CN110317237B - 一种α-硒-核苷三磷酸的合成和其高特异性核酸酶促聚合及其应用 - Google Patents

一种α-硒-核苷三磷酸的合成和其高特异性核酸酶促聚合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种α‑硒‑核苷三磷酸的合成,和其高特异性核酸酶促聚合及其应用。通过dNTPαSe为底物来提高酶促DNA聚合特异性和准确性，及其在聚合酶链反应PCR扩增放大、恒温扩增放大、滚环扩增放大或其它DNA聚合中的应用以。通过dNTPαSe降低DNA聚合酶反应速度，提高DNA聚合和扩增放大的特异性和准确性，减少副产物。另外，产生的硒修饰DNA也可作为DNA聚合和放大的模板或引物。还有，通过NTPαSe同样能够降低RNA聚合酶反应速度，提高RNA聚合的准确性，减少副产物。同时硒原子可以通过氧化或水解或其它方法除去，从而得到天然未修饰的核酸。

Description

一种α-硒-核苷三磷酸的合成和其高特异性核酸酶促聚合及 其应用
技术领域
本发明属于化学与分子生物学领域，具体涉及一种α-硒-核苷三磷酸的合成方法及其高特异性DNA酶促聚合和应用，包括在聚合酶链反应PCR扩增放大，或恒温扩增放大(例如环介导等温扩增LAMP放大)，或滚环扩增放大或者其它DNA聚合反应中减少副反应的应用，以及其它应用方法。另外，通过硒原子取代的NTPαSe底物，RNA聚合酶能够将Se原子引入到RNA中去，NTPαSe同样能够降低RNA聚合酶反应速度，提高RNA聚合的准确性，抑制RNA聚合非特异性延伸副反应发生，减少副产物。同时硒原子可以通过氧化或水解或其它方法除去，从而得到天然未修饰的核酸。
背景技术
在核酸中引入化学修饰(包括碱基修饰、糖环修饰和磷酸骨架修饰)可以改变核酸原有的性质，对核酸研究有着重要的意义。特定核苷酸的单原子修饰能在最小改变的情况下，尽可能保留原有核酸的理化性质，同时给核酸带来特性新改善，因此意义尤为重要。例如，硒修饰的核酸不仅能对核酸酶的水解有抵抗性，还能长出高质量的晶体和帮助相位测定，因而有作广泛的应用前景和空间。然而，要将修饰放入长度范围非常宽的核酸链中，以目前的化学合成寡核苷酸链的方法很难实现。因此，通过聚合酶引入修饰核苷是主要的途径。
DNA聚合在生物学、医学和生物***中起着重要作用，包括DNA 复制和遗传信息存储。高特异性的DNA合成对生物技术和疾病诊断也至关重要。然而在目前，由于引物之间或者引物和模板之间发生的非特异扩增，仍经常会影响PCR扩增放大，或恒温扩增放大，或滚环扩增放大或者其它聚合反应的特异性，最终影响实验的结果或实验结果的可信度。还有，RNA聚合酶能够额外延长RNA序列,发生非特异性延伸副反应，产生副产物。
综上所述，现有技术存在的问题是：DNA聚合酶促反应中易产生非特异性扩增，对引物设计要求较高，扩增模板样品的复杂性更易导致非特异性产物产生。另外，RNA聚合酶促反应中易产生非特异性 RNA产物(例如额外延长的序列)，导致副产物产生。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种化学修饰的替代底物(dNTPαSe和NTPαSe)的合成方法，dNTPαSe降低DNA聚合酶反应速度，该替代底物(dNTPαSe)能够有效地抑制非特异性扩增发生，提高聚合酶反应特异性的方法，及其在聚合酶链反应PCR扩增放大，或恒温扩增放大(例如环介导等温扩增LAMP放大)，或滚环扩增放大，或者反转录，或者其它聚合反应中减少副反应的应用以及其它应用方法。同样，NTPαSe降低RNA聚合酶反应速度，该替代底物(NTPαSe) 能够有效地抑制非特异性延伸反应发生，可望消除聚合酶反应副产物。
为了实现上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
一种α-硒-核苷三磷酸的合成方法，通过该一锅法，无需提前保护核甘中活泼基团，可直接反应生成，具体包括以下步骤：
1)将单体核苷、焦磷酸三丁基铵和3H-1,2-benzothiaselenol-3-one (BTSe)分别放置于不同的烧瓶中，并各自进行真空干燥；
2)向焦磷酸三丁基铵中注入DMF、三丁胺和无水2-氯-4H-1,3,2- 苯并二氧杂磷杂环己二烯-4-酮溶液得到混合液；
3)混合液在氩气环境下搅拌反应，加入单体核苷溶液，继续反应1h；
4)将BTSe溶液注射到反应容器中进行氧化反应；
5)反应时间1h后，在反应容器中添加反应溶液体积两倍的水，水解2h；
6)在二硫苏糖醇存在的环境下将氯化钠和乙醇依次加入反应液，将混合液冷冻，离心；
7)去掉上清，将沉淀溶解于水中，离心去掉上清即得目标产物。
进一步的，所述的单体核苷、焦磷酸三丁基铵和3H-1, 2-benzothiaselenol-3-one(BTSe)的摩尔比为1:2:2。
进一步的，所述的单体核苷选自脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、胸苷、脱氧修饰核苷(包括碱基修饰的核苷)、腺苷、胞苷、鸟苷、尿苷或修饰核苷(包括碱基修饰的核苷)之一种。
在本发明的另一方面，上述合成方法得到α-硒-核苷三磷酸也在本发明的保护范围之内。
所述的α-硒-核苷三磷酸的结构式如下：
Figure BDA0002032836710000041
碱基包括A,C,G,T和U以及修饰碱基。
在本发明的另一方面，还提供了制备得到的dNTPαSe和NTPαSe，及其在酶促DNA聚合或RNA聚合反应中的应用。
进一步的，酶促合成的硒DNA化合物通过DNA或RNA引物扩增得到。
进一步的，α-硒-核苷三磷酸酶促方法合成Se修饰DNA。
进一步的，硒修饰的核酸与过氧化氢(或其他氧化或水解)溶液接触以产生类似的天然核酸。
进一步的，该延伸酶包含DNA聚合酶、RNA聚合酶或反转录酶。
进一步的，RNA聚合酶参与反应，底物采用NTPαSe。
进一步的，反转录酶参与反应，底物采用dNTPαSe。
所述的酶促DNA聚合反应包括在聚合酶链反应PCR扩增放大，或恒温扩增放大(例如环介导等温扩增LAMP放大)，或滚环扩增放大，或者反转录，或者其它聚合反应中减少副反应的应用以及其它应用方法。
具体的通过硒原子取代的α-硒-核苷三磷酸(dNTPαSe替代天然 dNTP底物，成功地用DNA聚合酶将Se原子引入到DNA中去，dNTPαSe 降低DNA聚合酶反应速度，大大地提高DNA聚合和扩增放大的特异性和准确性，抑制DNA聚合非特异性副反应发生，减少副产物。
酶促DNA聚合和扩增放大的方法可以包括PCR扩增、等温扩增、滚环扩增，或者反转录，以及其它聚合扩增放大方法。
一种用于产生核酸的酶法工艺，所得产物混合物中有非特异性核酸产物，所述工艺包括：将引物序列(或启动子序列)与模板序列退火；并且在存在酶和包含至少一个修饰核苷酸的核苷酸混合物的情况下形成修饰核酸；其中，产品混合物中的非特异性核酸产物的量小于使用类似天然核苷酸的其他相同方法的量。
进一步的，分离经修饰的核酸；并使经修饰的核酸与过氧化氢(或其他氧化或水解)溶液接触以产生类似的天然核酸。
进一步的，所述方法是cDNA合成，或者反转录，以及其它聚合， PCR扩增，滚环扩增，或等温扩增(如LAMP扩增)过程。
一种用于进行核酸延伸反应的试剂混合物，所述混合物包括：DNA 引物序列，DNA模板序列，DNA聚合酶，α-硒-核苷三磷酸dNTPαSe。
进一步的，包含反应缓冲液，该反应缓冲液包含Tris HCl， (NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％
Figure BDA0002032836710000051
X-100或其任何组合。
一种用于进行RNA转录合成的试剂混合物，所述混合物包括：DNA 启动子序列，DNA模板序列，RNA聚合酶，α-硒-核苷三磷酸NTPαSe。
一种试剂混合物，包括：引物(或启动子)序列；模板序列；聚合酶；α-硒-核苷三磷酸(dNTPαSe和NTPαSe)。
在本发明的另一方面，还提供了α-硒-核苷三磷酸在酶促方法合成Se修饰DNA和RNA中的应用。
在本发明的另一方面，提供了一种用于进行核酸延伸与合成反应的试剂混合物，其特征在于，所述混合物包括：核酸引物序列，RNA 模板序列，反转录酶，α-硒-核苷三磷酸dNTPαSe。
本发明的有益效果为：
本发明通过一锅法合成α-硒-核苷三磷酸，无需提前保护核甘中活泼基团，可直接反应生成。同时α-硒-核苷三磷酸作为酶促反应底物，同族Se原子取代O原子，对聚合酶活性和识别性的影响较小，对合成的DNA的空间结构扰动较小，dNTPαSe降低DNA聚合酶反应速度，同时对非特异合成的抑制效果明显，对合成的DNA的序列没有影响。另外，通过硒原子取代的NTPαSe底物，RNA聚合酶能够将 Se原子引入到RNA中去，NTPαSe同样能够降低RNA聚合酶反应速度，提高RNA聚合的准确性，抑制RNA聚合非特异性副反应发生，减少副产物。而且合成产物(硒DNA或RNA)既具有一定的稳定性又能被很方便地氧化或水解为常规核酸(天然的核酸)。
附图说明
图1是本发明实施例提供的HPLC纯化Se-TTP粗产物色谱；
图2是为本发明实施例提供的高效液相色谱法分析每个dNTPαSe 的非对映异构体I和II；
图3是本发明实施例提供的DNA聚合酶识别dNTPαSe不同非对应异构体分析；
图4是本发明实施例提供的在不同温度无DNA模板的情况下， dNTPαSe抑制非特异性DNA引物延伸的分析；
图5是本发明实施例提供的单个或多个dNTPαSe三磷酸盐抑制DNA恒温聚合非特异性DNA聚合的分析；
图6是本发明实施例提供的四种不同dNTPαSe抑制PCR中的非特异性扩增；
图7是本发明实施例提供的dCTPαSe对不同引物的PCR反应中非特异产物的抑制分析；
图8是本发明实施例提供的dCTPαSe对复杂模板cDNA扩增中非特异产物的抑制分析；
图9是本发明实施例提供的Bst延伸反应合成的Se修饰DNA测序分析；
图10是本发明实施例提供的H2O2脱硒前后硒-DNA的ESI质谱。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1α-硒-核苷三磷酸(dNTPαSe)的合成和纯化
1)dNTPαSe合成
将单体核苷(1，1mmol，脱氧腺苷dA[250mg]，脱氧胞苷dC[225 mg]，脱氧鸟苷dG[265mg]，或胸苷dT[240mg])，焦磷酸三丁基铵 (945mg，2mmol，2equiv)和3H-1,2-benzothiaselenol-3-one(BTSe， 435mg，2mmol，2equiv)分别放入气密性好的烧瓶中，用油泵各自在高真空抽滤干燥1小时以上。再向干燥后的焦磷酸三丁基铵中注入 DMF(1.5mL)和三丁胺(TBA，3.0mL)用于溶解焦磷酸盐。然后将溶解在DMF(3.0mL)中的无水2-氯-4H-1,3，2-苯并二氧杂磷杂环己二烯-4-酮(405mg，2mmol，2equiv)注入焦磷酸盐溶液中。
将装有该反应混合物的反应瓶在氩气保护环境下在室温搅拌60 分钟。将上步反应液加入已溶解于DMF的脱氧核苷(1.5mL；注:脱氧腺苷dA溶于1.0mL DMF and 1.5mLDMSO；脱氧鸟苷dG溶于3.0mL DMSO)。保持该核苷磷酸化反应在氩气保护和室温下搅拌进行反应1 小时后，将溶于1,4-二氧六环(2.5mL)中的BTSe注射到装有该核苷反应混合物的反应瓶中，使BTSe的氧化反应在室温下进行1小时。然后将30mL水(约为反应溶液体积的两倍的量)加入到BTSe反应混合物中，在室温下水解2小时后，在有新鲜二硫苏糖醇(DTT，2mM)存在的环境下进行乙醇/NaCl沉淀(NaCl[4.5mL，3M]和乙醇[150mL] 依次加入到反应液中)，然后将混合溶液在-80℃下冷冻20分钟后，在室温、14，000rpm的转速下离心10分钟)。去掉上清，将沉淀重新溶解在1000μL水中然后重复上述离心条件再次沉淀，最后将沉淀重新溶解在少量水(400μL)中，然后在冷冻干燥器中迅速进行冻干.
2)纯化
利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)，使用Ultimate XB-C18 HPLC 柱(10μm，30×250mm，Welch)纯化粗产物。
使用95％缓冲液A(20mM三乙胺乙酸盐(TEAAc)，pH6.6) 和5％缓冲液B至20％缓冲液B(50％乙腈水溶液，20mM TEAAc， pH6.6)的线性梯度洗脱样品(流量15mL/min)50分钟。分别收集不同非对映异构体。将纯化的非对映异构体冻干并重新溶解于少量含有 10mM三(羟甲基)氨基甲烷/HCl(Tris-HCl，pH7.5)和20mM DTT 的溶液中，储存在-80℃环境中。
纯化后的dNTPαSe的HPLC分析：通过Ultimate AQ-C18柱(5μm， 4.6×250mm，Welch)在95％缓冲液A和5％缓冲液B至26％缓冲液B的线性梯度(1mL/min)。
在合成dNTPαSe时候，通过用选择性磷酸化试剂与每个核苷进行反应。该选择性磷酸化试剂由2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphospho rin-4-one与焦磷酸盐原位反应生成，降低了2-chloro-4H-1,3,2-benzo dioxaphosphorin-4-one的反应活性，提供了具有较好的区域反应活性的磷酸化试剂。因此，磷酸化试剂可以选择性地磷酸化每个核苷的5 '-OH，生成环状亚磷酸。然后该亚磷酸盐被3H-1,2-benzothiaselen ol-3-one(BTSe)将Se-功能团氧化***。紧随其后的是水解，生成所需的Se-核苷三磷酸盐。每个dNTPαSe由于其α-P生成了手性中心，因此每种dNTPαSe具有了两种非对映异构体。
合成的dNTPαSe和NTPαSe的结构分别如下：
Figure BDA0002032836710000091
碱基包括A,C,G,T和U以及修饰碱基。
其一种异构体分别为：
Figure BDA0002032836710000101
粗产品先由乙醇沉淀(有2mM二硫苏糖醇,以避免氧化和脱硒) 纯化。沉淀化合物再由反相高效液相色谱(如图1，TTPαSe纯化)进行纯化，dNTPαSe每一对非对映体可以很好地分开(图1)。此外，所有八种非对映异构体dATPαSe，dCTPαSe,dGTPαSe和TTPαSe用高效液相色谱(图2，峰1非对应异构体保留时间较短，记为dNTPαSe I，峰 2非对映异构体记为dNTPαSe II。(A)1:共进样dATP和dATPαSe I和II； 2:dATPαSe I；3:dATPαSeII；(B)1:共进样dCTP，dCTPαSe I和II；2: dCTPαSe I；3:dCTPαSe II；(C)1:共进样dGTP，dGTPαSe I和II；2:dGTPαSe I；3:dGTPαSe II；(D)1:共进样TTP和TTPαSe I和II；2:TTPαSe I；3:TTPαSe II)，质谱(表1),1H-,13C-,和31P-核磁共振分析(表2-4)。
表1高分辨质谱分析合成的dNTPαSe合成产物
Figure BDA0002032836710000102
表2 dNTPαSe的1H-NMR化学位移(δ，ppm)，溶剂为D2O
Figure BDA0002032836710000103
Figure BDA0002032836710000111
表3 dNTPαSe的13C-NMR化学位移(δ，ppm)，溶剂为D2O
Figure BDA0002032836710000112
表4 dNTPαSe的31P-NMR化学位移(δ，ppm)，溶剂为D2O
Figure BDA0002032836710000113
实施例2 dNTPαSe非对映异构体作为底物的DNA聚合酶延伸实验
延伸DNA聚合酶反应与每个dNTPαSe非对映异构体进行了5' -FAM-labeled底物(DNA引物0.5μM)和模板(DNA模板,0.5μM),DNA 聚合酶(DNA聚合，0.04U/μL；Klenow,0.2U/μL；Bst大片段，0.3U /μL)和核苷酸(DNAPolI反应中125μM,Klenow和Bst反应中15 μM)。反应混合物37℃孵育60min，每管加入等量8M尿素变性染料溶液。完全终止于95℃干浴中孵育10min，产物经脲变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Urea-PAGE)和FAM荧光成像分析(图3，(A)用于B、C 的DNA引物、模板和产物序列。DNA引物和DNA合成产物在5’端标记为6-FAM。(B)由DNA引物延伸聚合酶I(a),Klenow(b),Bst(c)和使用四个天然核苷酸和dNTPαSe I或II替换相应的天然dNTP。第1、4、 7、10泳道(阴性对照)比13泳道(包含所有天然dNTPs)中的样品分别少加了dATP、dGTP、dCTP和TTP。第2、5、8和11泳道则分别为 dATPαSe I、dGTPαSe I、dCTPαSe I和TTPαSe I替换相应的天然核苷酸。第3、6、9和12泳道为dATPαSe II,dGTPαSe II,dCTPαSeII和TTPαSe II 分别替换相应的天然核苷酸。Lane14和Lane15分别为DNA引物和 DNA合成产物。(C)DNA引物延伸dNTPαSe I和II的混合(1:1比例)分别替换相应的天然核苷酸)。
结果可以看出，所有天然dNTPs的阳性对照产生全长DNA产物，而每个缺失一个dNTP的阴性对照则没有产生任何全长产物。发现硒核苷三磷酸中的第一个(dNTPαSe I，在HPLC中迁移较快的非对映异构体)可以有效地被DNA聚合酶所识别，而dNTPαSe II(在HPLC中迁移较慢快的非对映异构体)没有被聚合酶识别。因为DNA聚合酶识别Sp-dNTPαS非对映体作为底物，类似地，可将dNTPαSe I划分为像Sp型(暂时命名)，而dNTPαSe II为Rp型(暂时命名)。dNTPαSe I 和II精确的空间化学目前正在进行研究。每个dNTPαSe I都能产生像对应的天然dNTP一样高质量、高效率地产生全长产物(图3B)。 dNTPαSe II非对映体则既不是底物又不是抑制剂(图3B、3C)。研究结果显示，所有dNTPαSe I均为DNA聚合酶的良好底物。这些实验结果也表明,分离dNTPαSe每一对非对映体可能不是必要的，非对映异构体II不会抑制DNA聚合反应。这一发现可以很大程度上节省分离纯化dNTPαSe的工作。
实施例3 dNTPαSe在不同温度下抑制引物自身非特异性扩增
按以下组分建立反应体系：DNA引物(2μM)，Bst(0.5U/μL) 和dNTP(全为天然dNTP或者dCTPαSe和其他几种天然dNTP，每种 200μM)。在20、30、40、50和60℃下反应60分钟，聚合酶变性在95℃ 10分钟后非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析，用标记荧光基团进行显色(图4，引物序列为5'-FAM-GTCGAGTCAAGAG CATCC-3')。
由于dNTP(O原子半径:0.73A)的氧原子被更大的硒原子(1.16A) 在α磷酸位置取代，这可能会减慢DNA聚合，从而提高dNTP掺入的准确性。
设计了没有DNA模板的引物延伸，因为引物可以彼此作为非特异性模板使用，从而产生非特异性延伸的副产物，如引物二聚体和背景合成的DNA副产物。为了减少不要想的引物延伸，研究了天然和 Se修饰核苷酸在不同温度下没有模板的反应(图4)。只有天然核苷酸作为底物时，发现底物被用掉了，而且非特异性DNA发生延伸，由形成了多个副产物。相反，dNTPαSe(比如dCTPαSe I)替换相应的天然 dNTP可以在宽温度范围内(30-60℃)有效防止非特异性DNA引物延伸。
实施例4 dNTPαSe抑制恒温聚合非特异性DNA引物延伸
按以下组分建立反应体系：DNA引物(2μM)，DNA模板(2μM)， Bst(0.5U/μL)和天然和/或Se-修饰核苷酸(200μM，每个核苷酸)。在55℃延伸60分钟或90分钟。产物用非变性PAGE，gel-red染色后照胶分析(图5，(A)B-C中的引物、模板和产物。对聚合产物进行非变性PAGE分析，(B)仅使用引物或模板，或(C)使用或不使用引物和模板。 DNA延伸反应按照以下进行：模板，dNTP或dNTPαSe，Bst聚合酶，反应缓冲条件下，55℃，60分钟)。
设计了在有DNA模板和Bst的情况下，用引物延伸进行DNA合成，在最佳温度为55℃下进行合成(图5)。结果发现，在DNA模板存在和缺失的情况下，天然dNTPs引起非特异性DNA聚合，产生多个副产物(尤其是较长的副产物，图5B)。相反，dNTPαSeI取代(一个或多个核苷酸)的样品中，产生更干净的聚合产物(存在和缺乏DNA模板)，产率也差不多。由于引物没有标记，这些PAGE凝胶通过GelRed染色，可视化反应样品中生成的DNA。“onlyprimer”实验(图5B)中缺乏信号 (lane3-6)是由于Se修饰的dNTPs完全抑制了非特异性延伸，尤其是在存在多个Se-dNTPs的情况下。在没有DNA的情况下，没有观察到 DNA聚合酶的从头合成(图5C)。此外，观察到单dNTPαSe I替换可以有效地抑制副产物的形成。此外，多个Se-dNTPs可以完全防止非特异性，而且合成效率还相似。DNA聚合酶还是具有功能，甚至所有4 个天然核苷酸都替换成4个dNTPαSe I时，产率仍能保持不变。显然，与天然dNTPs相比，Se修饰的dNTPs在DNA引物延伸和聚合方面具有更高的特异性。
实施例5 dNTPαSe抑制DNA非特异性PCR扩增
按以下组分建立反应体系：DNA引物(0.4μM)，DNA模板，Taq (0.075U/μL Transgen有限公司)、核苷酸(200μM)和1×Taq缓冲液(20 mM Tris-HCl，pH值8.3；20mM氯化钾；10mM(NH4)2SO4；2mM MgCl2)。反应条件是：94℃ 3分钟；35循环：94℃ 30s，最佳引物退火温度30s， 72℃ 90s；最后72℃的延伸5分钟。然后琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色成像分析产物(图6-8)。
在Taq DNA聚合酶链反应扩增环状和线性化质粒中，发现，dN TPαSe I可以明显抑制非特异性产物生成(图6，完全匹配引物(正向: 5'-TCAAGATCCGCCACAACATC-3'；反向:5'-CTGGGTGCTCAGGTAGTG-3')，特异性产物长度为119bp。(A)以环状质粒(pEGFP-C1)为模板的PCR扩增；(B)以线性化质粒(pEGFP-C1)为模板的PCR扩增)对PC R产量却没有影响。特别是dCTPαSeI几乎完全抑制非特异性产物和生成更特异的产物。
为测试的dCTPαSeI对非特异性扩增的影响的普遍性，检查了3 个新引物对(AF/AR,BF/BR,CF/CR)和以前的引物对(DF/DR)。结果表明，所有使用4种天然dNTPs的反应均产生明显的非特异性产物，当 Se-dCTP取代天然dCTP时，这些产物可被完全抑制(图7，(A)四对引物的序列；(B)PCR反应中dCTPαSe与天然dNTPs相比对聚合特异性的影响.以pEGFP-C1质粒为模板；引物对A-D都是完全匹配的特异性引物)。
相对于从细胞总RNA逆转录而来的总cDNAs，使用的质粒 (pEGFP-C1)在PCR反应中是一个非常简单的模板，因此即使反应条件已经优化，在PCR中以cDNAs为模板很容易产生非特异性产物。对cDNA模板的扩增反应结果显示(图8，(A)人源cDNA模板，扩增靶序列和引物；(B)与天然dNTP相比较，dCTPαSe对cDNA扩增中非特异扩增的抑制)，dCTPαSe对cDNA扩增中非特异扩增的抑制：当用dCTPαSeI(中间泳道)取代dCTP(左边泳道)后，非特异性DNA扩增被完全抑制，而且扩增效率没有受到显著影响。
实施例6 PSe-DNA和相应的天然DNA的PCR产物测序
用dNTPαSe，天然模板DNA(5'-acgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtacccggggatcctctagag-tcgacctgcaggcatgcaagcttggcgtaatc-atgg-tc at-3')和引物T(5'-aatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgcc-3')首先制备 Se-DNA(图9)。用尿素PAGE凝胶(12.5％)纯化聚合的Se-DNA。纯化的 Se-DNA作为模板的PCR扩增，以dNTPαSe和/或天然底物0.2mM， 0.6μM引物，0.15U/μl Taq DNA聚合酶和Mg2+2mM。然后用正向引物和反向引物进行测序。
为了确认在以dNTPαSe为底物、以Se-DNA为模板进行DNA聚合后的序列完整性，对扩增后的序列进行了测序。首先，用dNTPα Se作为底物和天然DNA模板合成了含Se的DNA，并通过PAGE胶纯化了Se-DNA产物。为了促进Se-DNA的分离，使用较长的DNA作为引物。纯化后的Se-DNA作为模板，以dNTPαSe作为底物，进行了 30循环的PCR扩增。然后用正、反向其引物进行测序。同时，用天然dNTPs进行了相同的实验，并对测序结果进行了比较。发现它们具有相同的最终序列(表5；图9，引物T(具有不配对的5'-端)、引物F 和引物R的序列分别为5'-d(aatttcacacaggaaatgaccatgattacgcc)-3'、5'-d (aatttcacacaggaaacagct)-3'和5'-d(acgacgttgtaaaacacacg)-3')。
表5 PCR产物测序
Figure BDA0002032836710000171
实施例7 Se-DNA的氧化脱硒为天然DNA
为了将Se-DNA转化为相应的native DNA，用过氧化氢进行氧化。通过指数放大反应(EXPAR)制备了单链天然和硒修饰的DNA。这两个 DNA序列经PAGE纯化，C18小柱脱盐(Sep-pac Vac,Waters公司)。然后用3％新鲜H2O2对Se-DNA进行脱硒处理，室温24小时或50℃ 2 小时。所得样品经ESI-MS分析(图10，单链Se-DNA序列为 5’-d(pApGpTpApCpTpApGpApTpGpTpGpApGpApCpApTpC)，含有dC-硒磷酸。Se-DNA分子式:C197H247N79O116P20Se3，[M-H+]-:6432.8(calc.)；完全脱硒的Se-DNAs(对应的nativeDNA)分子式:C197H247N79O119P20， [M-3Se+3O-H+]-:6243.1(calc.)。A:经H2O2处理和不经H2O2处理的Se-DNA在室温下24h的质谱重叠图谱(分别为红色和灰色谱)，观察到的质量分别为6431.9(6432.8,calc.)and6433.3(6432.8,calc.)； B:在50℃下，H2O2不处理和处理2小时，Se-DNA的质谱重叠图谱(分别为红色和灰色谱)，观察到的质量分别为6431.9(6432.8,calc.) and 6243.1(6245.2,calc.)。
研究结果表明，dNTPαSe和Se-DNA可以分别直接用作常规底物和DNA模板。这种DNA中的Se修饰可以在室温下24小时不被过氧化氢去除(图10A)。而在相同氧化条件下，仅仅50℃和短时间的处理，硒就可以被过氧化氢选择性地氧化去除(图10B)，生成相应的常规DNA(天然DNA)。虽然Se-DNA相对稳定，但可以方便地将其转化为相应的常规DNA。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 黄震
<120> 一种α-硒-核苷三磷酸的合成,和其高特异性核酸酶促聚合及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcgagtcaa gagcatcc 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcaagatccg ccacaacatc 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgggtgctc aggtagtg 18
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatttcacac aggaaatgac catgattacg cc 32
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatttcacac aggaaacagc t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgacgttgt aaaacacacg 20
<210> 7
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acccggggat cctctagagt 60
cgacctgcag gcatgcaagc ttggcgtaat catggtcat 99
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgcc 38
<210> 9
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acccggggat cctctagagt 60
cgacctgcag 70
<210> 10
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctctagagtc gacctgcagg catgcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 60
tgtgaaatt 69

Claims (1)

1.一种用于产生核酸的酶法方法，其特征在于，在cDNA合成、PCR扩增、滚环扩增或等温扩增过程中，将引物序列或启动子序列与模板序列进行退火反应，且在存在酶和包含至少一个Se修饰核苷酸的核苷酸混合物的情况下形成修饰核酸片段，分离形成的修饰核酸片段，并使经修饰的核酸片段与过氧化氢或水解溶液接触以产生类似的天然核酸；
所述的Se修饰核苷酸为α-硒-核苷三磷酸，结构式如下：
Figure FDA0003027527680000011
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