CN110313401A - 一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法 - Google Patents
一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110313401A CN110313401A CN201910630104.3A CN201910630104A CN110313401A CN 110313401 A CN110313401 A CN 110313401A CN 201910630104 A CN201910630104 A CN 201910630104A CN 110313401 A CN110313401 A CN 110313401A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- yucasin
- sword
- chalk
- cultivated
- chinese cymbidium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法，将企剑白墨墨兰根状茎接种于芽分化培养基中进行培养，所述芽分化培养基中含有细胞***素6‑BA和催化生长素生物合成的类黄素单加氧酶专一性抑制剂Yucasin，促进了激素相关基因的表达并引起内源激素微环境的改变，从而促进企剑白墨墨兰根状茎芽分化，可直接用于企剑白墨墨兰种苗的工厂化生产，推动墨兰产业发展。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养，具体地涉及一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法。
背景技术
中国兰，简称国兰(Chinese Cymbidium)，是指兰科兰属(Cymbidium)植物中的一部分地生种，包括春兰、墨兰、蕙兰、建兰、寒兰、春剑、莲瓣兰、豆瓣兰、送春等，具有极高的观赏价值、经济价值和文化价值。墨兰是国兰中最先被驯化、栽培最为广泛的种类之一。其中，‘企剑白墨墨兰’是墨兰四大传统品种之一，因其姿态秀美、芳香馥郁、花香幽远，深受达官贵人、文人雅士喜爱，是中国兰文化重要物质载体之一。随着中国日益强大，作为中国传统文化物质载体的国兰将具有更广阔的市场前景。
种苗工厂化繁殖是兰花产业的核心技术之一，直接影响兰花育种和种苗生产的效率。以大花蕙兰为代表的附生兰，中间繁殖体为类原球茎，易工厂化繁殖，早在上世纪60年代已形成‘兰花工业’；以国兰为代表的地生兰，中间繁殖体为根状茎，种苗工厂化繁殖难，导致目前国兰种苗生产仍然以分株繁殖为主，严重制约了国兰产业化发展。
兰花种苗工厂化生产可分为中间繁殖体诱导、增殖、芽分化、生根壮苗和试管苗移栽5个步骤。国兰组培快繁难的主要原因在于中间繁殖体根状茎难分化。如企剑白墨墨兰在组织培养过程中存在中间繁殖体根状茎分化难的问题，导致其工厂化繁殖效率低，无法满足商业化生产的要求。
发明内容
本发明的目的是为提高墨兰组织培养过程中苗分化的效率而提供一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法。
一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法，将企剑白墨墨兰根状茎接种于芽分化培养基中进行培养，所述芽分化培养基中含有6-BA和Yucasin。
所述的芽分化培养基包括以下组分：MS培养基+0.1～1.0mg/L 6-BA+30～100μmol/L Yucasin+25g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶，pH为5.4～5.8。
所述芽分化培养基配制方法为：将MS培养基、6-BA、蔗糖和卡拉胶混合并调节pH至5.4～5.8，经高压蒸汽灭菌，冷却，再加入经过滤灭菌的Yucasin。Yucasin为生长素吲哚乙酸(IAA)的生物合成吲哚丙酮酸(IPA)途径的关键酶——类黄素单加氧酶(YUCCA)专一抑制剂：5-(4-氯苯基)-2,4-二氢-[1,2,4]-***-3-硫酮，即5-(4Chlorophenyl)-2,4-dihydro-[1,2,4]-triazole-3-thione。
所述高压蒸汽灭菌的温度120～125℃，时间15～25min。
所述企剑白墨墨兰根状茎长度为1.0～1.5cm。
所述培养条件为：每天光照12～14小时，光照强度为1500～2000lux，培养温度为25～27℃的条件下培养，培养10～30天。与现有技术相比，本发明具有以下效果：
(1)芽分化是企剑白墨墨兰种苗工厂化繁殖的关键步骤，生长素和细胞***素在其中挥着关键作用。Yucasin是类黄素单加氧酶(YUCCA)专一性抑制剂，本发明在芽分化培养基中同时加入Yucasin和6-BA能显著促进企剑白墨墨兰根状茎激素相关基因YUCCA7,8、LAX2、PIN3、ABCB7,9、IAA3,4,6,9、GH3.4,6、ARF13、CRR2和LOG1的表达。
(2)在培养基中同时加入Yucasin和6-BA显著提高企剑白墨墨兰根状茎的玉米素及玉米素核苷、油菜素内酯和茉莉酸甲酯内源激素含量的同时，显著降低生长素和脱落酸内源激素的含量。
(3)本发明提供的方法首次将Yucasin与6-BA同时应用于企剑白墨墨兰组织培养中，促进了激素相关基因的表达并引起内源激素微环境的改变，从而促进企剑白墨墨兰根状茎的芽分化，可直接用于企剑白墨墨兰的工厂化生产，推动墨兰产业发展。
附图说明
图1为Yucasin在生长素(IAA)生物合成吲哚丙酮酸(IPA)途径作用示意图。
图2为Yucasin和激素对企剑白墨墨兰根状茎芽分化的影响(其中，CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μM yucasin培养基中培养)。
图3为企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程中激素相关基因YUC7的表达分析(其中，CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图4为企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程中激素相关基因YUC8的表达分析(其中，CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图5为企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程中激素相关基因LAX2的表达分析(其中，CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图6为企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程中激素相关基因PIN3的表达分析(其中，CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图7为企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程中激素相关基因ABCB7的表达分析(其中，CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图8为企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程中激素相关基因ABCB9的表达分析(其中，CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图9为企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程中激素相关基因IAA3的表达分析(其中，CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图10为企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程中激素相关基因IAA4的表达分析(其中，CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图11为企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程中激素相关基因IAA6的表达分析(其中，CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图12为企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程中激素相关基因IAA9的表达分析(其中，CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图13为企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程中激素相关基因ARF13的表达分析(其中，CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图14为企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程中激素相关基因GH3.4的表达分析(其中，CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图15为企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程中激素相关基因GH3.6的表达分析(其中，CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图16为企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程中激素相关基因CaRR2的表达分析(其中，CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图17为企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程中激素相关基因LOG1的表达分析(其中，CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图18为Yucasin联合6-BA对企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程内源生长素(IAA)的影响(CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图19为Yucasin联合6-BA对企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程内源异戊烯腺嘌呤及异戊烯腺苷(iP+iPR)的影响(CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/LIAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μM yucasin培养基中培养)。
图20为Yucasin联合6-BA对企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程内源玉米素及玉米素核苷(Z+ZR)的影响(CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L6-BA+50μM yucasin培养基中培养)。
图21为Yucasin联合6-BA对企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程内源双氢玉米素及双氢玉米素核苷(DHZ+DHZR)的影响(CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μMyucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μM yucasin培养基中培养)。
图22为Yucasin联合6-BA对企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程内源油菜素内酯(BRs)的影响(CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μM yucasin培养基中培养)。
图23为Yucasin联合6-BA对企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程内源茉莉酸甲酯(JA-me)的影响(CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μM yucasin培养基中培养)。
图24为Yucasin联合6-BA对企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程内源脱落酸(ABA)的影响(CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图25为Yucasin联合6-BA对企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程内源赤霉素3(GA3)的影响(CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
图26为Yucasin联合6-BA对企剑白墨墨兰根状茎芽分化过程内源赤霉素4(GA4)的影响(CK:在不含激素和yucasin培养基中培养；IAA:在含1.0mg/L IAA培养基中培养；6-BA:在含1.0mg/L6-BA培养基中培养；Yucasin:在含50μM yucasin培养基中培养；IAA+Yucasin:在含1.0mg/L IAA+50μM yucasin培养基中培养；6-BA+Yucasin:在含1.0mg/L 6-BA+50μMyucasin培养基中培养)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1 Yucasin联合6-BA促进企剑白墨墨兰根状茎芽的分化
(1)取长度为1.0～1.5cm的企剑白墨墨兰根状茎，接种于CK、IAA、6-BA、Yucasin、(Yucasin+IAA)和(Yucasin+6-BA)的6个处理中，每瓶接入10根根状茎，每处理各接21瓶。接种后置于培养箱中培养，温度：26±1℃，光照：2000lux,12h/d。在6个取样点(5天、10天、15天、20天、25天和30天)拍照后统计根状茎芽分化率。芽分化率计算公式为：
芽分化率＝(芽分化的根状茎数/接入根状茎数)×100％。
(2)培养基及处理条件：
CK：MS培养基+25.0g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶,pH＝5.8；
IAA：MS培养基+25.0g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶+1.0mg/L IAA,pH＝5.8；
6-BA：MS培养基+7.0g/L卡拉胶+1.0mg/L 6-BA,pH＝5.8；
Yucasin：MS培养基+25.0g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶+50μM Yucasin,pH＝5.8；
Yucasin+IAA：MS培养基+25.0g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶+200μM Yucasin+1.0mg/LIAA,pH＝5.8；
Yucasin+6-BA：MS培养基+25.0g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶+200μM Yucasin+1.0mg/L6-BA,pH＝5.8。
试验结果如图2所示，企剑白墨墨兰根状茎在6-BA和Yucasin+6-BA两种处理中能进行芽的分化，而其他处理不能分化。在Yucasin+6-BA中企剑白墨墨兰根状茎培养10天后即开始分化，培养25天后芽分化率达到100％，而在6-BA处理中企剑白墨墨兰根状茎培养15天后才开始芽的分化，但芽分化效率较低。
实施例2 Yucasin联合6-BA促进企剑白墨墨兰根状茎激素相关基因的表达
(1)取长度为1.0～1.5cm的企剑白墨墨兰根状茎，接种于CK、6-BA、Yucasin和(Yucasin+6-BA)的4个处理中，每瓶接入10根根状茎，每处理各接7瓶；接种后置于培养箱(温度：26±1℃，光照：2000lux,12h/d)中培养，在7个取样点(0天、5天、10天、15天、20天、25天和30天)每处理各随机取1瓶，共10根根状茎，并随机分成3组，每组3根根状茎(即一个重复样)约0.3克，取样后立即置于液氮中速冻，若不进行后续操作可保存于-80℃冰箱。
(2)培养基及处理条件：
CK：MS培养基+25.0g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶，pH＝5.8；
6-BA：MS培养基+7.0g/L卡拉胶+1.0mg/L 6-BA，pH＝5.8；
Yucasin：MS培养基+25.0g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶+50μM Yucasin，pH＝5.8；
Yucasin+6-BA：MS培养基+25.0g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶+200μM Yucasin+1.0mg/L6-BA，pH＝5.8。
(3)样品总RNA提取。取企剑白墨墨兰根状茎按天根生化科技有限公司提供的RNAprep Pure Plant Kit(Polysaccharides&Polyphenolics-rich)试剂盒进行。总RNA经琼脂糖凝胶电泳初步检验后，Nanodrop检测纯度，Agilent 2100检测RNA的浓度、总量和RIN值等。
(4)qRT-PCR分析。以企剑白墨墨兰根状茎的样品cDNA为模板，Rps3为内参基因，对15个纹瓣兰激素相关基因(表3)进行实时荧光定量PCR分析。
表1实时荧光定量PCR反应体系
表2实时荧光定量PCR程序
试验结果如图3-17所示，企剑白墨墨兰根状茎15个激素相关基因在(Yucasin+6-BA)处理中的表达量显著高于CK、6-BA和Yucasin处理的表达量，这说明了Yucasin联合6-BA促进了企剑白墨墨兰根状茎激素相关基因的表达。
表3激素相关基因及其qRT-PCR引物
实施例3Yucasin联合6-BA对企剑白墨墨兰根状茎内源激素含量的影响
(1)取长度为1.0～1.5cm的企剑白墨墨兰根状茎，接种于CK、6-BA、Yucasin和(Yucasin+6-BA)的4个处理中，每瓶接入10根根状茎，每处理各接3瓶。接种后置于培养箱(温度：26±1℃，光照：2000lux,12h/d)中培养。
(2)培养基及处理条件
CK：MS培养基+25.0g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶，pH＝5.8；
6-BA：MS培养基+7.0g/L卡拉胶+1.0mg/L 6-BA，pH＝5.8；
Yucasin：MS培养基+25.0g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶+50μM Yucasin，pH＝5.8；
Yucasin+6-BA：MS培养基+25.0g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶+200μM Yucasin+1.0mg/L6-BA,pH＝5.8。
(3)培养30天后取样点每处理取3瓶材料用于内源激素含量测定，共30根根状茎，并随机分成3组，每组10根根状茎(即一个重复样)，约0.8克，取样后立即置于液氮中速冻，若不进行后续操作可保存于-80℃冰箱。
(4)采用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked Immunosorbent Assays,ELISA)测定企剑白墨墨兰根状茎中的生长素(IAA)、异戊烯腺嘌呤及异戊烯腺苷(iP+iPR)、玉米素及玉米素核苷(Z+ZR)、双氢玉米素及双氢玉米素核苷(DHZ+DHZR)、茉莉酸甲酯(JA-me)、脱落酸(ABA)、赤霉素3(GA3)、赤霉素4(GA4)和油菜素内酯(BRs)等9种内源激素的含量，具体操作步骤按植物激素酶联免疫分析试剂盒(北京北农天一生物技术有限公司)内操作说明进行。
试验结果如图18-26所示，(Yucasin+6-BA)处理中企剑白墨墨兰根状茎的玉米素及玉米素核苷(Z+ZR)、油菜素内酯(BRs)和茉莉酸甲酯(JA-Me)含量显著高于(CK)、(6-BA)和(Yucasin)处理的含量，而生长素(IAA)和脱落酸(ABA)的含量显著低于(CK)、(6-BA)和(Yucasin)处理的含量。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 1
aaaagcccat gagcagacga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 2
caatcccctc tccgattccg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 3
agggtgatca gaagcttgcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 4
gagtccaagc atccagccat 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 5
cacgttcggt ctcttcacca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 6
gtaagagaga ggtggcggtg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 7
tggataggga atctgctgcg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 8
caatgctcag gcatcaaccg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 9
tgcttatggg aaggcaggtg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 10
tttctccaac ttgggtggca 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 11
tagcgtcctg aacgaggaga 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 12
tgtataccgg ggagaggcaa 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 13
agacggcgga tccaattacg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 14
agcctttggc ttcagatccc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 15
acgcttgtga ggtcaagagg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 16
gcctccgatc tcctggaatg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 17
tctcaagcgc tgcagaaaga 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 18
tggagccccc tacttgagaa 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 19
agcttggtag ctctggagga 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 20
ttttcagcgc gttctttcgg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 21
gtaccgactg ggtgacatgg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 22
ttgagggctt tctcgacgac 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 23
tcggaacctg ctccttgaac 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 24
ccgagatact cgagcggaac 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 25
ctttcccctt ccgcaggatt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 26
tcgttcaagg ttacggtggg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 27
agcaccttca accccacaat 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 28
agaaacgacg cattttggca 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 29
tatcagcttg cagccgttca 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence企剑白墨墨兰)
<400> 30
gcttgggaca ctaagcccat 20
Claims (6)
1.一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法，将企剑白墨墨兰根状茎接种于芽分化培养基中进行培养，其特征在于，所述芽分化培养基中含有6-BA和Yucasin。
2.根据权利要求1所述的促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法，其特征在于，所述的芽分化培养基包括以下组分：MS培养基+0.1～1.0mg/L 6-BA+30～100μmol/LYucasin+25g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶，pH为5.4～5.8。
3.根据权利要求2所述的促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法，其特征在于，所述芽分化培养基配制方法为：将MS培养基、6-BA、蔗糖和卡拉胶混合并调节pH至5.4～5.8，经高压蒸汽灭菌，冷却，再加入经过滤灭菌的Yucasin。
4.根据权利要求3所述的促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法，其特征在于，所述高压蒸汽灭菌的温度为120～125℃，时间为15～25min。
5.根据权利要求1所述的促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法，其特征在于，所述企剑白墨墨兰根状茎长度为1.0～1.5cm。
6.根据权利要求1所述的促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法，其特征在于，所述培养条件为：每天光照12～14小时，光照强度为1500～2000lux，培养温度为25～27℃的条件下培养，培养10～30天。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910630104.3A CN110313401A (zh) | 2019-07-12 | 2019-07-12 | 一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910630104.3A CN110313401A (zh) | 2019-07-12 | 2019-07-12 | 一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110313401A true CN110313401A (zh) | 2019-10-11 |
Family
ID=68122070
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910630104.3A Pending CN110313401A (zh) | 2019-07-12 | 2019-07-12 | 一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110313401A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116369206A (zh) * | 2023-04-24 | 2023-07-04 | 玉林师范学院 | 一种促进墨兰根状茎根分化方法 |
| CN116569841A (zh) * | 2023-04-24 | 2023-08-11 | 玉林师范学院 | 小分子有机化合物Prenol在墨兰根状茎根分化培养中的应用 |
| CN116602208A (zh) * | 2023-04-24 | 2023-08-18 | 玉林师范学院 | 一种墨兰根状茎植株再生方法 |
| CN116602209A (zh) * | 2023-04-24 | 2023-08-18 | 玉林师范学院 | Gpp在墨兰根状茎芽分化培养中的应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN85108913A (zh) * | 1985-11-04 | 1987-05-20 | 生物有机体公司 | 微生物的植物生长促进剂及产量增加剂 |
| US20070093483A1 (en) * | 2003-04-25 | 2007-04-26 | Astrazeneca Ab | Use of derivatives of 2, 4-dihydro-[1,2,4] triazole-3-thione as inhibitors of the enzyme myeloperoxidase (mpo) |
| CN103704126A (zh) * | 2013-12-11 | 2014-04-09 | 华南农业大学 | 一种创建兰花高效发生2n雄配子资源的方法 |
| CN107667848A (zh) * | 2017-09-26 | 2018-02-09 | 华南农业大学 | 一种创建易工厂化繁殖墨兰资源的方法 |
| CN107873525A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-04-06 | 武汉生物工程学院 | 一种墨兰组织培养快速繁殖方法 |
| CN108849504A (zh) * | 2018-06-20 | 2018-11-23 | 福建农林大学 | 一种杂交建兰根状茎诱导花芽成花的方法 |
-
2019
- 2019-07-12 CN CN201910630104.3A patent/CN110313401A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN85108913A (zh) * | 1985-11-04 | 1987-05-20 | 生物有机体公司 | 微生物的植物生长促进剂及产量增加剂 |
| US20070093483A1 (en) * | 2003-04-25 | 2007-04-26 | Astrazeneca Ab | Use of derivatives of 2, 4-dihydro-[1,2,4] triazole-3-thione as inhibitors of the enzyme myeloperoxidase (mpo) |
| CN103704126A (zh) * | 2013-12-11 | 2014-04-09 | 华南农业大学 | 一种创建兰花高效发生2n雄配子资源的方法 |
| CN107667848A (zh) * | 2017-09-26 | 2018-02-09 | 华南农业大学 | 一种创建易工厂化繁殖墨兰资源的方法 |
| CN107873525A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-04-06 | 武汉生物工程学院 | 一种墨兰组织培养快速繁殖方法 |
| CN108849504A (zh) * | 2018-06-20 | 2018-11-23 | 福建农林大学 | 一种杂交建兰根状茎诱导花芽成花的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LIU Y等: "Transcriptomic and Hormonal Analyses Reveal that YUC-Mediated Auxin Biogenesis Is Involved in Shoot Regeneration from Rhizome in Cymbidium", 《FRONTIERS IN PLANT SCIENCE》 * |
| 刘阳: "墨兰易工厂化繁殖资源创制及芽分化机理研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116369206A (zh) * | 2023-04-24 | 2023-07-04 | 玉林师范学院 | 一种促进墨兰根状茎根分化方法 |
| CN116569841A (zh) * | 2023-04-24 | 2023-08-11 | 玉林师范学院 | 小分子有机化合物Prenol在墨兰根状茎根分化培养中的应用 |
| CN116602208A (zh) * | 2023-04-24 | 2023-08-18 | 玉林师范学院 | 一种墨兰根状茎植株再生方法 |
| CN116602209A (zh) * | 2023-04-24 | 2023-08-18 | 玉林师范学院 | Gpp在墨兰根状茎芽分化培养中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110313401A (zh) | 一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法 | |
| CN100410362C (zh) | 高密度高品质培养小球藻的方法 | |
| CN101790935B (zh) | 马铃薯离体培养一步成苗培养基及其优化方法及成苗方法 | |
| CN103923841B (zh) | 一株对家蚕具有高致病力的球孢白僵菌菌株及其应用 | |
| CN106011005B (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌t600及其菌剂制备方法和应用 | |
| CN104651239A (zh) | 一种促进齿瓣石斛种子萌发形成幼苗的菌株及其应用 | |
| CN101822214A (zh) | 马铃薯茎节段直接培育微型种薯的育种方法 | |
| CN113943660B (zh) | 一株用于防控连作土传枯萎病的篮状菌属真菌njau-l8及其应用 | |
| CN109652455A (zh) | 一种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法及其应用 | |
| CN101946709A (zh) | 高原大花红景天种子育苗方法 | |
| CN110396485A (zh) | 产生生长素的类短短芽孢杆菌及其应用 | |
| CN104604678B (zh) | 一种野生竹节参无糖开放式组织培养快速育苗方法 | |
| CN102067818B (zh) | 试管藕诱导方法 | |
| CN109402009B (zh) | 一种筛选拮抗立枯丝核菌的固氮蓝藻的方法及其应用 | |
| CN104126508B (zh) | 一种兰花无菌苗快速菌根化的方法 | |
| CN106479898A (zh) | 一种雨生红球藻的培养基及其应用 | |
| CN110432154A (zh) | 一种桫椤组织的培养方法 | |
| CN107446867B (zh) | 一种红壤旱地非共生固氮菌及其培养方法和应用 | |
| CN103540534B (zh) | 高蛋白沙漠绿藻的工业化培养方法 | |
| CN110257277A (zh) | 一种复合菌剂zlm-11及其应用 | |
| CN101974561A (zh) | 农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法 | |
| CN105767016B (zh) | 一种抑食金球藻抑藻剂及其制备方法 | |
| CN105420167B (zh) | 一种蜡状芽孢杆菌及其应用 | |
| KR20080073388A (ko) | 체세포배 세포 급속증식을 이용한 나리류의 자구 대량생산방법 | |
| CN113817653A (zh) | 一株荧光假单胞菌BsEB-1及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zeng Ruizhen Inventor after: Liang Junsong Inventor after: Li Jieni Inventor after: Guo Herong Inventor after: Xie Li Inventor after: Zhang Zhisheng Inventor before: Zeng Ruizhen Inventor before: Liang Junsong Inventor before: Li Jieni Inventor before: Guo Herong Inventor before: Zhang Zhisheng |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191011 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |