CN110305818A - 一种阿维菌素菌种选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种阿维菌素菌种选育方法，该方法将阿维菌素孢子液稀释后经平面培养、斜面培养、种子培养、发酵培养得到高效价的单菌落并进行保种，平板培养基按质量百分比计，由以下组分组成：无水葡糖糖1‑5％、酵母浸粉0.1‑0.5％、磷酸氢二钾0.05‑0.5％、氯化钠0.3‑1.5％、琼脂1‑8％、余量为水；本发明的选育方法可以提高单菌落的孢子数量以及形态规则饱满的单菌落，与传统阿维菌种育种方法相比，大大的提高了得到高产菌的机率，提高筛选效率、节约筛选成本，平面培养基培养得到的阿维菌素单菌落孢子产量高，形态规则，呈火山状、草帽型。
Description
技术领域
本发明涉及一种阿维菌素菌种选育方法，属于菌种选育领域。
背景技术
阿维菌素，英文名称Avermectins，是由日本北里大学大村智等和美国Merck公司首先开发的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物，由链霉菌中灰色链霉菌Streptomyces avermitilis发酵产生，被行业人士称赞“青春永驻”的阿维菌素，目前已是全球用量最大、使用技术最成熟的农药品类之一。
目前，阿维菌素育种中，固体培养基多为琼脂，添加的氮源种类繁多，如酵母膏、牛肉膏、硫酸铵、豆饼花生饼粉等，但是这些氮源都不适合阿维菌素的单菌落生长，得到的阿维菌素单菌落孢子产量少，形态不规则，因此，目前的阿维菌素育种得到的单菌落状态严重影响了大批量育种的进度，甚至是暂停了育种的进度，随之阿维菌素市场容量越来越大，销售前景乐观。因此提高阿维菌素育种水平，提高经济效益，势在必行。
因此，有必要研发一种快速有效的阿维菌素菌种选育方法。
发明内容
针对现有的阿维菌素育种中，阿维菌素单菌落孢子产量少，形态不规则的缺陷，本发明提供一种阿维菌素菌种选育方法。
本发明的技术方案如下：
一种阿维菌素菌种选育方法，包括步骤如下：
(1)平面培养：将冻存的阿维菌素孢子液用无菌水稀释得到孢子悬浮液，将孢子悬浮液涂覆在平板培养基上，将平板培养基置于温度26-29℃的恒温条件下培养7-10天进行分离纯化，完成平面培养，
所述平板培养基按质量百分比计，由以下组分组成：无水葡糖糖1-5％、酵母浸粉0.1-0.5％、磷酸氢二钾0.05-0.5％、氯化钠0.3-1.5％、琼脂1-8％、余量为水；
(2)斜面培养：平面培养结束后在无菌室内挑选平板培养基上的阿维菌素单菌落，采用接种针将阿维菌素单菌落接种于斜面培养基上进行斜面培养；
(3)种子培养：将步骤(2)培养成熟的斜面菌种接于种子瓶培养基上，将种子瓶置于摇床上进行摇床培养，得到种子液；
(4)发酵培养：将种子液转接于发酵瓶培养基中，将发酵瓶置于摇床上进行摇床培养；
(5)单菌落效价测试：发酵培养结束后采用HPLC法测试单菌落效价，高效价者进行保种。
根据本发明优选的，步骤(1)中，孢子悬浮液的浓度为10-1～10-6。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述平板培养基按质量百分比计，由以下组分组成：无水葡糖糖1.5％、酵母浸粉0.25％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钠0.6％、琼脂2％、余量为水，pH 7.2-7.4，121℃灭菌30min。
根据本发明优选的，所述的酵母浸粉总氮质量分数为10.56～11.32％、氨基氮质量分数为5.06～5.28％，氯化物质量分数为0.2～0.4％，磷酸盐和碱性沉淀实验无沉淀出现，色泽呈亮黄色。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述的斜面培养为将斜面培养基置于温度26-29℃的恒温条件下培养4-6天，完成斜面培养。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述斜面培养基按质量百分比计，由以下组分组成：可溶性淀粉0.1％、酵母粉0.2％、麦芽提取物0.5％、六水合氯化钴0.001％、琼脂2％、余量为水，pH 7.2-7.4，121℃灭菌30min。
根据本发明优选的，步骤(3)中，摇床转速230-260转/分，培养温度为26-29℃，培养时间为34-39h。
根据本发明优选的，步骤(3)中，种子瓶培养基按质量百分比计，由以下组分组成：玉米淀粉2.5％、豆饼粉0.8％、花生饼粉1％、酵母粉0.5％、酵母膏0.5％、六水合氯化钴0.003％、淀粉酶0.067％、余量为水，pH 7.0-7.20，121℃灭菌30min。
根据本发明优选的，步骤(4)中，摇床转速为230-260转/分，培养温度为26-29℃，培养时间为6-12天。
根据本发明优选的，步骤(4)中，发酵瓶培养基按质量百分比计，由以下组分组成：玉米淀粉7％、豆饼粉0.8％、花生饼粉1％、酵母粉0.5％、酵母膏0.5％、玉米浆0.2％、六水合氯化钴0.003％、淀粉酶0.067％、余量为水，pH 7.2-7.5，121℃灭菌30min。
根据本发明优选的，步骤(5)中，测试单菌落效价的具体方法为：取1g步骤(4)发酵成熟的发酵液加入甲醇稀释，充分超声震荡混合，在转速3000rpm下离心10min，静置后，经0.22um有机滤膜过滤，收集滤液，用HPLC法测定其单菌落效价。
本发明步骤(5)中将效价高的菌株找出对应的斜面，用接种针刮孢子到牛奶甘油中，均匀打散，分别取1ml牛奶甘油种子液到冻存管中，拧紧封口，放入-80℃冰箱保存备用；将所保高产效价菌株随机取5支冻存管传斜面验证效价，所验效价稳定且高于对照3次以上可作为目标菌株，上中试罐验证，若高产菌株效价继续保持优势，则上大生产验证。
本发明的优点如下：
1、本发明的选育方法可以提高单菌落的孢子数量以及形态规则饱满的单菌落，与传统阿维菌种育种方法相比，大大的提高了得到高产菌的机率，提高筛选效率、节约筛选成本。
2、本发明的平面培养基可以加快育种进度，并把原来的培养周期缩短2-3天，大大提高筛选效率、节约筛选成本。
3、本发明的平面培养基培养得到的阿维菌素单菌落孢子产量高，形态规则，呈火山状、草帽型。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。
实施所用设备均为常规现有设备。
实施例中的酵母浸粉总氮质量分数为10.56～11.32％、氨基氮质量分数为5.06～5.28％，氯化物质量分数为0.2～0.4％，磷酸盐和碱性沉淀实验无沉淀出现，色泽呈亮黄色。
实施例1
一种阿维菌素菌种选育方法，包括步骤如下：
(1)平面培养：将冻存的阿维菌素孢子液用无菌水稀释得到孢子悬浮液，孢子悬浮液的浓度为10-5，吸取0.1mL孢子悬浮液涂覆在平板培养基上，将平板培养基置于温度26-29℃的恒温条件下培养7-10天进行分离纯化，完成平面培养，
所述平板培养基按质量百分比计，由以下组分组成：无水葡糖糖1.5％、酵母浸粉0.25％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钠0.6％、琼脂2％、余量为水；
(2)斜面培养：在无菌室内挑选阿维菌素单菌落，采用接种针接种于斜面培养基上，涂均匀，将斜面培养基置于温度28±1℃的恒温条件下培养5天，完成斜面培养。
所述斜面培养基按质量百分比计，由以下组分组成：
可溶性淀粉0.1％、酵母粉0.2％、麦芽提取物0.5％、六水合氯化钴0.001％、琼脂2％、余量为水，pH 7.2-7.4，121℃灭菌30min。
(3)种子培养：将培养成熟的斜面菌种用接种框取1*1cm的种子接于种子瓶培养基上，将种子瓶置于摇床上振摇进行摇床培养，得到种子液，摇床转速230rpm/min；温度28±1℃；培养时间34-39h，完成摇瓶种子培养，得种子液；
种子瓶培养基按质量百分比计，由以下组分组成：玉米淀粉2.5％、豆饼粉0.8％、花生饼粉1％、酵母粉0.5％、酵母膏0.5％、六水合氯化钴0.003％、淀粉酶0.067％、余量为水，pH 7.0-7.20，121℃灭菌30min
(4)将种子液按5％的接种量转接于发酵瓶培养基中，将发酵瓶置于摇床上进行摇床培养，摇床转速230rpm/min、温度28±1℃，培养时间为10天。
发酵瓶培养基按质量百分比计，由以下组分组成：玉米淀粉7％、豆饼粉0.8％、花生饼粉1％、酵母粉0.5％、酵母膏0.5％、玉米浆0.2％、六水合氯化钴0.003％、淀粉酶0.067％、余量为水，pH 7.2-7.5，121℃灭菌30min。
(5)单菌落效价测试：将发酵成熟的发酵液称取1g加适量甲醇稀释，充分超声震荡混合，转速3000rpm离心10min、静置后，经0.22um有机滤膜过滤，收集滤液，用HPLC法测定其单菌落效价。
高产菌株的保菌
将效价高的菌株找出对应的斜面，用接种针刮孢子到牛奶甘油中，均匀打散，分别取1ml牛奶甘油种子液到冻存管中，拧紧封口，放入-80℃冰箱保存备用。
高产菌株的复验
将所保高产效价菌株随机取5支冻存管传斜面验证效价，所验效价稳定且高于对照3次以上可作为目标菌株，上中试罐验证，若高产菌株效价继续保持优势，则上大生产验证。
对比例1
按实施例1所述阿维菌素菌种选育方法进行，不同之处在于，
步骤(1)中所述平板培养基按质量百分比计，由以下组分组成：无水葡糖糖1.5％、酵母膏0.2％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钠0.6％、琼脂2％、余量为水。
对比例2
按实施例1所述阿维菌素菌种选育方法进行，不同之处在于，
步骤(1)中所述平板培养基按质量百分比计，由以下组分组成：无水葡糖糖1.5％、硫酸铵0.25％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钠0.6％、琼脂2％、余量为水。
实验例：
1、在无菌室内挑取经实施例1平板培养基培养后的阿维菌素单菌落8株并依次编号，在无菌室内挑取经对比例1平板培养基培养后的阿维菌素单菌落6株并依次编号，在无菌室内挑取经对比例2平板培养基培养后的阿维菌素单菌落5株并依次编号，观察菌落形态及孢子分泌量，将挑选出的阿维菌素单菌落依次经斜面培养、种子培养、发酵瓶培养，发酵瓶培养时间为10天(实施例1步骤(2)-步骤(4))，测试最后发酵瓶培养的效价，测试结果如表1所示。
表1
通过表1挑选的19株单菌落菌株可以看出，得到单菌落的表型分布有5种，分别是馒头型、十字型、光秃型、火山状、草帽型，结合表1的孢子形态和效价可知，实施例1火山状和草帽型的效价最高，对比例1馒头型的其次，而对比例2十字型和光秃型的效价最低，基本异常，已无法进行正常的育种工作。因此，本发明实施例1采用酵母浸粉的平板培养基培养菌落的效价均高，且可挑选的菌株数量也多，培养周期由原来的10天缩短至现在的7-8天，大大提高了效率也提高了挑选到高产菌的机率。
2、将表1中测试效价相对较高的菌落进行经斜面培养、种子培养、发酵瓶培养复验，复验结果如表2所示。
表2
通过表2可以看出，经过5次复验，对比例1、对比例2及实施例1的效价稳定，高产菌株依旧高产，因此，单菌落形态规则饱满，孢子量大是筛选高产菌种的必要条件之一，可以提高筛选效率、节约筛选成本。因而本发明采用酵母浸粉的平面培养基得到阿维菌素单菌落孢子产量高，形态规则，火山状、草帽型。可以加快育种进度，并把原来的培养周期缩短2-3天，大大提高筛选效率、节约筛选成本。
Claims (10)
1.一种阿维菌素菌种选育方法，包括步骤如下：
(1)平面培养：将冻存的阿维菌素孢子液用无菌水稀释得到孢子悬浮液，将孢子悬浮液涂覆在平板培养基上，将平板培养基置于温度26-29℃的恒温条件下培养7-10天进行分离纯化，完成平面培养，
所述平板培养基按质量百分比计，由以下组分组成：无水葡糖糖1-5％、酵母浸粉0.1-0.5％、磷酸氢二钾0.05-0.5％、氯化钠0.3-1.5％、琼脂1-8％、余量为水；
(2)斜面培养：平面培养结束后在无菌室内挑选平板培养基上的阿维菌素单菌落，采用接种针将阿维菌素单菌落接种于斜面培养基上进行斜面培养；
(3)种子培养：将步骤(2)培养成熟的斜面菌种接于种子瓶培养基上，将种子瓶置于摇床上进行摇床培养，得到种子液；
(4)发酵培养：将种子液转接于发酵瓶培养基中，将发酵瓶置于摇床上进行摇床培养；
(5)单菌落效价测试：发酵培养结束后采用HPLC法测试单菌落效价，高效价者进行保种。
2.根据权利要求1所述的阿维菌素菌种选育方法，其特征在于，步骤(1)中，孢子悬浮液的浓度为10-1～10-6。
3.根据权利要求1所述的阿维菌素菌种选育方法，其特征在于，步骤(1)中，所述平板培养基按质量百分比计，由以下组分组成：无水葡糖糖1.5％、酵母浸粉0.25％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钠0.6％、琼脂2％、余量为水，pH 7.2-7.4，121℃灭菌30min。
4.根据权利要求1所述的阿维菌素菌种选育方法，其特征在于，所述的酵母浸粉总氮质量分数为10.56～11.32％、氨基氮质量分数为5.06～5.28％，氯化物质量分数为0.2～0.4％，磷酸盐和碱性沉淀实验无沉淀出现，色泽呈亮黄色。
5.根据权利要求1所述的阿维菌素菌种选育方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的斜面培养为将斜面培养基置于温度26-29℃的恒温条件下培养4-6天，完成斜面培养。
6.根据权利要求1所述的阿维菌素菌种选育方法，其特征在于，步骤(2)中，所述斜面培养基按质量百分比计，由以下组分组成：
可溶性淀粉0.1％、酵母粉0.2％、麦芽提取物0.5％、六水合氯化钴0.001％、琼脂2％、余量为水，pH 7.2-7.4，121℃灭菌30min。
7.根据权利要求1所述的阿维菌素菌种选育方法，其特征在于，步骤(3)中，摇床转速230-260转/分，培养温度为26-29℃，培养时间为34-39h。
8.根据权利要求1所述的阿维菌素菌种选育方法，其特征在于，步骤(3)中，种子瓶培养基按质量百分比计，由以下组分组成：玉米淀粉2.5％、豆饼粉0.8％、花生饼粉1％、酵母粉0.5％、酵母膏0.5％、六水合氯化钴0.003％、淀粉酶0.067％、余量为水，pH 7.0-7.20，121℃灭菌30min。
9.根据权利要求1所述的阿维菌素菌种选育方法，其特征在于，步骤(4)中，摇床转速为230-260转/分，培养温度为26-29℃，培养时间为6-12天。
10.根据权利要求1所述的阿维菌素菌种选育方法，其特征在于，步骤(4)中，发酵瓶培养基按质量百分比计，由以下组分组成：玉米淀粉7％、豆饼粉0.8％、花生饼粉1％、酵母粉0.5％、酵母膏0.5％、玉米浆0.2％、六水合氯化钴0.003％、淀粉酶0.067％、余量为水，pH7.2-7.5，121℃灭菌30min。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114457134A (zh) * | 2022-03-17 | 2022-05-10 | 石家庄华滋生物工程有限公司 | 一种基于复合有机氮源的阿维菌素发酵方法 |
Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030068788A1 (en) * | 2001-05-16 | 2003-04-10 | Buckel Thomas Gunther | Methods and compositions for making emamectin |
| CN101429536A (zh) * | 2008-12-15 | 2009-05-13 | 浙江升华拜克生物股份有限公司 | 一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法 |
| CN102634471A (zh) * | 2012-04-18 | 2012-08-15 | 南京工业大学 | 一种阿维菌素B1a高产菌株及其应用 |
| CN102839143A (zh) * | 2012-09-25 | 2012-12-26 | 宁夏启元药业有限公司 | 一种阿维菌素菌种选育方法 |
| CN104498400A (zh) * | 2014-12-10 | 2015-04-08 | 常熟理工学院 | 一种高产阿维菌素b组分的突变菌株及其筛选方法 |
| CN104651432A (zh) * | 2015-03-10 | 2015-05-27 | 齐鲁制药（内蒙古）有限公司 | 一种提高阿维菌素发酵水平的补料方法 |
| CN105803022A (zh) * | 2014-12-30 | 2016-07-27 | 青岛海科生物技术有限公司 | 一种具有缓释作用的阿维菌素培养基及其制备方法 |
| CN106190928A (zh) * | 2016-08-31 | 2016-12-07 | 华北制药集团爱诺有限公司 | 一种阿维菌素高产菌株及其筛选方法 |
| CN106222120A (zh) * | 2016-09-18 | 2016-12-14 | 江南大学 | 一种阿维菌素高产菌株的高效筛选方法 |
| US20170013837A1 (en) * | 2014-03-10 | 2017-01-19 | Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co. Ltd | Recombinant microorganism expressing avermectin analogue and use thereof |
| CN106609288A (zh) * | 2015-10-21 | 2017-05-03 | 上海国佳生化工程技术研究中心有限公司 | 一种通过优化发酵培养基提高工业阿维菌素B1a的产量的方法 |
| CN109868239A (zh) * | 2019-03-04 | 2019-06-11 | 内蒙古新威远生物化工有限公司 | 一种阿维菌素菌株及其筛选方法 |
| US20200131552A1 (en) * | 2017-03-13 | 2020-04-30 | Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd. | Ivermectin b1b producing strain and use thereof |
-
2019
- 2019-08-15 CN CN201910755568.7A patent/CN110305818A/zh active Pending
Patent Citations (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030068788A1 (en) * | 2001-05-16 | 2003-04-10 | Buckel Thomas Gunther | Methods and compositions for making emamectin |
| CN101429536A (zh) * | 2008-12-15 | 2009-05-13 | 浙江升华拜克生物股份有限公司 | 一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法 |
| CN102634471A (zh) * | 2012-04-18 | 2012-08-15 | 南京工业大学 | 一种阿维菌素B1a高产菌株及其应用 |
| CN102839143A (zh) * | 2012-09-25 | 2012-12-26 | 宁夏启元药业有限公司 | 一种阿维菌素菌种选育方法 |
| US20170013837A1 (en) * | 2014-03-10 | 2017-01-19 | Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co. Ltd | Recombinant microorganism expressing avermectin analogue and use thereof |
| CN106459885A (zh) * | 2014-03-10 | 2017-02-22 | 浙江海正药业股份有限公司 | 表达阿维菌素类似物的重组微生物及其用途 |
| CN104498400A (zh) * | 2014-12-10 | 2015-04-08 | 常熟理工学院 | 一种高产阿维菌素b组分的突变菌株及其筛选方法 |
| CN105803022A (zh) * | 2014-12-30 | 2016-07-27 | 青岛海科生物技术有限公司 | 一种具有缓释作用的阿维菌素培养基及其制备方法 |
| CN104651432A (zh) * | 2015-03-10 | 2015-05-27 | 齐鲁制药（内蒙古）有限公司 | 一种提高阿维菌素发酵水平的补料方法 |
| CN106609288A (zh) * | 2015-10-21 | 2017-05-03 | 上海国佳生化工程技术研究中心有限公司 | 一种通过优化发酵培养基提高工业阿维菌素B1a的产量的方法 |
| CN106190928A (zh) * | 2016-08-31 | 2016-12-07 | 华北制药集团爱诺有限公司 | 一种阿维菌素高产菌株及其筛选方法 |
| CN106222120A (zh) * | 2016-09-18 | 2016-12-14 | 江南大学 | 一种阿维菌素高产菌株的高效筛选方法 |
| US20200131552A1 (en) * | 2017-03-13 | 2020-04-30 | Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd. | Ivermectin b1b producing strain and use thereof |
| CN109868239A (zh) * | 2019-03-04 | 2019-06-11 | 内蒙古新威远生物化工有限公司 | 一种阿维菌素菌株及其筛选方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| BOOKONEYEE228: "酵母粉、酵母浸膏、酵母浸粉用于生物发酵行业的区别", 道客巴巴在线文档分享平台 * |
| XIAO-XIAO WANG等: "Yeast screening from avermectins wastewater and investigation on the ability of its fermentation", 《BIOPROCESS BIOSYST ENG》 * |
| 刘学艳等: "生物氮素在阿维菌素发酵中的应用研究", 《河北化工》 * |
| 徐瑶等: "氮源对阿维菌素合成的影响及基于二氧化碳释放速率的阿维菌素发酵调控", 《生物工程学报》 * |
| 李永亮等: "阿维菌素高产菌株的选育及分批补料发酵工艺的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑（电子期刊）》 * |
| 李燕霞等: "阿维菌素产生菌培养条件的优化", 《河北化工》 * |
| 樊乐等: "阿维菌素生产菌种的选育及发酵工艺的优化", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑（电子期刊）》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114457134A (zh) * | 2022-03-17 | 2022-05-10 | 石家庄华滋生物工程有限公司 | 一种基于复合有机氮源的阿维菌素发酵方法 |
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