CN110373335A - 出芽短梗霉菌pa-2发酵培养基及发酵条件优化方法 - Google Patents

出芽短梗霉菌pa-2发酵培养基及发酵条件优化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110373335A
CN110373335A CN201910801104.5A CN201910801104A CN110373335A CN 110373335 A CN110373335 A CN 110373335A CN 201910801104 A CN201910801104 A CN 201910801104A CN 110373335 A CN110373335 A CN 110373335A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aureobasidium pullulans
fermentation
culture medium
fermented
glucose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910801104.5A
Other languages
English (en)
Inventor
郭青云
程亮
魏有海
朱海霞
杨莹
庄新亚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Original Assignee
Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences filed Critical Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Priority to CN201910801104.5A priority Critical patent/CN110373335A/zh
Publication of CN110373335A publication Critical patent/CN110373335A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种出芽短梗霉菌PA‑2发酵培养基及发酵条件优化方法，涉及菌株培养技术领域，能够有效增加对出芽短梗霉菌PA‑2进行发酵培养时的孢子数，提高生产效率；该培养基包括所述培养基包括：葡萄糖、大豆粉和无机盐；所述无机盐包括：NaCI、MgSO4、KCI、K2HPO4和(NH4)2SO4；葡萄糖为84.60g/L、大豆粉为46.35g/L以及无机盐为10.91g/L；发酵培养的条件为：pH值为7.0、发酵培养时间为120h、接种量为8％、转速为180r/min、发酵温度为25℃和装液量为60mL。本发明提供的技术方案适用于出芽短梗霉菌的培养过程中。

Description

出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基及发酵条件优化方法
【技术领域】
本发明涉及菌株培养技术领域，尤其涉及一种出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基及发酵条件优化方法。
【背景技术】
田间杂草是作物病虫害发生和传播的介质，增加了农业田间管理劳动和投入成本，成为严重危害农业经济的因素之一(李久新，2011；陈世国，2015；李香菊，2018)。化学农药的长期大量使用导致农田杂草抗药性迅猛发展，作物药害、农药残留发生频繁，增加了治理难度和人工费用(冯维卓，2001；梁巧玲，2007)。因此，为研究高效、新型、绿色、无污染的生物农药增加除草药剂的丰富度，避免单一药剂的长期使用造成杂草抗药性已成为当前杂草防除研究的热点。出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)是一类与酵母密切相关的真菌，由于该菌可产生能够抑制杂草和植物病害的代谢产物，进而达到防除作用，因此可被作为生防除草剂应用在杂草生防领域。
目前，出芽短梗霉菌的生产主要通过发酵培养基进行发酵培养的方式。在不同生境中发现的出芽短梗霉菌对于生长条件和环境要求各有不同，优化适合特定菌株的发酵条件是研究利用该菌株的重要基础。不同学者采用单因素和正交优化设计以及Box-Benhnken中心组合设计分别对出芽短梗霉菌的不同菌株液体发酵条件进行优化，提高了发酵水平，缩短了发酵周期，为后续的工业生产奠定了基础。但是，现阶段对出芽短梗霉菌的研究以发酵产生糖类物质和提高发酵液活性物质为主要方向，对提高孢子数量的研究几乎没有，不能满足出芽短梗霉菌日益广泛的应用要求。
因此，有必要研究一种出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基及发酵条件优化方法提高孢子数量来应对现有技术的不足，以解决或减轻上述一个或多个问题。
【发明内容】
有鉴于此，本发明提供了一种出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基及发酵条件优化方法，能够有效增加对出芽短梗霉菌PA-2进行发酵培养时的孢子数，提高生产效率。
一方面，本发明提供一种出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基，其特征在于，所述培养基包括：葡萄糖、大豆粉和无机盐；
所述无机盐包括：NaCI、MgSO4、KCI、K2HPO4和(NH4)2SO4。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述培养基各成分的量为：葡萄糖为84.60g/L、大豆粉为46.35g/L以及无机盐为10.91g/L。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述无机盐的各成分的量为：NaCI为2.59g/L、MgSO4为0.52g/L、KCI为0.78g/L、K2HPO4为6.50g/L以及(NH4)2SO4为0.52g/L。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述培养基对出芽短梗霉菌PA-2进行发酵培养时产孢量的理论最高值为12.76×108CFU/mL。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基孢子数与葡萄糖、大豆粉、无机盐的质量浓度的二次多项回归方程为：
Y＝10.09-0.8256A+1.04B-0.3081C+0.3213AB-1.72AC-2.27BC-1.75A2-1.47B2-0.2757C2；
其中，Y代表孢子数；
A代表葡萄糖质量浓度；
B代表大豆粉质量浓度；
C代表无机盐质量浓度。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，各因子对孢子数影响的主次顺序为：A2、B2、BC>AC>B>A>C2>C>AB。
另一方面，本发明提供一种使用如上任一所述的培养基对出芽短梗霉菌PA-2进行发酵培养的方法，其特征在于，发酵培养的条件为：pH值为6.0～7.0、发酵培养时间为96～148h、接种量为8～12％、转速为160～200r/min、发酵温度为20～25℃和装液量为60～70mL。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，发酵培养的条件为：pH值为7.0、发酵培养时间为120h、接种量为8％、转速为180r/min、发酵温度为25℃和装液量为60mL。
再一方面，本发明提供一种采用如上任一所述的培养基培养的出芽短梗霉菌PA-2进行杂草防除的方法，其特征在于，步骤包括：
S1、将所述出芽短梗霉菌PA-2制成有效含量为108个/g的可湿性粉剂；
S2、将所述可湿性粉剂配备成800g/ha的喷剂；
S3、按200mL/m2喷药液量进行田间喷洒。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，杂草防除的株高抑制率为55.7％、鲜重效为75.0％。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：对培养基的成分和浓度进行优化，能够有效增加对出芽短梗霉菌PA-2进行发酵培养时的孢子数，提高生产效率；对发酵培养出芽短梗霉菌PA-2的培养条件进行优化，进一步提高孢子数，提高生产效率。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
【附图说明】
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2在不同基础培养基上的菌落形态；
图2是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2在不同基础培养基上的菌落直径比较结果图；
图3是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2在不同液体培养基中的生长曲线；
图4是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2菌株在不同葡萄糖含量发酵液中的孢子数；
图5是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2菌株在不同大豆粉含量发酵液中的产孢量；
图6是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2菌株在不同K2HPO4含量发酵液中的产孢量；
图7是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2菌株在不同MgSO4含量发酵液中的产孢量；
图8是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2菌株在不同NaCI含量发酵液中的产孢量；
图9是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2菌株在不同(NH4)2SO4含量发酵液中的产孢量；
图10是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2菌株在不同KCI含量发酵液中的产孢量；
图11是本发明一个实施例提供的葡萄糖浓度和大豆粉浓度对出芽短梗霉菌产孢量影响的响应面；
图12是本发明一个实施例提供的大豆粉浓度和无机盐浓度对出芽短梗霉菌产孢量影响的响应面；
图13是本发明一个实施例提供的葡萄糖浓度和无机盐浓度对出芽短梗霉菌产孢量影响的响应面；
图14是本发明一个实施例提供的初始pH对出芽短梗霉菌PA-2菌株产孢的影响趋势图；
图15是本发明一个实施例提供的发酵时间对出芽短梗霉菌PA-2菌株产孢的影响趋势图；
图16是本发明一个实施例提供的接种量对出芽短梗霉菌PA-2菌株产孢的影响趋势图；
图17是本发明一个实施例提供的转速对出芽短梗霉菌PA-2菌株产孢的影响趋势图；
图18是本发明一个实施例提供的发酵温度对出芽短梗霉菌PA-2菌株产孢的影响趋势图；
图19是本发明一个实施例提供的装液量对出芽短梗霉菌PA-2菌株产孢的影响趋势图。
【具体实施方式】
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明实施例进行详细描述。
应当明确，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
为了改善现有技术的不足，本发明以PA-2菌株发酵液中的产孢量为检测指标，采用单因子优化PA-2菌株发酵培养基和最佳发酵条件，通过中心复合实验(CentralComposite Design)对培养基成分研究最佳配比；PA-2菌株制成可湿性粉剂用于杂草田间药效试验。
一：材料及试验方法
1、本发明选用的试验材料为：
1)供试菌株：出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)菌株PA-2由本实验室从自然感病杨树叶上分离获得并保藏；
2)培养基
菌株活化培养基：PDA培养基；
菌株种子培养基：葡萄糖20g/L、酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L。
2、本发明的试验方法步骤包括：
步骤一：菌株活化和种子液制备
将实验室保存的出芽短梗霉菌PA-2转接到PDA固体培养基中，28℃培养5d，用打孔器在PDA固体培养基中打孔，在菌落边缘取菌块(Φ＝8mm)，接于盛有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，每50mL接菌1块；于25℃、180r/min条件下摇床培养3d，作为种子液；
步骤二：培养基的优化
基础固体培养基筛选：选择7种不同的基础培养基(表1)进行基础固体培养基的筛选；将活化的菌种打菌饼(Φ＝8mm)，置于不同的基础培养基平板中央，于25℃条件下培养，分别于7d和14d测量菌落直径，并观察培养基中菌落直径与形态；每个处理重复3次；选择菌落直径较大的培养基作为培养基优化的基础培养基。
液体发酵培养基筛选：将种子发酵液以4％接种量接入装有50mL不同上述7种液体发酵培养基的锥形瓶中，于180r/min、25℃条件下摇床培养；在发酵培养的第24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h，分别测定产孢量，并绘制不同培养基生长曲线；每个处理重复3次；选择产孢量较大的培养基作为培养基优化的基础培养基。
表1 供试培养基及其配方
步骤三：最适碳、氮源的筛选
选择3种碳源(玉米粉、小麦粉和蔗糖)，3种氮源(KNO3、酵母膏和(NH4)2SO4)，分别等量代替筛选出的基础培养基Ⅶ中的碳源和氮源，配制成不同的碳、氮源培养基进行PA-2菌株培养，根据发酵液中的产孢量筛选出最适碳、氮源的种类；每个处理重复3次。
步骤四：培养基优化单因素试验
将筛选出的培养基的各成分进行单因素试验，将种子液以4％接种量，接入装有50mL基础培养基Ⅶ的培养液250mL三角瓶中；于180r/min、25℃条件下摇床培养7d，测定产孢量；每个处理重复3次。
培养基各成分及水平选择如表2所示。
表2 单因素试验因素及水平
步骤五：响应面法设计优化培养基成分及配比
以单因素试验设计得到的结果为中心点，运用Design Expert 8.0.6软件针对主要因素碳源、氮源、无机盐重新编码，以出芽短梗霉菌PA-2菌株的产孢量为响应值(Y)，设计3因素5水平的20个响应面(RSM)试验，其因素与水平根据中心复合实验(CentralComposite Design,CCD)设计原理。
表3 中心复合设计实验因素及水平
步骤六：发酵条件优化试验
以优化的培养基为发酵培养基，分别测定不同初始pH值(5、6、7、8和9)、发酵时间(0h，12h、24h、36h、48h、60h)、装液量(20mL、40mL、60mL、80mL、100mL、120mL)、接种量(4％、8％、10％、12％、16％)、培养温度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃)和摇床转速(140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min)对PA-2菌株产孢量的影响，每个处理3次重复。
步骤七：PA-2可湿性粉剂对藜的防除试验
按照上述筛选的发酵培养基配方和发酵条件进行PA-2菌株发酵，发酵完成后进行喷雾干燥制成菌粉，加入不同助剂(硅藻土和聚乙烯醇等)制成有效含量为108个/g的可湿性粉剂；田间试验在青海省西宁市城北区二十里铺镇进行，随机区组排列，小区面积8m2，按200mL/m2喷药液量进行喷雾，可湿性粉剂设200、400、600和800g/ha，以200g/L氯氟吡氧乙酸EC为对照CK1、清水为对照CK2，每个处理3次重复，在杂草藜7叶-8叶进行喷雾施药后7d、20d和40d杂草藜的株高和鲜重，计算株高抑制率和鲜重效。
二：结果及分析
1、针对步骤二培养基优化的结果及分析
1.1、固体基础培养基筛选结果：
不同固体基础培养基上PA-2菌落形态有一定的差异，菌落形态及特征见表4。
表4 PA-2在不同基础培养基上菌落形态
图1是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2在不同基础培养基上的菌落形态，其中，1为PDA培养基，2为改良PDA培养基，3为培养基Ⅱ，4为培养基Ⅳ，5为培养基Ⅴ，6为培养基Ⅵ，7为培养基Ⅶ。由图1可知，菌株PA-2在不同培养基上菌落形态基本相似，菌落颜色基本是从白色转变为墨绿色。在大多数培养基中都是气生菌丝生长速度小，基内菌丝生长速度较快，且菌丝薄又稀疏。培养基Ⅵ和培养基Ⅶ菌丝发达，后期生长过程中培养基Ⅵ菌落边缘菌丝稀薄，气生菌丝最发达致密，但培养基Ⅶ在培养后期和前期菌落表现一致。
由表5的菌落直径比较结果可知，在第5d时观察，基础培养基Ⅱ中生长最好，菌落直径达到24.61mm，培养基Ⅵ长势最差，仅为16.49mm，其余培养基菌落直径之间差异不显著。第14d测量菌落直径，改良PDA、基础培养基Ⅱ、基础培养基Ⅶ直径之间没有显著性差异(图2)。同时，根据结合菌落形态观察，在基础培养基Ⅱ、改良PDA、基础培养基Ⅴ中发现基内菌丝最发达，而气生菌丝稀薄甚至不发达，在基础培养基Ⅶ中气生菌丝丰富致密。
表5 PA-2在不同基础培养基上的菌落直径比较
1.2、液体基础培养基筛选：
图3是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2在不同液体培养基中的生长曲线，其中，1为PDA培养基，2为改良PDA培养基，3为培养基Ⅱ，4为培养基Ⅳ，5为培养基Ⅴ，6为培养基Ⅵ，7为培养基Ⅶ。由图3可知，分别在不同时间对各基础培养基发酵液中的PA-2孢子悬浮液测定产孢量，7种供试培养基中基础培养基Ⅶ发酵液在96h时的产孢量最高，达到7.45×108CFU/mL，显著高于其他培养基处理(P<0.05，下同)；其次为基础培养基Ⅵ发酵液，在120h时产孢量为3.73×108CFU/mL；PDA和改良PDA培养基发酵液中产孢量最低，几乎不产孢或产孢很少。因此，结合菌丝生长形态和生长直径，选取基础培养基Ⅶ为PA-2菌株产孢的基础培养基。
2、针对步骤三种培养基碳、氮源的筛选结果
由表6可知，通过将不同碳氮源加入培养基中，PA-2菌株在含有玉米粉和葡萄糖培养基上产孢量最高，分别达到2.93×105和5.10×105CFU/mL，两者孢子悬浮液的OD600值之间不存在显著性差异；在大豆粉培养基上产孢量最高达2.13×106CFU/mL，与其它氮源OD600之间存在极显著性差异。因此选择葡萄糖和大豆粉作为PA-2菌株产孢发酵培养基的最适碳、氮源。
表6 PA-2在不同碳氮源培养基的产孢数量及菌悬液OD600
3、针对步骤四中培养基优化单因素试验的结果
3.1、葡萄糖
图4是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2菌株在不同葡萄糖含量发酵液中的孢子数。由图4可知，随着葡萄糖添加量的增加，孢子数呈现先缓慢增长再下降的趋势，当葡萄糖添加到80.00g时，OD600达到最大，为4.10×108CFU/mL，当葡萄糖添加到100.00g时，OD600呈下降趋势。因此，选择初始葡萄糖添加量80.00g/L为PA-2菌株发酵培养基的碳源。
3.2、大豆粉
图5是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2菌株在不同大豆粉含量发酵液中的产孢量。由图5可知，随着大豆粉添加量的增加，产孢量呈现先增长再下降的趋势，增长趋势明显。在大豆粉添加到35.00g时，产孢量达到最大，为4.20×108CFU/mL，当大豆粉添加量超过35.00g时，产孢量下降趋势。因此，选择初始大豆粉添加量35.00g/L为PA-2菌株发酵培养基的氮源。
3.3磷酸氢二钾
图6是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2菌株在不同K2HPO4含量发酵液中的产孢量。由图6可知，随着K2HPO4添加量的增加，产孢量呈现明显先增长再下降的趋势，上升趋势明显，在K2HPO4添加量到10.00g时，产孢量达到最大，为5.40×108CFU/mL；当K2HPO4添加量超过10.00g时，产孢量呈下降趋势。因此，选择K2HPO4添加量10.00g为PA-2菌株发酵培养基的无机盐。
3.4、硫酸镁
图7是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2菌株在不同MgSO4含量发酵液中的产孢量。由图7可知，随着MgSO4添加量的增加，OD600呈现缓慢的增长再下降的趋势，在MgSO4添加量到0.80g时，产孢量达到最大，为3.5×108CFU/mL；但与添加0.60g MgSO4相比，结果差距仅为0.1×108CFU/mL，差异不明显。但当MgSO4添加量超过0.80g时，产孢量呈快速下降趋势并且趋于平稳。因此，选择MgSO4添加量为0.80g作为培养基初始添加量。因此，选择MgSO4添加量0.80g/L为PA-2菌株发酵培养基的无机盐。
3.5、氯化钠
图8是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2菌株在不同NaCI含量发酵液中的产孢量。由图8可知，随着NaCI添加量的增加，产孢量呈现先增长再下降的趋势，且差异显著。在NaCI添加量到4.00g时，产孢量达到最大，为3.60×108CFU/mL；当NaCI添加量超过4.00g时，产孢量呈显著下降趋势。因此，选择NaCI添加量4.00g/L为PA-2菌株发酵培养基的无机盐。
3.6、硫酸铵
图9是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2菌株在不同(NH4)2SO4含量发酵液中的产孢量。由图9可知，随着(NH4)2SO4添加量的增加，产孢量呈现缓慢增长在快速下降的趋势，在(NH4)2SO4添加量到0.60g时，曲线轻微上涨并在添加量为0.80g-0.90g时，曲线几乎达到平稳，此时产孢量达到最大，当(NH4)2SO4添加量超过1.00g时，产孢量呈显著下降趋势。因此，为了节约成本，选择(NH4)2SO4添加量0.80g/L为PA-2菌株发酵培养基的无机盐。
3.7、氯化钾
图10是本发明一个实施例提供的出芽短梗霉菌PA-2菌株在不同KCI含量发酵液中的产孢量。由图10可知，随着KCL添加量的增加，产孢量呈现先增长再下降的趋势，但增长过程缓慢，数据差异不大。在KCL添加量到1.20g时，产孢量达到最大，为3.60×108CFU/mL；当KCL添加量超过1.20g时，产孢量呈现明显下降趋势。因此，选择KCI添加量1.20g/L为PA-2菌株发酵培养基的无机盐。
3.8、中心组合实验优化结果
在单因素实验的基础上，通过Design Expert 8.0.6的CCD设计原理，对出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基培养条件进行了3因素5水平实验，所得实验结果如表7所示。
表7 中心组合实验设计及结果
以出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基孢子数(Y)为响应值，根据CCD设计的实验结果，利用Design Expert 8.0.6软件对表7数据进行分析，得到孢子数与葡萄糖(A)、大豆粉(B)、无机盐(C)的二次多项回归方程：Y＝10.09-0.8256A+1.04B-0.3081C+0.3213AB-1.72AC-2.27BC-1.75A2-1.47B2-0.2757C2。
对回归模型进行可信度分析和方差分析，结果如表8所示。由表8可知，模型F＝23.15，P<0.0001，说明该回归方程是极显著的。失拟项不显著，说明该模型模拟性较好。模型的复相关系数R2＝0.9542，调整复相关系数R2＝0.9130，预测复相关系数R2＝0.7707，说明调整复相关系数0.9130与预测复相关系数0.7707有较合理的相符度，说明该模型具有较好的回归性。模型信噪比>4是令人满意的，表明该模型具有足够的信号响应设计。因此，该模型能够对出芽短梗霉菌PA-2孢子数进行分析和预测。
模型数据显示，一次项A、B及交互项AC、BC及二次项A2、B2影响极显著(P<0.01)，各因子的影响主次顺序：A2、B2、BC>AC>B>A>C2>C>AB。
表8 回归模型方差分析
注：***表示P＜0.01
根据回归方程绘制试验因素间交互效应三维立体响应曲面和等高线图，观察在一个因素不变的情况下，其他两个因素对产孢量的影响，其结果如图11-13所示，其中，葡萄糖浓度和大豆粉浓度交互作用响应面为开口向下的凸形曲面，之间交互效应的等高线形状为圆形说明葡萄糖浓度和大豆粉浓度的交互作用较显著。在一定的培养时间下，产孢量随着葡萄糖浓度的增加呈现先增长再下降的趋势。回归方程求解得到出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基产孢量的培养基条件为:葡萄糖84.60g/L，大豆粉46.35g/L，无机盐10.91g/L(其中NaCI 2.59g/L、MgSO4 0.52g/L、KCI 0.78g/L、K2HPO4 6.50g/L、(NH4)2SO4 0.52g/L)，预测PA-2产孢量最高值为12.76×108CFU/mL。
根据模型求出的最优条件配制培养基，对模型进行3次以上试验验证，出芽短梗霉菌PA-2平均产孢量达10.68×108CFU/mL。与预测值相比无明显差异，但略有不同。分析其原因可能是由于培养基在发酵过程中含氧量、转速、pH会随着孢子数的上升而有所改变，从而影响最终实际产孢数与预测值产生不同。
3.9、针对步骤六的发酵条件的优化结果
1)pH值
测定了5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，5个pH值对PA-2菌株产孢的影响。由图14可知，发酵培养基初始pH 5-7时，产孢量均随pH增大而增加，pH为7时产孢量值最高，为3.57×108CFU/mL，当pH大于7时，产孢量明显下降，说明中性条件适合PA-2菌株生长。因此，选择pH 7为PA-2菌株摇瓶产孢发酵的最佳pH值。
2)发酵时间
在发酵过程中，每隔12h对PA-2菌株发酵液中产孢量进行测定，结果表明在0-120h时内随着时间的增加，孢子数量呈对数增长，而在120h内产孢量达到最大，120h-192h产孢量区域稳定即进入平台期(图15)，因此，选择120h为PA-2菌株摇瓶产孢发酵的最佳发酵时间。
3)接种量
接种量的试验结果表明(图16)，接种量在4％-8％时，PA-2菌株的发酵液中的产孢量呈明显的上升趋势，8％时达到最高值，为3.04×108CFU/mL；接种量超过8％后，PA-2菌株的产孢量减少。因此，选择8％接种量作为PA-2菌株摇瓶产孢发酵的最佳接种量。
4)摇床转速
由图17可知，当摇床转速为120-180r/min时，随着转速增大，PA-2菌株发酵液中产孢量呈上升趋势，在180r/min时产孢量最高，达3.02×108CFU/mL；当转速超过180r/min时，产孢量缓慢下降。因此，选择180r/min作为PA-2菌株摇瓶产孢发酵最佳摇床转速。
5)发酵温度
分别在不同温度下进行发酵，结果表明(图18)，在24～30℃时，PA-2菌株发酵液中的产孢量均呈上升趋势，25℃时产孢量均达最高值，为3.05×108CFU/mL，超过25℃产孢量明显下降。因此，选择25℃作为PA-2菌株摇瓶产孢发酵的最佳温度。
6)装液量
对发酵时培养基装液量进行试验，结果表明(图19)，在250mL三角瓶中，装液量为40-60mL时，随装液量的增加，发酵液中的产孢量呈上升趋势，装液量在60mL时发酵液的产孢量最高，为3.43×108CFU/mL；装液量大于60mL后产孢量明显下降。因此，选择60mL为PA-2菌株摇瓶产芽孢发酵的最佳装液量。
经优化后，PA-2菌株产孢最适培养基为葡萄糖84.60g/L、大豆粉46.35g/L、NaCI2.59g/L、MgSO4 0.52g/L、KCI 0.78g/L、K2HPO4 6.50g/L、(NH4)2SO4 0.52g/L；最佳发酵条件为pH 7.0，培养时间120h，接种量8％，转速180r/min，发酵温度25℃，装液量60mL。田间防除试验结果表明，PA-2可湿性粉剂对杂草藜的鲜重效最高可达75％。优化后的培养基和发酵条件可有效提高PA-2菌株的产孢量，降低了发酵成本，为该菌作为微生物除草剂的生产应用提供依据。
采用PA-2可湿性粉剂对杂草进行田间防除试验，PA-2可湿性粉剂的制备过程为：按照上述筛选的发酵培养基配方和发酵条件进行PA-2菌株发酵，发酵完成后进行喷雾干燥制成菌粉，加入不同助剂(硅藻土和聚乙烯醇等)制成有效含量为108个/g的可湿性粉剂。在田间按200mL/m2喷药液量进行喷雾，可湿性粉剂设200、400、600和800g/ha，以200g/L氯氟吡氧乙酸EC为对照CK1、清水为对照CK2，每个处理3次重复，在杂草藜7叶-8叶进行喷雾施药后7d、20d和40d杂草藜的株高和鲜重，计算株高抑制率和鲜重效；试验结果如表9所示。
由表9可知，PA-2可湿性粉剂对藜有明显的防除作用，用药量为800g/ha时对藜的株高抑制率达55.7％和鲜重效达75.0％，显著高于用药量为200g/ha的防除效果，与对照药剂200g/L氯氟吡氧乙酸EC处理组的株高抑制效果相当，但与对照药剂处理组的鲜重效达到显著性差异。因此，田间可使用PA-2可湿性粉剂防除藜。
表9 PA-2可湿性粉剂对藜的田间防除效果
以上对本申请实施例所提供的一种出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基及发酵条件优化方法，进行了详细介绍。以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
如在说明书及权利要求书当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求书并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求书当中所提及的“包含”、“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含/包括但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求书所界定者为准。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者***不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者***所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者***中还存在另外的相同要素。
应当理解，本文中使用的术语“和/或”仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求书的保护范围内。

Claims (10)

1.一种出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基，其特征在于，所述培养基包括：葡萄糖、大豆粉和无机盐；
所述无机盐包括：NaCI、MgSO4、KCI、K2HPO4和(NH4)2SO4。
2.根据权利要求1所述的出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基，其特征在于，所述培养基各成分的量为：葡萄糖为84.60g/L、大豆粉为46.35g/L以及无机盐为10.91g/L。
3.根据权利要求2所述的出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基，其特征在于，所述无机盐的各成分的量为：NaCI为2.59g/L、MgSO4为0.52g/L、KCI为0.78g/L、K2HPO4为6.50g/L以及(NH4)2SO4为0.52g/L。
4.根据权利要求3所述的出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基，其特征在于，所述培养基对出芽短梗霉菌PA-2进行发酵培养时产孢量的理论最高值为12.76×108CFU/mL。
5.根据权利要求1或2所述的出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基，其特征在于，出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基孢子数与葡萄糖、大豆粉、无机盐的质量浓度的二次多项回归方程为：
Y＝10.09-0.8256A+1.04B-0.3081C+0.3213AB-1.72AC-2.27BC-1.75A2-1.47B2-0.2757C2；
其中，Y代表孢子数；
A代表葡萄糖质量浓度；
B代表大豆粉质量浓度；
C代表无机盐质量浓度。
6.根据权利要求5所述的出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基，其特征在于，各因子对孢子数影响的主次顺序为：A2、B2、BC>AC>B>A>C2>C>AB。
7.一种使用权利要求1-3任一所述的培养基对出芽短梗霉菌PA-2进行发酵培养的方法，其特征在于，发酵培养的条件为：pH值为6.0～7.0、发酵培养时间为96～148h、接种量为8～12％、转速为160～200r/min、发酵温度为20～25℃和装液量为60～70mL。
8.根据权利要求7所述的对出芽短梗霉菌PA-2进行发酵培养的方法，其特征在于，发酵培养的条件为：pH值为7.0、发酵培养时间为120h、接种量为8％、转速为180r/min、发酵温度为25℃和装液量为60mL。
9.一种采用如权利要求1-3任一所述的培养基培养的出芽短梗霉菌PA-2进行杂草防除的方法，其特征在于，步骤包括：
S1、将所述出芽短梗霉菌PA-2制成有效含量为108个/g的可湿性粉剂；
S2、将所述可湿性粉剂配备成800g/ha的喷剂；
S3、按200mL/m2喷药液量进行田间喷洒。
10.根据权利要求9所述的采用出芽短梗霉菌PA-2进行杂草防除的方法，其特征在于，杂草防除的株高抑制率为55.7％、鲜重效为75.0％。
CN201910801104.5A 2019-08-28 2019-08-28 出芽短梗霉菌pa-2发酵培养基及发酵条件优化方法 Pending CN110373335A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910801104.5A CN110373335A (zh) 2019-08-28 2019-08-28 出芽短梗霉菌pa-2发酵培养基及发酵条件优化方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910801104.5A CN110373335A (zh) 2019-08-28 2019-08-28 出芽短梗霉菌pa-2发酵培养基及发酵条件优化方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110373335A true CN110373335A (zh) 2019-10-25

Family

ID=68261010

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910801104.5A Pending CN110373335A (zh) 2019-08-28 2019-08-28 出芽短梗霉菌pa-2发酵培养基及发酵条件优化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110373335A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112852908A (zh) * 2021-01-11 2021-05-28 青海省农林科学院 一种具有除草作用的短梗霉素及其制备方法、测定方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102994395A (zh) * 2012-10-15 2013-03-27 苏州大学 一株出芽短梗霉及其应用
CN103642700A (zh) * 2013-12-04 2014-03-19 青海省农林科学院 一株出芽短梗霉菌及其应用
CN107969423A (zh) * 2017-11-22 2018-05-01 青海省农林科学院 一种极细链格孢菌株可湿性粉剂及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102994395A (zh) * 2012-10-15 2013-03-27 苏州大学 一株出芽短梗霉及其应用
CN103642700A (zh) * 2013-12-04 2014-03-19 青海省农林科学院 一株出芽短梗霉菌及其应用
CN107969423A (zh) * 2017-11-22 2018-05-01 青海省农林科学院 一种极细链格孢菌株可湿性粉剂及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李永龙等: "出芽短梗霉菌菌株PA-2的除草活性及对作物的安全性", 《中国生物防治学报》 *
郭法利等: "响应面法优化普鲁兰多糖发酵培养基", 《微生物学杂志》 *
郭青云: "青海农田杂草生物防治研究进展", 《第十一届全国杂草科学大会论文摘要集》 *
马永强等: "具有除草活性的生防菌株GD-9发酵条件优化及菌剂制备", 《植物保护》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112852908A (zh) * 2021-01-11 2021-05-28 青海省农林科学院 一种具有除草作用的短梗霉素及其制备方法、测定方法
CN112852908B (zh) * 2021-01-11 2023-05-19 青海省农林科学院 一种具有除草作用的短梗霉素及其制备方法、测定方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104388356B (zh) 桑普逊链霉菌菌株、其分离方法及应用
CN108165498B (zh) 拮抗水稻白叶枯病菌的灰黄青霉Pg-35菌株及其发酵滤液和在植物病害防冶中的应用
CN106190920B (zh) 枯草芽孢杆菌yn145及其应用
CN106282049B (zh) 特基拉芽孢杆菌jn369及其应用
CN107881132A (zh) 一种能用于沙漠植物的固氮解磷促生菌及其菌剂与其应用
CN102465096B (zh) 一种微生物菌剂及其制备方法和应用
CN105062897B (zh) 一株高产厚垣孢子的绿色木霉及其应用
CN110373335A (zh) 出芽短梗霉菌pa-2发酵培养基及发酵条件优化方法
CN104450560A (zh) 一株杀线虫氨鞘醇杆菌菌株及其应用
CN102021131B (zh) 一种地衣芽孢杆菌菌株及其应用
CN113755397A (zh) 一株具广谱拮抗性的解淀粉芽孢杆菌、其微生物菌剂及其应用
CN105838627A (zh) 一种防治烟草青枯病的青霉xfsf-8菌株及应用
CN104726379B (zh) 一株生物农药武夷菌素的高产菌株w‑273及其应用
CN109182189B (zh) 一株高产的氧化微杆菌及其应用
CN107058154A (zh) 一种东方红菌菌株、生防菌剂、生防发酵液及其制备方法和应用
CN103146613B (zh) 枯草芽孢杆菌pts-394的发酵培养方法
CN109136133A (zh) 海洋解淀粉芽孢杆菌bmf01用途及产芽孢方法
CN109207392A (zh) 一株巨大芽孢杆菌及其在防治西洋参根腐病中的应用
CN108531404A (zh) 一株层出镰孢菌的培养方法及其应用
CN114672429A (zh) 一种微生物复合菌剂及其在防治植物病害中的应用
CN108102992A (zh) 一株金橙黄微小杆菌及其在防治番茄根结线虫中的应用
CN105018394B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治水稻稻曲病方面的应用
Liu et al. Approaches for the establishment of optimized co-culture system of multiple Trichoderma strains for culture metabolites highly effective in cucumber growth promotion
CN110184226B (zh) 芽孢杆菌Mangrove-2008、菌剂及其在抑制黑曲霉生长中的用途和方法
CN105543125B (zh) 一株产井冈霉素的黄麻链霉菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20191025

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication