CN110343761B - ***癌的标志物组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种***癌的标志物组，以及该标志物组在制备用于***癌诊断的试剂或试剂盒中的应用。本发明还提供了一种用于检测基因mRNA标志物组的试剂组合；一种基因mRNA标志物组的检测方法；一种***癌分型***。本发明利用特定基因的mRNA标志物，实现了***癌的筛查、受试者发生***癌的风险评估、***癌的分型和/或预后预测，提高了诊断和检测的灵敏度、特异性和准确性，避免了过度治疗和***穿刺活检。

Description

***癌的标志物组及其应用
技术领域
本发明属于生物医学领域。具体地，本发明涉及***癌的标志物组及其应用。
背景技术
在世界范围内，***癌发病率位居男性恶性肿瘤第2位。近30年来***癌发病率在大部分国家都有明显的升高，目前***癌在美国的发病率已经超过肺癌，在危害男性健康的肿瘤中排第一。我国***癌发病率较低，但近年来呈显著上升趋势。自2008年起，***癌已成为泌尿***发病率最高的恶性肿瘤。国内***癌发病率城乡差异较大，特别是大城市的发病率更高。2017年中国***癌确诊患者是122万，近五年的复合增长率在12％左右。***癌早期不易被发现，约65％～75％的***癌患者在确诊时病情已发展至晚期。早期***癌患者进行根治手术或者放疗，5年的总生存率可以接近100％；而一旦到了晚期，5年的生存率只有28％。
***特异抗原PSA是由***上皮细胞产生的类丝氨酸蛋白酶的激肽释放酶。目前，血清PSA指标筛查是***癌检测的最常用的方法。与经直肠指检和经直肠超声发现可疑病灶相比，作为独立变量的PSA是较好的预测因子。实际上，没有公认的PSA水平的上限。PSA是一个连续参数，数值越高，***癌的可能性越大。但是尽管血清中PSA的水平较低，男性仍有隐匿性***癌的可能。
尽管PSA被认为是医学界较好的***癌标志物，但是由于以下原因PSA被认为是不完美的标志物：PSA具有器官特异性，但是不具有癌症特异性，高假阳性率和低特异性导致大量不必要的***活检和心理问题。因为***癌的特征是高度异质性的病程，部分患者会发展成具有扩散和转移的致命性癌症，需要积极治疗，而另一些患者的***癌是非转移性、进展缓慢，可以通过主动监测进行监控。而tPSA不能区别是原位性癌症还是进展性癌症。因此，通过液体活检，来找出预测***癌病理分型的标志物是目前临床上需要解决的问题。找出低危原位性的***癌患者，从而避免过度治疗和***穿刺活检。
迄今为止，已有多项关于验证***癌患者外周血中游离的核酸水平的研究。这些研究大部分集中在寻找循环核酸，来区分***癌和良性***增生患者或健康对照。然而，许多游离核酸在一些研究中表现出相互矛盾的结果。因此，游离核酸的分析被认为是一种不可重复的方法。近来，已经发现在外周血中含有细胞外囊泡，最近研究认为，细胞外囊泡富含的核酸是来源于细胞，包含罕见但高度特异性的核酸生物标记，而且细胞外囊泡还能保护其中的核酸免受血液中核酸酶的降解，因此，细胞外囊泡中的核酸的分析会优于外周血中游离核酸的分析。
细胞外囊泡中最重要的一种囊泡叫做外泌体。外泌体(Exosome)是一类直径30-150nm，具有完整膜结构的细胞外囊泡，主要负责细胞间的物质运输和信息传递。外泌体在1983年被发现，1987年正式被定名为exosome，最早被认为是细胞的废弃物。后来的研究表明，外泌体中包裹有细胞特异的核酸、蛋白与脂类，并能作为信号分子向其他细胞传递信息。更进一步的研究发现，外泌体在很多生理病理过程中扮演着重要的角色，如免疫中的抗原呈递，肿瘤的生长与迁移等。所有细胞都会分泌外泌体，但是肿瘤细胞会分泌出比正常细胞数量更多的外泌体。因此，血液外泌体可以一定程度上表征肿瘤的发展情况。
发明内容
本发明人通过大量研究发现，利用特定基因的mRNA表达水平，可以进行***癌诊断，包括***癌的筛查、受试者发生***癌的风险评估、***癌的分型和/或预后预测。
因此，本发明的目的之一在于提供***癌的标志物组，所述标志物组包括基因RELA、NDUFB4、EHD3、PFKL和RAN的mRNA。另外，本发明的目的之一在于提供上述标志物组的应用。
根据一个具体实施方案，基因RELA选自其1、2、3、4、5、7、8、9、10或11号外显子，更优选选自其1、2、3、9、10或11号外显子，特别优选其1号外显子。根据一个具体实施方案，基因NDUFB4选自其1、2或3号外显子，特别优选其3号外显子。根据一个具体实施方案，基因EHD3选自其1、2、3、4、5或6号外显子，特别优选其6号外显子。根据一个具体实施方案，基因PFKL选自其1、2、3、4、7、12、17、20、21或22号外显子，更优选选自其1、2、3、20、21或22号外显子，特别优选其1号外显子。根据一个具体实施方案，基因RAN选自其1、2、3、4、5、6、7或8号外显子，特别优选其8号外显子。
另一方面，本发明提供如上所述的标志物组在制备用于***癌诊断的试剂或试剂盒中的应用。
根据一个具体实施方案，上述***癌诊断包括***癌的筛查、受试者发生***癌的风险评估、***癌的分型和/或预后预测。
另一方面，本发明提供一种用于检测基因mRNA标志物组的试剂组合，所述标志物组包括基因RELA、NDUFB4、EHD3、PFKL和RAN的mRNA。
根据一个具体实施方案，上述试剂包括引物对1～5，其中，引物对1用于检测RELA的mRNA表达水平，引物对2用于检测NDUFB4的mRNA表达水平，引物对3用于检测EHD3的mRNA表达水平，引物对4用于检测PFKL的mRNA表达水平，引物对5用于检测RAN的mRNA表达水平。
根据一个具体实施方案，引物对由上游引物和下游引物组成。
根据一个具体实施方案，引物对1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，引物对2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，引物对3的核苷酸序列如SEQID NO：5和SEQ ID NO：6所示，引物对4的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，引物对5的核苷酸序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。
根据一个具体实施方案，试剂组合还包括探针、DNA聚合酶、PCR缓冲液、阴性对照品和阳性对照品中的一种或多种。
根据一个具体实施方案，试剂组合是用于***癌的筛查、受试者发生***癌的风险评估、***癌的分型和/或预后预测的试剂盒。
另一方面，本发明提供一种基因mRNA标志物组的检测方法，包括：利用上述试剂组合，获得基因mRNA表达水平，所述基因包括RELA、NDUFB4、EHD3、PFKL和RAN。
根据一个具体实施方案，上述检测方法包括：
1)提取血清中的总外泌体；
2)提取外泌体中全部的核糖核酸；
3)将核糖核酸转化成cDNA；
4)将cDNA加入到包含上述试剂组合的荧光PCR反应液中，进行PCR检测，获得基因mRNA水平。
根据一个具体实施方案，所述荧光PCR反应液还包含探针。
另一方面，本发明提供一种***癌分型的方法，包括：
1)利用上述试剂组合进行PCR检测，获得基因mRNA的Ct值；
2)获得内参基因的Ct值；
3)将基因mRNA的Ct值与内参基因的Ct值的差值△Ct带入分析模型中，获得SUMΔCt的值，
其中，所述分析模型为：SUMΔCt＝(m1)×RELAΔCt+(m2)×NDUFB4ΔCt+(m3)×EHD3ΔCt－(m4)×PFKLΔCt－(m5)×RANΔCt，
其中，m1为0.1～1.0，m2为0.1～0.5，m3为2.2～5.6，m4为1.2～3.0，m5为0.7～4.0；
4)根据SUMΔCt的值，得到***癌分型，
其中，当SUMΔCt的值为1.6～2.4时，为***癌阴性；当SUMΔCt的值为-0.6～1.6时，为低危原位性***癌；当SUMΔCt的值小于-0.6时，为疑似高危进展性***癌。
根据一个具体实施方案，上述***癌分型的方法还包括：提取血清中的总外泌体；提取外泌体中全部的核糖核酸；将核糖核酸转化成cDNA。
另一方面，本发明提供一种***癌分型***，包括信息获取模块、计算模块和诊断模块，
其中，信息获取模块用于执行获取受试者检测信息的操作，所述检测信息包括上述标志物组的Ct值和内参基因的Ct值；
计算模块用于执行将标志物组的Ct值与内参基因的Ct值的差值ΔCt代入分析模型，计算SUMΔCt值的操作，分析模型为：SUMΔCt＝(m1)×RELAΔCt+(m2)×NDUFB4ΔCt+(m3)×EHD3ΔCt－(m4)×PFKLΔCt－(m5)×RANΔCt，m1为0.1～1.0，m2为0.1～0.5，m3为2.2～5.6，m4为1.2～3.0，m5为0.7～4.0；
诊断模块用于执行根据SUMΔCt值判断受试者健康状况的操作，其中，如果受试者的SUMΔCt值为1.6～2.4，则判断为***癌阴性；如果受试者的SUMΔCt值为-0.6～1.6，则判断为低危原位性***癌；如果受试者的SUMΔCt值小于-0.6，则判断为疑似高危进展性***癌。
根据一个具体实施方案，m1优选为0.3～0.7，更优选0.4～0.6。
根据一个具体实施方案，m2优选为0.2～0.4。
根据一个具体实施方案，m3优选为2.5～5.3，更优选2.9～4.9，更优选3.5～4.3。
根据一个具体实施方案，m4优选为1.5～2.7，更优选1.8～2.4。
根据一个具体实施方案，m5优选为1.2～3.6，更优选1.6～3.2，更优选2.0～2.8。
根据一个具体实施方案，分析模型为：SUMΔCt＝0.1×RELAΔCt+0.1×NDUFB4ΔCt+2.2×EHD3ΔCt－1.2×PFKLΔCt－0.7×RANΔCt。
根据一个具体实施方案，分析模型为：SUMΔCt＝1×RELAΔCt+0.5×NDUFB4ΔCt+5.6×EHD3ΔCt－3×PFKLΔCt－4×RANΔCt。
根据一个优选的具体实施方案，分析模型为：SUMΔCt＝0.55×RELAΔCt+0.3×NDUFB4ΔCt+3.9×EHD3ΔCt－2.1×PFKLΔCt－2.4×RANΔCt。
根据一个具体实施方案，上述mRNA是外泌体源性mRNA。
本发明利用特定基因的mRNA标志物，实现了***癌的筛查、受试者发生***癌的风险评估、***癌的分型和/或预后预测，提高了诊断和检测的灵敏度、特异性和准确性，避免了过度治疗和***穿刺活检。
本发明的试剂组合和方法具有如下优点：操作简便、节省诊断/检测时间、结果清晰可靠。本发明的试剂组合适用性强，可广泛适用于科研实验以及临床检测，且可用于单样品或多样品，检测结果快速准确。
此外，本发明人所设计的引物特异性强，提高了扩增效果以及检测效率，获得的检测结果具有高可信度。
附图说明
图1为荧光定量PCR反应程序设置。
图2为RELA基因的1、2、3、4、5、7、8、9、10和11号外显子的ΔCt值。
图3为NDUFB4基因的1、2和3号外显子的ΔCt值。
图4为EHD3基因的1、2、3、4、5和6号外显子的ΔCt值。
图5为PFKL基因的1、2、3、4、7、12、17、20、21和22号外显子的ΔCt值。
图6为RAN基因的1、2、3、4、5、6、7和8号外显子的ΔCt值。
图7为1号外显子组和混合外显子组的ROC曲线，其中，横坐标为特异性，纵坐标为灵敏度。
图8为系数最小模型、系数中位数模型和系数最大模型的ROC曲线图，其中横坐标为特异性，纵坐标为灵敏度。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本说明书中所述“标志物”是指具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。
本说明书中所述“血液样本”是指从受试者的血液获得的样本，具体包括血清和/或血浆样本。
本说明书中所述“Ct值”是指PCR反应过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，其中C代表Cycle，t代表threshold。
本发明中涉及的基因的详细信息如下：
RELA，基因全名RELA proto-oncogene,NF-kB subunit，共11个外显子；
NDUFB4，基因全名NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit B4，共3个外显子；
EHD3，基因全名EH domain containing 1，共6个外显子；
PFKL，基因全名phosphofructokinase,liver type，共22个外显子；
RAN，基因全名RAN,member RAS oncogene family，共8个外显子。
实施例1
1.样本收集
收集130例疑似***癌患者的血液样本。
2.样本处理
对收集的120例样本进行如下处理：用外泌体提取试剂盒(QIAGEN公司：exoEasyMaxi Kit)，将样本血清中的总外泌体提取出来。随后将提取的外泌体，利用核糖核酸抽提试剂盒(QIAGEN公司：miRNeasy Micro Kit)，将外泌体中全部的核糖核酸进行提取。提取后的核糖核酸，用反转录试剂盒(Takara公司：PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA SynthesisKit)，将核糖核酸转化成cDNA。随后将cDNA加入到包含引物和探针的荧光PCR反应液中。将混合好的反应液放入荧光PCR仪器(Thermofisher公司：AB7500荧光PCR仪)，设置反应程序如图1，进行荧光定量PCR反应。反应完成后，读取每个反应孔的Ct值。
3.数据分析
对由上述步骤获得的实验数据进行数据整理、分析和建模，获得一种用于***癌诊断的分析模型，模型中包含5个基因。具体模型为：SUMΔCt＝(m1)×RELAΔCt+(m2)×NDUFB4ΔCt+(m3)×EHD3ΔCt－(m4)×PFKLΔCt－(m5)×RANΔCt，其中，m1为0.1～1.0，m2为0.1～0.5，m3为2.2～5.6，m4为1.2～3.0，m5为0.7～4.0。
具体地，通过荧光PCR测定得到每个基因的Ct值及spike-in的Ct值(spike-in是人源合成的一段RNA序列，起到内参基因的作用)，从而得到每个基因的ΔCt值(即，基因的Ct减去spike-in的Ct值)。通过数据分析统计，获得各个基因的ΔCt值对应的系数，从而整合成上述分析模型。并根据该分析模型区分阴性***癌、低危非进展性***癌和高危进展性***癌。
***癌分型标准如表1所示：
表1.
Figure BDA0002087542940000071
4.评价
根据样本的临床诊断结论，统计得到图8所示的受试者工作特征曲线(receiveroperator characteristic curve,ROC曲线)。由图8可知，本发明的标志物组对***癌诊断(包括***癌的筛查、受试者发生***癌的风险评估、***癌的分型和/或预后预测)具有良好的指示作用。
实施例2
鉴于外泌体中的核糖核酸存在片段化与异质性，同一个基因中不同外显子的含量可能不尽相同。为了获得更优的分析模型，本发明人评估了基因不同外显子的表达情况，以及不同外显子对分析模型的影响，对不同外显子进行了优化和选择。
评估模型中同一基因不同外显子的ΔCt值稳定性：
针对每个基因外显子设计引物：其中RELA覆盖1、2、3、4、5、7、8、9、10和11号外显子；NDUFB4覆盖1、2和3号外显子；EHD3覆盖1、2、3、4、5和6号外显子；PFKL覆盖1、2、3、4、7、12、17、20、21和22号外显子；RAN覆盖1、2、3、4、5、6、7和8号外显子。
随机选用10例血清样本，在荧光PCR仪器上检测上述5个基因在外泌体中的Ct值及spike-in的Ct值。具体检测方法参见实施例1。结果见图2～图6。
由图2～图6可以看出，每个基因两端的外显子的ΔCt值上明显小于中间的外显子。当外显子靠近两端时，检测样本之间的ΔCt值差异更小，当外显子靠近中间，检测样本之间的ΔCt值差异更显著，每个基因不同外显子ΔCt值统计结果如图2至图6所示。因此，优选每个基因的前三个外显子和最后三个外显子作为模型中检测的具体片段。
基于以上实验结果，确定以下外显子为优选外显示子：RELA基因序列的1～3号和9～11号外显子；NDUFB4基因序列的1～3号外显子；EHD3基因序列的1～6号外显子；PFKL基因序列的1～3号和20～22号外显子；RAN基因序列的1～8号外显子。
实施例3
为了进一步优化分析模型，本发明人进行了以下研究实验，比较了在同一个系数下(分析模型中取每个基因的最小系数)，选择ΔCt值相对较小的基因外显子(每个基因都选择1号外显子，称为1号外显子组)与选择ΔCt值相对较大的基因外显子在诊断/检测上的差异。
其中，对于ΔCt值相对大的基因外显子(称为混合外显子组)，RELA基因用7号外显子，NDUFB4基因用2号外显子，EHD3基因用4号外显子，PFKL基因用12号外显子，RAN基因用5号外显子。
随机选用30例入组样本，在荧光PCR仪器上检测1号外显子组和混合外显子组中的5个基因的Ct值及spike-in的Ct值，获得5个基因的ΔCt值，具体检测方法参见实施例1。将ΔCt值带入分析模型，获得各入组样本的SUM△Ct(参见表2)。
根据入组样本的临床诊断结论，统计获得同一系数模型中，1号外显子组和混合外显子组的ROC曲线(如图7所示)。由图7可以看出，当采用1号外显子组时，分析模型的有效性明显提高，其AUC高于混合外显子组，并且灵敏性和特异性都有显著升高。
上述结果表明，选择ΔCt值更小的基因外显子(1号外显子组)作为分析模型中检测的片段效果更好。
表2. 30例样本信息
Figure BDA0002087542940000081
Figure BDA0002087542940000091
实施例4
为了获得更加理想的模型分析结果，比较了不同基因系数对分析模型有效性的影响，以对基因系数进行优化。
选择分析模型中每个基因Ct值相对小的外显子作为检测片段，通过荧光定量PCR检测其Ct值：RELA基因用1号外显子、NDUFB4基因用3号外显子、EHD3基因用6号外显子、PFKL基因用1号外显子、RAN基因用8号外显子。荧光定量PCR的引物和探针信息如表3所示。
表3.
Figure BDA0002087542940000101
根据分析模型：SUMΔCt＝(m1)×RELAΔCt+(m2)×NDUFB4ΔCt+(m3)×EHD3ΔCt－(m4)×PFKLΔCt－(m5)×RANΔCt，其中，m1为0.1～1.0，m2为0.1～0.5，m3为2.2～5.6，m4为1.2～3.0，m5为0.7～4.0，比较当各个基因系数取最小、中位数和最大时，模型的诊断/检测效果。具体检测方法参见实施例1。
其中，系数最小模型为SUMΔCt＝0.1×RELAΔCt+0.1×NDUFB4ΔCt+2.2×EHD3ΔCt－1.2×PFKLΔCt－0.7×RANΔCt，系数中位数模型为SUMΔCt＝0.55×RELAΔCt+0.3×NDUFB4ΔCt+3.9×EHD3ΔCt－2.1×PFKLΔCt－2.4×RANΔCt，系数最大模型为SUMΔCt＝1×RELAΔCt+0.5×NDUFB4ΔCt+5.6×EHD3ΔCt－3×PFKLΔCt－4×RANΔCt。
随机选用90例入组样本，在荧光PCR仪器上检测5个基因的Ct值及spike-in的Ct值，获得5个基因的ΔCt值。将ΔCt值分别带入系数最小模型、系数中位数模型和系数最大模型，获得各入组样本的SUM△Ct(参见表4)。
根据入组样本的临床诊断结论，统计用三种系数模型下得到的ROC曲线(如图8所示)。由图8可以看出，用中位系数模型得到的AUC大于最小系数模型和最大系数模型。
上述结果表明，中位系数模型的诊断/检测效果优于最小系数或最大系数模型。
表4. 90例样本信息
Figure BDA0002087542940000111
Figure BDA0002087542940000121
/>
Figure BDA0002087542940000131
实施例5
制备试剂盒
试剂盒中包含：引物和探针(如表3所示)，PCR反应液：2×Taqpath ProAmp Mix(购自Thermofisher公司)。引物工作浓度在100～500nM，探针工作浓度在100～400nM。试剂盒中还包含阴性对照品，由RNase-free和DNase-free的纯水组成；还包含阳性对照品，由人来源的RWPE1细胞系提取的总RNA组成，阳性对照品的浓度是100ng/μL，还包含spiked-in对照，为一段合成的GAPDH基因的mRNA，浓度为0.1pg/μL，序列如SEQ ID NO：19所示。
虽然通过参照本发明的某些优选实施方式，已经对本发明进行了图示和描述，但本领域的普通技术人员应该明白，以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。本领域技术人员可以在形式上和细节上对其作各种改变，包括做出若干简单推演或替换，而不偏离本发明的精神和范围。
序列表
<110> 宽盈医疗科技（上海）有限公司
<120> ***癌的标志物组及其应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtgcgtgca gcctcttcgt c 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgcgtcact gcccggaat 19
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcctgcctaa ataaatc 17
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctgcgtctg cttct 15
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caacacccta tgctactgac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atacattgag caactaaccc 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcgagctggg cccgtgtt 18
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctggtcagg acgccgatg 19
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggatgagga tgatgac 17
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacttctgac gctggg 16
<210> 11
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gggagccaaa aggg 14
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgaggctgtt gtcatactt 19
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acttgctccc ggcccct 17
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcattaagta gtagtttctc 20
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cttgcccctg gtaccaa 17
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
catggccgcg gtggacct 18
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctgtgagaat gaagct 16
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctgccccctc tgctga 16
<210> 19
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttgcaggggg gagccaaaag ggtcatcatc tctgccccct ctgctgatgc ccccatgttc 60
gtcatgggtg tgaaccatga gaagtatgac aacagcctca agatc 105

Claims (12)

1.一种用于检测***癌的标志物组的试剂组合，所述标志物组包括基因RELA、NDUFB4、EHD3、PFKL和RAN的mRNA；其中，所述RELA选自其1、2、3、4、5、7、8、9、10或11号外显子；所述NDUFB4选自其1、2或3号外显子；所述EHD3选自其1、2、3、4、5或6号外显子；所述PFKL选自其1、2、3、4、7、12、17、20、21或22号外显子；所述RAN选自其1、2、3、4、5、6、7或8号外显子；所述mRNA是外泌体源性mRNA。
2.根据权利要求1所述的试剂组合，其中，所述RELA选自其1、2、3、9、10或11号外显子；所述NDUFB4选自其1、2或3号外显子；所述EHD3选自其1、2、3、4、5或6号外显子；所述PFKL选自其1、2、3、20、21或22号外显子；所述RAN选自其1、2、3、4、5、6、7或8号外显子。
3.根据权利要求1所述的试剂组合，其中，所述RELA选自其1号外显子；所述NDUFB4选自其3号外显子；所述EHD3选自其6号外显子；所述PFKL选自其1号外显子；所述RAN选自其8号外显子。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的试剂组合，其中，所述试剂组合包括引物对1～5，其中，引物对1用于检测RELA的mRNA表达水平，引物对2用于检测NDUFB4的mRNA表达水平，引物对3用于检测EHD3的mRNA表达水平，引物对4用于检测PFKL的mRNA表达水平，引物对5用于检测RAN的mRNA表达水平。
5.根据权利要求4所述的试剂组合，其中，引物对1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示，引物对2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，引物对3的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，引物对4的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8所示，引物对5的核苷酸序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。
6.根据权利要求4所述的试剂组合，所述试剂组合还包括探针、DNA聚合酶、PCR缓冲液、阴性对照品和阳性对照品中的一种或多种。
7.根据权利要求1～3中任一项所述的试剂组合，所述试剂组合是用于***癌的分型的试剂盒。
8.权利要求1～6中任一项所述的试剂组合在制备用于检测基因mRNA标志物组水平的试剂盒中的应用，所述基因mRNA标志物组包括RELA、NDUFB4、EHD3、PFKL和RAN的mRNA。
9.一种***癌分型***，包括信息获取模块、计算模块和诊断模块，
其中，所述信息获取模块用于执行获取受试者检测信息的操作，所述检测信息包括标志物组的Ct值和内参基因的Ct值，所述标志物组包括基因RELA、NDUFB4、EHD3、PFKL和RAN的mRNA，所述mRNA是外泌体源性mRNA；
所述计算模块用于执行将标志物组的Ct值与内参基因的Ct值的差值△Ct代入分析模型，计算SUM△Ct值的操作，
分析模型为：SUM△Ct＝(m1)×RELA△Ct+(m2)×NDUFB4△Ct+(m3)×EHD3△Ct－(m4)×PFKL△Ct－(m5)×RAN△Ct，m1为0.1～1.0，m2为0.1～0.5，m3为2.2～5.6，m4为1.2～3.0，m5为0.7～4.0；
所述诊断模块用于执行根据SUM△Ct值判断受试者健康状况的操作，其中，如果受试者的SUM△Ct值为1.6～2.4，则判断为***癌阴性；如果受试者的SUM△Ct值为-0.6～1.6，则判断为低危原位性***癌；如果受试者的SUM△Ct值小于-0.6，则判断为疑似高危进展性***癌。
10.根据权利要求9所述的***癌分型***，其中，所述分析模型为：SUM△Ct＝0.55×RELA△Ct+0.3×NDUFB4△Ct+3.9×EHD3△Ct－2.1×PFKL△Ct－2.4×RAN△Ct。
11.根据权利要求9所述的***癌分型***，其中，所述分析模型为：SUM△Ct＝0.1×RELA△Ct+0.1×NDUFB4△Ct+2.2×EHD3△Ct－1.2×PFKL△Ct－0.7×RAN△Ct。
12.根据权利要求9所述的***癌分型***，其中，所述分析模型为：SUM△Ct＝1×RELA△Ct+0.5×NDUFB4△Ct+5.6×EHD3△Ct－3×PFKL△Ct－4×RAN△C。
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