CN110358755A

CN110358755A - 酸性耐高温重组纤维素酶及其应用

Info

Publication number: CN110358755A
Application number: CN201910686471.5A
Authority: CN
Inventors: 李相前; 夏继林; 朱晓燕; 时号
Original assignee: Huaiyin Institute of Technology
Current assignee: Huaiyin Institute of Technology
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2019-10-22
Anticipated expiration: 2039-07-26
Also published as: CN110358755B

Abstract

本发明公开了三种酸性耐高温重组纤维素酶及其应用，该三种重组纤维素酶的氨基酸序列分别如SEQIDNO:1‑3所示。本发明的三种重组纤维素酶在pH为4.0～5.0，60～80℃条件下对CMC‑Na酶活最高为1.540U/mg，对Avicel活力最高为0.167U/mg。本发明三种重组纤维素酶在75℃，pH为4.0～4.5条件下保温2h酶活力基本保持不变。三种重组纤维素酶可直接降解CMC‑Na、结晶纤维素、滤纸及其它天然木质纤维素如水稻秸秆和小麦秸秆，其对水稻秸秆的活力最高达0.106U/mg。本发明三种重组纤维素酶比现有的纤维素酶具有更大的优越性，可有效降解天然木质纤维素，具有潜在的工业应用价值。

Description

酸性耐高温重组纤维素酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术及生物质精炼技术领域，具体涉及三种酸性耐高温重组纤维素酶及其应用。

背景技术

木质纤维素作为一种可再生资源可用于生产生物燃料或其它高附加值产品。然而木质纤维素中的纤维素被半纤维素和木质素包裹，且以共价键连接以及纤维素自身的微纤维交联以致其很难被纤维素酶所降解，因此很难将其转化为可发酵糖。对木质纤维素进行预处理可破坏其中的氢键，去除木质素及半纤维素，增强纤维素酶的可及性。然而常规的酸碱，离子液体等预处理不仅增加了生产成本，而且易导致严重的环境污染。此外，人工合成的底物如：滤纸、结晶纤维素及CMC-Na的成分单一，结构简单，仅由不同数目的葡萄糖分子组成。因此，将滤纸、结晶纤维素及CMC-Na完全降解为葡萄糖分子仅需要内、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的协同作用。然而，对天然木质纤维素的完全降解需多种糖苷水解酶及非酶结合蛋白的协同作用，其中内切葡聚糖酶、碳水化合物结合结构域(CBM)和外切葡聚糖酶在此过程中起到至关重要的作用。自然界中游离的单催化域纤维素酶往往携带CBM结构域，催化结构域可通过CBM牢固吸附在底物上，提高催化效率。而内切葡聚糖酶首先随机切割非结晶区释放寡糖链，其次外切葡聚糖酶沿结晶区或非结晶区寡糖链的末端逐步切割释放纤维二糖。然而，多种游离纤维素酶混合降解木质纤维素过程中存在个别低效率酶的无效吸附问题。此外，嗜热菌Caldicellulosiruptor saccharolyticus来源的内切葡聚糖酶(Endo5-CBM28)和外切葡聚糖酶(CBM3b-Exo5)均可直接降解Avicel，可省去木质纤维素的预处理步骤，节省成本和保护环境。然而Endo5-CBM28对CMC-Na活力为8.94U/mg，然而对Avicel和FP的活力分别仅有0.0113U/mg和0.0518U/mg。此外，Endo5对Avicel无活力。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足存在的问题，为充分发挥木质纤维素降解酶及CBM的分子内协同作用，在Endo5、CBM及Exo5中实现融合，构建三种融合酶。本发明提供三种全新的酸性耐高温重组纤维素酶Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5，本发明三种重组纤维素酶均具有耐酸耐高温，活性高，可直接降解CMC-Na、结晶纤维素(Avicel)、滤纸(FP)及其它天然木质纤维素。

本发明还提供三种编码酸性耐高温重组纤维素酶的核苷酸序列以及三种酸性耐高温重组纤维素的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，如本发明所述酸性耐高温重组纤维素酶，所述酸性耐高温重组纤维素酶包括三种酸性耐高温重组纤维素酶，其氨基酸序列分别如SEQIDNO.1-3所示。分别命名为Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5。

进一步地，所述三种酸性耐高温重组纤维素酶，其DNA序列分别如SEQIDNO.4-6所示。分别为endo5-2cbm-exo5、endo5-cbm3b-exo5和endo5-cbm28-exo5。

其中，所述DNA序列SEQIDNO.4-6，分别通过下列引物(SEQ ID NO.11-16)进行扩增后拼接获得：

SEQ ID NO.11

Endo-F：5’-AACGATCCATGGCTAATACTGCGTATGAAAAGGATA-3’；

SEQ ID NO.12

Endocbm-R：5’-AACGATGAGCTCTGTAAATCTTACATTGTCTAAG-3’；

SEQ ID NO.13

Endo-R：5’-AACGATGAGCTCTTTCTGGTCGCTGCCAGG-3’；

SEQ ID NO.14

cbmExo-F：5’-AACGATGAGCTCGGGGTAACAACATCATCTC-3’；

SEQ ID NO.15

Exo-R：5’-AACGATCTCGAGTTTTGAAGCTGGAACTGGCTC-3’；

SEQ ID NO.16

Exo-F：5’-AACGATGAGCTCTTTAAGAGTGGAGCAGGGCA-3’。

本发明所述重组载体，所述重组载体克隆包括有SEQ ID NO.4-6中所任意一种DNA序列。

本发明所述重组菌，所述重组菌包含有权利要求3中的重组载体。

本发明所述酸性耐高温重组纤维素酶在酶解CMC-Na、滤纸、Avicel、和天然木质纤维素中的应用。

作为优选，所述天然木质纤维素包括水稻秸秆和小麦秸秆。

进一步地，所述酶解反应温度为60～80℃，pH为4.0～4.5，反应时间为4h。

本发明所述的重组载体在酶解CMC-Na、滤纸、Avicel、和天然木质纤维素中的应用。

本发明所述的的重组载体在酶解CMC-Na、滤纸、Avicel、和天然木质纤维素中的应用。

本发明所述三种酸性耐高温纤维素酶，氨基酸序列为SEQIDNO.1、2和3序列，由各结构域经过不同的融合方式形成具有双功能纤维素酶的融合蛋白。

本发明根据现有的酶Endo5-CBM28、Endo5、CBM3b-Exo5和Exo5与底物结合的特点(还能加点别的特征分析，我们再合成新的模板)，设计了全新的基因endo5-cbm28、endo5、cbm3b-exo5和exo5基因(SEQ ID NO.7-10)，并设计全新的引物对(SEQIDNO.11-16)，引物和新设计的基因模板进行细致比对，有效避免了非特异的结合，再进行合成，再以全新的基因endo5-cbm28、endo5、cbm3b-exo5和exo5基因为基础，巧妙地构建全新重组基因endo5-2cbm-exo5、endo5-cbm3b-exo5和endo5-cbm28-exo5(SEQ ID NO.4-6)，最后得到本发明的三种全新的酸性耐高温重组纤维素酶Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5。所设计全新基因和形成全新的三种酶对于底物如CMC-Na、滤纸、Avicel、和天然木质纤维素活性更好，酶解效果更优。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明提供的三种全新的重组纤维素酶具有耐酸耐高温，在pH为4.0～5.0，60～80℃条件对CMC-Na酶活最高，为1.540U/mg；对Avicel酶活最高为0.167U/mg；在70～80℃，pH为4.0～6.0条件下均表现出高的活力。三种重组纤维素酶在75℃，pH为4.0～4.5条件下保温2h酶活力基本保持不变。此外，三种重组纤维素酶可直接降解Avicel、FP)及其它天然木质纤维素如水稻秸秆(RS)和小麦秸秆(WS)，其对水稻秸秆的活力最高达0.106U/mg。上述特性使得本发明得到的三种重组纤维素酶比现有的纤维素酶具有更大的优越性和更广的底物谱，在pH为4.0～5.0，60～80℃左右降解天然木质纤维素，活性和降解效果明显优于现有endo5-cbm28、endo5基因表达的酶Endo5-CBM28和Endo5及其他现有技术中的纤维素酶，并且本发明的重组纤维素酶易于表达，可以稳定获得，具有潜在的工业应用价值。

附图说明

图1是三种双催化域纤维素酶的融合构建方式图。

图2是三种双催化域纤维素酶Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5的SDS-PAGE蛋白电泳图；

图3是Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5活性随温度的变化结果图；

图4是Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5活性随pH的变化结果图；

图5是Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5热稳定变化结果图；

图6是Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5pH稳定变化结果图；

图7是Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5降解FP、Avicel及天然木质纤维素TLC图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。

以下实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

内切葡聚糖酶(Endo5)、碳水化合物结合结构域(CBM)及外切葡聚糖酶(Exo5)的基因制备。

可采用人工合成的方式制备现有技术中原始的endo5-cbm28、endo5、cbm3b-exo5和exo5基因，也可以Caldicellulosiruptor saccharolyticus的总DNA(购自美国菌种保藏中心)为模板通过PCR方式得到。

本实施例的全新的endo5-cbm28、endo5、cbm3b-exo5和exo5基因是根据酶Endo5-CBM28、Endo5、CBM3b-Exo5和Exo5与底物结合的特点，经过序列比对、预测、设计了新序列，并将新序列送至上海生工全基因合成。所设计全新基因对于底物如CMC-Na、滤纸、Avicel、和天然木质纤维素活性更好，酶解效果更优。

以全基因合成的新序列为模板，用下列全新的引物对(SEQ ID NO.11-16)，分别扩增endo5-cbm28、endo5、cbm3b-exo5和exo5基因。

Endo-F：5’-AACGATCCATGGCTAATACTGCGTATGAAAAGGATA-3’；

Endocbm-R：5’-AACGATGAGCTCTGTAAATCTTACATTGTCTAAG-3’；

Endo-R：5’-AACGATGAGCTCTTTCTGGTCGCTGCCAGG-3’；

cbmExo-F：5’-AACGATGAGCTCGGGGTAACAACATCATCTC-3’；

Exo-R：5’-AACGATCTCGAGTTTTGAAGCTGGAACTGGCTC-3’；

Exo-F：5’-AACGATGAGCTCTTTAAGAGTGGAGCAGGGCA-3’。

上述引物合成时，Endo-F引入NcoI酶切位点，Endocbm-R、Endo-R、cbmExo-F和Exo-F分别引入SacI酶切位点，Exo-R引入XhoI酶切位点。

PCR反应体系：1μL的C.saccharolyticus基因组DNA，Endo-F、Endocbm-R、Endo-R、cbmExo-F、Exo-F及Exo-R分别加1μL，25μLBiouniquer2×PCRMasterMix，22μL超纯水。

PCR反应条件：94℃变性5min；94℃变性30sec，50～55℃退火30sec，72℃延伸30～120sec，30Cycles；72℃延伸10min；4℃保温。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用胶回收试剂盒进行纯化(Trans，南京)。

以Endo-F和Endocbm-R为引物对扩增得到endo5-cbm28基因；以Endo-F和Endo-R为引物对扩增得到endo5基因；以cbmExo-F和Exo-R为引物对扩增得到cbm3b-exo5基因；以Exo-F和Exo-R为引物对扩增得到exo5基因。最终得到新设计的基因endo5-cbm28、endo5、cbm3b-exo5和exo5基因序列分别如SEQ ID NO.7-10。SEQ ID NO.7(endo5-cbm28)，SEQ IDNO.8(endo5)，SEQ ID NO.9(cbm3b-exo5)，SEQ ID NO.10(exo5)。

实施例2

重组克隆、表达载体pET28a-endo5-2cbm-exo5、pET28a-endo5-cbm3b-exo5和pET28a-endo5-cbm28-exo5的构建与验证

将纯化后的PCR产物endo5-cbm28、endo5(实施例1制备)和pET28a(Novagen)分别用NcoI和SacI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切PCR片段及载体大片段。割胶回收后的目的片段与载体，经浓缩加入8μL无菌水重悬。加入1μL10×LigaseBuffer和1μLLigase，于16℃过夜连接。连接产物转化大肠杆菌(E.coliDH5a)，然后涂布于含50μg/mL卡那霉素(Kan)的LB固体培养基，37℃培养13～15h。

从转化平板上挑取多个单菌落，采用上海生工质粒提取试剂盒提取质粒。对提取的质粒进行双酶切验证后进行测序验证。测序结果显示，pET28a载体中分别***了所克隆的目的片段(endo5-cbm28和endo5大小分别为1629bp和966bp)，分别得重组载体pET28a-endo5-cbm28和pET28a-endo5。接种阳性重组子，采用上海生工质粒提取试剂盒提取质粒。再将纯化后的PCR产物cbm3b-exo5、exo5(实施例1制备)及pET28a-endo5-cbm28、pET28a-endo5(实施例2制备)分别用SacI和XhoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切PCR片段及载体大片段。割胶回收后的目的片段cbm3b-exo5和exo5(实施例1制备)分别***pET28a-endo5-cbm28的下游；目的片段cbm3b-exo5***pET28a-endo5的下游。各片段经浓缩加入8μL无菌水重悬。加入1μL10×LigaseBuffer和1μLLigase，于16℃过夜连接。连接产物转化大肠杆菌(E.coliDH5a)，然后涂布于含50μg/mL卡那霉素(Kan)的LB固体培养基，37℃培养13～15h。从转化平板上挑取多个单菌落，采用上海生工质粒提取试剂盒提取质粒。对提取的质粒进行双酶切验证后进行测序验证。测序结果显示，pET28a-endo5-cbm28载体中分别***了所克隆的目的片段(cbm3b-exo5和exo5大小分别为1998bp和1599bp)；pET28a-endo5载体中***了所克隆的目的片段(cbm3b-exo5大小别为1998bp)。进而分别得到重组表达载体pET28a-endo5-2cbm-exo5、pET28a-endo5-cbm3b-exo5和pET28a-endo5-cbm28-exo5。其中endo5-2cbm-exo5、endo5-cbm3b-exo5和endo5-cbm28-exo5的DNA序列如SEQ ID NO.4、5和6所示，其翻译的蛋白(酸性耐高温重组纤维素酶)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、2和3所示。将这几种蛋白分别命名为Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5。三种双催化域纤维素酶的融合构建如图1所示。

SEQ ID NO.1(Endo5-2CBM-Exo5)，SEQ ID NO.2(Endo5-CBM3b-Exo5)，SEQ IDNO.3(Endo5-CBM28-Exo5)，SEQ ID NO.4(endo5-2cbm-exo5)，SEQ ID NO.5(endo5-cbm3b-exo5)，SEQ ID NO.6(endo5-cbm28-exo5)。

实施例3

重组纤维素酶Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5的表达与纯化。

将重组克隆、表达载体pET28a-endo5-2cbm-exo5、pET28a-endo5-cbm3b-exo5和pET28a-endo5-cbm28-exo5(实施例2制备)化学转化至表达宿主E.coliBL21(DE3)(Novagen)，获得含有重组质粒的重组菌。接种阳性重组子于5mL含有50μg/mLKan的Luria-Bertanibroth(LB)液体培养基，37℃，200rpm条件下过夜培养。转接4mL菌液于含有50μg/mLKan的500mLLB液体培养基，37℃，200rpm条件下培养菌体浓度(OD₆₀₀)至0.6～0.8。加入终浓度为0.5mM的IPTG，在25℃，200rpm条件下诱导表达12～14h。将培养液在高速冷冻离心机中以4℃，10000rpm，离心8min收集菌体。加入40mL的无菌水洗涤菌体，再次以4℃，10000rpm，离心8min，弃去上清。向沉淀中加入20mL的1×bindingbuffer(0.5M的NaCl，20mM的Tris-HCl，5mM的咪唑，pH7.9)，在冰水浴中通过超声波细胞破碎仪超声破碎。细胞破碎液在4℃，15000rpm，离心15min，得到含酸性耐高温重组纤维素酶的粗酶液。

粗酶液先经70℃加热预处理15min以除去热稳定性较差的杂蛋白，再过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化(操作步骤见His-BindKits，Novagen)。纯化后酶的纯度及分子量鉴定采用SDS-PAGE进行，结果见图2，1、2和3号泳道分别是纯化过后的Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM28-Exo5和Endo5-CBM3b-Exo5，分子量分别为129kDa、114kDa和111kDa，与理论值相近。

实施例4

重组纤维素酶Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5的酶学特性分析。

酶活定义：在pH值4.5和80℃反应条件下，每分钟降解CMC-Na底物释放出1μmol葡萄糖所需的酶量。

(1)最适温度

利用pH值为4.5的100mM的咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液稀释实施例3制备得到的纯酶液(稀释20倍)，利用稀释后的纯酶液进行活力测定。酶活测定的反应体系为150μL，包含50μL的1％CMC-Na底物，50μL的100mM的咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液，50μL的稀释后的纯酶液，反应体系的pH为4.5。将反应体系在40～90℃水浴中保温30min后，立即***冰浴终止反应。加入150μL的DNS试剂，沸水浴煮沸5min后，立即***冰浴终止反应。补水至1mL，测定520nm处的吸光度值，其中未加酶的反应管作为空白对照。实验设3次重复，计算酶活，取平均值作图。结果如图3所示，研究结果表明，Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5的最适酶活温度分别为80℃，60℃和80℃，其中Endo5-2CBM-Exo5在80℃条件下对CMC-Na酶活高达1.247U/mg；Endo5-CBM28-Exo5在80℃条件下对CMC-Na酶活高达0.636U/mg；Endo5-CBM3b-Exo5在80℃条件下对CMC-Na酶活高达0.320U/mg；将Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM28-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5在80℃条件下的酶活设置为相对活性100％，其它温度下的反应体系所测数据计算得到的活力以最高的酶活作为相对活力。在60～80℃条件下酶活力高。

(2)最适pH

酶活测定反应体系为150μL，包含50μL的1％CMC-Na底物，50μLpH4.0～8.0的100mM的咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液，50μL的稀释后的纯酶液(同上)。将反应体系分别置于最适酶活温度60或80℃水浴中保温30min后，立即***冰浴终止反应。加入150μL的DNS试剂，沸水浴煮沸5min后，立即***冰浴终止反应。补水至1mL，测定520nm处的吸光度值，其中未加酶的反应管作为空白对照。实验设3次重复，计算酶活，取平均值作图。结果如图4所示，研究结果表明，Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5的最适pH值分别为4.0，4.0和4.5，其中Endo5-2CBM-Exo5在80℃，pH4.0条件下对CMC-Na酶活高达1.540U/mg；Endo5-CBM28-Exo5在80℃，pH4.5条件下对CMC-Na酶活高达0.785U/mg；Endo5-CBM3b-Exo5在80℃，pH4.0条件下对CMC-Na酶活高达0.357U/mg。将Endo5-2CBM-Exo5在80℃，pH4.0条件下的酶活设置为相对活性100％，其它pH条件下的反应体系所测数据计算得到的活力以最高的酶活作为相对活力。在pH4.0～4.5条件下酶活力高。

(3)热稳定性

用pH值为4.5的100mM的咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液稀释实施4制备得到的纯酶液，利用稀释后的纯酶液进行活力测定。将稀释后的酶液在70℃，75℃，80℃，85℃，90℃水浴中保温30min，60min，90min，120min，测定残留酶活力。酶活测定反应在pH值为4.0或4.5，测定温度为60或80℃。实验设3次重复，计算酶活，取平均值作图。结果如图5所示，研究结果显示，重组酶在75℃条件下热处理2h，未见明显的活力下降，可见重组酶在75℃条件下具有好的热稳定性。

(4)pH稳定性

用pH值为4.5的100mM的咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液稀释实施4制备得到的纯酶液，利用稀释后的纯酶液进行活力测定。将稀释后的酶液在pH4.0～8.0，55℃条件下保温2h后，测定残留酶活力。酶活测定反应在60或80℃。实验设3次重复，计算酶活，取平均值作图。结果如图6所示，研究结果显示，重组酶在pH4.0～6.0条件下，55℃处理2h未见明显的活力下降，可见重组酶在pH4.0～6.0条件下具有好的稳定性。

实施例5

酸性耐高温重组纤维素酶Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5的应用研究。

重组纤维素酶Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5对FP、Avicel、RS、WS和蒸汽***的水稻秸秆(SPRS)的降解研究，具体步骤如下所述：

(1)配制纤维二糖及葡萄糖溶液，浓度均为1％；分别称取50mg的FP、Avicel、RS、WS和SPRS置于反应管，加入1mL的pH值为4.0或4.5的100mM的咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液和1mL经过适当稀释的纯酶液(稀释20倍，实施例3制备得到的纯酶液)。反应体系在60或80℃水浴摇床中，160rpm震荡4h。

(2)分别收集上述各反应管中的水解液于-20℃的冰箱中保存。

(3)配制上述水解液TLC展开剂和显色剂，展开剂成分及配比为正丁醇：乙酸：水＝2：1：1；显色剂成分及配比为硫酸：甲醇＝1：9。

(4)用毛细管吸取少量的1％纤维二糖、葡萄糖及上述的样品，分别点样在宽度为10cm，高度为20cm的玻璃硅胶板上。点样结束后，用吹风机吹干玻璃硅胶板后，置于含上述展开剂的层析缸中。

(5)6h后取出玻璃硅胶板，在105℃的烘箱中烘干，在通风橱将显色剂均匀喷洒在玻璃硅胶板，接着再放置105℃的烘箱中烘干。

结果如图7所示，1号泳道中的G1和G2分别代表葡萄糖和纤维二糖，2、3、4和5分别表示无酶(空白对照)、Endo5-2CBM-Exo5、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5水解上清液。研究结果显示，重组纤维素酶可有效地将FP、Avicel、RS、WS和SPRS水解为纤维二糖及葡萄糖。因此，这三种重组纤维素酶适用于水稻秸秆及小麦秸秆等原料的葡萄糖和纤维二糖生产。

(6)为进一步测定三种融合酶对CMC-Na、FP、Avicel、RS、WS和SPRS底物的降解活力，取第(2)步的各反应管中的水解液300μL。加入300μLDNS，沸水浴煮沸5min后，立即***冰浴，补水至2mL，测定520nm处的吸光度值，其中未加酶的反应管作为空白对照。实验设3次重复，计算酶活。

三种融合酶对CMC-Na、FP、Avicel、RS、WS和SPRS均表现出特异性活力。其中Endo5-2CBM-Exo5在80℃，pH4.0条件下对CMC-Na特异性活力最高，达到1.540±0.013U/mg；Endo5-CBM3b-Exo5在60℃，pH4.0条件下对FP特异性活力最高，达到0.074±0.006U/mg；Endo5-2CBM-Exo5在80℃，pH4.0条件下对Avicel特异性活力最高，达到0.167±0.008U/mg；Endo5-2CBM-Exo5在80℃，pH4.0条件下对SPRS特异性活力最高，达到0.075±0.006U/mg；Endo5-CBM3b-Exo5在60℃，pH4.0条件下对RS特异性活力最高，达到0.106±0.002U/mg；Endo5-CBM3b-Exo5在60℃，pH4.0条件下对WS特异性活力最高，达到0.078±0.008U/mg。

序列表

<110> 淮阴工学院

<120> 酸性耐高温重组纤维素酶及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1221

<212> PRT

<213> 人工序列(Endo5-2CBM-Exo5Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Asn Thr Ala Tyr Glu Lys Asp Lys Tyr Pro His Leu Ile Gly

1 5 10 15

Asn Ser Leu Val Lys Lys Pro Ser Val Gly Ala Arg Ile Gln Leu Leu

20 25 30

Lys Asn Gln Gly Arg Lys Ile Ile Ala Asp Gln Asn Gly Glu Pro Ile

35 40 45

Gln Leu Arg Ala Met Thr Ser His Ala Leu Asn Trp Tyr Pro Asn Ile

50 55 60

Leu Asn Gln Asn Ala Tyr Ala Gly Leu Ala Gln Asp Gln Gly Leu Asn

65 70 75 80

Val Ile Arg Ile Ala Met Tyr Leu Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Thr Gln

85 90 95

Pro Asn Val Arg Asp Lys Val Ile Glu Gly Ile Lys Ile Ala Leu Gln

100 105 110

Gln Asp Met Trp Val Leu Val Glu Trp His Ala Leu Asn Pro Ala Asp

115 120 125

Phe Asn Gly Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Lys Asn Phe Pro Lys Glu Leu

130 135 140

Ala Asn Lys Phe Phe Asn Gln Phe His Leu Leu Tyr Glu Leu Cys Asn

145 150 155 160

Gln Pro Asp Pro Ser Asp Phe Gly Leu Thr Gln Asp Glu Gly Gly Trp

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<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aacgatgagc tctttaagag tggagcaggg ca 32

Claims

1.酸性耐高温重组纤维素酶，其特征在于，所述酸性耐高温重组纤维素酶包括三种酸性耐高温重组纤维素酶，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示。

2.酸性耐高温重组纤维素酶，其特征在于，所述酸性耐高温重组纤维素酶包括三种酸性耐高温重组纤维素酶，其DNA序列分别如SEQIDNO.4-6所示。

3.根据权利要求2所述的酸性耐高温重组纤维素酶，其特征在于，所述DNA序列SEQ IDNO.4-6，分别通过下列引物SEQ ID NO.11-16进行扩增后拼接获得：

Endo-F：5’-AACGATCCATGGCTAATACTGCGTATGAAAAGGATA-3’；

Endocbm-R：5’-AACGATGAGCTCTGTAAATCTTACATTGTCTAAG-3’；

Endo-R：5’-AACGATGAGCTCTTTCTGGTCGCTGCCAGG-3’；

cbmExo-F：5’-AACGATGAGCTCGGGGTAACAACATCATCTC-3’；

Exo-R：5’-AACGATCTCGAGTTTTGAAGCTGGAACTGGCTC-3’；

Exo-F：5’-AACGATGAGCTCTTTAAGAGTGGAGCAGGGCA-3’。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体克隆包括SEQ ID NO.4-6中所任意一种DNA序列。

5.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包含有权利要求3中的重组载体。

6.酸性耐高温重组纤维素酶在酶解CMC-Na、滤纸、Avicel、和天然木质纤维素中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述天然木质纤维素包括水稻秸秆和小麦秸秆。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述酶解反应温度优选为60～80℃，pH为4.0～4.5，反应时间为4h。

9.权利要求4所述的重组载体在酶解CMC-Na、滤纸、Avicel、和天然木质纤维素中的应用。

10.权利要求5所述的重组菌在酶解CMC-Na、滤纸、Avicel、和天然木质纤维素中的应用。