的接种量，接种到发酵培养基，35-38℃，200-220rpm摇床中培养40-60h。

本发明的第三个目的是提供上述重组大肠杆菌的构建方法，将xylE、xylFGH或araE基因与pCDFDuet-ara连接，将得到的重组质粒pCDFDuet-ara-xylE、pCDFDuet-ara-xylFGH、pCDFDuet-ara-araE分别电击转化到E.coli KXW3009中，获得转化成功的重组大肠杆菌。

所述的一种提高1,2,4-丁三醇产量的方法用于医药或化工领域。如制备溶剂、润湿剂、医药和***的中间体。

所述的发酵培养基为：葡萄糖10g/L，木糖30g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，CaCO₃ 10g/L。

所述的种子培养基为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。

本发明的第四个目的是提供上述的重组大肠杆菌在医药或化工领域中的应用。如制备溶剂、润湿剂、医药和***的中间体。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种能提高1,2,4-丁三醇产量的基因工程菌的构建方法。该方法包括以下过程：利用PCR扩增克隆编码木糖转运蛋白的基因，将基因片段连接到过表达载体，然后利用电转化的方法转化入E.coli KXW3009，通过链霉素抗性筛选获得目的基因工程菌。应用获得的基因工程菌进行发酵48h，可以提高工程菌E.coli KXW3009中1,2,4-丁三醇的产量至12.32g/L。除重组菌株E.coli Z2中存在8.1g/L木糖的剩余外，E.coli Z1、E.coliZ3都没有木糖剩余，这样可以减少成本，增加BT产量。

附图说明

图1是重组菌株E.coli KXW3009在摇瓶中发酵的结果。

图2是重组菌株E.coli Z1在摇瓶中发酵的结果。

图3是重组菌株E.coli Z2在摇瓶中发酵的结果。

图4是重组菌株E.coli Z3在摇瓶中发酵的结果。

具体实施方式

出发菌E.coli KXW3009具体构建方法见景培源.多策略强化1,2,4-丁三醇的生物合成[D].江南大学,2018。

(一)重组质粒pCDFDuet-ara-xylE、pCDFDuet-ara-xylFGH、pCDFDuet-ara-araE的构建方法

将质粒pCDFDuet-1与***糖启动子araBAD分别用限制性内切酶XbaI和EcoRI双酶切，随后将纯化后的***糖启动子araBAD与pCDFDuet-1连接构建出pCDFDuet-ara载体。

将pCDFDuet-ara载体与木糖转运蛋白基因分别用限制性内切酶PstI和NotI双酶切，然后将纯化后的木糖转运蛋白基因xylE、xylFGH、araE与pCDFDuet-ara载体分别连接构建出质粒pCDFDuet-ara-xylE、pCDFDuet-ara-xylFGH、pCDFDuet-ara-araE。

反应体系如下：质粒pCDFDuet-1 0.5μL，***糖启动子araBAD基因4.5μL或质粒pCDFDuet-ara 0.5μL，木糖转运蛋白基因xylE 4.5μL，Ligation Solution 5μL，混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接4h以上，转化E.coli JM109，并涂布于链霉素抗性平板中筛选突菌株，最后选择卡那抗性平板生长良好的菌株培养，提取质粒pCDFDuet-ara-xylE、pCDFDuet-ara-xylFGH、pCDFDuet-ara-araE。

(二)培养基

种子培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。

发酵培养基：葡萄糖10g/L，木糖30g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，CaCO₃ 10g/L。

(三)HPLC检测底物、产物含量的方法

利用高效液相色谱法测定发酵液中木糖、木糖酸、葡萄糖、乳糖、BT含量，使用示差检测器检测，色谱柱为Aminex HPX-87H，柱温维持在60℃；流动相为5mmol·L^-1H₂SO₄，流速为0.6mL·min^-1，进样量为10μL。为了通过高效液相色谱法测定3,4-二羟基丁酸，通过使用2-硝基苯肼和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)作为衍生化试剂进行柱前衍生化，在60℃下进行30min。使用反相C18柱(lDevelosil ODS-UG)分离反应混合物，通过UV-VIS检测器在400nm处检测。柱温保持在40℃，流动相为20mmol·L^-1磷酸二氢钾(pH4.5)和乙腈体积比为3:1的混合物。流速为1mL·min^-1进样量为20μL。

木糖的检测方法使用异羟肟酸法定量。样品用0.7M盐酸稀释，100℃煮沸15分钟以将木糖酸转化为木糖酸-γ-内酯，然后添加1mL羟胺试剂(2M盐酸羟胺与2M氢氧化钠1:1混合)。然后依次添加3.2M盐酸650μL，FeCl₃盐酸溶液(100g/L溶于0.1M盐酸)500μL。在550nm处测定吸光度。

实施例1构建重组大肠杆菌

人工合成木糖转运蛋白基因SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5，双酶切后连接pCDFDuet-ara表达载体，使用T4连接酶(购自TaKaRa公司)完成连接工作，并将连接产物转化大肠杆菌，收集平板上菌体，提取质粒(质粒抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司)，并转化E.coli KXW3009。

转化方法采用电击转化法。步骤如下：挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37℃,150r·min^-1培养10～16h活化，活化后的种子液按1％的接种量转接到50mL的LB培养基中，培养至OD₆₀₀值约为0.4～0.6左右。将菌液放入冰中放置30min，然后4℃,8000r·min^-1离心收集菌体，弃去上清液。用预冷的10％甘油洗涤菌体2～3次(每次离心后放冰上静止5min)。弃尽上清，加入2～3mL的10％预冷甘油重悬菌体，并转入已灭菌的1.5mL的离心管中，每管100μL用于电转化。加入待转化的质粒5μL，冰上放置10-15min。1mm的电转杯在超净工作台中烘干，并放入冰中冷却20min。

将混有质粒的感受态细胞加入电转杯中，2500V电压下，电击5ms左右，电击完成后加入1mL的LB培养基混匀后吸出全部菌液，37℃后培养1h，然后涂布于相应的链霉素抗性平板上，获得分别具有xylE、xylFGH、araE基因的重组菌株E.coli Z1、E.coli Z2、E.coli Z3。

实施例2摇瓶发酵

(1)在无菌环境中，挑取转化成功的工程菌E.coli Z1、E.coli Z2、E.coli Z3单菌落接种到装有10mL种子培养基的50mL的摇瓶中，37℃，150rpm摇床中培养过夜，制备种子液；

(2)以1％的接种量，接种到装有50mL发酵培养基的250mL的摇瓶中，37℃，200rpm摇床中培养48h，不定时取样通过分光光度计测OD₆₀₀及通过液相测发酵产物。

从图1可知，在重组菌株E.coli KXW3009摇瓶发酵中，BT产量为8.54g/L，木糖剩余16.26g/L，有超过50％的木糖剩余。从图2、3、4可知，再过表达木糖转运蛋白后，BT的产量分别增加了3.62g/L、3g/L、3.78g/L，除重组菌株E.coli Z2中存在8.1g/L木糖的剩余外，E.coli Z1、E.coli Z3都没有木糖剩余，这样可以减少成本，增加BT产量。

对比例

将宿主菌E.coli KXW3009替换为E.coli BL21(DE3)，转入木糖转运蛋白基因xylE、xylFGH或araE的重组菌发酵后，均有超过30％的木糖剩余。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 过表达木糖转运蛋白基因提高1,2,4-丁三醇产量的方法及应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1476

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaataccc agtataattc cagttatata ttttcgatta ccttagtcgc tacattaggt 60

ggtttattat ttggctacga caccgccgtt atttccggta ctgttgagtc actcaatacc 120

gtctttgttg ctccacaaaa cttaagtgaa tccgctgcca actccctgtt agggttttgc 180

gtggccagcg ctctgattgg ttgcatcatc ggcggtgccc tcggtggtta ttgcagtaac 240

cgcttcggtc gtcgtgattc acttaagatt gctgctgtcc tgttttttat ttctggtgta 300

ggttctgcct ggccagaact tggttttacc tctataaacc cggacaacac tgtgcctgtt 360

tatctggcag gttatgtccc ggaatttgtt atttatcgca ttattggcgg tattggcgtt 420

ggtttagcct caatgctctc gccaatgtat attgcggaac tggctccagc tcatattcgc 480

gggaaactgg tctcttttaa ccagtttgcg attattttcg ggcaactttt agtttactgc 540

gtaaactatt ttattgcccg ttccggtgat gccagctggc tgaatactga cggctggcgt 600

tatatgtttg cctcggaatg tatccctgca ctgctgttct taatgctgct gtataccgtg 660

ccagaaagtc ctcgctggct gatgtcgcgc ggcaagcaag aacaggcgga aggtatcctg 720

cgcaaaatta tgggcaacac gcttgcaact caggcagtac aggaaattaa acactccctg 780

gatcatggcc gcaaaaccgg tggtcgtctg ctgatgtttg gcgtgggcgt gattgtaatc 840

ggcgtaatgc tctccatctt ccagcaattt gtcggcatca atgtggtgct gtactacgcg 900

ccggaagtgt tcaaaacgct gggggccagc acggatatcg cgctgttgca gaccattatt 960

gtcggagtta tcaacctcac cttcaccgtt ctggcaatta tgacggtgga taaatttggt 1020

cgtaagccac tgcaaattat cggcgcactc ggaatggcaa tcggtatgtt tagcctcggt 1080

accgcgtttt acactcaggc accgggtatt gtggcgctac tgtcgatgct gttctatgtt 1140

gccgcctttg ccatgtcctg gggtccggta tgctgggtac tgctgtcgga aatcttcccg 1200

aatgctattc gtggtaaagc gctggcaatc gcggtggcgg cccagtggct ggcgaactac 1260

ttcgtctcct ggaccttccc gatgatggac aaaaactcct ggctggtggc ccatttccac 1320

aacggtttct cctactggat ttacggttgt atgggcgttc tggcagcact gtttatgtgg 1380

aaatttgtcc cggaaaccaa aggtaaaacc cttgaggagc tggaagcgct ctgggaaccg 1440

gaaacgaaga aaacacaaca aactgctacg ctgtaa 1476

<210> 2

<211> 491

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Asn Thr Gln Tyr Asn Ser Ser Tyr Ile Phe Ser Ile Thr Leu Val

1 5 10 15

Ala Thr Leu Gly Gly Leu Leu Phe Gly Tyr Asp Thr Ala Val Ile Ser

20 25 30

Gly Thr Val Glu Ser Leu Asn Thr Val Phe Val Ala Pro Gln Asn Leu

35 40 45

Ser Glu Ser Ala Ala Asn Ser Leu Leu Gly Phe Cys Val Ala Ser Ala

50 55 60

Leu Ile Gly Cys Ile Ile Gly Gly Ala Leu Gly Gly Tyr Cys Ser Asn

65 70 75 80

Arg Phe Gly Arg Arg Asp Ser Leu Lys Ile Ala Ala Val Leu Phe Phe

85 90 95

Ile Ser Gly Val Gly Ser Ala Trp Pro Glu Leu Gly Phe Thr Ser Ile

100 105 110

Asn Pro Asp Asn Thr Val Pro Val Tyr Leu Ala Gly Tyr Val Pro Glu

115 120 125

Phe Val Ile Tyr Arg Ile Ile Gly Gly Ile Gly Val Gly Leu Ala Ser

130 135 140

Met Leu Ser Pro Met Tyr Ile Ala Glu Leu Ala Pro Ala His Ile Arg

145 150 155 160

Gly Lys Leu Val Ser Phe Asn Gln Phe Ala Ile Ile Phe Gly Gln Leu

165 170 175

Leu Val Tyr Cys Val Asn Tyr Phe Ile Ala Arg Ser Gly Asp Ala Ser

180 185 190

Trp Leu Asn Thr Asp Gly Trp Arg Tyr Met Phe Ala Ser Glu Cys Ile

195 200 205

Pro Ala Leu Leu Phe Leu Met Leu Leu Tyr Thr Val Pro Glu Ser Pro

210 215 220

Arg Trp Leu Met Ser Arg Gly Lys Gln Glu Gln Ala Glu Gly Ile Leu

225 230 235 240

Arg Lys Ile Met Gly Asn Thr Leu Ala Thr Gln Ala Val Gln Glu Ile

245 250 255

Lys His Ser Leu Asp His Gly Arg Lys Thr Gly Gly Arg Leu Leu Met

260 265 270

Phe Gly Val Gly Val Ile Val Ile Gly Val Met Leu Ser Ile Phe Gln

275 280 285

Gln Phe Val Gly Ile Asn Val Val Leu Tyr Tyr Ala Pro Glu Val Phe

290 295 300

Lys Thr Leu Gly Ala Ser Thr Asp Ile Ala Leu Leu Gln Thr Ile Ile

305 310 315 320

Val Gly Val Ile Asn Leu Thr Phe Thr Val Leu Ala Ile Met Thr Val

325 330 335

Asp Lys Phe Gly Arg Lys Pro Leu Gln Ile Ile Gly Ala Leu Gly Met

340 345 350

Ala Ile Gly Met Phe Ser Leu Gly Thr Ala Phe Tyr Thr Gln Ala Pro

355 360 365

Gly Ile Val Ala Leu Leu Ser Met Leu Phe Tyr Val Ala Ala Phe Ala

370 375 380

Met Ser Trp Gly Pro Val Cys Trp Val Leu Leu Ser Glu Ile Phe Pro

385 390 395 400

Asn Ala Ile Arg Gly Lys Ala Leu Ala Ile Ala Val Ala Ala Gln Trp

405 410 415

Leu Ala Asn Tyr Phe Val Ser Trp Thr Phe Pro Met Met Asp Lys Asn

420 425 430

Ser Trp Leu Val Ala His Phe His Asn Gly Phe Ser Tyr Trp Ile Tyr

435 440 445

Gly Cys Met Gly Val Leu Ala Ala Leu Phe Met Trp Lys Phe Val Pro

450 455 460

Glu Thr Lys Gly Lys Thr Leu Glu Glu Leu Glu Ala Leu Trp Glu Pro

465 470 475 480

Glu Thr Lys Lys Thr Gln Gln Thr Ala Thr Leu

485 490

<210> 3

<211> 3717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaaaataa agaacattct actcaccctt tgcacctcac tcctgcttac caacgttgct 60

gcacacgcca aagaagtcaa aataggtatg gcgattgatg atctccgtct tgaacgctgg 120

caaaaagatc gagatatctt tgtgaaaaag gcagaatctc tcggcgcgaa agtatttgta 180

cagtctgcaa atggcaatga agaaacacaa atgtcgcaga ttgaaaacat gataaaccgg 240

ggtgtcgatg ttcttgtcat tattccgtat aacggtcagg tattaagtaa cgttgtaaaa 300

gaagccaaac aagaaggcat taaagtatta gcttacgacc gtatgattaa cgatgcggat 360

atcgattttt atatttcttt cgataacgaa aaagtcggtg aactgcaggc aaaagccctg 420

gtcgatattg ttccgcaagg taattacttc ctgatgggcg gctcgccggt agataacaac 480

gccaagctgt tccgcgccgg acaaatgaaa gtgttaaaac cttacgttga ttccggaaaa 540

attaaagtcg ttggtgacca atgggttgat ggctggttac cggaaaacgc attgaaaatt 600

atggaaaacg cgctaaccgc caataataac aaaattgatg ctgtagttgc ctcaaacgat 660

gccaccgcag gtggggcaat tcaggcatta agcgcgcaag gtttatcagg gaaagtagca 720

atctccggcc aggatgcgga tctcgcaggt attaaacgta ttgctgccgg tacgcaaact 780

atgacggtgt ataaacctat tacgttgttg gcaaatactg ccgcagaaat tgccgttgag 840

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aaagacggat tccacaaaga gagcgagctg taaatgcctt atctacttga aatgaagaac 1020

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gttaatcgtc atattaaacg agttaatgat gtctcgtttt ccctgaaacg tggcgaaata 1860

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gtgtggcccg gacaatggga aggaaaaatt tatattgatg gcaaacaggt agatattcgt 1980

aactgtcagc aagccatcgc ccaggggatt gcgatggtcc ccgaagacag aaagcgcgac 2040

ggcatcgttc cggtaatggc ggttggtaaa aatattaccc tcgccgcact caataaattt 2100

accggtggca ttagccagct tgatgacgcg gcagagcaaa aatgtattct ggaatcaatc 2160

cagcaactca aagttaaaac gtcgtccccc gaccttgcta ttggacgttt gagcggcggc 2220

aatcagcaaa aagcgatcct cgctcgctgt ctgttactta acccgcgcat tctcattctt 2280

gatgaaccca ccaggggtat cgatattggc gcgaaatacg agatctacaa attaattaac 2340

caactcgtcc agcagggtat tgccgttatt gtcatctctt ccgaattacc tgaagtgctc 2400

ggccttagcg atcgtgtact ggtgatgcat gaagggaaac taaaagccaa cctgataaat 2460

cataacctga ctcaggagca ggtgatggaa gccgcattga ggagcgaaca tcatgtcgaa 2520

aagcaatccg tctgaatgtc gaaaagcaat ccgtctgaag tgaaattggc cgtaccgaca 2580

tccggtggct tctccgggct gaaatcactg aatttgcagg tcttcgtgat gattgcagct 2640

atcatcgcaa tcatgctgtt ctttacctgg accaccgatg gtgcctactt aagcgcccgt 2700

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gtcccttcat ttattgtcac cctcgcgggc atgttggcat ttcgcggcat actcattggc 3000

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tatctccccg ccagtaccgg cttcatcatt ggcgcgcttg gcttaatggc ttttgttggt 3120

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ccttctgcgg gaaatatcgc cgaactggac gcaattgcag catgcgtgat tggcggcacc 3540

agcctggctg gcggtgtggg aagcgttgcc ggagcagtaa tgggggcatt tatcatggct 3600

tcactggata acggcatgag tatgatggat gtaccgacct tctggcagta tatcgttaaa 3660

ggtgcgattc tgttgctggc agtatggatg gactccgcaa ccaaacgccg ttcttga 3717

<210> 4

<211> 1236

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Lys Ile Lys Asn Ile Leu Leu Thr Leu Cys Thr Ser Leu Leu Leu

1 5 10 15

Thr Asn Val Ala Ala His Ala Lys Glu Val Lys Ile Gly Met Ala Ile

20 25 30

Asp Asp Leu Arg Leu Glu Arg Trp Gln Lys Asp Arg Asp Ile Phe Val

35 40 45

Lys Lys Ala Glu Ser Leu Gly Ala Lys Val Phe Val Gln Ser Ala Asn

50 55 60

Gly Asn Glu Glu Thr Gln Met Ser Gln Ile Glu Asn Met Ile Asn Arg

65 70 75 80

Gly Val Asp Val Leu Val Ile Ile Pro Tyr Asn Gly Gln Val Leu Ser

85 90 95

Asn Val Val Lys Glu Ala Lys Gln Glu Gly Ile Lys Val Leu Ala Tyr

100 105 110

Asp Arg Met Ile Asn Asp Ala Asp Ile Asp Phe Tyr Ile Ser Phe Asp

115 120 125

Asn Glu Lys Val Gly Glu Leu Gln Ala Lys Ala Leu Val Asp Ile Val

130 135 140

Pro Gln Gly Asn Tyr Phe Leu Met Gly Gly Ser Pro Val Asp Asn Asn

145 150 155 160

Ala Lys Leu Phe Arg Ala Gly Gln Met Lys Val Leu Lys Pro Tyr Val

165 170 175

Asp Ser Gly Lys Ile Lys Val Val Gly Asp Gln Trp Val Asp Gly Trp

180 185 190

Leu Pro Glu Asn Ala Leu Lys Ile Met Glu Asn Ala Leu Thr Ala Asn

195 200 205

Asn Asn Lys Ile Asp Ala Val Val Ala Ser Asn Asp Ala Thr Ala Gly

210 215 220

Gly Ala Ile Gln Ala Leu Ser Ala Gln Gly Leu Ser Gly Lys Val Ala

225 230 235 240

Ile Ser Gly Gln Asp Ala Asp Leu Ala Gly Ile Lys Arg Ile Ala Ala

245 250 255

Gly Thr Gln Thr Met Thr Val Tyr Lys Pro Ile Thr Leu Leu Ala Asn

260 265 270

Thr Ala Ala Glu Ile Ala Val Glu Leu Gly Asn Gly Gln Glu Pro Lys

275 280 285

Ala Asp Thr Thr Leu Asn Asn Gly Leu Lys Asp Val Pro Ser Arg Leu

290 295 300

Leu Thr Pro Ile Asp Val Asn Lys Asn Asn Ile Lys Asp Thr Val Ile

305 310 315 320

Lys Asp Gly Phe His Lys Glu Ser Glu Leu Met Pro Tyr Leu Leu Glu

325 330 335

Met Lys Asn Ile Thr Lys Thr Phe Gly Ser Val Lys Ala Ile Asp Asn

340 345 350

Val Cys Leu Arg Leu Asn Ala Gly Glu Ile Val Ser Leu Cys Gly Glu

355 360 365

Asn Gly Ser Gly Lys Ser Thr Leu Met Lys Val Leu Cys Gly Ile Tyr

370 375 380

Pro His Gly Ser Tyr Glu Gly Glu Ile Ile Phe Ala Gly Glu Glu Ile

385 390 395 400

Gln Ala Ser His Ile Arg Asp Thr Glu Arg Lys Gly Ile Ala Ile Ile

405 410 415

His Gln Glu Leu Ala Leu Val Lys Glu Leu Thr Val Leu Glu Asn Ile

420 425 430

Phe Leu Gly Asn Glu Ile Thr His Asn Gly Ile Met Asp Tyr Asp Leu

435 440 445

Met Thr Leu Arg Cys Gln Lys Leu Leu Ala Gln Val Ser Leu Ser Ile

450 455 460

Ser Pro Asp Thr Arg Val Gly Asp Leu Gly Leu Gly Gln Gln Gln Leu

465 470 475 480

Val Glu Ile Ala Lys Ala Leu Asn Lys Gln Val Arg Leu Leu Ile Leu

485 490 495

Asp Glu Pro Thr Ala Ser Leu Thr Glu Gln Glu Thr Ser Ile Leu Leu

500 505 510

Asp Ile Ile Arg Asp Leu Gln Gln His Gly Ile Ala Cys Ile Tyr Ile

515 520 525

Ser His Lys Leu Asn Glu Val Lys Ala Ile Ser Asp Thr Ile Cys Val

530 535 540

Ile Arg Asp Gly Gln His Ile Gly Thr Arg Asp Ala Ala Gly Met Ser

545 550 555 560

Glu Asp Asp Ile Ile Thr Met Met Val Gly Arg Glu Leu Thr Ala Leu

565 570 575

Tyr Pro Asn Glu Pro His Thr Thr Gly Asp Glu Ile Leu Arg Ile Glu

580 585 590

His Leu Thr Ala Trp His Pro Val Asn Arg His Ile Lys Arg Val Asn

595 600 605

Asp Val Ser Phe Ser Leu Lys Arg Gly Glu Ile Leu Gly Ile Ala Gly

610 615 620

Leu Val Gly Ala Gly Arg Thr Glu Thr Ile Gln Cys Leu Phe Gly Val

625 630 635 640

Trp Pro Gly Gln Trp Glu Gly Lys Ile Tyr Ile Asp Gly Lys Gln Val

645 650 655

Asp Ile Arg Asn Cys Gln Gln Ala Ile Ala Gln Gly Ile Ala Met Val

660 665 670

Pro Glu Asp Arg Lys Arg Asp Gly Ile Val Pro Val Met Ala Val Gly

675 680 685

Lys Asn Ile Thr Leu Ala Ala Leu Asn Lys Phe Thr Gly Gly Ile Ser

690 695 700

Gln Leu Asp Asp Ala Ala Glu Gln Lys Cys Ile Leu Glu Ser Ile Gln

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Gln Leu Lys Val Lys Thr Ser Ser Pro Asp Leu Ala Ile Gly Arg Leu

725 730 735

Ser Gly Gly Asn Gln Gln Lys Ala Ile Leu Ala Arg Cys Leu Leu Leu

740 745 750

Asn Pro Arg Ile Leu Ile Leu Asp Glu Pro Thr Arg Gly Ile Asp Ile

755 760 765

Gly Ala Lys Tyr Glu Ile Tyr Lys Leu Ile Asn Gln Leu Val Gln Gln

770 775 780

Gly Ile Ala Val Ile Val Ile Ser Ser Glu Leu Pro Glu Val Leu Gly

785 790 795 800

Leu Ser Asp Arg Val Leu Val Met His Glu Gly Lys Leu Lys Ala Asn

805 810 815

Leu Ile Asn His Asn Leu Thr Gln Glu Gln Val Met Glu Ala Ala Leu

820 825 830

Arg Ser Glu His His Val Glu Lys Gln Ser Val Met Ser Lys Ser Asn

835 840 845

Pro Ser Glu Val Lys Leu Ala Val Pro Thr Ser Gly Gly Phe Ser Gly

850 855 860

Leu Lys Ser Leu Asn Leu Gln Val Phe Val Met Ile Ala Ala Ile Ile

865 870 875 880

Ala Ile Met Leu Phe Phe Thr Trp Thr Thr Asp Gly Ala Tyr Leu Ser

885 890 895

Ala Arg Asn Val Ser Asn Leu Leu Arg Gln Thr Ala Ile Thr Gly Ile

900 905 910

Leu Ala Val Gly Met Val Phe Val Ile Ile Ser Ala Glu Ile Asp Leu

915 920 925

Ser Val Gly Ser Met Met Gly Leu Leu Gly Gly Val Ala Ala Ile Cys

930 935 940

Asp Val Trp Leu Gly Trp Pro Leu Pro Leu Thr Ile Ile Val Thr Leu

945 950 955 960

Val Leu Gly Leu Leu Leu Gly Ala Trp Asn Gly Trp Trp Val Ala Tyr

965 970 975

Arg Lys Val Pro Ser Phe Ile Val Thr Leu Ala Gly Met Leu Ala Phe

980 985 990

Arg Gly Ile Leu Ile Gly Ile Thr Asn Gly Thr Thr Val Ser Pro Thr

995 1000 1005

Ser Ala Ala Met Ser Gln Ile Gly Gln Ser Tyr Leu Pro Ala Ser

1010 1015 1020

Thr Gly Phe Ile Ile Gly Ala Leu Gly Leu Met Ala Phe Val Gly

1025 1030 1035

Trp Gln Trp Arg Gly Arg Met Arg Arg Gln Ala Leu Gly Leu Gln

1040 1045 1050

Ser Pro Ala Ser Thr Ala Val Val Gly Arg Gln Ala Leu Thr Ala

1055 1060 1065

Ile Ile Val Leu Gly Ala Ile Trp Leu Leu Asn Asp Tyr Arg Gly

1070 1075 1080

Val Pro Thr Pro Val Leu Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Gly Gly

1085 1090 1095

Met Phe Met Ala Thr Arg Thr Ala Phe Gly Arg Arg Ile Tyr Ala

1100 1105 1110

Ile Gly Gly Asn Leu Glu Ala Ala Arg Leu Ser Gly Ile Asn Val

1115 1120 1125

Glu Arg Thr Lys Leu Ala Val Phe Ala Ile Asn Gly Leu Met Val

1130 1135 1140

Ala Ile Ala Gly Leu Ile Leu Ser Ser Arg Leu Gly Ala Gly Ser

1145 1150 1155

Pro Ser Ala Gly Asn Ile Ala Glu Leu Asp Ala Ile Ala Ala Cys

1160 1165 1170

Val Ile Gly Gly Thr Ser Leu Ala Gly Gly Val Gly Ser Val Ala

1175 1180 1185

Gly Ala Val Met Gly Ala Phe Ile Met Ala Ser Leu Asp Asn Gly

1190 1195 1200

Met Ser Met Met Asp Val Pro Thr Phe Trp Gln Tyr Ile Val Lys

1205 1210 1215

Gly Ala Ile Leu Leu Leu Ala Val Trp Met Asp Ser Ala Thr Lys

1220 1225 1230

Arg Arg Ser

1235

<210> 5

<211> 1419

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggttacta tcaatacgga atctgcttta acgccacgtt ctttgcggga tacgcggcgt 60

atgaatatgt ttgtttcggt agctgctgcg gtcgcaggat tgttatttgg tcttgatatc 120

ggcgtaatcg ccggagcgtt gccgttcatt accgatcact ttgtgctgac cagtcgtttg 180

caggaatggg tggttagtag catgatgctc ggtgcagcaa ttggtgcgct gtttaatggt 240

tggctgtcgt tccgcctggg gcgtaaatac agcctgatgg cgggggccat cctgtttgta 300

ctcggttcta tagggtccgc ttttgcgacc agcgtagaga tgttaatcgc cgctcgtgtg 360

gtgctgggca ttgctgtcgg gatcgcgtct tacaccgctc ctctgtatct ttctgaaatg 420

gcaagtgaaa acgttcgcgg taagatgatc agtatgtacc agttgatggt cacactcggc 480

atcgtgctgg cgtttttatc cgatacagcg ttcagttata gcggtaactg gcgcgcaatg 540

ttgggggttc ttgctttacc agcagttctg ctgattattc tggtagtctt cctgccaaat 600

agcccgcgct ggctggcgga aaaggggcgt catattgagg cggaagaagt attgcgtatg 660

ctgcgcgata cgtcggaaaa agcgcgagaa gaactcaacg aaattcgtga aagcctgaag 720

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gcgccgcgta tcttcaaaat ggcgggcttt acgaccacag aacaacagat gattgcgact 900

ctggtcgtag ggctgacctt tatgttcgcc acctttattg cggtgtttac ggtagataaa 960

gcagggcgta aaccggctct gaaaattggt ttcagcgtga tggcgttagg cactctggtg 1020

ctgggctatt gcctgatgca gtttgataac ggtacggctt ccagtggctt gtcctggctc 1080

tctgttggca tgacgatgat gtgtattgcc ggttatgcga tgagcgccgc gccagtggtg 1140

tggatcctgt gctctgaaat tcagccgctg aaatgccgcg atttcggtat tacctgttcg 1200

accaccacga actgggtgtc gaatatgatt atcggcgcga ccttcctgac actgcttgat 1260

agcattggcg ctgccggtac gttctggctc tacactgcgc tgaacattgc gtttgtgggc 1320

attactttct ggctcattcc ggaaaccaaa aatgtcacgc tggaacatat cgaacgcaaa 1380

ctgatggcag gcgagaagtt gagaaatatc ggcgtctga 1419

<210> 6

<211> 472

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Val Thr Ile Asn Thr Glu Ser Ala Leu Thr Pro Arg Ser Leu Arg

1 5 10 15

Asp Thr Arg Arg Met Asn Met Phe Val Ser Val Ala Ala Ala Val Ala

20 25 30

Gly Leu Leu Phe Gly Leu Asp Ile Gly Val Ile Ala Gly Ala Leu Pro

35 40 45

Phe Ile Thr Asp His Phe Val Leu Thr Ser Arg Leu Gln Glu Trp Val

50 55 60

Val Ser Ser Met Met Leu Gly Ala Ala Ile Gly Ala Leu Phe Asn Gly

65 70 75 80

Trp Leu Ser Phe Arg Leu Gly Arg Lys Tyr Ser Leu Met Ala Gly Ala

85 90 95

Ile Leu Phe Val Leu Gly Ser Ile Gly Ser Ala Phe Ala Thr Ser Val

100 105 110

Glu Met Leu Ile Ala Ala Arg Val Val Leu Gly Ile Ala Val Gly Ile

115 120 125

Ala Ser Tyr Thr Ala Pro Leu Tyr Leu Ser Glu Met Ala Ser Glu Asn

130 135 140

Val Arg Gly Lys Met Ile Ser Met Tyr Gln Leu Met Val Thr Leu Gly

145 150 155 160

Ile Val Leu Ala Phe Leu Ser Asp Thr Ala Phe Ser Tyr Ser Gly Asn

165 170 175

Trp Arg Ala Met Leu Gly Val Leu Ala Leu Pro Ala Val Leu Leu Ile

180 185 190

Ile Leu Val Val Phe Leu Pro Asn Ser Pro Arg Trp Leu Ala Glu Lys

195 200 205

Gly Arg His Ile Glu Ala Glu Glu Val Leu Arg Met Leu Arg Asp Thr

210 215 220

Ser Glu Lys Ala Arg Glu Glu Leu Asn Glu Ile Arg Glu Ser Leu Lys

225 230 235 240

Leu Lys Gln Gly Gly Trp Ala Leu Phe Lys Ile Asn Arg Asn Val Arg

245 250 255

Arg Ala Val Phe Leu Gly Met Leu Leu Gln Ala Met Gln Gln Phe Thr

260 265 270

Gly Met Asn Ile Ile Met Tyr Tyr Ala Pro Arg Ile Phe Lys Met Ala

275 280 285

Gly Phe Thr Thr Thr Glu Gln Gln Met Ile Ala Thr Leu Val Val Gly

290 295 300

Leu Thr Phe Met Phe Ala Thr Phe Ile Ala Val Phe Thr Val Asp Lys

305 310 315 320

Ala Gly Arg Lys Pro Ala Leu Lys Ile Gly Phe Ser Val Met Ala Leu

325 330 335

Gly Thr Leu Val Leu Gly Tyr Cys Leu Met Gln Phe Asp Asn Gly Thr

340 345 350

Ala Ser Ser Gly Leu Ser Trp Leu Ser Val Gly Met Thr Met Met Cys

355 360 365

Ile Ala Gly Tyr Ala Met Ser Ala Ala Pro Val Val Trp Ile Leu Cys

370 375 380

Ser Glu Ile Gln Pro Leu Lys Cys Arg Asp Phe Gly Ile Thr Cys Ser

385 390 395 400

Thr Thr Thr Asn Trp Val Ser Asn Met Ile Ile Gly Ala Thr Phe Leu

405 410 415

Thr Leu Leu Asp Ser Ile Gly Ala Ala Gly Thr Phe Trp Leu Tyr Thr

420 425 430

Ala Leu Asn Ile Ala Phe Val Gly Ile Thr Phe Trp Leu Ile Pro Glu

435 440 445

Thr Lys Asn Val Thr Leu Glu His Ile Glu Arg Lys Leu Met Ala Gly

450 455 460

Glu Lys Leu Arg Asn Ile Gly Val

465 470

<210> 7

<211> 166

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aaagccatga caaaaacgcg taacaaaagt gtctataatc acggcagaaa agtccacatt 60

gattatttgc acggcgtcac actttgctat gccatagcat ttttatccat aagattagcg 120

gatcctacct gacgcttttt atcgcaactc tctactgttt ctccat 166

Claims

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，在宿主细胞大肠杆菌中转入带有木糖转运蛋白基因xylE或araE的重组质粒，所述xylE编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述araE编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述宿主细胞为E. coli KXW3009，所述重组质粒的出发质粒为pCDFDuet-ara；所述pCDFDuet-ara是将质粒pCDFDuet-1与***糖启动子araBAD分别用限制性内切酶XbaI和EcoRI双酶切，随后将纯化后的***糖启动子基因与pCDFDuet-1连接构建而成。

2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述xylE的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述araE的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

4.一种生产1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，应用权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌进行发酵。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵条件为：（1）挑取转化成功的重组大肠杆菌单菌落接种到种子培养基摇瓶中，35-38℃，150-180 rpm摇床中培养过夜，制备种子液；

（2）以1-5%的接种量，接种到发酵培养基，35-38℃，200-220 rpm摇床中培养40-60 h。

6.权利要求1-3任一所述重组大肠杆菌的构建方法，将xylE或araE基因与pCDFDuet-ara连接，将得到的重组质粒pCDFDuet-ara-xylE、pCDFDuet-ara-araE分别电击转化E. coli KXW3009，获得转化成功的重组大肠杆菌E.coli Z1、E.coli Z3。

7.权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌在医药或化工领域中制备1,2,4-丁三醇的应用。