CN110343192B - 千层塔多糖的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种千层塔多糖的提取方法，涉及食品医药加工技术领域。所述千层塔多糖的提取方法包括以下步骤：将千层塔干燥后粉碎过筛，得千层塔粉末；将所述千层塔粉末与水混合后进行提取，得千层塔提取液；将所述千层塔提取液通过大孔树脂脱色、去蛋白质处理，得纯化液；对所述纯化液醇沉处理，得沉淀物并进行干燥，得千层塔多糖。本发明提出的千层塔多塔多糖的提取方法，流程简单、成本低，得到的千层塔多糖能够有效清除自由基，对增强机体的免疫力起到积极作用。

Description

千层塔多糖的提取方法
技术领域
本发明涉及食品医药加工技术领域，特别涉及一种千层塔多糖的提取方法。
背景技术
千层塔[Lycopodium serratum Thunb.]为石杉科石杉属藏类植物，又名蛇足石杉、蛇足草等。千层塔作为传统中草药常用于治疗跌打损伤、精神***以及消炎解毒等。千层塔中含有千层塔多糖、石杉胆碱、萜类及黄酮类物质。此外，千层塔中含有较多的千层塔多糖，对于清除人体内自由基、增强免疫力以及抗氧化有重要作用。
目前对于千层塔多糖提取的研究还没有，研究千层塔多糖的提取方法，具有重要的意义。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种千层塔多糖的提取方法，旨在解决千层塔多糖不易提取的技术问题。
为实现上述目的，本发明提出千层塔多糖的提取方法，所述方法包括以下步骤：
将千层塔干燥后粉碎过筛，得千层塔粉末；
将所述千层塔粉末与水混合后进行提取，得千层塔提取液；
将所述千层塔提取液通过大孔树脂脱色、去蛋白质处理，得纯化液；
对所述纯化液醇沉处理，得沉淀物并进行干燥，得千层塔多糖。
可选地，所述将千层塔干燥后粉碎过筛，得千层塔粉末的步骤中，所述干燥的条件为：干燥温度为60～70℃，干燥时间为5～6h；和/或，
所述过筛为过60～140目筛。
可选地，所述将所述千层塔粉末与水混合后进行提取，得千层塔提取液的步骤包括：
将所述千层塔粉末与水混合，在40～60℃水浴条件下加热2～4h，得粗提液；
将所述粗提液在6000～8000r/min转速下离心5-10min后，取上层液抽滤，得千层塔提取液。
可选地，所述将所述千层塔粉末与水混合，在40～60℃水浴条件下加热2～4h，得粗提液的步骤中，所述千层塔粉末的质量与所述水的体积之比为1：(10～30)。
可选地，所述将所述千层塔提取液通过大孔树脂脱色、去蛋白质处理，得到纯化液的步骤包括：
将所述千层塔提取液通过大孔树脂在25～30℃温度下脱色10～30min，得脱色液，所述千层塔提取液与所述大孔树脂的体积比为(1～4)：1；
将所述脱色液与Sevage溶液混合，分层后得纯化液。
可选地，所述将所述脱色液与Sevage溶液混合，分层后得纯化液的步骤中，所述脱色液与所述Sevage溶液的体积比为(1～3)：1。
可选地，所述将所述脱色液与Sevage溶液混合，分层后得纯化液的步骤中，所述Sevage溶液为氯仿和正丁醇的混合溶液，所述混合溶液中氯仿和正丁醇的体积比(3～4)：1。
可选地，所述对所述纯化液醇沉处理，得沉淀物并进行干燥，得千层塔多糖的步骤，包括：
向所述纯化液中加入乙醇溶液，然后在3～5℃下静置10～16h，得固液混合液；
使所述固液混合液固液分离后得沉淀物并干燥，得千层塔多糖。
可选地，所述向所述纯化中加入乙醇溶液，然后在3～5℃下静置10～16h，得固液混合液的步骤中，所述纯化液与所述乙醇溶液的体积比为1：(1～3)；和/或，
所述乙醇溶液的体积浓度为60％～90％。
可选地，所述对所述纯化液醇沉处理，得沉淀物并进行干燥，得千层塔多糖的步骤中，所述沉淀物的干燥方式为冷冻干燥，所述冷冻干燥条件为：干燥温度为-20～-10℃，干燥时间为36～48h。
本发明提出的千层塔多糖的提取方法，通过将千层塔多糖粉末与水混合进行提取，再经大孔树脂脱色、去蛋白、醇沉处理，得到千层塔多糖沉淀，最后将千层塔多糖沉淀干燥，便可得到纯度较高的千层塔多糖。本发明提出的千层塔多糖的提取方法，通过提取，将千层塔中的千层塔多糖溶于水中，形成提取液，之后通过脱色以及除蛋白，将提取液纯化，最后醇沉得到纯度较高的千层塔多糖沉淀。流程简单、成本低，得到的千层塔多糖能够有效清除自由基，对增强机体的免疫力起到积极作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提出的千层塔多糖的提取方法的一实施例的流程示意图；
图2为葡萄糖含量测定中葡萄糖标准曲线图；
图3为抗氧化活性测定中实施例1、2、3和4制得的千层塔多糖对ABTS自由基的清除率变化趋势图；
图4抗氧化活性测定中实施例1、2、3和4制得的千层塔多糖对Fe2+的清除率变化趋势图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
千层塔是一种性能优良的中草药，其中含有多种对机体有益的物质，包括千层塔多糖，而目前对于千层塔多糖的提取尚未有研究。鉴于此，本发明提出一种千层塔多糖的提取方法，能够得到纯度较高的千层塔多糖，流程简单、成本低，得到的千层塔多糖能够有效清除自由基，对增强机体的免疫力起到积极作用。
图1为本发明提出的千层塔多糖的提取方法的一实施例的流程示意图，所述千层塔多糖的提取方法包括以下步骤：
步骤S10、将千层塔干燥后粉碎过筛，得千层塔粉末。
本发明的技术方案中，以千层塔为原料，经过一系列的处理，可以得到纯度较高的千层塔多糖。其中，采摘的千层塔中含有大量的水分，需进行干燥，干燥温度优选60～70℃，干燥时间优选5～6h，以保护千层塔中的千层塔多糖不被破坏，同时将水分充分蒸发。其中，干燥温度可以为60℃、62℃、65℃、67℃、70℃等，干燥时间可以为5h、5.2h、5.5h、5.6h、5.8h、6h等，优选干燥条件为：干燥温度60℃，干燥时间6h。
干燥粉碎后的千层塔需要过筛，以使得到的千层塔粉末粒径均匀，有利于千层塔多糖的提取，过筛优选过60～140目筛，可以为60目、70目、80目、100目、120目、140目等，优选140目筛，此时得到的千层塔粉末粒径较小，表面积较大，有利于后续千层塔多糖的提取。
步骤S20、将所述千层塔粉末与水混合后进行提取，得千层塔提取液。
具体实施步骤S20时，可以包括以下步骤：
步骤S21、将所述千层塔粉末与水混合，在40～60℃水浴条件下加热2～4h，得粗提液；
步骤S22、将所述粗提液在6000～8000r/min转速下离心5-10min后，取上层液抽滤，得千层塔提取液。
其中，在进行步骤步骤S21时，千层塔粉末的质量和水的体积之比为1：(10～30)，单位为(g/ml)，具体地，可以是每1g千层塔粉末对应加入10ml、18ml、20ml、22ml、25ml、30ml等的水，优选地，每1g千层塔粉末对应加入20ml的水，此时千层塔多糖提取充分，浓度适中。此外，为了在提取液制备时不引入其他杂质，本实施例中的水采用超纯水。
步骤S30、将所述千层塔提取液通过大孔树脂脱色、去蛋白质处理，得纯化液。
具体实施步骤S30时，分为以下两步实施：
步骤S31、将所述千层塔提取液通过大孔树脂在25～30℃温度下脱色10～30min，得脱色液，所述千层塔提取液与所述大孔树脂的体积比为(1～4)：1；
步骤S32、将所述脱色液与Sevage溶液混合，分层后得纯化液。
在步骤S31中，大孔树脂选用型号为Amberlite XAD-4的非离子型大孔树脂，脱色效果较好。
在步骤S32中，脱色液与Sevage溶液的体积比为(1～3)：1，如1:1、2:1、2.5:1、3:1等，其中，Sevage溶液为氯仿和正丁醇的混合溶液，氯仿和正丁醇的体积比(3～4)：1。此外，为了节约除蛋白的Sevage溶液，可以将步骤S31中得到的脱色液先浓缩，再与Sevage溶液混合，如此提高了蛋白质的去除率，也节约了原料。
步骤S40、对所述纯化液醇沉处理，得沉淀物并进行干燥，得千层塔多糖。
步骤S40也分为两步进行：
步骤S41、向所述纯化液中加入乙醇溶液，然后在3～5℃下静置10～16h，得固液混合液；
步骤S42、使所述固液混合液固液分离后得沉淀物并干燥，得千层塔多糖。
其中，醇沉的步骤中，纯化液与乙醇溶液的体积比以及乙醇溶液的浓度均会对醇沉的效果产生影响，纯化液与乙醇溶液的体积比为1：(1～3)；乙醇的体积浓度为60％～90％。
千层塔多糖经醇沉析出之后，将固液混合物固液分离，将固体千层塔多糖干燥，其干燥方式可选冷冻干燥，干燥温度为为-20～-10℃，干燥时间为36～48h，可使干燥后的千层塔多糖保持原来的化学组成和物理性质。
本发明提供的千层塔多糖的提取方法，通过将千层塔多糖粉末与水混合进行提取，再经大孔树脂脱色、去蛋白、醇沉处理，得到千层塔多糖沉淀，最后将千层塔多糖沉淀干燥，便可得到纯度较高的千层塔多糖。本发明提出的千层塔多糖的提取方法，流程简单、成本低，得到的千层塔多糖能够有效清除自由基，对增强机体的免疫力起到积极作用。此外，本发明提供的技术方案中，对千层塔多糖的提取条件(提取温度、千层塔的质量和水的体积之比、提取时间)进行优化，提高了千层塔多糖的提取率。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
将千层塔在60℃下干燥6h，过140目筛，得千层塔粉末。将千层塔粉末与超纯水混合，千层塔粉末质量与超纯水体积之比为1：20，在50℃水浴条件下加热3h，得粗提液，将粗提液在8000r/min转速下离心5min后，取上层液抽滤，得千层塔提取液。之后，将千层塔提取液通过大孔树脂在30℃温度下脱色30min，得脱色液，其中，千层塔提取液与所述大孔树脂的体积比为1：1，将脱色液与Sevage溶液以体积比1：1混合，分层后得纯化液，Sevage溶液中氯仿和正丁醇的体积比3：1。向纯化液中加入体积分数为90％的乙醇溶液，纯化液与乙醇溶液的体积比为1：3，然后在4℃下静置12h，得固液混合液，使固液混合液固液分离后得沉淀物并在-20℃下冷冻干燥48h，得千层塔多糖。
实施例2
将千层塔在70℃下干燥5h，过60目筛，得千层塔粉末。将千层塔粉末与超纯水混合，千层塔粉末质量与超纯水体积之比为1：20，在60℃水浴条件下加热2h，得粗提液，将粗提液在6000r/min转速下离心10min后，取上层液抽滤，得千层塔提取液。之后，将千层塔提取液通过大孔树脂在25℃温度下脱色10min，得脱色液，其中，千层塔提取液与所述大孔树脂的体积比为4：1，将脱色液与Sevage溶液以体积比3：1混合，分层后得纯化液，Sevage溶液中氯仿和正丁醇的体积比4：1。向纯化液中加入体积分数为60％的乙醇溶液，纯化液与乙醇溶液的体积比为1：1，然后在5℃下静置10h，得固液混合液，使固液混合液固液分离后得沉淀物并在-10℃下冷冻干燥36h，得千层塔多糖。
实施例3
将千层塔在65℃下干燥5.5h，过100目筛，得千层塔粉末。将千层塔粉末与超纯水混合，千层塔粉末质量与超纯水体积之比为1：10，在40℃水浴条件下加热3h，得粗提液，将粗提液在7000r/min转速下离心8min后，取上层液抽滤，得千层塔提取液。之后，将千层塔提取液通过大孔树脂在27℃温度下脱色20min，得脱色液，其中，千层塔提取液与所述大孔树脂的体积比为3：1，将脱色液与Sevage溶液以体积比2：1混合，分层后得纯化液，Sevage溶液中氯仿和正丁醇的体积比3.5：1。向纯化液中加入体积分数为70％的乙醇溶液，纯化液与乙醇溶液的体积比为1：2，然后在3℃下静置16h，得固液混合液，使固液混合液固液分离后得沉淀物并在-15℃下冷冻干燥42h，得千层塔多糖。
实施例4
将千层塔在62℃下干燥6h，过80目筛，得千层塔粉末。将千层塔粉末与超纯水混合，千层塔粉末质量与超纯水体积之比为1：30，在50℃水浴条件下加热4h，得粗提液，将粗提液在7000r/min转速下离心6min后，取上层液抽滤，得千层塔提取液。之后，将千层塔提取液通过大孔树脂在29℃温度下脱色27min，得脱色液，其中，千层塔提取液与所述大孔树脂的体积比为2：1，将脱色液与Sevage溶液以体积比1：1混合，分层后得纯化液，Sevage溶液中氯仿和正丁醇的体积比3.7：1。向纯化液中加入体积分数为80％的乙醇溶液，纯化液与乙醇溶液的体积比为1：3，然后在4℃下静置13h，得固液混合液，使固液混合液固液分离后得沉淀物并在-17℃下冷冻干燥40h，得千层塔多糖。
实施例5
将千层塔在68℃下干燥5h，过120目筛，得千层塔粉末。将千层塔粉末与超纯水混合，千层塔粉末质量与超纯水体积之比为1：20，在50℃水浴条件下加热3h，得粗提液，将粗提液在8000r/min转速下离心9min后，取上层液抽滤，得千层塔提取液。之后，将千层塔提取液通过大孔树脂在30℃温度下脱色25min，得脱色液，其中，千层塔提取液与所述大孔树脂的体积比为1：1，将脱色液与Sevage溶液以体积比3：1混合，分层后得纯化液，Sevage溶液中氯仿和正丁醇的体积比3：1。向纯化液中加入体积分数为90％的乙醇溶液，纯化液与乙醇溶液的体积比为1：1，然后在3℃下静置15h，得固液混合液，使固液混合液固液分离后得沉淀物并在-13℃下冷冻干燥38h，得千层塔多糖。
实施例6
将千层塔在60℃下干燥6h，过140目筛，得千层塔粉末。将千层塔粉末与超纯水混合，千层塔粉末质量与超纯水体积之比为1：20，在50℃水浴条件下加热3h，得粗提液，将粗提液在8000r/min转速下离心5min后，取上层液抽滤，得千层塔提取液。之后，将千层塔提取液通过大孔树脂在25℃温度下脱色15min，得脱色液，其中，千层塔提取液与所述大孔树脂的体积比为4：1，将脱色液与Sevage溶液以体积比1：1混合，分层后得纯化液，Sevage溶液中氯仿和正丁醇的体积比4：1。向纯化液中加入体积分数为90％的乙醇溶液，纯化液与乙醇溶液的体积比为1：3，然后在4℃下静置12h，得固液混合液，使固液混合液固液分离后得沉淀物并在-20℃下冷冻干燥46h，得千层塔多糖。
对比例1
除水浴加热温度为80℃外，其他步骤与实施例1相同。
对比例2
除水浴加热时间为1h外，其他步骤与实施例1相同。
对比例3
除千层塔粉末质量与超纯水体积之比为1：50外，其他步骤与实施例1相同。
将上述各实施例和对比例制备的千层塔多糖进行如下检测。
(一)千层塔多糖提取率的测定
取实施例1至6和对比例1至3制备的千层塔多糖按如下方法测定：
葡萄糖含量标准曲线测定：称取0.01g葡萄糖置于100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解，并稀释至刻度，摇匀，得葡萄糖标准溶液。分别用移液枪移取葡萄糖标准溶液1.6mL、3.2mL、4.8mL、6.4mL、8mL、12.8mL、16mL于25mL的容量瓶中，分别加入5％的苯酚溶液2.5mL、浓硫酸5mL，摇匀后在沸水浴中水浴15min，冷却至室温。分别在490nm处测定吸光度，以千层塔多糖的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制葡萄糖的标准曲线，见图2。
千层塔多糖提取率的测定，具体步骤为：用蒸馏水溶解提取的千层塔多糖并定容至100mL，按照上述葡萄糖吸光度的测定方法测定吸光度，可以求得千层塔多糖的提取率并记录在表1中，千层塔多糖的提取率为提取出的千层塔多糖的质量除以千层塔的质量。
表1 千层塔多糖提取率对比
Figure BDA0002180951520000091
由上表1可知，本发明提出的提取方法，提取的千层塔多糖的提取率普遍达到1.3％以上，说明本发明提出的提取千层塔多糖的方法有显著优势。同时，各对比例的千层塔多糖的提取率普遍低于实施例，也说明了对各参数优化后的本发明提取方法制得的千层塔多糖具有更好的优势。
(二)抗氧化活性的测定
(1)分别取实施例1、2、3和4制备的千层塔多糖按如下方法测定其对ABTS自由基的清除性能
将20mL的过硫酸钾溶液加入100mL的ABTS溶液中，在室温下避光反应24h，用蒸馏水稀释，直至波长为734nm处吸光度值为0.7左右为止，得溶液放在阴暗处，重复以上步骤4次得4组溶液，再分别取浓度为1，2，4，8mg/mL千层塔多糖溶液各400μL至上述4组溶液中，得到4组样品，分别将样品在734nm测定吸光度，记为A1。以蒸馏水作空白对照。按下列公式计算清除率并绘制清除率变化图如图3所示。
清除率＝[1－(A1－A2)/A0]×100％。
式中A0为对照组的吸光度；A1为样品吸光度；A2为样品的本底吸光度值(蒸馏水替代ABTS+储备液)。
(2)分别取实施例1、2、3和4制备的千层塔多糖按如下方法测定其对Fe2+自由基的清除性能
取浓度为1，2，4，8mg/mL千层塔多糖溶液各100μL至试管中，每支试管中分别加入10μL的5mmol/L的氯化亚铁溶液，20μL的菲啰嗪，270mL的蒸馏水，摇匀，得到4组样品，分别将样品在562nm处测吸光度，记为A1。以蒸馏水作空白对照。按下列公式计算清除率并绘制清除率变化图如图4所示。
清除率＝[1－(A1－A2)/A0]×100％。
式中A0为对照组的吸光度；A1为样品吸光度；A2为样品的本底吸光度值(蒸馏水替代氯化亚铁)。
从图3和图4可以看出，千层塔多糖对ABTS自由基以及Fe2+均有清除作用，且随着千层塔多糖浓度的升高，对ABTS自由基以及Fe2+的清除率基本呈现升高趋势，说明本发明制备方法制得的千层塔多糖具有较好的抗氧化活性。
综上所述，本发明实施例制备的千层塔多糖具有较好的抗氧化活性，可以有效清除ABTS自由基以及Fe2+，能够广泛用于制备具有抗氧化功效和增强免疫活性的产品中，应用前景广阔。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种千层塔多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
将千层塔干燥后粉碎过筛，得千层塔粉末；
将所述千层塔粉末与水混合后进行提取，得千层塔提取液；
将所述千层塔提取液通过大孔树脂脱色、去蛋白质处理，得纯化液；
对所述纯化液醇沉处理，得沉淀物并进行干燥，得千层塔多糖。
2.如权利要求1所述的千层塔多糖的提取方法，其特征在于，所述将千层塔干燥后粉碎过筛，得千层塔粉末的步骤中，所述干燥的条件为：干燥温度为60～70℃，干燥时间为5～6h；和/或，
所述过筛为过60～140目筛。
3.如权利要求1所述的千层塔多糖的提取方法，其特征在于，所述将所述千层塔粉末与水混合后进行提取，得千层塔提取液的步骤包括：
将所述千层塔粉末与水混合，在40～60℃水浴条件下加热2～4h，得粗提液；
将所述粗提液在6000～8000r/min转速下离心5-10min后，取上层液抽滤，得千层塔提取液。
4.如权利要求3所述的千层塔多糖的提取方法，其特征在于，所述将所述千层塔粉末与水混合，在40～60℃水浴条件下加热2～4h，得粗提液的步骤中，所述千层塔粉末的质量与所述水的体积之比为1g：(10～30)ml。
5.如权利要求1所述的千层塔多糖的提取方法，其特征在于，所述将所述千层塔提取液通过大孔树脂脱色、去蛋白质处理，得纯化液的步骤包括：
将所述千层塔提取液通过大孔树脂在25～30℃温度下脱色10～30min，得脱色液，所述千层塔提取液与所述大孔树脂的体积比为(1～4)：1；
将所述脱色液与Sevage溶液混合，分层后得纯化液。
6.如权利要求5所述的千层塔多糖的提取方法，其特征在于，所述将所述脱色液与Sevage溶液混合，分层后得纯化液的步骤中，所述脱色液与所述Sevage溶液的体积比为(1～3)：1。
7.如权利要求5所述的千层塔多糖的提取方法，其特征在于，所述将所述脱色液与Sevage溶液混合，分层后得纯化液的步骤中，所述Sevage溶液为氯仿和正丁醇的混合溶液，所述混合溶液中氯仿和正丁醇的体积比(3～4)：1。
8.如权利要求1所述的千层塔多糖的提取方法，其特征在于，所述对所述纯化液醇沉处理，得沉淀物并进行干燥，得千层塔多糖的步骤包括：
向所述纯化液中加入乙醇溶液，然后在3～5℃下静置10～16h，得固液混合液；
使所述固液混合液固液分离后得沉淀物并干燥，得千层塔多糖。
9.如权利要求8所述的千层塔多糖的提取方法，其特征在于，所述向所述纯化液中加入乙醇溶液，然后在3～5℃下静置10～16h，得固液混合液的步骤中，所述纯化液与所述乙醇溶液的体积比为1：(1～3)；和/或，
所述乙醇溶液的体积浓度为60％～90％。
10.如权利要求1所述的千层塔多糖的提取方法，其特征在于，所述对所述纯化液醇沉处理，得沉淀物并进行干燥，得千层塔多糖的步骤中，所述沉淀物的干燥方式为冷冻干燥，所述冷冻干燥条件为：干燥温度为-20～-10℃，干燥时间为36～48h。
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