CN110279648A - 一种含外泌体的美容制剂及用途 - Google Patents

一种含外泌体的美容制剂及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含外泌体的美容制剂，包含脂肪来源间充质干细胞外泌体。本发明所述所述含外泌体的美容制剂中添加了脂肪来源间充质干细胞外泌体，脂肪来源间充质干细胞外泌体具有抑制弹性蛋白酶和胶原蛋白酶的活性，能有效对抗衰老，提高皮肤的弹性，改善皮肤皱纹；将其与美白组合物配合使用，还能促进美白组合物的吸收，起到更好的美白紧致肌肤的效果。

Description

一种含外泌体的美容制剂及用途
技术领域
本发明涉及一种干细胞外泌体及其用途，具体涉及一种含外泌体的美容制剂及用途。
背景技术
外泌体(Exosome)是由细胞内囊泡结构释放到细胞外的一种膜性囊泡，直径约30-150nm，细胞在正常的生理状况下都会分泌外泌体，由于质膜和多泡体之间融合的结果，外泌体样囊泡通过胞吐作用被分泌到胞外空间。外泌体样囊泡被脂质双层分为内部和外部，由于其含有膜脂质、膜蛋白、遗传物质和细胞质成分，间接地反映出细胞的性质和状态。同时，外泌体样囊泡通过与其他细胞和组织的结合，并将膜成分、mRNA、miRNA、蛋白质(生长激素、细胞因子等)等转移至受体细胞，而作为介导细胞-细胞之间通讯的胞外运输蛋白。
皮肤衰老是人体衰老固有的生理机制和外界风吹日晒、环境污染等损害共同作用的结果。皮肤衰老通常体现在皮肤弹性降低和皮肤皱纹的产生，据报道，胶原蛋白和弹性蛋白的减少将导致皮肤弹性降低和皮肤皱纹产生，胶原蛋白和弹性蛋白受胶原蛋白酶和弹性蛋白酶调控，胶原蛋白酶和弹性蛋白酶能够引起胶原蛋白和弹性蛋白降解，从而导致胶原蛋白和弹性蛋白减少，导致皱纹产生，皮肤弹性减低。目前尚未有对脂肪来源间充质干细胞外泌体在皮肤抗衰老方面的相关研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种含外泌体的美容制剂及用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种含外泌体的美容制剂，包含脂肪来源间充质干细胞外泌体。脂肪来源间充质干细胞外泌体具有抑制弹性蛋白酶和胶原蛋白酶的活性，能有效对抗衰老，提高皮肤的弹性，改善皮肤皱纹。
优选地，所述美容制剂还包含美白组合物；所述美白组合物包含草豆蔻提取物、杏仁提取物和茉莉花提取物。
草豆蔻是姜科山姜属多年生草本香料植物，草豆蔻提取物能有效抑制金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌等细菌的生长，同时草豆蔻提取物对人套膜蛋白的生成具有促进作用，人套膜蛋白可以促进角蛋白膜蛋白的形成、提高皮肤的屏障功能。草豆蔻提取物中含有金合欢醇、水芹烯和黄酮类物质，对络氨酸酶的活性具有很好的抑制作用，可以从源头上减少黑色素的生成，而具有美白和淡斑的功效。
杏仁提取物含有枸橼酸、苹果酸、苦杏苷、脂肪酸等，此外尤其富含钙和磷，还含有糖质、钙、钠、纤维质、维生素A、B、C等，为粗糙而干燥的皮肤提供保湿和营养。另外，脂肪酸可使皮肤角质层软化，滋润护肤，并可抑杀细菌，此外，杏仁提取物能够抑制皮肤内络氨酸酶的活性，清除潜在斑点，均匀肤色，有淡斑亮肤功效。
茉莉花提取物，可以长发润燥香肌，含有的香精油、芳樟醇脂等物质，能够抑制皮肤色素形成同时活化表皮细胞，有利于皮肤的再生。
本发明所述美容制剂将脂肪来源间充质干细胞外泌体与草豆蔻提取物、杏仁提取物和茉莉花提取物配合使用，能提高皮肤弹性，减缓皱纹的同时，还能促进美白组合物的吸收，起到更好的美白紧致肌肤的效果。
优选地，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体和美白组合物的重量之比为：1～3:1。两者采用上述配比时，皮肤吸收效果较好，且美白效果更为显著。
更优选地，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体和美白组合物的重量之比为：2:1。尤其是采用上述配比时，美白效果最佳。
优选地，所述草豆蔻提取物、杏仁提取物和茉莉花提取物的重量之比为：草豆蔻提取物：杏仁提取物：茉莉花提取物＝1～3:4:1～3。各提取物采用上述配比时，络氨酸酶抑制效果更佳。
更优选地，所述草豆蔻提取物、杏仁提取物和茉莉花提取物的重量之比为：草豆蔻提取物：杏仁提取物：茉莉花提取物＝1:2:1。尤其是采用上述配比时，络氨酸酶抑制效果最佳。
优选地，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)将脂肪组织分散于消化液中，得到细胞悬浮液；
(2)将细胞悬浮液离心处理，弃去上清液，得脂肪干细胞；
(3)将脂肪干细胞接种至培养基进行扩增培养，离心，取上清液，浓缩，加入外泌体提取剂，得所述脂肪来源间充质干细胞外泌体。
所述脂肪组织来源于人或动物，所述外泌体提取试剂为Exoquick-TC(SBI)，也可以为其他品牌的外泌体提取试剂。所述脂肪来源间充质干细胞外泌体中具有CD9、CD63标志。
优选地，步骤(1)中，所述消化液为含有I型胶原酶的PBS缓冲液；所述I型胶原酶的体积为脂肪组织体积的0.2～0.4％，所述PBS缓冲液的加入量为脂肪组织体积的4～6倍，消化时间为45～90min；
步骤(3)中，所述扩增培养的条件为：在温箱内，36～38℃条件下，5％CO2，培养基为含10％FBS的DMEM培养基，培养时间为48～72h。
优选地，步骤(2)中，所述离心的转速为1800～2200r/min，时间为3～5min。
优选地，步骤(3)中，加入外泌体提取剂后，在3～5℃下放置8～15h，然后离心，取沉淀，即所述脂肪来源间充质干细胞外泌体。
优选地，所述美容制剂为水剂、乳剂、膏霜、凝胶或粉剂。除上述组分有明确的要求外，在无损本发明的效果的范围内，本领域技术人员可以根据具体的美容制剂的剂型添加或使用其他辅料成分。
优选地，所述美容制剂中，脂肪来源间充质干细胞外泌体的重量百分含量为0.1～1％。
本发明的目的还在于提供所述含外泌体的美容制剂在抑制络氨酸酶制剂、美白制剂、抑制弹性蛋白酶制剂、抑制胶原蛋白酶制剂、抗衰老制剂或改善皮肤弹性制剂中的用途。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种含外泌体的美容制剂，所述美容制剂中添加了脂肪来源间充质干细胞外泌体，脂肪来源间充质干细胞外泌体具有抑制弹性蛋白酶和胶原蛋白酶的活性，能有效对抗衰老，提高皮肤的弹性，改善皮肤皱纹；将其与美白组合物配合使用，还能促进美白组合物的吸收，起到更好的美白紧致肌肤的效果。
附图说明
图1为弹性蛋白酶的活性测试结果。
具体实施方式
实施例中除脂肪来源间充质干细胞外泌体以外的各原料均购买自市场。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明所述含外泌体的美容制剂的一种实施例，本实施例所述含外泌体的美容制剂包含以下重量百分含量的组分：脂肪来源间充质干细胞外泌体0.8％、草豆蔻提取物0.1％、杏仁提取物0.2％、茉莉花提取物0.1％、荷荷巴油10％、甘油10％、丙二醇3％、透明质酸0.5％、PEG-20甲基葡糖倍半硬脂酸酯2％、甲基葡萄糖苷倍半硬脂酸酯1％、卡波姆0.3％、尼泊金甲酯0.1％、苯氧乙醇0.4％和余量的去离子水。
本实施例所述脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)将人脂肪组织分散于含有I型胶原酶的PBS缓冲液消化液中，所述I型胶原酶的体积为脂肪组织体积的0.3％，所述PBS缓冲液的加入量为脂肪组织体积的5倍，消化时间为60min，得到细胞悬浮液；
(2)将细胞悬浮液在2000r/min离心处理4min，弃去上清液，得脂肪干细胞；
(3)将脂肪干细胞接种至培养基进行扩增培养，所述扩增培养的条件为：在温箱内，36～38℃条件下，5％CO2，培养基为含10％FBS的DMEM培养基，培养时间为72h离心，取上清液，浓缩至体积缩小50％以上，加入外泌体提取剂Exoquick-TC(SBI)，外泌体提取剂的加入量为浓缩后的上清液的50％，即得所述脂肪来源间充质干细胞外泌体。
实施例2
一、弹性蛋白酶抑制活性
通过测量由胰弹性蛋白酶作用于底物N-琥珀酰-丙胺酸-丙胺酸-丙胺酸-p-硝基苯胺产生的4-硝基苯胺(4-nitoanilide)肽段的量，利用分光光度法评估弹性蛋白酶的活性。N-琥珀酰-丙胺酸-丙胺酸-丙胺酸-p-硝基苯胺西格玛)和其它用于测试的物质在37℃下温育，加入猪胰弹性蛋白酶启始反应。测定波长为410nm处的吸光度来测量被释放的游离4-硝基苯胺的量。0.2M的pH为8.0的Tris-HCl缓冲液用作阴性对照，美白组合物(质量浓度为0.1％草豆蔻提取物、0.2％杏仁提取物和0.1％茉莉花提取物的混合物)作为对照组。实施例1制得的脂肪来源间充质干细胞外泌体在分析基质中的最终浓度为0.05％、0.1％、0.3％、0.8％、1％和1.2％。测试结果见图1。从图1中弹性蛋白酶抑制百分比为相对阴性对照的百分比，从图1可以看出，脂肪来源间充质干细胞外泌体对弹性蛋白酶活性具有剂量依赖式抑制效果，而美白组合物对弹性蛋白酶活性的抑制效果不明显。
二、胶原蛋白酶抑制分析
胶原蛋白酶(酶EC 3.4.24.3，5μg)单独与脂肪来源间充质干细胞外泌体(1μg/mL和10μg/mL)分别一起加入到含有PZ肽(0.5mg)的0.1M的Tris缓冲液(pH＝7.4)中，使总体积为1.7ml，PZ肽是胶原蛋白酶的底物。混合物在37℃水浴中温育30min，然后加入1mL的25mM的柠檬酸溶液终止酶反应。加入5mL的乙酸乙酯混合后，利用紫外分光光度计在波长为320nm处测量有机层的吸光度。胶原蛋白酶抑制由以下公式计算：
胶原蛋白酶抑制百分比＝[(Ac－As)/Ac]×100，其中，Ac表示(含有胶原蛋白酶的对照的吸光度－不含胶原蛋白酶的对照的吸光度)，As表示(含有胶原蛋白酶的样品的吸光度－不含胶原蛋白酶的样品的吸光度)。
与对照相比，0.1％和1.0％的脂肪来源间充质干细胞外泌体的胶原蛋白酶抑制百分比分别为88.5％和62.8％，表现出胶原蛋白酶抑制活性，而美白组合物(质量浓度为0.1％草豆蔻提取物、0.2％杏仁提取物和0.1％茉莉花提取物的混合物)的胶原蛋白酶抑制百分比为94.1％，表明美白组合物对胶原蛋白酶的抑制效果不明显。
三、酪氨酸酶抑制分析
酪氨酸酶催化底物多巴产生多巴醌，并进一步氧化生成黑色素，黑色素在475nm波长有最大吸收峰。通过测定单位时间内，酶催化反应体系生成黑色素变化量的增长直线，以直线斜率测定酶活力大小。酶活力单位(U)定义为：每分钟黑色素在475nm波长的吸光度(OD475)增加0.001为一个酶活力单位。
本发明的酪氨酸酶活性测定的方法：反应总体系为3mL，加入的磷酸盐缓冲溶液2.4mL，加入0.2mL酪氨酸酶水溶液，于32℃恒温水浴锅中保温10min，加入L-DOPA溶液0.4mL置于试管中，并测定10min时OD475。根据酶反应活性的定义，在有抑制剂存在时，酶反应活性表示为ACTi；在无抑制剂存在时，酶反应活性则表示为ACT0，则待测样品对酪氨酸酶的相对抑制率(I)可以定义为：
I(％)＝(1-ACTi/ACT0)×100％＝[1-(OD1-OD3)/(OD2-OD4)]×100％
式中：OD1是指含有底物、酪氨酸酶、待测样品的测活体系的吸光度值；
OD2是指只含有底物、酪氨酸酶活性测定体系的吸光度值；
OD3是指只含有底物、待测样品活性测定体系的吸光度值；
OD4是指只含有底物、缓冲溶液活性测定体系的吸光度值。
将试验组1～3进行体外酪氨酸酶活性测定，以去离子水作为对照组，使用紫外分光光度计测定样品酪氨酸酶活性，结果见表1。
表1酪氨酸酶活性测试结果
从表1可以看出，美白组合物具有一定体外酪氨酸酶活性抑制效果，脂肪来源间充质干细胞外泌体的酪氨酸酶活性抑制效果不显著。
采用同样的方法对浓度相同但不同配比的草豆蔻提取物、杏仁提取物、茉莉花提取物进行了体外酪氨酸酶活性抑制测试，测试结果表明草豆蔻提取物、杏仁提取物和茉莉花提取物的重量之比为：草豆蔻提取物：杏仁提取物：茉莉花提取物＝1～3:4:1～3时酪氨酸酶活性抑制效果较佳，尤其是草豆蔻提取物、杏仁提取物和茉莉花提取物的重量之比为：草豆蔻提取物：杏仁提取物：茉莉花提取物＝1:2:1时抑制效果最佳。
四、为了验证脂肪来源间充质干细胞外泌体对美白组合物的促进效果，依据《化妆品卫生规范》(2007年版)进行试验。选择30名身体健康、无化妆品过敏史的志愿者，每组10名(男女不限)，志愿者每天早晚洁面后分别使用试验组4～6所述护肤品，进行皮肤黑色素的检测，试验组4～6所述护肤品的配方分别为：
试验组4：脂肪来源间充质干细胞外泌体1.2％、荷荷巴油10％、甘油10％、丙二醇3％、透明质酸0.5％、PEG-20甲基葡糖倍半硬脂酸酯2％、甲基葡萄糖苷倍半硬脂酸酯1％、卡波姆0.3％、尼泊金甲酯0.1％、苯氧乙醇0.4％和余量的去离子水。
试验组5：草豆蔻提取物0.3％、杏仁提取物0.6％、茉莉花提取物0.3％、荷荷巴油10％、甘油10％、丙二醇3％、透明质酸0.5％、PEG-20甲基葡糖倍半硬脂酸酯2％、甲基葡萄糖苷倍半硬脂酸酯1％、卡波姆0.3％、尼泊金甲酯0.1％、苯氧乙醇0.4％和余量的去离子水。
试验组6：实施例1所述美容制剂。
检测结果见表2。
表2皮肤黑色素的检测结果
组别 0周 2周 4周 6周 8周
试验组4 100％ 97％ 96％ 95％ 95％
试验组5 100％ 92％ 89％ 85％ 80％
试验组6 100％ 90％ 86％ 83％ 76％
从表2可以看出，在脂肪来源间充质干细胞外泌体、草豆蔻提取物、杏仁提取物、茉莉花提取物总添加量一致的情况下，使用试验组6所述护肤品的美白效果更为显著，说明脂肪来源间充质干细胞外泌体可能能够促进皮肤对美白组合物的吸收，从而发挥协同增效的美白效果。
采用上述方法对脂肪来源间充质干细胞外泌体、草豆蔻提取物、杏仁提取物和茉莉花提取物的总添加量相同，但是不同配比时进行了试验，研究表明当脂肪来源间充质干细胞外泌体与美白组合物的重量之比为1～3:1时，能有较好的美白效果，且脂肪来源间充质干细胞外泌体和美白组合物的重量之比为2:1时最佳。当脂肪来源间充质干细胞外泌体的添加量为0.1～1％时，即可实现较好的美白促进效果。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种含外泌体的美容制剂，其特征在于，包含脂肪来源间充质干细胞外泌体。
2.如权利要求1所述含外泌体的美容制剂，其特征在于，所述美容制剂还包含美白组合物；所述美白组合物包含草豆蔻提取物、杏仁提取物和茉莉花提取物。
3.如权利要求2所述含外泌体的美容制剂，其特征在于，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体和美白组合物的重量之比为：1～3:1；优选地，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体和美白组合物的重量之比为：2:1。
4.如权利要求2所述含外泌体的美容制剂，其特征在于，所述草豆蔻提取物、杏仁提取物和茉莉花提取物的重量之比为：草豆蔻提取物：杏仁提取物：茉莉花提取物＝1～3:4:1～3；优选地，所述草豆蔻提取物、杏仁提取物和茉莉花提取物的重量之比为：草豆蔻提取物：杏仁提取物：茉莉花提取物＝1:2:1。
5.如权利要求1所述含外泌体的美容制剂，其特征在于，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)将脂肪组织分散于消化液中，得到细胞悬浮液；
(2)将细胞悬浮液离心处理，弃去上清液，得脂肪干细胞；
(3)将脂肪干细胞接种至培养基进行扩增培养，离心，取上清液，浓缩，加入外泌体提取剂，得所述脂肪来源间充质干细胞外泌体。
6.如权利要求5所述含外泌体的美容制剂，其特征在于，步骤(1)中，所述消化液为含有I型胶原酶的PBS缓冲液；所述I型胶原酶的体积为脂肪组织体积的0.2～0.4％，所述PBS缓冲液的加入量为脂肪组织体积的4～6倍，消化时间为45～90min；
步骤(3)中，所述扩增培养的条件为：在温箱内，36～38℃条件下，5％CO2，培养基为含10％FBS的DMEM培养基，培养时间为48～72h。
7.如权利要求2所述含外泌体的美容制剂，其特征在于，步骤(3)中，加入外泌体提取剂后，在3～5℃下放置8～15h，然后离心，取沉淀，即所述脂肪来源间充质干细胞外泌体。
8.如权利要求1～7中任一项所述含外泌体的美容制剂，其特征在于，所述美容制剂为水剂、乳剂、膏霜、凝胶或粉剂。
9.如权利要求1所述含外泌体的美容制剂，其特征在于，所述美容制剂中，脂肪来源间充质干细胞外泌体的重量百分含量为0.1～1％。
10.如权利要求1～9中任一项所述含外泌体的美容制剂在抑制络氨酸酶制剂、美白制剂、抑制弹性蛋白酶制剂、抑制胶原蛋白酶制剂、抗衰老制剂或改善皮肤弹性制剂中的用途。
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