CN110339188B - 4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮在制备抗肝纤维化和抗肝癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了4‑甲基‑5,6‑二氢吡喃‑2酮在制备抗肝纤维化和抗肝癌药物中的应用，属于抗肝纤维化和肝癌药物技术领域。本发明发现4‑甲基‑5,6‑二氢吡喃‑2酮具有良好的抗肝纤维化活性和抑制肝癌细胞转移的活性，能够用于制备抗肝纤维化药物和抗肝癌药物。实施例结果显示，4‑甲基‑5,6‑二氢吡喃‑2酮可抑制Ⅰ型胶原蛋白α1启动子的活性，降低肝星状细胞LX‑2中COL1A1、ACTA2等肝纤维化标志物的表达，改善BDL大鼠肝脏组织病理结构以及肝纤维化程度，能够抑制肝癌细胞HepG2的转移。
Description
技术领域
本发明涉及抗肝纤维化和肝癌药物技术领域，特别涉及4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮在制备抗肝纤维化和抗肝癌药物中的应用。
背景技术
慢性肝脏疾病是一类世界性的严重危害人类健康的疾病，病毒感染(HBV HCV)、毒物(黄曲霉素)、酒精、先天性代谢缺陷等多种因素都可以引起慢性肝病。肝纤维化是继发于各种慢性因素引起的肝脏损伤和炎症后组织修复过程中的代偿反应，肝纤维化的进一步发展会导致肝硬化、肝功能衰竭和肝癌。研究发现，肝纤维化是一种可逆性病变，如果能在这一阶段给予有效的治疗，对慢性肝炎的治疗，肝硬化及肝癌等严重致死性疾病的预防具有重要的意义。近年来，肝纤维化的临床治疗取得一些新进展，但是目前中国仅批准上市了复方鳖甲软肝片和扶正化瘀胶囊等几种中成药，可供选择的抗肝纤维化药物较少。
肝癌是全世界发病率和死亡率均很高的癌症，中国是全世界肝癌发病率最高的国家和地区之一。手术是肝癌最常用的治疗手段，但受到肿瘤大小、位置及恶性程度等多种因素的影响，且肝癌发现时一般已经发展至中晚期，能够应用手术进行治疗的只有少数患者，对于不可手术切除的肝癌患者，治疗选择非常有限，预后极差。索拉非尼作为一种新型激酶抑制剂，可同时作用于肿瘤细胞和肿瘤血管，作为突破性的肝癌靶向治疗药物，其对肝癌患者的生存改善依然较为有限，亟需开发新型的肝癌治疗策略。
因此，从肝纤维化到肝癌的演化过程中，寻找能够同时抑制肝纤维化和肝癌的药物有可能对肝癌的预防与治疗有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮在制备抗肝纤维化和抗肝癌药物中的应用。本发明将4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮用于制备抗肝纤维化药物和抗肝癌药物，具有良好的抗肝纤维化和抗肝癌活性。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下方案：
本发明提供了4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮在制备抗肝纤维化药物和抗肝癌药物中的应用。
本发明提供了4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮为有效成分与药学上可接受的载体组成的组合物在制备抗肝纤维化药物和抗肝癌药物中的应用。
本发明提供了4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮在制备肝纤维化和肝癌预防保健品中的应用。
本发明提供了一种用于抗肝纤维化和抗肝癌的药物，所述药物的有效成分包括4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮的衍生物、药学上可接受的盐、溶剂化物、代谢产物、立体异构体、互变异构体、多晶型物、药物前体。
本发明提供了4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮在制备抗肝纤维化药物中应用，本发明发现4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮(CAS:2381-87-5)具有良好的抗肝纤维化活性和抑制肝癌细胞转移的活性，能够用于制备抗肝纤维化药物和抗肝癌药物。肝星状细胞是肝纤维化的细胞学基础，肝星状细胞的激活会诱导COL1A1、ACTA2、TGFB1、MMP2等肝纤维化标志物的表达，导致肝脏大量的胶原沉积。实施例结果显示，4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮可抑制Ⅰ型胶原蛋白α1启动子的活性，降低LX-2细胞中COL1A1、ACTA2等肝纤维化标志物的表达，降低BDL大鼠血清中ALT，AST，ALP，TG，LDL水平、改善BDL大鼠肝脏组织病理结构以及肝纤维化程度，抑制大鼠肝脏组织中Col1a1、Acta2、Mmp2、Tgfb1的mRNA表达。此外，4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮具有明显的抑制肝癌细胞的转移能力。这些结果表明4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮具有良好的抗肝纤维化活性，有望研发成为抗肝纤维化和抗肝癌的新药。
附图说明
图1是实施例1所得LX2细胞存活率柱状图；
图2是实施例2中不同浓度的4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮对COL1A1启动子的活性抑制比示意图；
图3是实施例3中COL1A1的mRNA的表达结果示意图；
图4是实施例3中α-SMA的mRNA的表达结果示意图；
图5是实施例3中4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮对目的基因蛋白表达水平影响的检测结果示意图；
图6是实施例4中BDL手术后大鼠肝脏/体重比值图；
图7是实施例4中BDL手术后大鼠体重变化图；
图8是实施例4中BDL大鼠肝脏组织图；
图9是实施例4中BDL大鼠肝脏病理切片图；
图10是实施例4中大鼠肝脏胆管增生双盲评分图；
图11是实施例4中大鼠肝脏组织坏死双盲评分图；
图12是实施例4中大鼠肝脏组织切片天狼星红染色图；其中，A)为sham组染色结果图，B)为BDL组染色结果图，C)为4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮处理组染色结果图，D)为各组染色面积百分含量示意图；
图13是实施例4中肝纤维化标志物mRNA表达水平示意图；其中，A为COL1A1的mRNA表达水平示意图，B为acta2的mRNA表达水平示意图，C为Mmp2的mRNA表达水平示意图，D为Tgfb1的mRNA表达水平示意图；
图14是实施例5中肝癌细胞划痕实验结果图。
具体实施方式
本发明提供了4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮在制备抗肝纤维化药物和抗肝癌药物中的应用。本发明对所述4-甲基-5,6-二氢吡喃-2在制备抗肝纤维化药物和抗肝癌药物中的应用方式没有特殊的要求，根据具体需要，使用本领域技术人员熟知的方法将所述4-甲基-5,6-二氢吡喃-2制备成不同剂型的药物即可。在本发明中，所述4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮的有效浓度优选为3～100μmol·L-1，更优选为20～80μmol·L-1。
本发明对所述4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮的来源没有特殊的要求，使用市售的4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮或自行制备均可。当需自行制备4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮时，所述4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮的制备方法优选包括以下步骤：
在催化剂的作用下，使甲瓦龙酸内酯发生消去反应，得到4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮。
在本发明中，所述催化剂优选为一水合对甲苯磺酸；所述甲瓦龙酸内酯与催化剂的质量比优选为20:1；在本发明中，所述消去反应使用的溶剂优选为甲苯，本发明对所述溶剂的用量没有特殊的要求，能够将所述甲瓦龙酸内酯和催化剂溶解即可。在本发明中，所述消去反应的温度优选为反应液的回流温度，时间优选为19h。
在本发明中，所述消去反应后还包括对消去反应液的后处理，所述后处理包括以下步骤：
对所述消去反应液依次进行抽滤、硅胶柱层析和洗脱，得到纯净的4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮。
在本发明中，所述抽滤优选为减压抽滤，所述抽滤的时间优选为1h；本发明对所述硅胶柱层析的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的硅胶柱层析的方式即可。在本发明中，所述洗脱的方式优选为石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，所述石油醚-乙酸乙酯的体积比优选为10:1～2:1。
在本发明中，所述消去反应的反应式如式I所示：
本发明提供了4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮为有效成分与药学上可接受的载体组成的组合物在制备抗肝纤维化药物和抗肝癌药物中的应用。本发明对所述载体的种类没有特殊要求，可以包括一种或多种药学上可接受的载体。
在本发明中，所述组合物可以制备成多种剂型，以便于给药。在本发明中，所述组合物的剂型具体可为肠道外用药制剂，具体的如注射剂、栓剂；所述注射剂可以为溶液、混悬液或者可注射的干燥粉末(在注射前加入注射水可立即使用)；所述注射剂除包括有效成分外，还优选包括以下载体或助剂：生理上可接受的无菌含水或非水溶液剂、分散剂、混悬剂、乳剂、合适的含水或非水载体、稀释剂、溶剂或媒介物，具体的如水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯中的一种或多种，所述可注射有机酯优选包括油酸乙酯。
在本发明中，所述抗肝纤维化和抗肝癌药物具体可为口服制剂，所述口服制剂具体可以为固体剂型或液体剂型；所述固体剂型具体的如片剂、糖衣丸剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂或包衣剂，所述液体剂型具体的可为乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂或酏剂。
本发明提供了4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮在制备肝纤维化和肝癌预防保健品中的应用。本发明所述4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮用于肝纤维化和肝癌预防保健品时，4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮可以制成任何常规口服剂型，如片剂、胶囊、散剂、颗粒等；或制成注射液针剂等非口服剂型。本发明所述4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮用于肝纤维化和肝癌预防保健品时，其辅料可选用药学上可接受的任何形式。
本发明提供了一种用于抗肝纤维化和抗肝癌的药物，所述药物的有效成分包括4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮的衍生物、药学上可接受的盐、溶剂化物、代谢产物、立体异构体、互变异构体、多晶型物、药物前体。
在本发明中，所述用于抗肝纤维化和抗肝癌的药物的剂量需要根据给药方式、患病程度、患者年龄、有无既往病史等因素综合考虑进行调整。
下面结合实施例对本发明提供的4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮在制备抗肝纤维化和抗肝癌药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1 4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮对LX2细胞没有毒性
采用不同浓度的4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮(以下简称C8)(50，100，150，200，300μmol·L-1)对处于对数生长期的人肝星状细胞LX2处理24h，使用磺酰罗丹明B蛋白染色(SRB)比色法检测化合物对细胞增殖的影响，具体操作方式如下：
(1)细胞铺板：将处于对数生长期的细胞接种于96孔培养板，在37℃、5％CO2条件下培养24h；
(2)给药：细胞贴壁后，弃去原培养基，用培养基将化合物储液配制为梯度浓度，分别设置空白对照组，溶媒对照组，以及给药组，每个浓度设3个复孔，每孔体积200μL，继续培养24h；
(3)细胞固定：取出培养板，先用PBS缓冲液小心漂洗一遍，每孔加入10％(m/v)的三氯乙酸(TCA)50uL固定细胞，4℃放置lh；然后弃固定液，用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥；
(4)染色：在空气中干燥后，每孔加SRB溶液100uL，室温下放置10～30min。然后去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥；
(5)溶解：最后加入150μL/孔的10mM Tris溶液(pH10.5)溶液，在平板振荡器上振荡5min；
(6)测量：在酶联免疫检测仪测定OD(光密度)值，用空白对照调零，所用波长为515nm；
(7)计算：细胞生长抑制率＝[(OD对照孔－OD给药孔)/OD对照孔]×100％。
经检测，所得LX2细胞存活率柱状图如图1所示。由图1可知，在实验所设的各个浓度阶段，4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮对LX2细胞均没有明显的细胞毒性，在300μmol·L-1时对LX2细胞增殖的抑制率为8.7％，表明4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮不影响LX2细胞的增殖，因此4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮基本没有细胞毒性。
实施例2 4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮抑制肝星状细胞COL1A1启动子的活性
肝纤维化最重要的特征是胶原的过度表达，特别是Ⅰ型胶原α1(COL1A1)，COL1A1是导致肝纤维化的一种重要胶原蛋白，在肝纤维化进程中均会高表达，且这种高表达表现在转录水平上。如果能够抑制该启动子活性，就能抑制胶原的产生，进而抑制肝纤维化。因此将4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮对胶原启动子活性的影响作为初步判断潜在药物抗肝纤维化作用的指标。
使用基于COL1A1启动子的高通量抗肝纤维化筛选模型，采用单荧光素酶基因报告检测***检测不同浓度的4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮(3、20、50和100μmol·L-1)及阳性对照25μmol·L-1表示没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对LX-2-COL1A1细胞中COL1A1启动子活性的影响，其中，单荧光素酶报告基因检测***检测化合物的具体方法如下：
(一)药物处理
(1)实验前构建稳定表达COL1A1启动子的单克隆细胞株(LX-2-COL细胞)，并冻存于液氮中；复苏该细胞株，并于DMEM培养基，5％CO2恒温37℃细胞培养箱中培养，在细胞的对数生长期，细胞汇合度至90％～95％时，以1.5×104个/孔将细胞铺至96孔板中，继续培养24h；
(2)96孔板中的细胞贴壁后，弃去原培养基，用新培养基将待测化合物的储液稀释到所需浓度，加入梯度浓度的待测化合物，药物作用24h后，用Bright-GloTMLuciferaseAssay System(萤光素酶检测***)试剂盒检测启动子活性。
(二)活性检测
(1)Bright-GloTMAssay Reagent冻存于-40℃冰箱中，用前取出置于室温平衡；
(2)将无血清DMEM培养基与Bright-GloTMAssay Reagent按1:1的比例混匀，按照96孔板每孔50μL配制工作液；
(3)吸弃原培养基，用PBS小心漂洗1次后，吸弃PBS并加入步骤(2)中所述工作液；
(4)将孔板置于振荡器上，室温震荡5min，使细胞彻底裂解；
(5)使用多孔道移液器将孔板中的液体转移到不透光的专用96孔板中，放入单功能化学发光酶标仪
L中进行COL1A1启动子的活性检测。
不同浓度的4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮对COL1A1启动子的活性抑制比如图2所示。由图2可知，不同浓度的4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮能够显著抑制COL1A1启动子的活性，30μmol·L-1和100μmol·L-1的4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮对COL1A1启动子的活性的抑制率分别为54.6％和59.7％。
实施例3 4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮抑制肝星状细胞中肝纤维化相关基因mRNA和蛋白表达水平
使用实时荧光PCR检测法(Real-time PCR)对目的基因mRNA表达水平影响进行检测，COL1A1、α-SMA的相对mRNA的表达结果分别如图3、图4所示；使用蛋白质印迹法(Westernblot)对目的基因蛋白表达水平影响进行检测，检测结果如图5所示。由图3～5可知，4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮处理由TGFβ1诱导的LX2细胞24h后，能够浓度依赖性地抑制肝纤维化标志物COL1A1以及α-SMA的mRNA和蛋白表达水平。
其中，实时荧光PCR检测法(Real-time PCR)的具体操作方式为：
使用Roche公司的Fast Start Universal Probe Master(ROX)进行Taqman的Realtime PCR反应，以逆转录所得cDNA为模板，并以GAPDH基因作为内参对照，配制如下反应体系(20μL)：
2×FastStart Universal Probe Master
根据样品数和不同的引物，配好以上除cDNA外的反应体系，加到Real-time PCR用96孔板中，每孔17μL。再在每孔加入3μL cDNA模板，用封口膜封住96孔板，将以上体系混合均匀并离心(1000rpm，5min)，放入700FastStartReal-time PCR System，设定反应程序如下：
其中，荧光信号值在每个循环的末尾收集，反应结束后，根据仪器给出的每个样品的目的基因ct值和内参基因ct值，采用相对ct值法分析目的基因和内参基因的表达量，判断药物对细胞或动物组织的相关基因表达的影响。
蛋白质印迹法(Western blot)的具体操作方式为：
(1)预处理PVDF膜：提前将裁剪好的PVDF膜，浸泡在甲醇中15S进行活化，然后浸泡1×转膜缓冲液中；可在左上角或右上角剪去一角，作为标记，以区分膜的正反面和顺序；
(2)卸下凝胶：将凝胶从板上取下，切除浓缩胶和溴酚蓝前沿部分，浸泡在1×转膜缓冲液中平衡；
(3)安装凝胶和PVDF膜：夹板白色透明一侧置于底端，依次放上海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、海绵，再将夹板黑色侧压上，扣紧；组装的过程中，每层都要尽量避免有气泡，尤其是PVDF膜和凝胶之间；
(4)转膜：调节电流，180mA恒流转膜1.5h，或调节电压90V恒压，转膜1h～1.5h；此条件根据目的蛋白分子大小适当调整，分子小的时间要适当缩短；
(5)封闭：转膜结束后，取出PVDF膜，放入5％脱脂牛奶中，室温封闭1～2h；
(6)一抗孵育：根据预染Marker所标注分子量大小和待测目的条带的大小将膜裁开，宁多勿少；用1％BSA或者一抗稀释液配制一抗，一抗稀释比例按说明书；准备好抗体和膜后，将膜放入杂交袋中，再加入相应的一抗，于4℃摇床孵育过夜；
(7)漂洗：取出膜条，用1×PBS-T漂洗三次，每次10min；
(8)二抗孵育：提前准备好二抗，用1％BSA配制，抗体浓度按说明书配制；将膜放入二抗孵育盒中，加入相应的二抗，于室温孵育2h；
(9)漂洗：从杂交袋中取出膜条，用1×PBS-T漂洗三次，每次10min；
(10)ECL显色曝光：配制新鲜的增强型HRP底物化学发光液(ECL)，将底物与缓冲液按1：1(V/V)的比例混合，均匀的滴加到膜条上，在凝胶成像仪中曝光显色；
(11)结果分析：保存曝光图片，用Image J处理，与内参比较后，统计蛋白表达变化情况。
实施例4 4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮改善胆总管结扎(Bile Duct Ligation,BDL)大鼠的肝脏病理和肝纤维化状况
4.1 4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮不降低BDL手术后大鼠的体重
将Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(体重在180～220g)适应性喂养1～2天，随机分为假手术组(sham)，BDL组，4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮处理组，每组6～8只，同时每组多预留出2～3只，以防止动物在手术中意外死亡或者术后因并发症提前死亡。
对SD大鼠进行BDL手术，具体方法为：
(1)手术前一晚，将动物禁食，正常饮水；
(2)术前给超净台紫外消毒30min，手术器械、缝合针高压灭菌后，浸泡在75％乙醇中，打开小动物麻醉机，加入足量的异氟烷；
(3)待动物完全麻醉后，剃去腹部的毛，用碘伏消毒后，上腹正中开腹，用无菌棉棒抬高肝缘，拉开十二指肠，找到胆总管，用尖头镊将胆总管与周围的脂肪组织分离，在近肝门处和近十二指肠处用缝合线各结扎两道，从两结扎位置中间剪断肝总管，将内脏恢复原样后撒上维生素K和青霉素并缝合切口；假手术组仅开腹，然后缝合；缝合后使动物侧躺，待清醒后自由饮食和饮水。
接受BDL手术当日视为第0天，从第一天起开始给予BDL组腹腔注射生理盐水，给予4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮处理组腹腔注射4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮(100mg·kg-1)，同时每天称量体重，给药14天，至第15天处死动物，称量体重和肝重，并收取血、胆汁、肝脏、尿液进行分析，同时设置假手术组(sham组)进行对照。所得大鼠肝脏/体重比值图如图6所示，大鼠体重变化图如图7所示。
由图6可知，BDL组相对于sham组，肝重与体重的比值显著性升高，而4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮处理组并不会降低该比值；由图7可知，在给药期间，4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮处理组动物体重稳定增长，与BDL组基本持平，表明4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮给药后不会降低BDL大鼠的体重，在该剂量下具有良好的体内安全性。
4.2 4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮能够显著改善大鼠肝功能
对sham组、BDL组和4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮处理组大鼠血清及尿液中各项肝脏相关的生化指标进行检测，检测使用日立7180型全自动生化分析仪和中生北控生物科技股份有限公司的生化指标检测试剂盒，检测指标为：
(1)血清(Serum)：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(TBA)、总胆红素(TBIL)、总胆固醇(CHO)、总甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)；若检测结果超出范围，用双蒸水稀释10倍，再次检测；
(2)尿样(Urine)和胆汁(Bile)：总胆汁酸(TBA)和总胆红素(TBIL)。其中，尿样和胆汁均事先用双蒸水稀释10倍。
检测所得结果如表1所示。
表1 BDL大鼠的血清及尿液中各项肝脏相关的生化指标
| sham(n＝7) | BDL(n＝8) | C8 100mg·kg<sup>-1</sup>(n＝8) | |
| Serum AST(U·L<sup>-1</sup>) | 125.71±24.69 | 757±255.49** | 424.63±265.3# |
| Serum ALT(U·L<sup>-1</sup>) | 27.71±9.48 | 124.11±62.52** | 68.38±39.81# |
| Serum ALP(U·L-1) | 216.71±33.62 | 417.22±70.40** | 271.63±56.30## |
| Serum CHO(mmol·L<sup>-1</sup>) | 1.77±0.23 | 3.38±0.41** | 2.74±0.83 |
| Serum LDL(mmol·L<sup>-1</sup>) | 0.41±0.05 | 1.59±0.22** | 1.11±0.49# |
| Serum HDL(mmol·L<sup>-1</sup>) | 0.93±0.13 | 0.91±0.22** | 1.03±0.32 |
| Serum TG(mmol·L<sup>-1</sup>) | 0.34±0.14 | 1.11±0.31** | 0.71±0.37# |
| Serumγ-GT(U·L<sup>-1</sup>) | / | 46.33±16.77** | 34.50±28.76 |
| Serum TBA(μmol·L<sup>-1</sup>) | 14.19±4.65 | 257.39±43.10** | 164.65±142.25 |
| Serum TBiLi(μmol·L<sup>-1</sup>) | 1.97±0.22 | 162.70±21.91** | 99.69±82.08 |
| Urine TBA(μmol·L<sup>-1</sup>) | 6.88±1.20 | 472.5±197.6 | 356.41±325.53 |
| Urine TBiLi(μmol·L<sup>-1</sup>) | 1.82±0.47 | 83±42.62 | 53.25±51.10 |
| Bile TBA(μmol·L<sup>-1</sup>) | / | 487.16±131.08 | 671.33±287.60 |
| Bile TBiLi(μmol·L<sup>-1</sup>) | / | 14.967±3.64 | 9.225±7.90 |
表1中C8为4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮，*p<0.05，**p<0.01vs.sham组；#p<0.05，##p<0.01vs.BDL组。
由表1可知，BDL手术后，大鼠血清及尿液中各项肝脏相关的生化指标都显著恶化，而4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮不仅可以显著性降低BDL大鼠血清中ALT、AST、ALP等酶含量，还可以改善血清中TG和LDL水平，该结果表明，4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮给药后能够显著改善BDL手术后的大鼠肝功能。
4.3 4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮能够改善BDL大鼠肝脏组织病变
胆管结扎对模型动物会造成较为严重的影响，在引起胆汁淤积后，会造成各种代谢紊乱，并引起肝脏损伤及进一步的纤维化。图8为BDL大鼠肝脏组织图；由图8可知，BDL组的大鼠肝脏肿大，肝脏表面粗糙且凹凸不平，肝脏***，而4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮处理组与BDL组相比，肝脏体积小，表面较光滑，组织较柔软，因此4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮在一定程度上能够改善胆管结扎对动物肝脏的损害。
大鼠肝脏病理切片图如图9所示。病理切片结果显示，sham组大鼠肝脏组织肝细胞规则排列，肝小叶完整，窦间隙均匀，胞浆丰富，无炎性细胞浸润、坏死和胆管增生情况；BDL组肝脏组织病理结构发生明显改变，出现大量的胆管增生，组织坏死明显增多；4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮处理组可以显著改善肝脏中胆管增生和组织坏死。
对所有动物肝脏组织H&E病理切片进行双盲评分，其中胆管增生双盲评分如图10所示，组织坏死双盲评分如图11所示。由图10、11可知，相对于BDL组，4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮处理组胆管增生平均分降低，肝组织坏死程度明显降低。
4.4 4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮抑制BDL大鼠肝纤维化程度
对肝脏组织切片进行天狼星红染色(Sirius Red)，染色结果如图12的A)～C)所示，各组染色面积百分含量如图12的D)所示。由图12可知，sham组仅有少量的胶原纤维染色，BDL组胶原纤维染色大量增多，而4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮处理组胶原纤维染色明显减少；对切片的阳性染色面积进行统计，结果显示4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮给药后胶原纤维面积显著缩小，说明4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮能够抑制BDL大鼠的肝纤维化发展。
4.5 4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮抑制BDL大鼠肝纤维化标志物的表达
提取大鼠肝脏组织总RNA，使用RT-PCR检测COL1A1、ACTA2、Mmp2和Tgfb1肝纤维化标志物的mRNA水平，所得结果如图13所示。由图13可知，BDL手术后，ACTA2，COL1A1，Mmp2，Tgfb1等肝纤维化相关标志物的mRNA表达显著升高，4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮给药后，COL1A1，Mmp2，Tgfb1的mRNA水平显著降低(ACTA2,p≈0.1)。该结果表明，4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮给药后可以显著抑制BDL大鼠肝纤维化标志物的表达。
实施例5 4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮抑制肝癌细胞的转移能力
采用不同浓度的4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮(80，160，240μmol·L-1)对处于对数生长期的人肝癌细胞HepG2处理48h，于倒置显微镜下显微镜下观察伤痕合拢的情况，具体操作方式如下：
(1)细胞铺板：将对数生长期的细胞消化、计数，以3×105/mL/孔的细胞数接种于6孔板中；
(2)划痕：当细胞生长48小时后，覆盖度接近100％时，用10μL Tip头在单层细胞上划痕；
(3)清洗：用PBS冲洗细胞，洗去细胞碎片；
(4)给药：细胞在含有特定浓度药物的培养基中继续培养；
(5)观察：每隔一段时间，于倒置显微镜下显微镜下观察伤痕合拢的情况，并于48小时照相。
经划痕实验分析，划痕后用4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮处理HepG2细胞48小时后，在显微镜下观察细胞的愈合情况，所得肝癌细胞划痕实验结果图如图14所示。由图14可知，HepG2细胞在48小时后细胞逐渐向划痕处迁移运动，划痕变窄，而4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮处理组细胞则划痕清晰可见，且随给药浓度的增加而扩大，在最高的240μM浓度下，细胞划痕基本没有变窄。结果说明4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮处理后，肝癌HepG2细胞运动减弱，由此说明4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮可抑制肝癌细胞的转移。
综合上述结果可知，4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮可以有效地抑制COL1A1启动子的活性，浓度依赖性地抑制肝纤维化标志物COL1A1以及α-SMA的mRNA和蛋白表达水平，改善大鼠的肝功能、胆管增生和坏死程度，降低肝纤维水平，且能够抑制肝癌细胞的转移，表明其具有良好的体内外抗肝纤维作用和体外抗肝癌细胞转移作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮在制备抗肝纤维化药物中的应用。
2.4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮为有效成分与药学上可接受的载体组成的组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。
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