CN110352067A - Hla限制性vgll1肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文中提供了肿瘤抗原VGLL1特异性肽。本文中还提供了产生VGLL1特异性T细胞的方法以及它们用于治疗癌症的用途。此外，VGLL1特异性肽可用作疫苗。

Description

HLA限制性VGLL1肽及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年10月7日提交的美国临时专利申请No.62/405,779的权益，其全部内容通过引用并入本文。
包含在1KB(在Microsoft Windows中测量的)的并且于2017年10月5日创建的名为“UTFCP1307WO_ST25.txt”的文件中的序列表通过电子提交随同提交，并且通过引用并入本文。
发明背景
1.技术领域
本发明总体上涉及免疫学和医学领域。更具体地，其涉及肿瘤抗原特异性肽及其用于治疗癌症的用途。
2.背景技术
过继性T细胞治疗(adoptive T cell therapy，ACT；还称作“过继性细胞转移”)已经显示出作为用于治疗黑素瘤的方法的前景；遗憾的是，这种方法也已受到包括对非癌组织的毒性在内的限制的阻碍。ACT通常涉及将大量的自体活化的肿瘤特异性T细胞输注到患者中，例如以治疗癌症。ACT已经在黑素瘤患者中引起治疗性临床应答(Yee 2002；Dudley2002；Yee 2014)。一般来说，为了产生有效的抗肿瘤T细胞应答，通常需要以下三个步骤：使抗原特异性T细胞致敏(priming)并活化，使活化的T细胞迁移至肿瘤部位，以及通过抗原特异性T细胞来识别并杀伤肿瘤。靶抗原的选择对于诱导有效的抗原特异性T细胞是重要的。
虽然已经鉴定了黑素瘤和少数其他实体瘤恶性肿瘤的数种肿瘤相关抗原，但是缺乏胰腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、***、乳腺癌和头颈癌的免疫原性靶标。因此，鉴定和验证这些常见和难以治疗的恶性肿瘤的新表位和靶抗原是有必要的。
发明内容
在一些实施方案中，本公开内容提供了VGLL1肽及其使用方法，例如在包括过继性T细胞治疗的治疗中。在一些实施方案中，所述肽可用于体外扩增施用于哺乳动物对象(例如人患者)以治疗疾病(例如癌症)的VGLL1特异性T细胞。在另一些实施方案中，对T细胞进行遗传改造以表达具有针对VGLL1的抗原特异性的T细胞受体(Tcell receptor，TCR)。在另一些实施方案中，可将肽施用于哺乳动物对象以诱导免疫应答或对对象进行针对该肽的免疫接种，并且这样的免疫应答可用于治疗疾病(例如癌症)或降低获得或复发疾病的机会。
在一个实施方案中，本公开内容提供了长度为35个氨基酸或更少(例如，34、33、32、31或30个氨基酸)的分离的VGLL1肽，其包含与SEQ ID NO：1(LSELETPGKY)具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述肽能够诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)。在一些方面，肽包含与SEQ ID NO：1具有至少91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的氨基酸序列。在某些方面，肽的长度为30个氨基酸或更少，例如长度为29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个氨基酸。
在一些方面，肽与人I类HLA蛋白结合。在特定方面，人I类HLA蛋白是HLA-A*0101或HLA-A1家族的其他成员，例如HLA-A*0102和HLA-A*0103。在另一些方面，I类HLA蛋白是HLA-A*2902或HLA-A29家族的其他成员、或HLA-A*3002和HLA-A30家族的其他成员。在另一些方面，I类HLA蛋白是HLA-B*1801或HLA-B18家族的其他成员或HLA-B*4403或HLA-B44家族的其他成员。
在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含一些实施方案的分离的VGLL1肽和药物载体。在一些方面，药物组合物配制成用于肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、吸入或皮下注射。在某些方面，肽包含在脂质体、含脂质的纳米粒中，或基于脂质的载体中。在一些方面，药物制剂配制成用于注射或作为鼻喷雾剂吸入。
另一些实施方案提供了编码一些实施方案的VGLL1肽的分离的核酸。本文中还提供了载体，其包含由编码VGLL1肽的核酸组成的连续序列。
在另一个实施方案中，提供了在对象中促进免疫应答的方法，其包括向对象施用有效量的一些实施方案的VGLL1肽，其中所述肽在对象中诱导抗原特异性T细胞。在一些方面，对象被诊断为癌症。在某些方面，癌症是胰腺癌、卵巢癌、胃癌或乳腺癌。在特定方面，对象是人。
在另外的一些方面，所述方法还包括施用至少第二种抗癌治疗。在一些方面，第二种抗癌治疗选白化学治疗、放射治疗、免疫治疗或手术。在特定方面，免疫治疗是免疫检查点抑制剂。在一个具体方面，免疫检查点抑制剂是抗PD1单克隆抗体。
另一个实施方案提供了产生VGLL1特异性T细胞的方法，其包括获得起始T细胞群，以及使起始T细胞群与一些实施方案的VGLL1肽(例如SEQ ID NO：1的肽)接触，从而产生VGLL1特异性T细胞。在一些方面，接触进一步限定为将起始T细胞群与抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)共培养，其中APC在其表面上呈递一些实施方案的VGLL1肽。在特定方面，APC是树突细胞。在一些方面，起始T细胞群是CD8+T细胞。在某些方面，T细胞是CTL。在一些方面，获得包括从外周血单核细胞(peripheral blood mononuclearcell，PBMC)分离起始T细胞群。本文中还提供了药物组合物，其包含通过本文中的方法产生的VGLL1特异性T细胞。
一个更进一步的实施方案提供了具有针对VGLL1的抗原特异性的抗原受体，例如T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)。另一个实施方案提供了经改造以表达VGLL1特异性TCR或CAR的T细胞。在一些方面，VGLL1特异性嵌合抗原受体包含细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和/或细胞外结构域。在某些方面，编码CAR的DNA整合到细胞的基因组中。在一些方面，CAR的细胞外结构域包含VGLL1结合区。例如，VGLL1结合区可以是F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv或scFv。在某些方面，CAR的细胞内信号传导结构域是T-淋巴细胞活化结构域。例如，CAR的细胞内信号传导结构域可包含CD3ξ、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CDl37、FcεRIγ、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132、DAP分子、CD70、细胞因子受体、CD40或其组合。在某些方面，eCAR的跨膜结构域包含CD28跨膜结构域、IgG4Fc铰链、Fc区、CD4跨膜结构域、CD3ξ跨膜结构域、半胱氨酸突变的人CD3ξ结构域、CD16跨膜结构域、CD8跨膜结构域或***受体跨膜结构域。
另一个实施方案提供了在对象中治疗癌症的方法，其包括向对象施用有效量的一些实施方案的VGLL1特异性T细胞。在一些方面，癌症是胰腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌或乳腺癌。在特定方面，对象是人。在一些方面，抗原特异性T细胞是自体的。在一些方面，确定对象具有表达VGLL1的癌细胞。
在某些方面，所述方法还包括在施用抗原特异性T细胞之前进行对象的淋巴细胞耗竭。在一些方面，淋巴细胞消除包括施用环磷酰胺和/或氟达拉滨。
在一些方面，所述方法还包括施用至少第二种治疗剂。在某些方面，至少第二种治疗剂包括化学治疗、免疫治疗、手术、放射治疗或生物治疗。在特定方面，免疫治疗是免疫检查点抑制剂。在一个具体方面，免疫检查点抑制剂是抗PD1单克隆抗体。
在某些方面，VGLL1特异性T细胞和/或至少第二种治疗剂静脉内、腹膜内、气管内、瘤内、肌内、内镜、病灶内、经皮、皮下、区域性施用或通过直接注射或灌注施用。
本文中还提供了包含有效量的一些实施方案的VGLL1特异性T细胞的组合物，其用于在对象中治疗癌症。在一些方面，癌症是胰腺癌、卵巢癌，胃癌、膀胱癌或乳腺癌。在特定方面，对象是人。在一些方面，抗原特异性T细胞是自体的。在一些方面，确定对象具有表达VGLL1的癌细胞。
本文中还提供了确定患有癌症的对象的预后的方法，其包括测量从所述对象获得的样品中VGLL1的表达水平，其中升高的VGLL1水平表明对象预后不良。在一些方面，样品是血液样品或组织样品，例如肿瘤样品。在特定方面，癌症是胰腺癌。
本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。然而，应理解，详细描述和具体实例尽管指出了本发明的一些优选实施方案但是仅作为举例说明给出，因为根据本详细描述，在本发明精神和范围之内的多种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得明显。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分并且为了进一步示出本发明的某些方面而包括在内。通过参照这些附图中的一个或更多个并结合本文中提出的一些特定实施方案的详细描述可更好地理解本发明。
图1A至1D：来源于VGLL1的胰腺肿瘤相关抗原的基于质谱的鉴定。(A)从来源于PDAC患者MP015的胰腺肿瘤类器官细胞系(hMIA-2D)分离的结合HLA I类的VGLL1肽，LSELETPGKY(SEQ ID NO：1)的串联质谱(mass spectrometry，MS)分析。顶部的图示出了来自发现相串联MS的原始洗脱肽的谱。中间和底部的谱示出了靶向MS的实验，其中将同位素标记的合成肽LSELETPGKY(SEQ ID NO：1)(具有加下划线的重赖氨酸残基)添入肿瘤样品中并与天然肽共洗脱，证明了肽特征的金标准确认。(B)与(A)相同的质谱，但是圈出‘y’离子以突出对应于重赖氨酸残基的同位素标记的肽的8个原子质量单位的预期质量移位。(C)与(A)相同的质谱，但是圈出‘b’离子以突出对于仅b9+离子的8个原子质量单位的预期质量移位，而对于其他‘b’离子没有。(D)天然VGLL1肽和同位素标记的VGLL1肽，LSELETPGKY(SEQID NO：1)和LSELETPGKY(SEQ ID NO：1)的预期串联MS片段离子质量的分析。
图2A至2B：与正常组织相比，在数种肿瘤类型中VGLL1 mRNA转录物过表达。(A)来源于GTex门户正常组织(gtexportal.org)和TCGA(cancergenome.nih.gov)肿瘤组织数据库的RNAseq分析示出了分别在正常组织和多种癌症中的VGLL1转录物表达。每个点表示一个分析的人样品的结果。左侧星形和箭头表示在膀胱中发现的VGLLl转录物的最高平均正常组织水平。右侧星形和箭头表示在MP015患者来源的类器官细胞系hMIA2D(从中检测到VGLL1肽)中VGLL1转录物的水平。方框表示过表达VGLL1转录物的5种癌症类型：胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌和胃癌。TPM(transcripts per million)，转录物/百万。(B)来源于TCGA数据的五种癌症类型中的VGLLl表达患病率。如果通过RNAseq表达确定VGLLl mRNA表达＞3TPM，则认为肿瘤相关表达是阳性的。
图3：升高的VGLL1表达是癌症中的不良预后因素。胰腺癌患者存活分析，分为最高(黑线)、第2高(深灰色)、第3高(中灰色)和最低(浅灰色)VGLL1肿瘤转录物表达的四分位数，通过TCGA RNAseq数据确定。最低VGLL1表达与最高存活率相关。
图4A至4D：从PDAC患者外周血中分离并扩增VGLL1肽特异性细胞毒性T细胞并输注用于治疗。(A)描述过继性T细胞治疗过程的示意图。(B)来自HLA-A*0101阳性PDAC患者MP015的外周血用自体LSELETPGKY(SEQ ID NO：1)肽脉冲的树突细胞刺激两次，然后进行2轮基于四聚体的OWL分选和迅速扩增方案(rapid expansion protocol，REP)。(C)将VGLL1特异性CTL扩增至约200亿个细胞并输注到患者MP015中，同时每三周进行抗PD1治疗。(D)尽管显示出强大的体外自体抗肿瘤活性，但CTL输注没有引起严重的毒性，也没有引起任何明显的临床益处。对来自患者MP015的多个纵向肿瘤样品进行的基因表达分析显示，在原始肿瘤(类器官细胞系hMIA-2D的来源)的收获和VGLLl特异性CTL输注之间的间隔月期间发生VGLLl抗原丢失。
图5A至5B：VGLLl特异性CTL识别并且杀伤患者来源的和同种异体的HLA-A*0101+胰腺癌细胞。(A)扩增的HLA-A*0101限制性VGLL1特异性CD8+ T细胞与自体PDAC患者MP015来源的肿瘤系hMIA-2D、HLA-A*0101阳性PDAC细胞系Capan-1或HLA-A*0101阳性黑素瘤细胞系A375以5∶1和20∶1的效应物比靶标(E∶T)细胞比在标准51Cr释放测定中共培养以测量细胞毒性活性。(B)与(A)相同的细胞毒性测定，不同之处在于所有三种细胞系用1mM同源VGLL1肽抗原脉冲并在VGLL1特异性CTL暴露之前洗涤。
图6A至6C：VGLL1特异性CTL杀伤来源于胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌和三阴性乳腺癌的HLA-A0101+肿瘤细胞系。(A)扩增的HLA-A*0101限制性VGLL1特异性CD8+ T细胞与用滴定量的同源VGLL1肽脉冲的HLA-A*0101阳性Mel888黑素瘤细胞以5：1效应物比靶标(E∶T)细胞比在标准51Cr释放细胞毒性测定中共培养。(B)以5∶1 E∶T细胞比针对六种HLA-A*0101阳性细胞系(包括四种PDAC系(hMIA-2D、Capan-1、BXPC3和MP081)、三阴性乳腺癌系(BT20)和膀胱癌系(UBLC1))测试的VGLL1特异性CTL的细胞毒性测定结果。(C)在具有或不具有先前的干扰素γ治疗的情况下，以5∶1 E∶T细胞比针对两种另外的HLA-A*0101阳性细胞系(三阴性乳腺癌系(BT549)和卵巢癌系(OAW28))测试的VGLL1特异性CTL的细胞毒性测定结果。
图7A至7B：在HLA-A*0101转导之后，胃癌系MKN74被VGLL1特异性CTL杀伤。(A)亲本MKN74胃癌细胞和用慢病毒载体转导以表达HLA-A*0101的MKN74细胞的流式细胞术分析。细胞用HLA-A*0101特异性mAb染色并通过流式细胞术分析。转导的MKN74细胞向右移位。(B)以5∶1E∶T细胞比针对未转导的HLA-A*0101阳性黑素细胞或慢病毒转导以表达VGLL1的相同黑素细胞测试的VGLL1特异性CTL的细胞毒性测定结果。
具体实施方式
对于患有许多不同癌症类型的患者，基于T细胞的免疫治疗代表了具有经证实效力的有前景的方法。然而，由于缺乏目前已知的肿瘤相关抗原，抗原特异性T细胞治疗对于大多数癌症类型是不可行的，这阻碍了它们的临床开发。本公开内容中的研究通过质谱分析法描绘了胰腺细胞系和肿瘤标本的免疫肽组(immunopeptidome)，并鉴定了来源于新的肿瘤相关抗原VGLL1的肽表位，所述肿瘤相关抗原VGLL1在胰腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌和乳腺癌中以相比于正常组织显著更高的水平表达。使用这些肽表位，从胰腺患者外周血单核细胞(PBMC)产生抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其识别HLA匹配的同种异体肿瘤细胞系上内源性存在的抗原，引起肿瘤细胞的杀伤。因此，本文中提供的这些抗原特异性CTL可用于靶向实体癌症(例如胰腺癌、卵巢癌、胃癌和乳腺癌)。
因此，本公开内容提供了肿瘤抗原特异性肽(例如针对肿瘤抗原VGLL1)用作用于治疗癌症的免疫治疗。本研究将VGLL1鉴定为来自胰腺洗脱的肿瘤相关抗原。VGLL1肽具有51nM的预测的HLA-A*0101亲和力，其世界患病率为10％至20％。因此，在一些实施方案中，VGLL1肽(例如包含SEQ ID NO：1)在本文中提供。例如，VGLL1特异性肽可与T细胞群接触或用于刺激T细胞群以诱导识别或结合VGLL1特异性肽的T细胞增殖。在另一些实施方案中，本公开内容的VGLL1特异性肽可施用于对象(例如人患者)以增强对象针对癌症的免疫应答。
VGLL1特异性肽可包含在主动免疫治疗(例如癌症疫苗)或被动免疫治疗(例如过继性免疫治疗)中。主动免疫治疗包括用经纯化的肿瘤抗原或免疫显性VGLL1特异性肽(天然或经修饰的)对对象进行免疫接种。或者，可向对象施用VGLLl特异性肽脉冲(或经编码肿瘤抗原的基因转染)的抗原呈递细胞。VGLL1特异性肽可以是经修饰的或包含一个或更多个突变，例如替换突变。被动免疫治疗包括过继性免疫治疗。过继性免疫治疗通常涉及向对象施用细胞，其中所述细胞(例如CTL)已经在体外针对VGLL1特异性肽致敏(参见例如US 7,910,109)，例如通过使用APC在体外将VGLL1表位呈递给CTL。
在本研究中观察到存活率对应于VGLL1表达，最低的VGLL1表达与最高的存活率相关。因此，VGLL1是肿瘤标志物，其可用作癌症患者的预后标志物，特别是胰腺癌患者的预后标志物。
I.定义
就特定组分而言，本文中使用的“基本上无”在本文中用于意指特定组分均不被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何非预期污染产生的特定组分的总量远低于0.05％，优选地低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法未检测到特定组分的量的组合物。
如本说明书中所用，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或更多个/种。如本文权利要求书中所用，当与词组“包含/包括”组合使用时，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种。
除非明确地指出仅指替代方案或者替代方案相互排斥，否则权利要求书中术语“或/或者”的使用用于意指“和/或”，但是本公开内容支持指仅替代方案和“和/或”的定义。本文中使用的“另一个/种”可意指至少第二个/种或更多个/种。
在本申请通篇，术语“约/大约”用于表示值包括用于确定所述值的装置、方法之误差的固有变化或者研究对象之间存在的变化。
“治疗(treatment)”和“进行治疗(treating)”是指为了获得疾病或健康相关病症的治疗益处而向对象施用或施加治疗剂或对对象执行某种方法或方式。例如，治疗可包括施用T细胞治疗。
“对象”和“患者”是指人或非人，例如灵长类、哺乳动物和脊椎动物。在特定实施方案中，对象是人。
本申请通篇使用的术语“治疗益处”或“治疗有效的”是指就药物治疗该病症而言促进或增强对象健康的任何情况。这包括但不限于疾病的体征或症状的频率或严重程度降低。例如，癌症的治疗可涉及例如肿瘤尺寸减小、肿瘤侵袭性降低、癌症生长速率降低或阻止转移。癌症的治疗还可指患有癌症的对象存活的延长。
“抗癌”剂能够负面地影响对象中的癌细胞/肿瘤，例如通过促进癌细胞的杀伤、诱导癌细胞的凋亡、降低癌细胞的生长速率、降低转移的发生率或数量、减小肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、降低向肿瘤或癌细胞的血液供应、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症的进展或提高患有癌症的对象的寿命。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用并且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性即可。
本文中使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，例如，构成该群的单个抗体除了可能以较小量存在的可能的突变(例如天然存在的突变)之外是相同的。因此，修饰语“单克隆”表明抗体的特性不是分离的抗体的混合物。在某些实施方案中，这样的单克隆抗体通常包括包含靶结合的多肽序列的抗体，其中靶结合的多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单个靶结合的多肽序列的方法来获得。例如，选择方法可以是从多个克隆(例如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆库)中选择唯一的克隆。应理解，可以进一步改变选择的靶结合序列，例如，以提高对靶的亲和力、使靶结合序列人源化、提高其在细胞培养中的产生、降低其体内免疫原性、产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶结合序列的抗体也是单克隆抗体。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体制剂的优点在于其通常未被其他免疫球蛋白污染。
短语“可药用的或药理学上可接受的”是指适当时当施用于动物(例如人)时不产生不利反应、***反应或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，包含抗体或另外的活性成分的药物组合物的制备对于本领域技术人员将是已知的。此外，对于动物(例如人)施用，应理解，制剂应符合FDA生物标准办公室(FDA Office of BiologicalStandards)所要求的无菌性、致热原性(pyrogenicity)、一般安全性和纯度标准。
如本领域普通技术人员将已知的，本文中使用的“可药用的载体”包括任何和所有水性溶剂(例如水、醇/水溶液、盐水溶液、胃肠外载剂(例如氯化钠、林格右旋糖等))、非水溶剂(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯(例如油酸乙酯))、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等张剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、流体和营养补充剂等材料及其组合。根据公知的参数调节药物组合物中多种组分的pH和精确浓度。
术语“单位剂量”或“剂量”是指适合用于对象的物理上离散的单元，每个单位包含治疗性组合物的预定量，所述预定量经计算产生与其施用(即合适的途径和治疗方案)相关的以上讨论的期望响应。根据治疗数量和单位剂量二者，待施用的量取决于所期望的效果。施用于患者或对象的本发明实施方案的组合物的实际剂量可以通过身体和生理因素(例如对象的体重、年龄、健康状况和性别，待治疗疾病的类型，疾病渗透程度，先前或同时的治疗性干预，患者的特发病，施用途径，以及特定治疗物质的效力、稳定性和毒性)来确定。例如，剂量还可包含每次施用约1μg/kg/体重至约1000mg/kg/体重(该这样的范围包括干预剂量)或更多，以及可从其中来源的任何范围。在可从来自本文中所列数字来源的范围的一些非限制性实例中，可施用约5μg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5μg/kg/体重至约500mg/kg/体重等的范围。在任何事件下，负责施用的医疗人员将确定组合物中活性成分的浓度和个体对象的合适剂量。在一些实施方案中，抗原特异性T细胞输注的剂量可包含约1亿至约300亿个细胞，例如100、150或200亿个细胞。
术语“免疫检查点”是指免疫***中的向其组分提供抑制信号以平衡免疫反应的分子，例如蛋白质。已知的免疫检查点蛋白包括CTLA-4、PD-1及其配体PD-L1和PD-L2以及另外的LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR。在本领域中认为涉及LAG3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3和KIR的途径构成类似于CTLA-4和PD-1依赖途径的免疫检查点途径(参见例如Pardoll，2012.Nature Rev Cancer 12：252-264；Mellman等，2011.Nature 480：480-489)。
“免疫检查点抑制剂”是指抑制免疫检查点蛋白功能的任何化合物。抑制包括功能降低和完全阻断。特别地，免疫检查点蛋白是人免疫检查点蛋白。因此免疫检查点蛋白抑制剂特别是人免疫检查点蛋白抑制剂。
本文中使用的“保护性免疫应答”是指哺乳动物宿主的免疫***针对癌症的应答。保护性免疫应答可提供用于治疗癌症的治疗效果，例如减小肿瘤尺寸或提高存活。
本文中使用的术语“抗原”是能够被抗体或T细胞受体结合的分子。抗原可通常用于诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，引起B和/或T淋巴细胞的产生。
术语“肿瘤相关抗原”、“肿瘤抗原”和“癌细胞抗原”在本文中可互换使用。在每种情况下，所述术语是指由癌细胞特异性或优先表达的蛋白质、糖蛋白或碳水化合物。
本文中使用的术语“嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)”可指例如人造T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体，并且涵盖将人造特异性移植到特定免疫效应细胞上的经改造受体。可使用CAR将单克隆抗体的特异性赋予至T细胞，从而允许产生大量特异性T细胞，例如，用于过继性细胞治疗。在特定实施方案中，CAR指导细胞针对例如肿瘤相关抗原的特异性。在一些实施方案中，CAR包含细胞内活化结构域、跨膜结构域和含有肿瘤相关抗原结合区的细胞外结构域。在一些特定方面，CAR包含来源于单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合物，融合至CD3ζ跨膜结构域和内结构域。其他CAR设计的特异性可来源于受体的配体(例如肽)或来源于模式识别受体，例如Dectin。在某些情况下，可以修饰抗原识别结构域的间隔以降低活化诱导的细胞死亡。在某些情况下，CAR包含用于额外共刺激信号传导的结构域，例如CD3ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10和/或OX40。在一些情况下，分子可以与CAR共表达，包括共刺激分子、用于成像的报道基因(例如用于正电子发射断层摄影)、在添加前药之后有条件地消融T细胞的基因产物、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体。
多核苷酸或多核苷酸区域(或者多肽或多肽区域)与另一序列具有一定百分比(例如80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”或“同源性”，意味着在比对时，在比较两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。该比对和百分比同源性或序列同一性可以使用本领域中已知的软件程序，例如在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等，编辑，1987)副刊30，7.7.18节，表7.7.1中描述的那些来确定。优选地，默认参数用于比对。优选的比对程序是BLAST，使用默认参数。特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止＝60；期望＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序依据＝HIGH SCORE；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。
II.VGLL1肽
本公开内容的某些实施方案涉及肿瘤抗原特异性肽，例如VGLL1肿瘤抗原。在特定实施方案中，肿瘤抗原特异性肽具有VGLL1肽的氨基酸序列(LSELETPGKY：SEQ ID NO：1)。肿瘤抗原特异性肽可具有与SEQ ID NO：1的肽序列具有至少百分之80、85、90、95、96、97、98、99或100序列同一性的氨基酸序列。
本文中使用的术语“肽”涵盖包含以下的氨基酸链：7至35个氨基酸，优选8至35个氨基酸残基，并且甚至更优选8至25个氨基酸，或者长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸，或可从其中来源的任何范围。例如，在一些实施方案中，本公开内容的VGLLl肽可包含SEQ ID NO：1的VGLL1肽，或由其组成。本文中使用的“抗原性肽”是这样的肽：其当引入脊椎动物中时可以刺激在脊椎动物中产生抗体(即是抗原性的)，并且其中该抗体可以选择性地识别和/或结合该抗原性肽。抗原性肽可包含免疫反应性VGLL1肽，并且可包含另外的序列。另外的序列可来源于天然抗原并且可以是异源的，并且这样的序列可以但不需要是免疫原性的。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)可以选择性地与HLA-A*0101结合。在某些实施方案中，VGLL1肽的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸，或可从其中来源的任何范围。优选地，肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)的长度为8至35个氨基酸。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)的长度为8至10个氨基酸。
如本领域技术人员将理解的，MHC分子可以结合多种尺寸的肽，但通常不结合全长蛋白质。尽管MHC I类分子传统地被描述为与长度为8至11个氨基酸的肽结合，但是已经显示，长度为15个氨基酸的肽可以通过在结合位点的中间凸出或延伸到MHC I类结合沟之外而与MHC I类分子结合(Guo等，1992；Burrows等，2006；Samino等，2006；Stryhn等，2000；Collins等，1994；Blanchard and Shastri，2008)。此外，最近的研究也表明较长的肽可被更高效地内吞、加工、以及由抗原呈递细胞呈递(Zwaveling等，2002；Bijker等，2007；Melief and van der Burg，2008；Quintarelli等，2011)。如Zwaveling等(2002)中所表明的，长度为多至35个氨基酸的肽可用于选择性地结合II类MHC并且是有效的。如技术人员将立刻理解的，天然存在的全长肿瘤抗原(例如VGLL1)将不可用于选择性地结合II类MHC使得其被内吞并且产生T细胞增殖。一般来说，天然存在的全长肿瘤抗原蛋白不展现这些特性并将因此不可用于这些免疫治疗目的。
在某些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)是免疫原性的或抗原性的。如以下实施例中所示出的，本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)可以促进T细胞的增殖。预期，这样的肽可用于诱导一定程度的保护性免疫。
肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)可以是重组肽、合成肽、经纯化肽、固定化肽、经可检测地标记的肽、经包封肽或载体表达的肽(例如，由在载体中的核酸编码的肽，所述载体包含与该核酸可操作地连接的异源启动子)。在一些实施方案中，可向对象(例如人患者)施用合成的肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)以在对象中诱导免疫应答。与重组表达的肽相比，合成的肽可展现出某些优点，例如细菌污染的风险降低。肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)还可包含在配制成用于施用于哺乳动物或人对象的药物组合物(例如疫苗组合物)中。
A.细胞渗透肽
在一些实施方案中，免疫治疗可使用与细胞渗透剂(例如脂质体或细胞渗透肽(cell penetrating peptide，CPP))缔合的本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)。用肽脉冲的抗原呈递细胞(例如树突细胞)可用于增强抗肿瘤免疫(Celluzzi等，1996；Young等，1996)。脂质体和CPP将在以下进一步详细描述。在一些实施方案中，免疫治疗可使用编码本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)的核酸，其中所述核酸例如在病毒载体或非病毒载体中递送。
肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)还可与细胞渗透肽(CPP)缔合或共价结合。可与肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)共价结合的细胞渗透肽包括例如HIV Tat、疱疹病毒VP22、果蝇触足(Drosophila Antennapedia)同源框(homeobox)基因产物、信号序列、融合序列或抗微生物肽I(protegrin I)。使肽与CPP共价结合可以延长树突细胞对肽的呈递，因此增强抗肿瘤免疫(Wang和Wang，2002)。在一些实施方案中，本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)(例如包含在肽或多表位串内)可与CPP共价结合(例如通过肽键)以产生融合蛋白。在另一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)或编码肿瘤抗原特异性肽的核酸可被包封在脂质体(例如多层、囊泡状或多囊泡状脂质体)内或与其缔合。
本文中使用的“缔合”意指物理缔合、化学缔合或二者。例如，缔合可以涉及共价键、疏水性相互作用、包封、表面吸附等。
本文中使用的“细胞渗透剂”是指增强肽/多表位串向抗原呈递细胞的细胞内递送的组合物或化合物。例如，细胞渗透剂可以是当与肽缔合时增强其穿过质膜之能力的脂质。或者，细胞渗透剂可以是肽。细胞渗透肽(CPP)是本领域中已知的，并且包括例如HIV的Tat蛋白(Frankel和Pabo，1988)、HSV的VP22蛋白(Elliott和O′Hare，1997)和成纤维细胞生长因子(Lin等，1995)。
已从果蝇触足同源框基因(Antp)的第三个螺旋、HIV Tat和疱疹病毒VP22中鉴定出细胞渗透肽(或“蛋白质转导结构域”)，其所有均包含富含精氨酸和赖氨酸残基的带正电荷的结构域(Schwarze等，2000；Schwarze等，1999)。此外，来源于信号序列的疏水性肽也已被鉴定为细胞渗透肽(Rojas等，1996；Rojas等，1998；Du等，1998)。已经显示，使这些肽与标志物蛋白(例如β-半乳糖苷酶)偶联赋予标志物蛋白被高效地内化到细胞中，并且包含这些肽的嵌合框内融合蛋白已经被用于在体外和体内将蛋白质递送到广谱细胞类型中(Drin等，2002)。这些细胞渗透肽与根据本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)的融合可增强多肽的细胞摄取。
在一些实施方案中，通过使脂质(例如硬脂酸酯或豆蔻酸酯)与多肽连接来促进细胞摄取。已经显示，脂化(lipidation)增强肽向细胞中的进入。脂质部分的连接是本公开内容提高细胞的多肽摄取的另一种方式。细胞摄取在以下进一步讨论。
本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)可包含在脂质体疫苗组合物中。例如，脂质体组合物可以是或包含脂蛋白体组合物(proteoliposomal composition)。用于产生可用于本公开内容的脂蛋白体组合物的方法例如在Neelapu等(2007)和Popescu等(2007)中描述。在一些实施方案中，脂蛋白体组合物可用于治疗黑素瘤。
通过增强肿瘤抗原特异性多肽的摄取，降低治疗所需的蛋白质或肽的量可能是可行的。这进而可以显著降低治疗成本并提高治疗剂的供应。较低的剂量还可以使肽的潜在免疫原性最小化并限制毒性副作用。
在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)可与纳米粒缔合以形成纳米粒-多肽复合物。在一些实施方案中，纳米粒是脂质体或其他基于脂质的纳米粒，例如基于脂质的囊泡(例如，DOTAP：胆固醇囊泡)。在另一些实施方案中，纳米粒是基于铁氧化物的超顺磁性纳米粒。直径为约10nm至100nm的超顺磁性纳米粒足够小以避免被脾隔离(sequester)，但足够大以避免被肝清除。该尺寸的颗粒可以渗透非常小的毛细血管并且可以有效地分布在身体组织中。超顺磁性纳米粒-多肽复合物可以用作MRI造影剂来鉴定和追踪摄取肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)的那些细胞。在一些实施方案中，纳米粒是半导体纳米晶体或半导体量子点，其二者均可用于光学成像。在另一些实施方案中，纳米粒可以是在二氧化硅核心之上包含金层的纳米壳。纳米壳的一个优点是可使用标准化学来使多肽与金层缀合。在另一些实施方案中，纳米粒可以是富勒烯或纳米管(Gupta等，2005)。
肽通过肾从循环中迅速除去，并且在血清中对通过蛋白酶的降解敏感。通过使肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)与纳米粒缔合，本公开内容的纳米粒-多肽复合物可提供针对降解的保护和/或降低通过肾的清除。这可提高多肽的血清半衰期，从而降低有效治疗的多肽剂量需求。此外，这可降低治疗成本，并且使治疗的免疫学问题和毒性反应最小化。
B.多表位串
在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)包括或包含在多表位串中。多表位串是包含连接在一起的来自一个或更多个抗原的多个抗原表位的肽或多肽。多表位串可用于在对象(例如人对象)中诱导免疫应答。多表位串先前已被用于靶向疟疾和其他病原体(Baraldo等，2005；Moorthy等，2004；Baird等，2004)。多表位串可指核酸(例如，编码包括VGLL1肽在内的多种抗原的核酸)，或者肽或多肽(例如，包含包括VGLL1肽在内的多种抗原)。多表位串可包含在癌症疫苗组合物中。
C.生物功能等同物
本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)可被修饰以包含不改变其分别与HLA类蛋白(例如HLA-A*0101)结合区的相互作用的氨基酸替换、***和/或缺失。肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)的这样的生物功能等同物可以是具有类似特征或在其他方面期望的特征(例如，HLA-A*0101的结合)的分子。作为一个非限制性实例，在本文中公开的肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)中某些氨基酸可被替换为其他氨基酸而没有可观的相互作用能力损失，如可检测地未改变的肽与HLA-A*0101的结合所表明的。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽在锚定位置具有替换突变，例如在以下位置中一个、两个或全部处具有替换突变：1(P1)、2(P2)和/或9(P9)。因此应想到，在序列和/或结构上被修饰但生物学效用或活性未改变的本文中公开的肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)(或编码这样的肽的核酸)仍在本文中公开的组合物和方法的范围之内。
技术人员还充分理解的是，生物功能等同肽的定义所固有的是以下概念：存在对可在分子的限定部分中做出改变、同时仍然维持可接受水平的等同生物活性的改变数量的限制。因此，本文中将生物功能等同肽定义为其中某些(不是大部分或所有)氨基酸可被替换的那些肽。当然，根据本公开内容可容易地制备和使用多种具有不同替换的不同肽。
技术人员还意识到，在显示某些残基(例如在特定表位中的残基)对肽的生物或结构特性特别重要的情况下，这样的残基通常可不更换。在本公开内容中可以是这种情况，如本文中公开的肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)中的突变可导致物种特异性丧失并且进而降低所得肽用于本公开内容的方法的效用。因此，抗原性的(例如，特异性地结合HLA-A*0101)并且包含保守氨基酸替换的肽被理解为包含在本公开内容中。保守替换最不可能显著地改变蛋白质的活性。“保守氨基酸替换”是指将氨基酸替换为化学上类似的氨基酸，即将非极性氨基酸替换为其他非极性氨基酸；将极性氨基酸替换为其他极性氨基酸，将酸性残基替换为其他酸性氨基酸，等。
氨基酸替换(例如可用于修饰本文中公开的肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)的那些)通常基于氨基酸侧链取代基的相对类似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。对氨基酸侧链取代基的尺寸、形状和类型的分析揭示，精氨酸、赖氨酸和组氨酸全部是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸全部具有类似的尺寸；并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸全部具有大致类似的形状。因此，基于这些考虑，本文中将精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸定义为生物功能等同物。在一些实施方案中，突变可增强TCR-pMHC相互作用和/或肽-MHC结合。
本公开内容还考虑了本文中公开的肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)的异形体(isoform)。异形体与本公开内容的肽包含相同数目和种类的氨基酸，但异形体具有不同的分子结构。本公开内容所考虑的异形体是与本文中所述的本公开内容的肽具有相同特性的那些。
可通过对已存在氨基酸进行化学修饰或通过从头合成本文中公开的肽在蛋白质中并入非标准氨基酸。非标准氨基酸是指在化学结构上与由遗传密码所编码的二十种标准氨基酸不同的氨基酸。
在一些选定实施方案中，本公开内容考虑了本文中公开的肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)的化学衍生物。“化学衍生物”是指具有一个或更多个通过功能性侧基的反应而化学衍生化的残基并且保留生物活性和效用的肽。这样的衍生化肽包括例如以下那些，其中游离氨基已被衍生化以形成特定盐或通过烷基化和/或酰化、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基、甲酰基或乙酰基等衍生化。游离的羧基可被衍生化以形成有机或无机盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼并且优选酰胺(伯胺或仲胺)。化学衍生物可包括包含二十种标准氨基酸的一种或更多种天然存在氨基酸衍生物的那些肽。例如，可将4-羟脯氨酸替换为丝氨酸；并且可将鸟氨酸替换为赖氨酸。
应注意，所有氨基酸残基序列在本文中均用左右取向为氨基末端至羧基末端的常规方向的式来表示。此外，应注意，在氨基酸残基序列的起点或末端的短划线表示与具有一个或更多个氨基酸残基的另外序列的肽键。本文中所述的氨基酸优选是“L”异构体形式。然而，“D”异构体形式的残基可以被替换为任何L-氨基酸残基，只要蛋白质保留本文中所述的期望功能特性即可。
优选的肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)或其类似物优选特异性地或优先地结合HLA-A*0101。确定特定肿瘤抗原特异性肽或经标记肽或者其类似物是否或以何种程度可结合HLA-A*0101并且可使用例如以下体外测定来进行评估：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、免疫染色、胶乳凝集(latex agglutination)、间接血凝测定(indirect hemagglutination assay，IHA)、补体结合(complement fixation)、间接免疫荧光测定(FA)、浊度法(nephelometry)、流式细胞术测定、化学发光测定、侧流免疫测定、u-捕获测定、质谱测定、基于颗粒的测定、抑制测定和/或亲合力测定。
D.编码肿瘤抗原特异性肽的核酸
在一些方面，本公开内容提供了编码分离的抗原特异性肽的核酸，所述分离的抗原特异性肽包含与SEQ ID NO：1具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，或者所述肽与SEQ ID NO：1相比可具有1、2、3或4个点突变(例如替换突变)。如上所述，这样的肿瘤抗原特异性肽的长度可以是例如8至35个氨基酸，或可从其中来源的任何范围。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽对应于肿瘤抗原蛋白的一部分(例如，VGLL1：NP_057351.1)。术语“核酸”旨在包括DNA和RNA并且可以是双链或单链的。
本公开内容的一些实施方案提供了可特异性地结合HLA-A*0101的重组产生的肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)。因此，可使编码肿瘤抗原特异性肽的核酸与表达载体可操作地连接，并且使用分子生物学领域中公知的方法在合适的表达***中产生肽。编码本文中公开的肿瘤抗原特异性肽的核酸可并入到确保该肽良好表达的任何表达载体中。可能的表达载体包括但不限于黏粒、质粒或经修饰病毒(例如复制缺陷的逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，只要该载体适合于宿主细胞的转化即可。
“适合于宿主细胞的转化”的重组表达载体意指该表达载体包含本公开内容的核酸分子和与该核酸分子可操作地连接的基于待用于表达的宿主细胞选择的调节序列。术语“有效连接”或“可操作地连接”可互换使用，并且旨在意指核酸以允许该核酸表达的方式与调节序列连接。
因此，本公开内容提供了重组表达载体，其包含编码肿瘤抗原特异性肽的核酸，和用于转录和翻译所***的蛋白质序列的必需调节序列。合适的调节序列可来源于多种来源，包括细菌、真菌或病毒基因(例如参见Goeddel(1990)中描述的调节序列)。
合适调节序列的选择通常取决于所选择的宿主细胞，并且可由本领域普通技术人员容易地实现。这样的调节序列的一些实例包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列；核糖体结合序列，其包括翻译起始信号。此外，根据所选择的宿主细胞和所使用的载体，其他序列(例如复制起点、另外的DNA限制性位点、增强子和赋予转录可诱导性的序列)也可并入到表达载体中。还将理解的是，必需调节序列可由天然蛋白质和/或其侧翼区提供。
重组表达载体还可包含选择性标志基因，其有利于选择用本文中公开的重组肿瘤抗原特异性肽(例如VGLL1肽)转化或转染的宿主细胞。选择性标志基因的一些实例是编码例如以下蛋白质的基因：赋予针对某些药物之抗性的G418和潮霉素、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或萤火虫萤光素酶。选择性标志基因的转录通过选择性标志蛋白质(例如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或萤火虫萤光素酶)的浓度改变来监测。如果选择性标志基因编码赋予抗生素抗性(例如新霉素抗性)的蛋白质，则可用G418选择转化体细胞。已经并入选择性标志基因的细胞将存活下来，而其他细胞将死亡。这使得可以可视化和测定重组表达载体的表达，并且特别地确定突变对表达和表型的影响。应理解，选择性标志可引入与目的核酸分离的载体上。
重组表达载体可以被引入到宿主细胞中以产生转化体宿主细胞。术语“转化体宿主细胞”旨在包括已经用本公开内容的重组表达载体转化或转染的原核和真核细胞。术语“用……转化”、“用……转染”、“转化”和“转染”旨在涵盖通过本领域中已知的许多可能技术之一将核酸(例如载体)引入到细胞中。合适的宿主细胞包括广泛多种的原核和真核宿主细胞。例如，本公开内容的蛋白质可在细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli))、昆虫细胞(使用杆状病毒)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。
本公开内容的核酸分子还可使用标准技术化学合成。化学合成多聚脱氧核苷酸的多种方法是已知的，包括固相合成，其与肽合成类似，已经在可商购的DNA合成仪中完全自动化(参见例如美国专利No.4,598,049；4,458,066；4,401,796；和4,373,071)。
III.过继性T细胞治疗
本公开内容的某些实施方案涉及获得T细胞并将其施用于对象作为靶向癌细胞的免疫治疗。特别地，T细胞是抗原特异性T细胞(例如，VGLL1特异性T细胞)。在过去的二十年中已经描述了数种用于功能性抗肿瘤效应T细胞的衍生、活化和扩增的基本方法。这些包括：自体细胞，例如肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)；使用自体DC离体活化的T细胞、淋巴细胞、人造抗原呈递细胞(APC)或涂有T细胞配体和活化抗体的珠，或通过捕获靶细胞膜分离的细胞；天然表达抗宿主肿瘤T细胞受体(TCR)的同种异体细胞；和经遗传重编程或“重定向”以表达展现出称为“T-体(T-body)”的抗体样肿瘤识别能力的肿瘤反应性TCR或嵌合TCR分子的非肿瘤特异性自体或同种异体细胞。这些方法已经产生了许多用于T细胞制备和免疫的方案，其可用于本文中所述的方法。
A.T细胞制备
在一些实施方案中，T细胞来源于血液、骨髓、淋巴或淋巴器官。在一些方面，细胞是人细胞。细胞通常是原代细胞，例如直接从对象分离和/或从对象分离并冷冻的那些。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或另一些细胞类型(例如全部T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞、及其亚群)的一个或更多个亚群，例如由以下限定的那些：功能、活化状态、成熟度、分化的潜力、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌特征、和/或分化程度。关于待治疗的对象，细胞可以是同种异体的和/或自体的。在一些方面，例如对于现成技术，细胞是多能性的和/或多潜能性的，例如干细胞，例如诱导的多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)。在一些实施方案中，如本文中所述的，所述方法包括从对象分离细胞、制备、加工、培养和/或改造它们，并在冷冻保存之前或之后将它们重新引入相同的患者中。
T细胞(例如，CD4+和/或CD8+ T细胞)的亚型和亚群中有初始T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(例如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、黏膜相关不变T(mucosa-associated invariant T，MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助性T细胞(例如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助性T细胞)、α/β T细胞和δ/γ T细胞。
在一些实施方案中，一种或更多种T细胞群富集或耗尽对特定标志物(例如表面标志物)呈阳性的细胞，或对特定标志物呈阴性的细胞。在一些情况下，这样的标志物是在某些T细胞群(例如非记忆细胞)上不存在或以相对低的水平表达但是在某些其他T细胞群(例如记忆细胞)上以相对较高的水平存在或表达的那些标志物。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(例如B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标志物(例如CD14)来使T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助性和CD8+细胞毒性T细胞。通过阳性或阴性选择在一种或更多种初始、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或表达至相对较高程度的标志物，这样的CD4+和CD8+群可以进一步分类成亚群。
在一些实施方案中，CD8+ T细胞进一步富集或耗尽稚细胞、中枢记忆细胞、效应记忆细胞和/或中枢记忆干细胞，例如通过基于与相应亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择。在一些实施方案中，进行中枢记忆T(TCM)细胞的富集以提高效力，例如改善在施用之后的长期存活、扩增和/或植入，这在一些方面在这样的亚群中特别强大。参见Terakura等(2012)Blood.1：72-82；Wang等(2012)J Immunother.35(9)：689-701。
在一些实施方案中，T细胞是自体T细胞。在该方法中，从患者获得肿瘤样品并获得单细胞悬液。单细胞悬液可以以任何合适的方式，例如机械地(使用例如gentleMACSTMDissociator，Miltenyi Biotec，Auburn，Calif.解聚肿瘤)或酶促地(例如胶原酶或DNA酶)获得。肿瘤酶消化物的单细胞悬液在白介素-2(IL-2)中培养。培养细胞直至汇合(例如约2×106淋巴细胞)，例如约5至约21天，优选约10至约14天。例如，细胞可以培养5天、5.5天或5.8天至21天、21.5天或21.8天，例如10天、10.5天或10.8天至14天、14.5天或14.8天。
可以汇集培养的T细胞并迅速扩增。迅速扩增在约10至约14天的时间内提供抗原特异性T细胞的数量至少约50倍(例如，50、60、70、80、90或100倍或更高)的增加。更优选地，迅速扩增在约10至约14天的时间内提供至少约200倍(例如，200、300、400、500、600、700、800、900或更高)的增加。
扩增可以通过本领域中已知的许多方法中的任一种来完成。例如，可以在饲养淋巴细胞和白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)(IL-2为优选)的存在下使用非特异性T细胞受体刺激来迅速扩增T细胞。非特异性T细胞受体刺激可包含约30ng/ml的OKT3(小鼠单克隆抗CD3抗体(可从Raritan，N.J.获得))。或者，可以在T细胞生长因子(例如300IU/ml IL-2或IL-15，IL-2为优选)的存在下，通过用一种或更多种可以任选地由载体表达的癌症抗原(包括其抗原性部分，例如表位或细胞)(例如人白细胞抗原A1(HLA-A1)结合肽)体外刺激外周血单核细胞(PBMC)来迅速扩增T细胞。通过用表达HLA-A1的抗原呈递细胞脉冲的相同癌症抗原再刺激来迅速扩增体外诱导的T细胞。或者，可以用经辐射的自体淋巴细胞或用经辐射的HLA-A1+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激T细胞。
可以修饰自体T细胞以表达促进自体T细胞的生长和活化的T细胞生长因子。合适的T细胞生长因子包括例如：白介素(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12。合适的修饰方法是本领域中已知的。参见例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.2001；和Ausubel等，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons，NY，1994。在特定方面，经修饰的自体T细胞以高的水平表达T细胞生长因子。T细胞生长因子编码序列(例如IL-12的编码序列)在本领域中是容易获得的，启动子也是如此，其与编码T细胞生长因子的序列的可操作地连接促进高水平表达。
B.经遗传改造的抗原受体
可以对T细胞进行遗传改造以表达抗原受体，例如经改造的TCR和/或CAR。例如，自体T细胞可以被修饰以表达具有针对癌症抗原的抗原特异性的TCR。在特定实施方案中，抗原受体具有针对VGLL1的抗原特异性。合适的修饰方法是本领域中已知的。参见例如Sambrook和Ausubel。例如，可使用Heemskerk等Hum Gene Ther.19：496-510(2008)和Johnson等Blood 114：535-46(2009)中描述的转导技术来转导T细胞以表达具有针对癌症抗原的抗原特异性的T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，T细胞包含通过基因工程引入的编码一种或更多种抗原受体的一种或更多种核酸，以及这样的核酸的遗传改造的产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，例如从另一生物体或细胞获得的核酸，例如，其通常不在被改造的细胞和/或这样的细胞来源于其中的生物体中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，例如未在自然界中发现的核酸(例如嵌合的)。
在一些实施方案中，CAR包含与抗原特异性结合的细胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，抗原是在细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，并且抗原是经加工的肽抗原，例如细胞内蛋白的肽抗原，其与TCR一样，在主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子的背景下在细胞表面上被识别。
示例性抗原受体，包括CAR和重组TCR，以及用于将受体改造并引入到细胞中的方法，包括例如在以下中描述的那些：国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337，美国专利No.6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，和欧洲专利申请号EP2537416，和/或由以下描述的那些：Sadelain等，Cancer Discov.2013年4月；3(4)：388-398；Davila等(2013)PLoSONE 8(4)：e61338；Turtle等，Curr.Opin.Immunol.，2012年10月；24(5)：633-39；Wu等，Cancer，2012年3月18(2)：160-75。在一些方面，经遗传改造的抗原受体包括美国专利No.7,446,190中描述的CAR和国际专利申请公开No.WO/2014055668 A1中描述的那些。
1.嵌合抗原受体
在一些实施方案中，经改造的抗原受体包括CAR，包括活化或刺激性CAR、共刺激CAR(参见WO2014/055668)和/或抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等，2013)。CAR通常包含在一些方面通过接头和/或跨膜结构域与一个或更多个细胞内信号传导组分连接的细胞外抗原(或配体)结合结构域。这样的分子通常模拟或接近通过天然抗原受体的信号、通过与共刺激受体结合的这样的受体的信号和/或仅通过共刺激受体的信号。
在一些实施方案中，构建具有针对特定抗原(或标志物或配体)的特异性的CAR，例如在特定细胞类型中表达以被过继性治疗靶向的抗原，例如癌症标志物，和/或旨在诱导抑制反应的抗原，例如在正常或非患病细胞类型上表达的抗原。因此，CAR通常在其细胞外部分包含一种或更多种抗原结合分子，例如一种或更多种抗原结合片段、结构域或部分，或一种或更多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包含抗体分子的一个或更多个抗原结合部分，例如来源于单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
在一些方面，抗原特异性结合或识别组分与一个或更多个跨膜结构域和细胞内信号传导结构域连接。在一些实施方案中，CAR包含与CAR的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用与CAR中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸替换来选择或修饰跨膜结构域以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他组分的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域来源于天然或合成的来源。在来源是天然的情况下，在一些方面，结构域来源于任何膜结合的或跨膜蛋白。跨膜区包括来源于以下的那些(即包括至少以下的跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CDl6、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。或者，在一些实施方案中跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成的跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成的跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
CAR通常包含至少一种细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，CAR包含TCR复合物(例如介导T细胞活化和细胞毒性的TCR CD3+链)的细胞内组分，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合分子与一种或更多种细胞信号传导组件连接。在一些实施方案中，细胞信号传导组件包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，CAR还包含一种或更多种另外的分子(例如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，CAR包含CD3ζ、CD3-Q或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
2.T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，经遗传改造的抗原受体包括重组TCR和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。“T细胞受体”或“TCR”是指包含可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRp)或可变γ和δ链(也分别称为TCRγ和TCR5)的能够特异性结合与MHC受体结合的抗原肽的分子。在一些实施方案中，TCR是αβ形式。一般来说，以αβ和γδ形式存在的TCR通常在结构上相似，但表达它们的T细胞可具有不同的解剖位置或功能。TCR可以在细胞表面上或以可溶的形式存在。一般来说，TCR出现在其通常负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合之抗原的T细胞(或T淋巴细胞)表面。在一些实施方案中，TCR还可以包含恒定结构域、跨膜结构域和/或短的细胞质尾(参见例如，Janeway等1997)。例如，在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和在C端末端的短的细胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质相关。除非另有说明，否则术语“TCR”应理解为涵盖其功能性TCR片段。该术语还涵盖完整或全长的TCR，包括αβ形式或γδ形式的TCR。
因此，出于本文中的目的，提及TCR包括任何TCR或功能性片段，例如与在MHC分子中结合的特定抗原肽(即MHC-肽复合物)结合的TCR的抗原结合部分。可互换使用的TCR的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指包含TCR的结构性结构域的一部分但与完全TCR结合的抗原(例如MHC-肽复合物)结合的分子。在一些情况下，抗原结合部分包含足以形成用于与特异性MHC-肽复合物(例如通常其中每条链包含三个互补决定区)结合的结合位点的TCR的可变结构域，例如TCR的可变α链和可变β链。
在一些实施方案中，TCR链的可变结构域缔合以形成环，或类似于免疫球蛋白的互补决定区(complementarity determining region，CDR)，其通过形成TCR分子的结合位点并确定肽特异性来赋予抗原识别并确定肽特异性。一般来说，与免疫球蛋白一样，CDR由框架区(framework region，FR)分开(参见例如Chothia等，1988)。在一些实施方案中，CDR3是负责识别经加工的抗原的主要CDR，尽管α链的CDR1也已显示出与抗原肽的N端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C端部分相互作用。认为CDR2识别MHC分子。在一些实施方案中，β-链的可变区可以包含另外的高变区(HV4)区。
在一些实施方案中，TCR链包含恒定结构域。例如，像免疫球蛋白一样，TCR链(例如，α链、β链)的细胞外部分可以包含两个免疫球蛋白结构域、N端的可变结构域(例如，Va或Vp；通常基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等，″Sequences of Proteins ofImmunological Interest，US Dept.Health and Human Services，Public HealthService National Institutes of Health，1991，第5版)和与细胞膜相邻的一个恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Ca，通常基于Kabat的氨基酸117至259，β链恒定结构域或Cp，通常基于Kabat的氨基酸117至259)。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分包含两个近膜端恒定结构域和两个包含CDR的远膜端可变结构域。TCR结构域的恒定结构域包含短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，在两条链之间形成连接。在一些实施方案中，TCR可以在α链和β链的每一个中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中包含两个二硫键。
在一些实施方案中，TCR链可以包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，TCR链包含细胞质尾。在一些情况下，该结构允许TCR与其他分子(如CD3)缔合。例如，包含具有跨膜区的恒定结构域的TCR可以将蛋白质锚定于细胞膜并与CD3信号传导装置或复合物的不变亚基缔合。
一般来说，CD3是可以具有在哺乳动物中的三条不同链(γ、δ和ε)和ζ链的多蛋白复合物。例如，在哺乳动物中，复合物可以包含CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链和CD3ζ链的同二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是包含单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区带负电荷，这是允许这些链与带正电荷的T细胞受体链缔合的特征。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的细胞内尾各自包含单个称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的保守基序，而每个CD3ζ链具有三个。一般来说，ITAM涉及TCR复合体的信号传导能力。这些辅助分子具有带负电荷的跨膜区并在将信号从TCR传送到细胞中发挥作用。CD3-和ζ-链与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合物。
在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体，或者其可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是包含例如通过一个或更多个二硫键连接的两条独立的链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体。在一些实施方案中，鉴定针对靶抗原(例如癌症抗原)的TCR并将其引入细胞中。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，例如通过公众可获得的TCR DNA序列的聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增。在一些实施方案中，TCR获自生物来源，例如来自细胞，例如来自T细胞(例如细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以获自体内分离的细胞。在一些实施方案中，可以从患者分离高亲和力的T细胞克隆，并分离TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，已经在用人免疫***基因(例如人白细胞抗原***或HLA)改造的转基因小鼠中产生了针对靶抗原的TCR克隆。参见例如肿瘤抗原(参见例如，Parkhurst等，2009和Cohen等，2005)。在一些实施方案中，噬菌体展示用于分离针对靶抗原的TCR(参见例如，Varela-Rohena等，2008和Li，2005)。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以从通过TCR序列的知识合成产生。
3.抗原呈递细胞
抗原呈递细胞，包括巨噬细胞、B淋巴细胞和树突细胞，通过其特定MHC分子的表达来区分。APC内化抗原并在其外细胞膜上重新表达该抗原的一部分以及MHC分子。主要组织相容性复合体(MHC)是具有多个基因座的大的遗传复合体。MHC基因座编码两个主要类别的MHC膜分子，称为I类和II类MHC。T辅助性淋巴细胞通常识别与MHC II类分子相关的抗原，而T细胞毒性淋巴细胞识别与MHC I类分子相关的抗原。在人中，MHC被称为HLA复合物，并且在小鼠中为H-2复合物。
在一些情况下，aAPC可用于制备一些实施方案的治疗组合物和细胞治疗产品。对于关于抗原呈递***的制备和使用的一般指导，参见例如，美国专利No.6,225,042、6,355,479、6,362,001和6,790,662；美国专利申请公开No.2009/0017000和2009/0004142；和国际公开No.WO2007/103009。
aAPC***可包含至少一种外源辅助分子。可使用辅助分子的任何合适的数量和组合。辅助分子可选自例如共刺激分子和黏附分子的辅助分子。一些示例性共刺激分子包括CD86、CD64(FcγRI)、41BB配体和IL-21。黏附分子可包括结合碳水化合物的糖蛋白例如选凝素、结合跨膜的糖蛋白例如整联蛋白、钙依赖性蛋白质例如钙黏着蛋白、和单次跨膜免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)超家族蛋白例如细胞间黏附分子(intercellular adhesionmolecule，ICAM)，黏附分子促进例如细胞与细胞或细胞与基质的接触。一些示例性黏附分子包括LFA-3和ICAM，例如ICAM-1。用于选择、克隆、制备和表达示例性辅助分子(包括共刺激分子和黏附分子)的技术、方法和试剂在例如美国专利No.6,225,042、6,355,479和6,362,001中举例说明。
IV.治疗方法
本文中还提供了用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括向个体施用有效量的抗原特异性T细胞治疗，例如VGLL1特异性T细胞治疗。本文中还提供了具有经遗传改造的TCR转导的T细胞(使TCR与其他生物反应性蛋白质(例如抗CD3)缀合)的过继性T细胞治疗。在另一些实施方案中，提供了用于治疗癌症的方法，其包括用经纯化的肿瘤抗原或免疫显性肿瘤抗原特异性肽对对象进行免疫接种。
考虑治疗的癌症的一些实例包括：肺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、***癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、***、胃肠癌、淋巴瘤、肺中肿瘤前病变、结肠癌、黑素瘤和膀胱癌。另外的示例性癌症包括但不限于：肺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、***癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、***、胃肠癌、淋巴瘤、肺中肿瘤前病变、结肠癌、黑素瘤和膀胱癌。另一些实例癌症包括：黑素瘤、恶性黑素瘤、结肠癌、淋巴瘤、肉瘤、胚细胞瘤、肾癌、胃肠肿瘤、神经胶质瘤、***肿瘤、膀胱癌、直肠肿瘤、胃癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、子宫癌、***、急性髓性白血病(acute myeloid leukaemia，AML)、急性淋巴性白血病(acute lymphoid leukaemia，ALL)、慢性髓性白血病(chronic myeloid leukaemia，CML)、慢性淋巴性白血病(chroniclymphocytic leukaemia，CLL)、白血病、肝细胞癌、多种病毒诱导的肿瘤(例如***状瘤病毒诱导的癌(例如***)、腺癌、疱疹病毒诱导的肿瘤(例如伯基特淋巴瘤(Burkitt’slymphoma)、EBV诱导的B细胞淋巴瘤)、乙型肝炎诱导的肿瘤(肝细胞癌)、HTLV-1和HTLV-2诱导的淋巴瘤)、听神经瘤、肺癌、小细胞肺癌、咽癌、***癌、胶质母细胞瘤、直肠癌、星形细胞瘤、脑肿瘤、视网膜母细胞瘤、基底细胞癌、脑转移瘤、髓母细胞瘤、***癌、胰腺癌、睾丸癌、霍奇金综合征(Hodgkin’s syndrome)、脑膜瘤、Schneeberger病、垂体肿瘤、蕈样真菌病(Mycosis fungoide)、类癌、神经鞘瘤、脊髓瘤、伯基特淋巴瘤、喉癌、肾癌、胸腺瘤、子宫体癌(corpus carcinoma)、骨癌、非霍奇金淋巴瘤、尿道癌、CUP综合征、头颈肿瘤、少突神经胶质瘤、外阴癌、肠癌、结肠癌、食管癌、疣参与(wart involvement)、小肠肿瘤、颅咽管瘤、卵巢癌、生殖器肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、肝转移癌、***癌、舌癌、胆囊癌、白血病、浆细胞瘤、睑肿瘤(lid tumor)和***癌。
在一些实施方案中，T细胞是自体的。然而，所述细胞可以是同种异体的。在一些实施方案中，从患者自身分离T细胞，使得细胞是自体的。如果T细胞是同种异体的，则可以从数个供体汇集T细胞。将细胞以足以控制、降低或消除所治疗的疾病的症状和体征的量施用于目标对象。
在一些实施方案中，对象可以在T细胞治疗之前施用非清髓性淋巴细胞耗竭化学治疗(nonmyeloablative lymphodepleting chemotherapy)。非清髓性淋巴细胞耗竭化学治疗可以是任何合适的这样的治疗：其可以通过任何合适的途径施用。非清髓性淋巴细胞耗竭化学治疗可以包括例如施用环磷酰胺和氟达拉滨，特别地如果癌症是黑素瘤，其可以是转移性的。施用环磷酰胺和氟达拉滨的一个示例性途径是静脉内。同样，可以施用任何合适剂量的环磷酰胺和氟达拉滨。在特定方面，施用约60mg/kg环磷酰胺持续2天，在此之后施用约25mg/m2氟达拉滨持续5天。
在某些实施方案中，促进自体T细胞生长和活化的T细胞生长因子与自体T细胞同时或在自体T细胞随后施用于对象。T细胞生长因子可以是促进自体T细胞生长和活化的任何合适的生长因子。合适的T细胞生长因子的一些实例包括白介素(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12，它们可以单独或以多种组合(例如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2、IL-7和IL-15，IL-12和IL-7，IL-12和IL-15，或IL-12和IL2)使用。IL-12是优选的T细胞生长因子。
T细胞可以静脉内、肌内、皮下、表面、经口、经皮、腹膜内、眼眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。T细胞治疗的合适剂量可基于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程、个体的临床状况、个体的临床病史和对治疗的反应以及主治医师的判断来确定。
对于离散的、实体的、可及的肿瘤特别考虑瘤内注射或注射到肿瘤脉管***中。局部、区域或全身施用也可以是合适的。对于＞4cm的肿瘤，待施用的体积将为约4至10ml(特别是10ml)，而对于＜4cm的肿瘤，将使用约1至3ml的体积(特别是3ml)。作为单次剂量递送的多次注射包含约0.1至约0.5ml体积。
A.药物组合物
本文中还提供了包含抗原特异性T细胞治疗和可药用载体的药物组合物和制剂。用于在对象中药用的疫苗组合物可包含本文中公开的肿瘤抗原肽(例如VGLL1)组合物和可药用载体。
本文中所述的药物组合物和制剂可以以经冻干的制剂或水性溶液的形式，通过将具有所需纯度的活性成分(例如抗体或多肽)与一种或更多种任选的可药用载体混合来制备(Remington′s Pharmaceutical Sciences第22版，2012)。可药用载体在所使用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚、丁基醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螫合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反荷离子，例如钠；金属配合物(例如Zn-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括形成空隙的(insterstitial)药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(Baxter International，Inc.)。某些示例性sHASEGP(包括rHuPH20)和使用的方法描述于美国专利公开No.2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面，sHASEGP与一种或更多种另外的糖胺聚糖酶(例如软骨素酶)组合。
B.组合治疗
在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法涉及抗原肽或抗原特异性T细胞群与至少一种另外的治疗组合。另外的治疗可以是放射治疗、手术(例如，肿块切除术和***切除术)、化学治疗、基因治疗、DNA治疗、病毒治疗、RNA治疗、免疫治疗、骨髓移植、纳米治疗、单克隆抗体治疗或前述的组合。另外的治疗可以是辅助或新辅助治疗的形式。
在一些实施方案中，另外的治疗是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，另外的治疗是施用副作用限制剂(例如旨在降低治疗副作用的发生和/或严重程度的药剂，例如抗恶心剂等)。在一些实施方案中，另外的治疗是放射治疗。在一些实施方案中，另外的治疗是手术。在一些实施方案中，另外的治疗是放射治疗和手术的组合。在一些实施方案中，另外的治疗是γ辐射。在一些实施方案中，另外的治疗是靶向PBK/AKT/mTOR途径、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、凋亡抑制剂和/或化学预防剂的治疗。另外的治疗可以是本领域中已知的一种或更多种化学治疗剂。
T细胞治疗可在相对于另外的癌症治疗(例如免疫检查点治疗)之前、期间、之后或以多种组合施用。施用可以以同时至间隔数分钟至数天至数周进行。在其中将T细胞治疗与另外的治疗剂分开提供给患者的实施方案中，通常将确保在每次递送的时间之间相当长的一段时间内不会失效，使得两种化合物仍然能够对患者发挥有利的组合效应。在这种情况下，考虑在彼此相隔约12小时至24小时或72小时内，并且更特别地，在彼此相隔约6小时至12小时内，可为患者提供抗体治疗和抗癌治疗。在一些情况下，可期望显著地延长治疗的时间周期，其中各自施用之间的间隔由数天(2、3、4、5、6或7)延长至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
可使用多种组合。对于以下的实例，抗原肽或抗原特异性T细胞治疗是“A”，并且抗癌治疗是“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
考虑到药剂的毒性(如果有的话)，向患者施用本发明实施方案的任何化合物或治疗将遵循用于施用这样的化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在可归因于组合治疗的监测毒性的步骤。
1.化学治疗
根据本发明实施方案可使用广泛多种的化学治疗剂。术语“化学治疗”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于意指在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物通过其在细胞内的活性模式(例如其是否影响细胞周期和在什么阶段影响细胞周期)进行分类。或者，可基于药剂直接交联DNA、嵌入到DNA中或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝***畸变的能力来表征药剂。
化学治疗剂的一些实例包括：烷化剂，例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯类，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱类(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；卡利抑素(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycin)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CBl-TMl)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustard)，例如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类(nitrosurea)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，例如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如，加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；二膦酸盐类(bisphosphonate)，例如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authrarnycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(例如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfimromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢物类，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨和氟尿苷；雄激素类，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺类，例如米托坦(mitotane)和曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；氨苯吖啶(amsacrine)；阿莫斯汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；埃博霉素类(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登素生物碱类(maytansinoid)，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物)；雷佐生(razoxane)；根毒素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌(triaziquone)；2，2’，2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(trichothecene)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛(docetaxel)；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位复合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂类；依托泊苷(VP-16)；异磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺安托(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊拜膦酸(ibandronate)；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨；卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素(plicomycin)、吉西他滨、诺维本、法呢基蛋白转移酶抑制剂、反铂；以及以上任一种的可药用盐、酸或衍生物。
2.放射治疗
导致DNA损伤并已广泛使用的其他因素包括通常被称为γ射线、X射线的那些和/或向肿瘤细胞定向递送放射性同位素。还考虑了其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束照射(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV辐照。最有可能所有这些因素对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持引起广泛的损害。X射线的剂量范围以50至200伦琴日剂量持续一段长时间(3至4周)至2000至6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、放射辐射的强度和类型以及赘生性细胞的摄取。
3.免疫治疗
技术人员将理解，另外的免疫治疗可与一些实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫治疗通常依赖于使用免疫效应细胞和分子以靶向并破坏癌细胞。利妥昔单抗就是这样的一个实例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物特异的抗体。抗体单独可充当治疗的效应物，或者其可募集其他细胞以实际影响细胞杀伤。抗体还可与药物或毒素(化学治疗性、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并且充当靶向剂。或者，效应物可以是直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用的携带表面分子的淋巴细胞。多种效应物细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
已经出现抗体-药物缀合物作为癌症治疗剂开发的突破性方法。癌症是世界上引起死亡的原因之一。抗体-药物缀合物(Antibody-drug conjugate，ADC)包含与杀伤细胞的药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。该方法将Mab针对其抗原靶标的高特异性与高效细胞毒性药物组合，产生将有效载荷(药物)递送至具有丰富水平抗原的肿瘤细胞的“武装”MAb。药物的靶向递送还使其在正常组织中的暴露最小化，导致毒性降低和治疗指数提高。FDA对两种ADC药物的批准(2011年(维汀-布仑妥昔单抗(brentuximab vedotin))和2013年(曲妥珠单抗美坦新(trastuzumab emtansine)或T-DM1))验证了该方法。目前存在超过30种ADC药物候选者处于癌症治疗临床试验的多个阶段(Leal等，2014)。随着抗体工程和接头-有效载荷优化变得越来越成熟，新ADC的发现和开发越来越依赖于适合于该方法和靶向Mab产生的新靶标的鉴定和验证。ADC靶标的两个标准是在肿瘤细胞中上调/高水平的表达和强大的内化。
在免疫治疗的一个方面，肿瘤细胞必须具有可进行靶向的一些标志物，即，不存在于大多数其他细胞上。存在许多肿瘤标志物，并且这些肿瘤标志物中的任一种可能适于本发明实施方案的上下文中的靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化的路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层黏连蛋白受体、erb B和p155。免疫治疗的一个替代方面是将抗癌作用与免疫刺激作用结合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，趋化因子例如MIP-1、MCP-1、IL-8和生长因子，例如FLT3配体。
目前正在研究或正在使用的免疫治疗的一些实例是免疫佐剂，例如，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等，1998)；细胞因子治疗，例如干扰素α、β和γ、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等，1998；Davidson等，1998；Hellstrand等，1998)；基因治疗，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；以及单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节昔脂GM2和抗p185(Hollander，2012；Hanibuchi等，1998；美国专利5,824,311)。考虑一种或更多种抗癌治疗可与本文中所述的抗体治疗一起使用。
在一些实施方案中，免疫治疗可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点调高信号(例如共刺激分子)或调低信号。可通过免疫检查点阻断被靶向的抑制性免疫检查点包括：腺苷A2A受体(A2A receptor，A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞衰减剂(B and Tlymphocyte attenuator，BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4，也称为CD152)、吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(killer-cellimmunoglobulin，KIR)、淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG3)、程序性死亡1(programmed death 1，PD-1)、T-细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3，TIM-3)和T细胞激活的V结构域Ig抑制剂(V-domain Ig suppressor of T cell activation，VISTA)。特别地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
免疫检查点抑制剂可以是药物，例如小分子、重组形式的配体或受体，或者特别是抗体，例如人抗体(例如国际专利公开WO2015016718；Pardoll，2012；二者均通过引用并入本文)。可使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知抑制剂，特别是可使用嵌合、人源化或人形式的抗体。如本领域技术人员将知晓的，替代和/或等同名称可用于本公开内容中提及的某些抗体。在本公开内容的上下文中，这样的替代和/或等同名称是可互换的。例如，已知，lambrolizumab也以替代和等同名称MK-3475和派姆单抗为人所知。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PDL1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PDL2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附蛋白、融合蛋白或寡肽。一些示例性抗体描述于美国专利No.US8735553、US8354509和US8008449中，所有均通过引用并入本文。用于本文中提供的方法的其他PD-1轴拮抗剂在本领域中是已知的，例如描述于美国专利申请No.US20140294898、US2014022021和US20110008369中，所有均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自纳武单抗、派姆单抗和CT-011。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫黏附蛋白(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的细胞外或PD-1结合部分的免疫黏附蛋白)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗，也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和是WO2006/121168中描述的抗PD-1抗体。派姆单抗，也称为MK-3475、Merck3475、lambrolizumab、阳SCH-900475，是WO2009/114335中描述的抗PD-1抗体。CT-011，也称为hBAT或hBAT-1，是WO2009/101611中描述的抗PD-1抗体。AMP-224，也称为B7-DCIg，是WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PDL2-Fc融合可溶性受体。
可以在本文中提供的方法中被靶向的另一种免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4在T细胞表面上发现并且当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时用作“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，其在辅助性T细胞的表面上表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28类似，并且这两种分子与抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也分别称为B7-1和B7-2)结合。CTLA4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。细胞内CTLA4也在调节性T细胞中发现并且可能对其功能很重要。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化导致CTLA-4(B7分子的抑制性受体)的表达提高。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附蛋白、融合蛋白或寡肽。
可以使用本领域中公知的方法来产生适用于本发明方法的抗人CTLA-4抗体(或由其衍生的VH和/或VL结构域)。或者，可以使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，在以下中公开的抗CTLA-4抗体可用于本文中公开的方法中：US 8,119,129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO 00/37504(CP675,206，也称为曲美目单抗；以前的ticilimumab)，美国专利No.6,207,156；Hurwitz等，1998；Camacho等，2004；和Mokyr等，1998。每个上述公开物的教导在此通过引用并入。也可以使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合CTLA-4的抗体。例如，国际专利申请No.WO2001014424、WO2000037504和美国专利No.US8017114中描述了人源化CTLA-4抗体；所有均通过引用并入本文。
示例性的抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和)或其抗原结合片段和变体(参见例如WO 01/14424)。在另一些实施方案中，抗体包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抗体包含伊匹单抗的VH区的CDRl、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体竞争与CTLA-4上的相同表位结合和/或结合至CTLA-4上的相同表位。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。
用于调节CTLA-4的其他分子包括例如美国专利No.US5844905、US5885796和国际专利申请No.WO1995001994和WO1998042752(所有均通过引用并入本文)中描述的CTLA-4配体和受体，以及例如美国专利No.US8329867(通过引用并入本文)中描述的免疫黏附蛋白。
4.手术
约60％患有癌症的人将经历某种类型的手术，其包括预防性、诊断性或分期、治愈性和缓解性手术。治愈性手术包括其中全部或一部分癌组织被物理去除、切除和/或破坏的切除术，并且可以与其他治疗(例如本发明实施方案的治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代治疗)结合使用。肿瘤切除术是指物理去除至少一部分肿瘤。除肿瘤切除术之外，通过手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和用显微镜控制的手术(莫氏手术(Mohs’surgery))。
在切除一部分或全部癌性细胞、组织或肿瘤之后，可以在体内形成腔。治疗可通过灌注、直接注射或向该区域局部施用另外的抗癌治疗来实现。这样的治疗可以重复，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可具有多种剂量。
5.另外的药剂
考虑可以将另外的药剂与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的治疗效力。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体与GAP连接的增量调节的药剂、细胞抑制剂和分化剂、细胞黏附抑制剂、提高过度增殖细胞对细胞凋亡诱导剂或其他生物药剂的敏感性的试剂。通过提高GAP连接数提高细胞间信号转导将会提高相邻过度增殖细胞群的抗过度增殖性作用。在另一些实施方案中，细胞抑制剂或分化剂可以与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的抗过度增殖效力。考虑细胞黏附抑制剂以提高本发明实施方案的效力。细胞黏附抑制剂的一些实例是黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑提高过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其他试剂(例如抗体c225)可以与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗效力。
V.制品或药盒
本文中还提供了包含抗原特异性T细胞或抗原肽(例如VGLL1肽)的制品或药盒。制品或药盒还可以包含包装插页，所述包装插页包含使用抗原特异性T细胞以在个体中治疗癌症或延迟癌症进展或增强患有癌症的个体的免疫功能的说明书。本文中所述的任一种抗原特异性T细胞可包含在制品或药盒中。合适的容器包括例如瓶、小瓶、袋和注射器。容器可以由多种材料例如玻璃、塑料(例如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(例如不锈钢或哈氏合金(hastelloy))形成。在一些实施方案中，容器容纳制剂，并且容器上或与容器相关的标签可指示使用指导。制品或药盒还可包含从商业和使用者立场来看期望的其他材料，包括另外的缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明的包装插页。在一些实施方案中，制品还包含一种或更多种另一种药剂(例如化学治疗剂和抗肿瘤剂)。对于一种或更多种药剂合适的容器包括例如瓶、小瓶、袋和注射器。
VI.实施例
包含以下实施例以示出本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，在随后实施例中公开的技术代表本发明人发现在本发明的实践中工作良好的技术，并因此可被认为构成用于实施本发明的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应理解，可对所公开的特定实施方案作出许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果而不背离本发明的精神和范围。
实施例1-肿瘤抗原特异性肽的鉴定和表征
获得胰腺患者来源的肿瘤类器官细胞系(hMIA-2d)(Cold Spring HarborLaboratories)以鉴定胰腺肿瘤中的HLA限制性肽。将HLA I类免疫沉淀，对肽进行酸洗脱并通过串联质谱分析。从肿瘤细胞系中检测到约1800种肽，并且这些中的10种肽可能是可靶向的(即在基本正常组织中表现出低的或不存在的表达)。来自胰腺癌患者MP015的顶部洗脱的肽是VGLL1(表1)，预测其结合多种HLA I类同种型(表2)。相同的肽也在来源于不同患者MP081的第二HLA-A*0101阳性胰腺类器官肿瘤细胞系中检测出(表1)。通过靶向质谱检测，比较天然肽的质谱与同位素标记的(即重赖氨酸，C15+N13)肽的质谱，验证了VGLL1肽的身份(图1A至1D)。
表1：在来自2名HLA-A*0101阳性患者的PDAC肿瘤类器官样品中通过MS检测到VGLL1衍生的肽。
表2：预测VGLL1衍生的肽结合多种HLA I类同种型。
使用RNA测序在正常组织和肿瘤细胞系中评价VGLL1基因的表达(图2A)。根据癌症基因组图谱，绝大多数正常组织实际上没有VGLL1的表达，而肿瘤细胞，特别是胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫癌、乳腺癌和***，具有升高的VGLL1表达。这些TGCA癌症中VGLL1过表达的患病率总结在图2B中。因此，VGLL1是肿瘤相关的共转录活化物，在正常组织中具有有限的表达。
合成临床级肽和肽HLA-A*0101四聚体并将其用于产生VGLL1特异性CTL(图4A)。通过VGLL1肽脉冲的用IL-21处理的树突细胞刺激自体患者PBMC产生VGLL1特异性CD8+ T细胞。使用基于四聚体的分选对CD8+ T细胞进行分选并通过迅速扩增方案(REP)使其扩增以产生约105亿个T细胞，其中91.7％的T细胞是CD8和四聚体阳性的(图4B)。
为了确定VGLL1特异性CD8+ T细胞识别和杀伤表达VGLL1的细胞的能力，使用HLA-A*0101阳性胰腺肿瘤细胞系进行标准51Cr释放测定。通过51Cr释放测定，VGLL1扩增的T细胞显示对患者肿瘤细胞系hMIA-2D约70％的杀伤和对一种另外的HLA-A1+胰腺细胞系Capan-1的稍微较低的杀伤(图5)。这表明VGLL1特异性CD8+ T细胞可识别由胰腺细胞内源性加工的VGLL1表位。作为对照，使用对VGLL1表达呈阴性的HLA-A*0101阳性黑素瘤细胞(A375)。
此外，用VGLL1特异性CTL培养其他癌细胞类型，并通过铬释放测定测量细胞毒性。观察到VGLL1特异性CTL能够识别和杀伤多种HLA-A*0101阳性肿瘤细胞类型，包括乳腺、卵巢和***细胞系(图6)。一种HLA-A*0101阴性胃细胞系未被VGLLl特异性T细胞识别，但在转导以表达HLA-A*0101之后，所述细胞系被识别且杀伤。这表明胃癌细胞也表达VGLLl，并且通过用干扰素-γ预先治疗可以进一步增强CTL特异性杀伤(图7)。
在进一步的T细胞扩增(图4B)之后，对胰腺癌患者MP015输注与抗PDl抗体派姆单抗(每三周)以及低剂量皮下IL-2(每12小时250,000U/m2)组合的198亿个扩增的VGLLl特异性T细胞(图4C)。由于VGLL1抗原丢失没有观察到临床应答(图4D)，并且患者经历很少或没有治疗相关的毒性。重要的是，未观察到细胞输注相关的不良事件。
其中超过95％四聚体对靶抗原呈阳性的分选的T细胞产物的T细胞受体分析显示TCR序列的99％受限于21种克隆型，其中显性克隆占所有序列的43％。外周血样品的HTTCS追踪显示了PBMC中总T细胞的1.7％的累积频率(代表所有21种克隆型)，其中显性克隆型包含总T细胞的多于1％。一个月之后，转移的抗原特异性T细胞在外周以非常低但可检测的水平(.03％)存在；然而，其在胸腔积液活检中积累(0.37％)。未检测到渗入肺肿瘤组织。
总之，这些结果表明可以从患者肿瘤样品中鉴定有关的肿瘤相关抗原表位，并且其具有足够的免疫原性以从患者外周血中引发自体胰腺肿瘤反应性抗原特异性T细胞。用于过继性转移的这样的T细胞的分离和扩增是可行的，并且转移的T细胞在外周血中获得相对高的频率，在超过一个月之后以高频率检测其的胸腔积液中明显富集。因此，鉴定的抗原特异性肽(例如VGLL1)可以用于产生在实体癌(例如胰腺癌和其他癌症类型)的治疗中用于过继性T细胞转移的抗原特异性T细胞。
此外，使用癌症基因组图谱数据库进行分析以基于VGLL1转录物表达关联胰腺癌患者的存活率(图3)以及其他癌症。观察到总体存活率与VGLL1表达显著相关，具有最高VGLL1表达(最高四分位数)的患者具有最差的总体存活率。相反，具有最低VGLL1表达(底部四分位数)的患者显示出最长的总体存活。因此，VGLL1是肿瘤标志物，其可用作癌症患者，特别是胰腺癌患者的预后标志物。
实施例2-材料和方法
细胞系：使hMIA-2d细胞维持在含有4mM L-谷氨酰胺、1mM非必需氨基酸、10mM丙酮酸钠和50U/ml青霉素、50mg/ml链霉素和10％FBS(TCB)的RPMI 1640中。使用LCL作为饲养细胞并且用包含10％FBS、50U/ml青霉素和50mg/ml链霉素的RPMI 1640培养。用于T细胞培养的CTL培养基包含10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、50U/ml青霉素和50mg/ml链霉素。
将MP015患者来源的肿瘤细胞(hMIA-2d)扩增至约10E8个细胞(10×10cm汇合板)，然后使用Triton X-100裂解。将细胞裂解物与每10mg蛋白质1μg HLA-A、HLA-B、HLA-C特异性mAb W6/32一起在4℃孵育过夜，同时轻轻搅拌。使用蛋白A/G Ultralink树脂珠免疫沉淀HLA分子，然后使用0.1N乙酸在5个连续的1mL洗脱液中将其与肿瘤相关肽一起直接洗脱。通过Western印迹分析证实HLA的纯化，并且汇集HLA阳性洗脱物并通过串联质谱(MS/MS)进行分析。
质谱：对于发现相串联质谱(MS/MS)，将洗脱的MHC I类结合肽注射到高灵敏度HPLC***(Dionex 3000RSLC)上，通过在1.8微米C18(Agilent Technologies)上在0.1％甲酸水-乙腈中进行反相色谱进行分离，并使用数据依赖性采集在Orbitrap Elite质谱仪(Thermo Scientific)上进行分析。Mascot算法使用10ppm亲本质量容差、0.8d片段离子容差、Met氧化、无酶选择性针对SwissProt完全人蛋白质数据库对获取的MS/MS谱进行搜索。搜索结果与使用NetMHC 3-4的合适MHC结合特异性相互参考。在发现相MS/MS中检测到大约1800个肽，所有肽对应于与人蛋白质组内的蛋白质匹配的野生型序列。
基于发现MS/MS，全外显子组测序和考虑了正常组织(GTex RNAseq数据库)、人胰腺肿瘤(TCGA RNAseq数据库)中的靶基因表达的生物信息学分析，以及患者自身的RNAseq分析的结果，合成了11种同位素标记的高可信度的目的肽(8种突变的和3种非突变的)，并将其用作更灵敏的靶向MS/MS分析中的标准品。在该分析中，通过合成肽的MS分析预先确定目的合成肽标准物的保留时间窗，然后使用每个m/z周围3Da的质量窗构建用于搜索肿瘤相关肽的靶向方法。靶向MS/MS实验验证了所有3种非突变肽的存在，但未发现任何预测的突变肽的MS证据。
VGLL1特异性CD8T细胞的产生和扩增：用先前描述的方式(Li，2005)产生肿瘤抗原特异性CTL。通过用肿瘤抗原肽脉冲的自体DC刺激对HLA-A*0101呈阳性的白细胞去除术(leukapheresis)PBMC。对于诱导树突细胞，将黏附PBMC与GM-CSF和IL-4一起在AIM-V培养基(Invitrogen Life Technologies)中培养6天并且随后添加IL1b、IL-6、TNF-α和PGE2用于成熟。1天之后，将成熟DC在室温下在3ug/ml β-微球蛋白的存在下以2×106个细胞/ml1％人血清白蛋白(HAS)/PBS用40ug/ml肽脉冲4小时。在用1％HSA/PBS洗涤之后，将DC以1.5×106个细胞/ml/孔与PBMC在48孔板中混合。初始和在培养之后3至4天添加IL-21(30ng/ml)。在第二次刺激之后1天添加IL-2和IL-7以扩增活化的抗原特异性T细胞。
在第二次刺激之后6天，用VGLL1肽/MHC-PE缀合四聚体和CD8-APC抗体对细胞进行染色，并随后通过OWL分选来分选CD8和四聚体阳性细胞。通过迅速扩增方案(REP)利用饲养细胞PBL和LCL在IL-21下扩增分选的VGLL1特异性CD8T细胞。
肽-MHC四聚体染色：通过用VGLL1肽/HLA A*0101的四聚体染色证实VGLL1特异性CD8T细胞。将CD8T细胞与PE缀合的四聚体一起孵育20分钟，洗涤并随后在室温下用APC缀合的CD8抗体染色15分钟。在洗涤之后，通过流式细胞术(LSRFortessa X-20分析仪)分析细胞。
51铬释放测定：使用标准51铬(51Cr)释放测定来测定VGLL1特异性CD8T细胞对表达或不表达VGLL1的靶标的特异性裂解(specific lysis)。用100uCi的51Cr标记靶标2小时并且在洗涤3次之后，将经标记的靶标以每孔2000个靶标平板接种一式三份的孔。将效应细胞与靶标以多种效应物∶靶标(E∶T)比例一起孵育。4小时之后，从每孔中收集30ul的上清液并通过γ计数器测量51Cr。计算特异性裂解的百分比。
RNAseq分析：使用具有Ribo-Zero Gold的Illumina TruSeq标准总RNA试剂盒由Avera Institute for Human Genetics对肿瘤样品进行全转录组Seq(RNA-Seq)。每个肿瘤RNA样品使用约2亿个配对末端读数。使用ISIS v2.4.60解复用(demultiplexing)并转化为FASTQ格式来对BCL(Illumina HigSeq的原始输出)文件进行处理。使用适用于特定运行的参数(例如，对于51个碱基的测序运行，3个错配中有2个在前40个种子区域中)使用BWA将FASTQ文件和序列读数与基因组(Hg19)比对。然后，在任何下游分析之前，使用Picard和GATK程序对经比对的BAM文件进行标记重复、重新比对和重新校准。使用TopHat、TopHat-Fusion和Cufflinks算法处理RNASeq数据。
统计分析：使用GraphPad prism 6.0e版本进行数据分析。使用参数检验(Anova或非配对t检验)分析正态分布的数据。如果p值＜0.05，则统计学检验差异被认为是显著的。
***
根据本公开内容，本文中公开且要求保护的所有方法均可在没有过度实验的情况下做出和执行。虽然本发明的组合物和方法已根据一些优选实施方案进行描述，但是对于本领域技术人员来说将明显的是，在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下可对本文中所述方法以及本文所述方法的步骤或步骤顺序作出改变。更具体地，将明显的是，在化学和生理两方面都相关的某些试剂可替代本文中所述的试剂而实现相同或类似的结果。对本领域技术人员而言明显的所有这样的类似替代和修改被认为在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念之内。
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<400> 1
Leu Ser Glu Leu Glu Thr Pro Gly Lys Tyr
1 5 10

Claims (50)

1.长度为35个氨基酸或更少的分离的VGLL1肽，其包含与SEQ ID NO：1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述肽能够诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
2.权利要求1所述的肽，其中所述肽包含与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
3.权利要求1所述的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
4.权利要求1或权利要求2所述的肽，其中所述肽与人I类HLA蛋白结合。
5.权利要求4所述的肽，其中所述人1类HLA蛋白来自HLA-A1家族、HLA-A29家族、HLA-A30家族、HLA-B18家族或HLA-B44家族。
6.权利要求4所述的肽，其中所述人1类HLA蛋白来自HLA-A1家族。
7.权利要求4所述的肽，其中所述人I类HLA蛋白是HLA-A*0101、HLA-A*0102、HLA-A*0103、HLA-A*2902、HLA-A*3002、HLA-B*1801或HLA-B*4403。
8.权利要求4所述的肽，其中所述人I类HLA蛋白是HLA-A*0101。
9.权利要求1至5中任一项所述的肽，其中所述肽的长度为30个氨基酸或更少。
10.权利要求1至5中任一项所述的肽，其中所述肽的长度为25个氨基酸或更少。
11.权利要求1至5中任一项所述的肽，其中所述肽的长度为20个氨基酸或更少。
12.权利要求1至5中任一项所述的肽，其中所述肽的长度为15个氨基酸或更少。
13.权利要求1所述的肽，其中所述肽由SEQ ID NO：1组成，并且其中所述肽选择性地结合HLA-A*0101。
14.药物组合物，其包含权利要求1至13中任一项所述的分离的肽和药物载体。
15.权利要求14所述的组合物，其中所述药物组合物配制成用于肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、吸入或皮下注射。
16.权利要求14所述的组合物，其中所述肽包含在脂质体、含脂质的纳米粒中，或基于脂质的载体中。
17.权利要求14所述的组合物，其中药物制剂配制成用于注射或作为鼻喷雾剂吸入。
18.分离的核酸，其编码权利要求1至13中任一项所述的VGLLl肽。
19.载体，其包含由权利要求18所述的核酸组成的连续序列。
20.在对象中促进免疫应答的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求1至13中任一项所述的肽，其中所述肽在所述对象中诱导VGLL1特异性T细胞。
21.权利要求20所述的方法，其中所述对象被诊断为患有癌症。
22.权利要求21所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、卵巢癌、胃癌或乳腺癌。
23.权利要求20所述的方法，其中所述对象是人。
24.权利要求20所述的方法，其还包括施用至少第二种抗癌治疗。
25.权利要求24所述的方法，其中所述第二种抗癌治疗选自化学治疗、放射治疗、免疫治疗或手术。
26.权利要求25所述的方法，其中所述免疫治疗是免疫检查点抑制剂。
27.权利要求26所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是抗PDl单克隆抗体。
28.产生VGLLl特异性T细胞的方法，其包括：
(a)获得起始T细胞群；以及
(b)使所述起始T细胞群与权利要求1至13中任一项所述的VGLLl肽接触，从而产生VGLLl特异性T细胞。
29.权利要求28所述的方法，其中接触进一步限定为将所述起始T细胞群与抗原呈递细胞(APC)共培养，其中所述APC在其表面上呈递权利要求1所述的VGLL1肽。
30.权利要求29所述的方法，其中所述APC是树突细胞。
31.权利要求28所述的方法，其中所述起始T细胞群是CD8+T细胞。
32.权利要求28所述的方法，其中所述T细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
33.权利要求28所述的方法，其中获得包括从外周血单核细胞(PBMC)分离所述起始T细胞群。
34.药物组合物，其包含根据权利要求28至33中任一项产生的所述VGLL1特异性T细胞。
35.在对象中治疗癌症的方法，其包括向所述对象施用有效量的根据权利要求28至33中任一项产生的所述VGLL1特异性T细胞。
36.权利要求35所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、卵巢癌、胃癌或乳腺癌。
37.权利要求35所述的方法，其中所述对象是人。
38.权利要求35所述的方法，其中所述VGLL1特异性T细胞是自体的。
39.权利要求35所述的方法，其还包括在施用所述VGLL1特异性T细胞之前进行所述对象的淋巴细胞耗竭。
40.权利要求39所述的方法，其中淋巴细胞耗竭包括施用环磷酰胺和/或氟达拉滨。
41.权利要求35所述的方法，其还包括施用至少第二种治疗剂。
42.权利要求41所述的方法，其中所述至少第二种治疗剂包括化学治疗、免疫治疗、手术、放射治疗或生物治疗。
43.权利要求42所述的方法，其中所述免疫治疗是免疫检查点抑制剂。
44.权利要求43所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是抗PD1单克隆抗体。
45.权利要求41所述的方法，其中所述VGLL1特异性T细胞和/或所述至少第二种治疗剂静脉内、腹膜内、气管内、瘤内、肌内、内镜、病灶内、经皮、皮下、区域性施用，或通过直接注射或灌注施用。
46.权利要求35所述的方法，其中确定所述对象具有表达VGLL1的癌细胞。
47.包含有效量的权利要求34所述的VGLL1特异性T细胞的组合物，其用于在对象中治疗癌症。
48.权利要求47所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、卵巢癌、胃癌或乳腺癌。
49.权利要求47所述的方法，其中所述对象是人。
50.权利要求47所述的方法，其中所述VGLL1特异性T细胞是自体的。
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