CN110358816B - 一种用于鸡来源细胞pcr检测的引物组、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于鸡来源细胞PCR检测的引物组、试剂盒及应用，属于细胞学技术领域。本发明所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明采用聚合酶链式反应，能够扩增出鸡来源细胞的特异条带，进而快速、准确的检测出鸡来源的细胞。本发明的试剂盒和检测方法具有耗时短，操作简单、稳定性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及细胞学技术领域，尤其涉及一种用于鸡来源细胞PCR检测的引物组、试剂盒及应用。
背景技术
细胞体外培养技术是在人工提供的条件下使细胞在生物体外生长并维持其结构和功能特性的一项生物技术。近年来，动物细胞培养技术在很多领域被广泛应用。可以在体外直接观察活细胞的形态结构和生命活动，用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究。
鸡作为家禽，关于其养殖，育种和疾病的研究颇多。随着体外培养细胞在基础研究及应用研究中的大量应用，体外培养鸡来源细胞已经成为科研工作的需要。于是，越来越多的实验室开始建立和购买鸡来源的细胞系。近几年来，不同种属间的细胞交叉污染越来越严重，因此无论是自己建立的还是购买的鸡来源细胞系都需要鉴定后才能做实验。目前，细胞种属鉴定及排除种属间交叉污染的方法主要有染色体分析、STR图谱、同工酶电泳和PCR(聚合酶链式反应)法。其中，染色体分析十分耗时、成本比较高、灵敏度低；STR图谱的灵敏度高，但可鉴定的种属范围有限，目前只应用于人源和小鼠源细胞的检测；同工酶电泳，实验结果重复性差，会因为电泳缓冲液批次的问题而跑出的条带各异。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于鸡来源细胞PCR检测的引物组、试剂盒及应用，以快速、准确地检测鸡来源细胞。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于鸡来源细胞PCR检测的引物组，所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了一种用于鸡来源细胞PCR检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组。
优选的，所述试剂盒还包括能够分别扩增人来源基因组DNA、小鼠来源基因组DNA、大鼠来源基因组DNA、叙利亚仓鼠来源基因组DNA、中国仓鼠来源基因组DNA、狗来源基因组DNA、牛来源基因组DNA、猪来源基因组DNA、非洲绿猴来源基因组DNA和兔子来源基因组DNA的引物组。
优选的，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、MgCl2和dNTPs。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。
优选的，所述阳性对照品包括鸡来源基因组DNA；所述阴性对照品包括PBS。
本发明还提供了上述方案所述的引物组或所述的试剂盒在鸡来源细胞PCR检测中的应用，所述应用包括以下步骤：
1)提取待测样品基因组DNA；
2)以待测样品基因组DNA为模板，利用所述引物组进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
3)用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，在193bp处出现扩增条带表示待测样品中含有鸡来源细胞；在193bp处未出现扩增条带表示待测样品中不含鸡来源细胞。
优选的，步骤2)中所述PCR扩增反应使用的反应体系以25μL计包括：待测样品基因组DNA 5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、DNA聚合酶1μL、MgCl21μL、dNTPs 1μL和无菌去离子水15μL。
优选的，所述上游引物和下游引物的使用浓度独立为0.2uM；所述DNA聚合酶的使用浓度为0.06U/μL；所述dNTPs的使用浓度为0.2mM；所述MgCl2的使用浓度为2mM。
优选的，步骤2)中所述PCR扩增反应的程序为：95℃5min，[94℃30s、56℃45s、72℃90s，30个循环]，72℃10min，反应结束。
本发明的有益效果：本发明提供了一种用于鸡来源细胞PCR检测的引物组、试剂盒及应用。现有的鸡来源细胞鉴定的方法包括同工酶法和核型分析，这两种方法存在耗时长，操作复杂，结果稳定性差等缺点，并不能满足快速、准确检测鸡来源细胞的要求。本发明采用聚合酶链式反应，能够扩增出鸡来源细胞的特异条带，进而快速、准确的检测出鸡来源的细胞。本发明的试剂盒和检测方法具有耗时短，操作简单、稳定性好等优点。
附图说明
图1为实施例1中待检样品的PCR结果；
图2为实施例2中扩增鸡来源细胞的基因组DNA的引物组灵敏度检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种用于鸡来源细胞PCR检测的引物组，所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：5’-GTATTCCCGTGCAAAAACGAG-3’；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：5’-GTGAAGAGTTGTGGTCTG-3’。
本发明还提供了一种用于鸡来源细胞PCR检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组；优选的，所述试剂盒还包括能够分别扩增人来源基因组DNA、小鼠来源基因组DNA、大鼠来源基因组DNA、叙利亚仓鼠来源基因组DNA、中国仓鼠来源基因组DNA、狗来源基因组DNA、牛来源基因组DNA、猪来源基因组DNA、非洲绿猴来源基因组DNA和兔子来源基因组DNA的引物组，上述引物组能够检测出样品中是否有其他种属的细胞污染。
本发明所述扩增人来源基因组DNA的引物组根据细胞色素b基因序列设计得到，扩增片段441bp；所述扩增人来源基因组DNA的上游引物如SEQ ID NO：3所示，具体为：5’-TATTGCAGCCCTAGCAGCACTCCA-3’；所述扩增人来源基因组DNA的下游引物如SEQ ID NO：4所示，具体为：5’-AGAATGAGGAGGTCTGCGGC-3’。
本发明所述扩增小鼠来源基因组DNA的引物组根据细胞色素c氧化酶亚基I基因序列设计得到，扩增片段150bp；所述扩增小鼠来源基因组DNA的上游引物如SEQ ID NO：5所示，具体为：5’-ATTACAGCCGTACTGCTCCTAT-3’；所述扩增小鼠来源基因组DNA的下游引物如SEQ ID NO：6所示，具体为：5’-CCCAAAGAATCAGAACAGATGC-3’。
本发明所述扩增大鼠来源基因组DNA的引物组根据D4Rhw 5基因涉及得到；所述D4Rhw 5基因位于大鼠4号染色体上，PCR扩增片段317bp；所述扩增大鼠来源基因组DNA的上游引物如SEQ ID NO：7所示，具体为：5’-AGACACTCTGACGACTGTCAACA-3’；所述扩增大鼠来源基因组DNA的下游引物如SEQ ID NO：8所示，具体为：5’-CATGGTAGAGAAAATCTGTTCCG-3’。
本发明所述扩增叙利亚仓鼠来源基因组DNA的引物组根据β-珠蛋白基因(线粒体DNA)设计得到，扩增片段1500bp；所述扩增叙利亚仓鼠来源基因组DNA的上游引物如SEQ IDNO：9所示，具体为：5’-AGGTGATCCACTCCTTCGCT-3’；所述扩增叙利亚仓鼠来源基因组DNA的下游引物如SEQ ID NO：10所示，具体为：5’-TGTTCTCTAGGGAACAAGTGACTT-3’。
本发明所述扩增中国仓鼠来源基因组DNA的引物组根据细胞色素b基因设计得到，扩增片段293bp；所述扩增中国仓鼠来源基因组DNA的上游引物如SEQ ID NO：11所示，具体为：5’-GTGACCCATATCTGCCGAGAT-3’；所述扩增中国仓鼠来源基因组DNA的下游引物如SEQID NO：12所示，具体为：5’-CATTCTACTAGGGTGGTGCCC-3’。
本发明所述扩增狗来源基因组DNA的引物组根据细胞色素c氧化酶亚基I基因设计得到，扩增片段153bp；所述扩增狗来源基因组DNA的上游引物如SEQ ID NO：13所示，具体为：5’-GAACTAGGTCAGCCCGGTACTT-3’；所述扩增狗来源基因组DNA的下游引物如SEQ ID NO：14所示，具体为：5’-RP-CGGAGCACCAATTATTAACGGC-3’。
本发明所述扩增牛来源基因组DNA的引物组根据BT225基因设计得到，扩增引物NCBI数据库UniSTS:64730，扩增片段272bp；所述扩增牛来源基因组DNA的上游引物如SEQID NO：15所示，具体为：5’-TCACTGGCTTACAACTAGGG-3’；所述扩增牛来源基因组DNA的下游引物如SEQ ID NO：16所示，具体为：5’-TGGAGATGAGTTTGACTAAG-3’。
本发明所述扩增猪来源基因组DNA的引物组根据钙蛋白酶抑素基因设计得到；所述钙蛋白酶抑素基因位于2号染色体2q2.1-q2.4，扩增片段517bp；所述扩增猪来源基因组DNA的上游引物如SEQ ID NO：17所示，具体为：5’-ACTGCCAGCAGCCTAAATGTAT-3’；所述扩增猪来源基因组DNA的下游引物如SEQ ID NO：18所示，具体为：5’-TCCCTAACTTGCCAGTCTTAGC-3’。
本发明所述扩增非洲绿猴来源基因组DNA的引物组根据细胞色素c氧化酶亚基I基因(线粒体DNA)设计得到，扩增片段222bp；所述扩增非洲绿猴来源基因组DNA的上游引物如SEQ ID NO：19所示，具体为：5’-CCTCTTTCCTGCTGCTAATG-3’；所述扩增非洲绿猴来源基因组DNA的下游引物如SEQ ID NO：20所示，具体为：5’-TTTGATACTGGGATATGGCG-3’。
本发明所述扩增兔子来源基因组DNA的引物组根据细胞色素c氧化酶亚基I基因(线粒体DNA)设计得到，扩增片段151bp；所述扩增兔子来源基因组DNA的上游引物如SEQ IDNO：21所示，具体为：5’-CGGGAACTGGCTTGTCCCCCTG-3’；所述扩增兔子来源基因组DNA的下游引物如SEQ ID NO：22所示，具体为：5’-AACAGTTCAGCCAGTCCCCGCC-3’。
本发明中，所述引物组中各引物的使用浓度优选的独立为0.2uM。在本发明的具体实施过程中，所述引物组中的引物均由天一辉远公司合成。
本发明中，所述试剂盒优选的还包括DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品优选的包括鸡来源基因组DNA，更优选为鸡来源的DNA干粉，购自于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；所述鸡来源的DNA干粉使用时用无菌去离子水溶解混匀；鸡来源的DNA干粉和无菌去离子水的质量体积比优选为1：100；所述所述阴性对照品优选的包括PBS，更优选的包括PBS干粉；所述使用时用无菌去离子水溶解混匀；所述PBS干粉和无菌去离子水的质量体积比优选为1：100。
本发明中，所述DNA聚合酶的使用浓度优选为0.06U/μL；所述dNTPs的使用浓度优选为0.2mM；所述MgCl2的使用浓度优选为2mM。
本发明还提供了上述方案所述的引物组或所述的试剂盒在鸡来源细胞PCR检测中的应用，所述应用包括以下步骤：
1)提取待测样品基因组DNA；
2)以待测样品基因组DNA为模板，利用所述引物组进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
3)用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，在193bp处出现扩增条带表示待测样品中含有鸡来源细胞；在193bp处未出现扩增条带表示待测样品中不含鸡来源细胞。
本发明首先提取待测样品基因组DNA；本发明对所述提取待测样品基因组DNA的方法没有特殊限制，本发明具体实施过程中，采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取待测样品基因组DNA；所述血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)购自于天根生化科技(北京)有限公司提供。
得到待测样品基因组DNA后，本发明以待测样品基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物组进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；所述PCR扩增反应使用的反应体系以25μL计优选的包括：待测样品基因组DNA 5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、DNA聚合酶1μL、MgCl21μL、dNTPs1μL和无菌去离子水15μL；所述PCR扩增反应的程序优选为：95℃5min，[94℃30s、56℃45s、72℃90s，30个循环]，72℃10min，反应结束。
得到PCR扩增产物后，本发明用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，在193bp处出现扩增条带表示待测样品中含有鸡来源细胞；在193bp处未出现扩增条带表示待测样品中不含鸡来源细胞。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1一种用于鸡来源细胞PCR检测的方法
(1)将PCR相关试剂1(扩增鸡来源细胞的基因组DNA的引物组，DNA聚合酶，dNTP和MgCl2的干粉，使用时需用1mL无菌去离子水溶解混匀)用1mL无菌去离子水溶解混匀；
(2)将PCR相关试剂2(分别扩增人来源基因组DNA、小鼠来源基因组DNA、大鼠来源基因组DNA、叙利亚仓鼠来源基因组DNA、中国仓鼠来源基因组DNA、狗来源基因组DNA、牛来源基因组DNA、猪来源基因组DNA、非洲绿猴来源基因组DNA和兔子来源基因组DNA的引物组，DNA聚合酶，dNTP和MgCl2的干粉)用1mL无菌去离子水溶解混匀；
(3)将试剂盒中的12.5μg阴性对照(PBS干粉)用250μL无菌去离子水溶解混匀；
(4)将试剂盒中的25μg阳性对照(鸡来源的DNA干粉)用250μL无菌去离子水溶解混匀；
(5)取4支干净的EP管，分别标记阴性对照，阳性对照，待检样品和种属排除；
(6)在阴性对照的EP管中加入20μLPCR相关试剂1和5μL阴性对照；在阳性对照的EP管中加入20μLPCR相关试剂1和5μL阳性对照；在待检样品的EP管中加入20μLPCR相关试剂1和5μL待检样品；在其它种属的EP管中加入20μLPCR相关试剂2和5μL待检样品；
(7)将混匀好的4支EP管放入PCR仪中，开启程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃复性45s，72℃延伸1min30s，30个循环，72℃延伸10min；
(8)PCR程序结束后，取出所有EP管，分别取10μL样品跑DNA琼脂糖凝胶电泳，观察结果。如图1所示，待检样品1，待检样品2和阳性对照条带出现的位置一致，从而可以判断出待检样品为鸡来源的细胞；其它种属没有条带出现，从而可以判断出待检细胞无人，小鼠，大鼠，叙利亚仓鼠，中国仓鼠，狗，牛，猪，猴和兔子的种属污染。
实施例2扩增鸡来源细胞的基因组DNA的引物组灵敏度检测
(1)将PCR相关试剂1(扩增鸡来源细胞的基因组DNA的引物组，DNA聚合酶，dNTP和MgCl2的干粉，使用时需用1mL无菌去离子水溶解混匀)用1mL无菌去离子水溶解混匀；
(2)将试剂盒中的阳性对照(鸡来源的DNA干粉)用250μL无菌去离子水溶解混匀；
(3)取5支干净的EP管，分别标记100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.01ng；
(4)稀释阳性对照，在每支EP管中加入5μLPCR阳性对照，质量分别为100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.01ng；
(5)在每支EP管中加入20μLPCR相关试剂1；
(6)将混匀好的5支EP管放入PCR仪中，开启程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃复性45s，72℃延伸1min30s，30个循环，72℃延伸10min；
(7)PCR程序结束后，取出所有EP管，分别取10μL样品跑DNA琼脂糖凝胶电泳，观察结果。
检测结果参见图2，图2中(鸡来源DNA干粉)量分别为100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.01ng时的PCR结果；由图2可以看出该试剂盒可以检测出鸡来源DNA的最低含量为0.01ng。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖北国际旅行卫生保健中心
武汉大学
<120> 一种用于鸡来源细胞PCR检测的引物组、试剂盒及应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 1
gtattcccgt gcaaaaacga g 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 2
gtgaagagtt gtggtctg 18
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 3
tattgcagcc ctagcagcac tcca 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 4
agaatgagga ggtctgcggc 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 5
attacagccg tactgctcct at 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 6
cccaaagaat cagaacagat gc 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 7
agacactctg acgactgtca aca 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 8
catggtagag aaaatctgtt ccg 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 9
aggtgatcca ctccttcgct 20
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 10
tgttctctag ggaacaagtg actt 24
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 11
gtgacccata tctgccgaga t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 12
cattctacta gggtggtgcc c 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 13
gaactaggtc agcccggtac tt 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 14
cggagcacca attattaacg gc 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 15
tcactggctt acaactaggg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 16
tggagatgag tttgactaag 20
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 17
actgccagca gcctaaatgt at 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 18
tccctaactt gccagtctta gc 22
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 19
cctctttcct gctgctaatg 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 20
tttgatactg ggatatggcg 20
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 21
cgggaactgg cttgtccccc tg 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 22
aacagttcag ccagtccccg cc 22
<210> 23
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 23
gatcggacga gagaccctgt ggactttaaa atcacgacca ccttacaacc ttacacagcc 60
ccactgggtc cacccacaca taaacccctg gtcgacattt ttcggttggg gcgaccttgg 120
agaaaaaaaa atcctccaaa cccacagacc acaactcttc actaagaa 168
Claims (10)
1.一种用于鸡来源细胞PCR检测的引物组，所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种用于鸡来源细胞PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括能够分别扩增人来源基因组DNA、小鼠来源基因组DNA、大鼠来源基因组DNA、叙利亚仓鼠来源基因组DNA、中国仓鼠来源基因组DNA、狗来源基因组DNA、牛来源基因组DNA、猪来源基因组DNA、非洲绿猴来源基因组DNA和兔子来源基因组DNA的引物组。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、MgCl2和dNTPs。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括鸡来源基因组DNA；所述阴性对照品包括PBS。
7.权利要求1所述的引物组或权利要求2～6任意一项所述的试剂盒在鸡来源细胞PCR检测中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
1)提取待测样品基因组DNA；
2)以待测样品基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物组进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
3)用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，在193bp处出现扩增条带表示待测样品中含有鸡来源细胞；在193bp处未出现扩增条带表示待测样品中不含鸡来源细胞。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增反应使用的反应体系以25μL计包括：待测样品基因组DNA 5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、DNA聚合酶1μL、MgCl21μL、dNTPs 1μL和无菌去离子水15μL。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述上游引物和下游引物的使用浓度独立为0.2uM；所述DNA聚合酶的使用浓度为0.06U/μL；所述dNTPs的使用浓度为0.2mM；所述MgCl2的使用浓度为2mM。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增反应的程序为：95℃5min，[94℃30s、56℃45s、72℃90s，30个循环]，72℃10min，反应结束。
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