CN110295113B - 一种海洋产蛋白酶芽孢杆菌稳定性保护剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种海洋产蛋白酶芽孢杆菌稳定性保护剂，属于微生物技术领域。该保护剂包括Tris‑HCl缓冲液、甘油、甘露醇、EDTA、氯化钾、硫酸镁、磷酸氢二钠、2‑乙基己酸二苯基锑，所述的Tris‑HCl缓冲液、甘油、甘露醇、EDTA、氯化钾、硫酸镁、磷酸氢二钠、2‑乙基己酸二苯基锑按一定比例配成液态保护剂。本发明的一种海洋产蛋白酶芽孢杆菌稳定性保护剂克服了海洋产蛋白酶芽孢杆菌菌种在低温冷藏条件下变性、存活率低的问题，可使菌种存活率稳定在90%以上。

Description

一种海洋产蛋白酶芽孢杆菌稳定性保护剂
技术领域
本发明涉及微生物保存领域，尤其涉及一种海洋产蛋白酶芽孢杆菌稳定性的保护剂。
背景技术
随着规模化、集约化水产养殖业的迅速发展，水产养殖病害频繁发生。近年来，人们开始尝试在养殖生产中使用有益微生物，尤其是海洋中的产酶益生菌，可以改善养殖生态环境，提高养殖动物的免疫力，抑制病原微生物，从而减少疾病的发生。其中，来源于海洋产蛋白酶的芽孢杆菌因其特有的产蛋白酶的性质，被开发出多种多样的使用方式，可以直接加入养殖水体或添加到饲料中使用，也可以通过饵料生物作用于海水养殖动物，还可以通过注射或浸浴使用。
由于此类产蛋白酶芽孢杆菌来源于海洋，其生长存活条件应与海洋生态环境相似，但通常在实验室模拟的环境条件下培养出的菌种在冷藏保存时会出现存活率低、活性下降等问题。因此，寻求一种能够保持海洋产蛋白没芽孢杆菌稳定性的保护剂是相关研究人员一直在探究的课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种海洋产蛋白酶芽孢杆菌稳定性保护剂，利用该保护剂增强菌的活性并提高菌的存活率。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案为：一种海洋产蛋白酶芽孢杆菌稳定性保护剂，其特征在于：该保保护剂通过向Tris-HCl缓冲液中添加甘油、甘露醇、EDTA、氯化钾、硫酸镁、磷酸氢二钠及2-乙基己酸二苯基锑制作而成。
进一步的，所述Tris-HCl缓冲液是指10 mM Tris-HCl缓冲液，缓冲液的PH值为7.5。
进一步的，所述甘油的浓度为25-35%（v/v），所述甘露醇的浓度为5.5-7.5%（w/v）、所述EDTA的浓度为1.5-3.5%（w/v）、所述氯化钾浓度为0.5-0.7%（w/v）、所述硫酸镁浓度为0.35-0.55%（w/v）、所述磷酸氢二钠浓度为0.25-0.45%（w/v）、所述2-乙基己酸二苯基锑的浓度为0.03-0.08%（v/v），上述各成分的浓度以保护剂的体积为基准计算。
进一步的，甘油的浓度为32%（v/v），所述甘露醇的浓度为5.5%（w/v）、所述EDTA的浓度为1.5%（w/v）、所述氯化钾浓度为0.55%（w/v）、所述硫酸镁浓度为0.35%（w/v）、所述磷酸氢二钠浓度为0.32%（w/v）、所述2-乙基己酸二苯基锑的浓度为0.05%（v/v）。
进一步的，所述稳定剂制备方法如下：甘油、甘露醇、EDTA、氯化钾、硫酸镁、磷酸氢二钠、2-乙基己酸二苯基锑按比例添加到10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）的溶液中，在常温下搅拌均匀，使溶质完全溶解，静置10 min后，用10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）的溶液定容。
本发明申请的一种海洋产蛋白酶芽孢杆菌稳定性保护剂，具体是在Tris-HCl缓冲液为基础液中添加有甘油、甘露醇、EDTA、氯化钾、硫酸镁、磷酸氢二钠、2-乙基己酸二苯基锑。其中，Tris-HCl缓冲液用于提供稳定的液态环境，使溶液的pH保持稳定，且pH7.6接近于海洋产蛋白酶芽孢杆菌在海水中的生长pH环境；甘油用于自由扩散到细胞内，降低细胞内的水活度，抑制菌株生化反应的进行；甘露醇用于平衡菌株细胞内外的渗透压；EDTA作为螯合抗菌剂，用于抑制杂菌生长；氯化钾、硫酸镁、磷酸氢二钠可提供海洋产蛋白酶芽孢杆菌在海洋环境中存活所需的无机盐离子；2-乙基己酸二苯基锑能有效抑制菌种衰退，是一种重要的生物稳定剂。通过该保护剂的应用能够极大提高蛋白酶芽孢杆菌的活性及存活率。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明提供的海洋产蛋白酶芽孢杆菌稳定性保护剂做进一步说明。
实施例1
一种海洋产蛋白酶芽孢杆菌稳定性保护剂，取甘油、甘露醇、EDTA、氯化钾、硫酸镁、磷酸氢二钠、2-乙基己酸二苯基锑按比例添加到10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）的溶液中，在常温下搅拌均匀，使溶质完全溶解，静置10 min后，用10 mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）的溶液定容，得到最终保护剂内各成分的浓度为：32%甘油（v/v）、5.50%甘露醇（w/v）、1.50% EDTA（w/v）、0.55%氯化钾（w/v）、0.35%硫酸镁（w/v）、0.32%磷酸氢二钠（w/v）、0.05%2-乙基己酸二苯基锑（v/v）。其中mM单位含义为毫摩尔每升。
取活菌含量为50亿cfu/mL的海洋产蛋白酶芽孢杆菌活菌菌液，向菌液中加入稳定性保护剂5%，于4℃条件下保存30天，每隔5天取出涂布于2216E平板，并置于30℃恒温培养箱中培养24 h，进行活菌计数，统计存活率如下表所示。
Figure 172970DEST_PATH_IMAGE002
实施例2
一种海洋产蛋白酶芽孢杆菌稳定性保护剂，取甘油、甘露醇、EDTA、氯化钾、硫酸镁、磷酸氢二钠、2-乙基己酸二苯基锑按比例添加到10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）的溶液中，在常温下搅拌均匀，使溶质完全溶解，静置10 min后，用10 mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）的溶液定容，得到最终保护剂内各成分的浓度为：35%甘油（v/v）、6.2%甘露醇（w/v）、3.20% EDTA（w/v）、0.50%氯化钾（w/v）、0.47%硫酸镁（w/v）、0.30%磷酸氢二钠（w/v）、0.06%2-乙基己酸二苯基锑（v/v），用10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）的溶液定容。其中mM单位含义为毫摩尔每升。
取活菌含量为50亿cfu/mL的海洋产蛋白酶芽孢杆菌活菌菌液，向菌液中加入稳定性保护剂5%，于4℃条件下保存30天，每隔5天取出涂布于2216E平板，并置于30℃恒温培养箱中培养24 h，进行活菌计数，统计存活率如下表所示。
Figure 231056DEST_PATH_IMAGE004
实施例3
一种海洋产蛋白酶芽孢杆菌稳定性保护剂，取甘油、甘露醇、EDTA、氯化钾、硫酸镁、磷酸氢二钠、2-乙基己酸二苯基锑按比例添加到10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）的溶液中，在常温下搅拌均匀，使溶质完全溶解，静置10 min后，用10 mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）的溶液定容，得到最终保护剂内各成分的浓度为：27%甘油（v/v）、5.8%甘露醇（w/v）、1.8% EDTA（w/v）、0.60%氯化钾（w/v）、0.55%硫酸镁（w/v）、0.45%磷酸氢二钠（w/v）、0.07%2-乙基己酸二苯基锑（v/v），用10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）的溶液定容。其中mM单位含义为毫摩尔每升。
取活菌含量为50亿cfu/mL的海洋产蛋白酶芽孢杆菌活菌菌液，向菌液中加入稳定性保护剂5%，于4℃条件下保存30天，每隔5天取出涂布于2216E平板，并置于30℃恒温培养箱中培养24 h，进行活菌计数，统计存活率如下表所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
实施例4
一种海洋产蛋白酶芽孢杆菌稳定性保护剂，取甘油、甘露醇、EDTA、氯化钾、硫酸镁、磷酸氢二钠、2-乙基己酸二苯基锑按比例添加到10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）的溶液中，在常温下搅拌均匀，使溶质完全溶解，静置10 min后，用10 mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）的溶液定容，得到最终保护剂内各成分的浓度为：30%甘油（v/v）、6.5%甘露醇（w/v）、3.4% EDTA（w/v）、0.47%氯化钾（w/v）、0.45%硫酸镁（w/v）、0.35%磷酸氢二钠（w/v）、0.08%2-乙基己酸二苯基锑（v/v），用10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）的溶液定容。其中mM单位含义为毫摩尔每升。
取活菌含量为50亿cfu/mL的海洋产蛋白酶芽孢杆菌活菌菌液，向菌液中加入稳定性保护剂5%，于4℃条件下保存30天，每隔5天取出涂布于2216E平板，并置于30℃恒温培养箱中培养24 h，进行活菌计数，统计存活率如下表所示。
Figure 48009DEST_PATH_IMAGE006
实施例5
一种海洋产蛋白酶芽孢杆菌稳定性保护剂，取甘油、甘露醇、EDTA、氯化钾、硫酸镁、磷酸氢二钠、2-乙基己酸二苯基锑按比例添加到10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）的溶液中，在常温下搅拌均匀，使溶质完全溶解，静置10 min后，用10 mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）的溶液定容，得到最终保护剂内各成分的浓度为：25%甘油（v/v）、5.8%甘露醇（w/v）、3.5% EDTA（w/v）、0.70%氯化钾（w/v）、0.50%硫酸镁（w/v）、0.35%磷酸氢二钠（w/v）、0.04%2-乙基己酸二苯基锑（v/v），用10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）的溶液定容。其中mM单位含义为毫摩尔每升。
取活菌含量为50亿cfu/mL的海洋产蛋白酶芽孢杆菌活菌菌液，向菌液中加入稳定性保护剂5%，于4℃条件下保存30天，每隔5天取出涂布于2216E平板，并置于30℃恒温培养箱中培养24 h，进行活菌计数，统计存活率如下表所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE007
发明人通过对比以上实施例分析结果，发现本发明的海洋产蛋白酶芽孢杆菌稳定性保护剂可以保持海洋产蛋白酶芽孢杆菌存活率保持在90%以上，其中，实施例1的效果最佳，达到94.16%。

Claims (2)

1.一种海洋产蛋白酶芽孢杆菌稳定性保护剂，其特征在于：保护剂通过向Tris-HCl缓冲液中添加甘油、甘露醇、EDTA、氯化钾、硫酸镁、磷酸氢二钠及2-乙基己酸二苯基锑制作而成；
所述Tris-HCl缓冲液是指10 mM Tris-HCl缓冲液，缓冲液的PH值为7.5；
所述甘油的浓度为25-35%v/v，所述甘露醇的浓度为5.5-7.5%w/v、所述EDTA的浓度为1.5-3.5%w/v、所述氯化钾浓度为0.5-0.7%w/v、所述硫酸镁浓度为0.35-0.55%w/v、所述磷酸氢二钠浓度为0.25-0.45%w/v、所述2-乙基己酸二苯基锑的浓度为0.03-0.08%v/v，上述各成分的浓度以保护剂的体积为基准计算。
2.根据权利要求1所述的一种海洋产蛋白酶芽孢杆菌稳定性保护剂，其特征在于：甘油的浓度为32%v/v，所述甘露醇的浓度为5.5%w/v、所述EDTA的浓度为1.5%w/v、所述氯化钾浓度为0.55%w/v、所述硫酸镁浓度为0.35%w/v、所述磷酸氢二钠浓度为0.32%w/v、所述2-乙基己酸二苯基锑的浓度为0.05%v/v。
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