CN110278919A - 一种构建蠕形螨致玫瑰痤疮样皮损动物模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种构建蠕形螨致玫瑰痤疮样皮损动物模型的方法，包括通过面部蠕形螨阳性的供螨者洗净皮肤，拭干，挤压刮取鼻翼或面部皮脂分泌物，通过清洗挤压后的分泌物，制备蠕形螨原虫混悬液，并将蠕形螨原虫混悬液皮内注射于日本大耳兔背部4cm×4cm实验区中。本发明针对现有家兔对人蠕形螨自然感染途径的反应性很小，缺少蠕形螨致玫瑰痤疮样皮损动物模型的问题，采用日本大耳兔品系同时在皮内接种蠕形螨原虫，构建出蠕形螨致玫瑰痤疮样皮损动物模型，所述日本大耳兔皮损可以观察到与人类蠕形螨阳性的玫瑰痤疮高度相似的红斑、丘疹皮损临床表现及组织病理学表现，符合作为蠕形螨致玫瑰痤疮样皮损动物模型的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种动物模型技术领域，具体涉及一种构建蠕形螨致玫瑰痤疮样皮损动物模型的方法。
背景技术
玫瑰痤疮是一种常见的累及患者面部皮肤血管和毛囊皮脂腺的一种慢性炎症性皮肤病，临床表现为患者面中部为主的一过性或持久性红斑、毛细血管扩张、丘疹、脓疱，一些病程较长的患者由于组织增生还可出现暗红色的斑块甚至鼻赘。目前，玫瑰痤疮的发病率逐年增高，治疗缺乏特效药。由于该病有损患者面部美观，从而对患者身心健康及生活质量都有所影响，有些患者会出现抑郁症，自卑，怯懦，性格孤僻，精神负担重，丧失生活的信心。玫瑰痤疮逐渐成为医学界研究的热点，目前一般认为玫瑰痤疮的发生与遗传、细胞炎性因子、血管神经调节障碍等有关。近年的研究表明，蠕形螨与玫瑰痤疮的发病有密切关系。
蠕形螨俗称毛囊虫，寄生于人体的仅两种，即毛囊蠕形螨和皮脂蠕形螨。蠕形螨寄生于人的毛囊和皮脂腺内，具有高感染性、低致病性和条件致病性等特点。已发现蠕形螨可见于以下皮肤障碍：伴有或不伴红斑的面部瘙痒、毛细血管扩张等皮肤损害。国内外多项研究表明，玫瑰痤疮患者面部的蠕形螨检出率明显高于正常人。我国朱晓燕等使用透明胶带黏贴法对164例在校大学生的皮肤标本进行蠕形螨计数，发现玫瑰痤疮患者皮肤的蠕形螨数量明显多于正常人群，也证明了蠕形螨与玫瑰痤疮等面部皮损具有确切联系。目前有关蠕形螨参与玫瑰痤疮的发病的机制，主要有以下几个方面：
①蠕形螨损伤皮肤的屏障功能
皮肤的屏障功能的破坏是多种面部疾病的始动因素。国外发表文章报道了玫瑰痤疮的患者皮损经连续切片其皮损组织后，在其病理性肉芽肿等结构中均找到蠕形螨，并提到在连续切片中，常发现病理组织内有蠕形螨颗粒，因此推测蠕形螨因能够引起组织发生迟发型超敏反应而致病。在玫瑰痤疮皮损处的角质形成细胞中，蠕形螨的部分残体可诱导TLR2的过度表达和活化以及KLK5表达水平升高。KLK5具有使角质桥粒发生降解、细胞间连接发生解离的作用，从而使皮肤角质层因失去完整性而不能发挥正常的屏障功能；KLK5还可激活PAR2和下游的NF-κB通路，上调IL-8、TSLP以及TNF等炎症因子的表达；同时KLK5在PAR2信号通路的表达过程中发挥作用，阻碍板层小体释放，使角质层渗透屏障功能不能得到良好的修复。有研究从玫瑰痤疮的皮损中鉴定出热休克蛋白和脂蛋白的存在，这两种蛋白都是TLR2的激动剂。在蠕形螨等的诱导下，皮肤角质形成细胞所表达的TLR2数量和活性均升高，表皮KLK5活化，导致角质形成细胞间桥粒降解、抑制板层小体释放以及导致炎症因子的聚集，从而损害了皮肤物理屏障和免疫屏障功能。这些都说明蠕形螨在玫瑰痤疮患者体内可能引发、激活了一系列的免疫反应。
②蠕形螨影响皮肤血管、神经调节
玫瑰痤疮的不同亚型至少有500个基因与正常皮肤不同，这些异常的基因涉及到肾上腺素受体、蛋白酶等，即关系到血管调节；涉及到瞬时受体电位、辣椒素受体1等，即产生神经源性炎症。辣椒素受体属于瞬时受体电位家族的一员，当其被蠕形螨激活后，可释放一系列炎症介质导致疼痛和神经炎性症状的发生，引起玫瑰痤疮患者产生刺痛、烧灼感等不适，这些炎性介质包括降钙素基因相关肽和P物质等。也有相关研究表明，玫瑰痤疮患者可能存在神经血管调节受体相关的基因突变或者存在易感基因，在蠕形螨等多种因素的诱发下，通过瞬时受体电位释放神经肽，引起特征性的潮红、水肿甚至持续性红斑。
从目前国内外研究来看，蠕形螨的研究成为人体寄生虫学和皮肤病学领域的热门课题。因此，建立蠕形螨所致玫瑰痤疮的动物模型，深入开展蠕形螨所致玫瑰痤疮的研究，弄清病因及发病机理，研制治愈玫瑰痤疮药物，对于减轻患者心理负担，提高生活质量，将产生积极作用。
发明内容
鉴于上述，玫瑰痤疮发病率高，为了研究蠕形螨所致玫瑰痤疮的发病机制，本发明的目的在于提供一种构建蠕形螨致玫瑰痤疮样皮损动物模型的方法，利用该方法能够成功构建蠕形螨所致玫瑰痤疮样皮损的日本大耳兔动物模型。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种构建蠕形螨致玫瑰痤疮样皮损动物模型的方法，其步骤是：
a.清洁蠕形螨原虫混悬液的制备
①供螨者：中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院皮肤科门诊患者，确诊为玫瑰痤疮，并且螨虫镜检阳性；
②制备方法：供螨者温水洗净皮肤，拭干，然后使用取螨器挤压刮取鼻翼或面部皮脂分泌物，在获得的皮脂分泌物中加入一滴2%洗洁精，混合至均匀乳液状，并将均匀乳液状转移至5ml的玻璃试管中，加入2ml的1× PBS进行稀释，用洗耳球吹打混匀，置于4℃冰箱静置自然沉淀2h，弃玻璃试管中的上清液后，再次加入2ml的1× PBS进行稀释并沉淀，弃上清液后，再次重复上述操作，将清洗后的沉淀物转移入1.5ml EP管中备用；
③将②中获得的最终混悬液一滴置于载玻片上，在光学显微镜下观察，若蠕形螨原虫混悬液中蠕形螨密度为＞5条/cm2，则所取蠕形螨原虫混悬液合格；
b.造模前准备
①选择健康的12周龄雌性普通级日本大耳兔【SCXK（甘）2015～0001】，体重均在2.0～2.5kg之间；
②备皮：剔除日本大耳兔背部脊柱一侧4cm×4cm大小区域毛作为实验区域；
c.造模
①选择注射部位，注射部位为日本大耳兔已备皮的实验区皮肤；
②用75%酒精消毒实验皮肤区域；
③将a步骤③中制备的蠕形螨原虫混悬液转移至2ml皮试注射器中，排尽含有蠕形螨原虫混悬液的2ml皮试注射器内空气，一手绷紧日本大耳兔局部皮肤，一手持注射器针头斜面向上，与皮肤呈5°刺入日本大耳兔实验区皮肤，待针头斜面完全进入皮内，放平注射器。用紧绷皮肤的手固定针栓，注入0.2ml蠕形螨原虫混悬液，使局部形成皮丘，迅速拔针，不可按压局部。
d.观察方法
①观察及皮损红斑评分
首次注射蠕形螨原虫混悬液后观察注射部位皮损变化，并对皮肤红斑给予0～4标准评分，连续观察6周；
②组织病理观察
切除日本大耳兔实验区皮肤病变组织行病理检查，将所取组织进行固定、包埋，进行常规HE染色和显微镜下观察。每2周切取一次皮损，共观察6周。
本发明的优点：
1.本发明应用日本大耳兔做动物模型，兔的皮肤与人体更接近，分为表皮、真皮及皮下组织，且含有皮肤附属器，如：毛囊及皮脂腺。日本大耳兔皮肤较厚，通过皮内注射方式较容易将蠕形螨注射于真皮层内。日本大耳兔对刺激反应敏感，反应近似于人，抗感染及适应率更强，死亡率低，实验区域大，更适合于蠕形螨所致玫瑰痤疮样皮损的建模。
2. 通过制备清洁蠕形螨原虫混悬液的步骤可以得到相对清洁的蠕形螨，不会造成皮内注射后日本大耳兔细菌感染，不会影响其他杂质干扰观察日本大耳兔皮肤病理组织的实验结果，达到蠕形螨致玫瑰痤疮样皮损的动物模型目的。
3.本发明通过皮内注射的方式，可以成功的观察到日本大耳兔动物模型和蠕形螨阳性的玫瑰痤疮患者一样的临床表现，此外在日本大耳兔组织病理中可以观察到与蠕形螨阳性的玫瑰痤疮患者组织病理高度相似的肉芽肿组织。符合日本大耳兔作为蠕形螨致玫瑰痤疮样皮损动物模型的要求，且能够反映出高度相似的临床及组织病理学表现。
4. 本发明按照人伦理念，人体实验违反道德规范。本发明可以在动物上复制蠕形螨阳性的玫瑰痤疮患者皮损的临床表现及组织病理学表现，可以长期开展蠕形螨所致玫瑰痤疮动物模型上连续的组织病理学观察及相关研究。
附图说明
图1为蠕形螨阳性的玫瑰痤疮患者面部皮脂腺分泌物中的蠕形螨（原始放大倍率×40）。
图2A为蠕形螨感染1天后日本大耳兔实验区背部皮损可见炎性红斑。
图2B为蠕形螨感染2周后日本大耳兔实验区背部皮损可见红斑基础上约0.4～0.8cm左右***丘疹；
图2C为蠕形螨感染4周后日本大耳兔实验区背部皮损可见散在0.4～0.8cm左右炎性丘疹；
图2D为蠕形螨感染6周后日本大耳兔实验区背部皮损可见散在0.3～0.5cm左右结节。
图2E为病程为3个月的蠕形螨阳性玫瑰痤疮患者临床表现，为红斑基础上约0.3～1cm左右丘疹、结节。
图3A为蠕形螨感染4周后日本大耳兔实验区背部皮损病理组织表现，为真皮内有炎性细胞浸润，肉芽肿组织形成（原始放大倍率×100）；
图3B为蠕形螨感染6周后日本大耳兔实验区背部皮损病理组织表现，为真皮内有完整的肉芽肿组织形成（原始放大倍率×100）；
图3C为病程为3个月的蠕形螨阳性玫瑰痤疮患者皮损病理组织表现，为真皮内炎性细胞浸润及肉芽肿组织形成（原始放大倍率×40）。
图3D为图3C的局部放大图，为真皮内炎性细胞浸润及肉芽肿组织形成（原始放大倍率×100）。
具体实施方式
下面，结合附图，对本发明技术方案再做进一步说明：
一种构建蠕形螨致玫瑰痤疮样皮损动物模型的方法，其步骤是：
构建动物模型
1、日本大耳兔的选择与培养
①选择健康的12周龄雌性普通级日本大耳兔【SCXK（甘）2015～0001】24只，体重均在2.0～2.5kg之间。
②动物分组：将日本大耳兔饲养1周后，随机分成实验组和对照组，每组12只，分笼饲养于清洁动物室。
③饲养条件：温度 23±2℃，湿度 54±10％，每天通风 2～3 次，每次持续 1 小时，按照日本大耳兔的自然生活模式，给予草料喂养，使其自由进行饮水和进食，自由活动，在此条件下饲养1周，等日本大耳兔完全适应该条件后，开始实验操作。
2、实验清洁蠕形螨的制备
①供螨者：中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院皮肤科门诊患者，确诊为玫瑰痤疮，并且螨虫镜检阳性。蠕形螨感染度标准参照每平方厘米皮肤计算螨的数量，分为轻中重3度：1～5只为轻度感染(+)，6～10只为中度感染(++)，10只以上为重度感染(+++)。本发明主要选取中重度蠕形螨感染的玫瑰痤疮患者作为供螨者（即蠕形螨密度为＞5条/cm2），图1为蠕形螨阳性的玫瑰痤疮患者面部皮脂腺分泌物中的蠕形螨，图2E为供螨者面部皮损临床表现，图3C为供螨者皮损组织病理学表现。
②取材部位：鼻周、面部皮损处皮脂分泌丰富部位。
③蠕形螨混悬液制备方法：供螨者温水洗净皮肤，拭干，使用灭菌的毛巾热敷患者面部2min，使得供螨着面部毛孔充分张开。由于蠕形螨在离体状态下耐低温不耐高温，故整个取螨过程中，在室温20～30℃的环境下操作，供螨者需面对医师，仰头约60度角不动，医师带上指套，手持灭菌后的取螨器，用取螨器刮片端快速挤压患者鼻沟，鼻翼部或面部皮损处，挤出线头状乳白色或淡黄色皮脂（根据供螨着不同取材颜色质地略有不同），在获得的皮脂分泌物中加入一滴2%安利洗洁精作为皮脂溶解剂，混合至均匀乳液状，转移至5ml的玻璃试管中，加入2ml的1×PBS（HyClone SH30256.01B）进行稀释，以保护虫体，再用洗耳球吹打混匀，置于4℃冰箱静置自然沉淀2h，弃玻璃试管中的上清液后，再次加入2ml的1× PBS进行稀释并沉淀弃上清液后，再次重复上述操作。最后，将清洗后的沉淀物转移入1.5ml EP管中备用；
④由于在操作过程中蠕形螨密度会改变，故将上述③中获得的最终混悬液一滴置于载玻片上，在光学显微镜（BX53; Olympus Corporation, Tokyo, Japan)下观察，若蠕形螨原虫混悬液中蠕形螨密度为＞5条/cm2则所取蠕形螨原虫混悬液合格。
3、造模方法
①造模前准备：用记号笔标记出4cm×4cm日本大耳兔脊柱一侧实验皮肤范围。并使用清洁毛刷蘸取少量生理盐水，均匀的刷在日本大耳兔实验区域使兔毛湿润。打开备皮包取出刮毛刀片刮除实验区域兔毛，使得实验区域皮肤充分暴露。
②造模：
a.将蠕形螨原虫混悬液，皮内注射于日本大耳兔背部实验区，每个皮丘0.2ml。
b.皮内注射方法：
（1）选择注射部位，注射部位为日本大耳兔已备皮的实验区皮肤；（2）用75%酒精消毒实验皮肤区域；（3）排尽含有蠕形螨原虫混悬液或者1×PBS的2ml皮试注射器内空气，一手绷紧局部皮肤，一手持注射器针头斜面向上，与皮肤呈5°刺入日本大耳兔实验区皮肤，待针头斜面完全进入皮内，放平注射器。用紧绷皮肤的手固定针栓，对实验组实验区皮肤皮内注入0.2ml蠕形螨原虫混悬液，对对照组实验区皮肤皮内注入0.2ml1×PBS，使局部形成皮丘。迅速拔针，不可按压局部。
③观察：实验组和对照组第1天及每2周观察皮损变化，并每2周切取皮肤组织行病理检查。
④皮损取材及皮肤组织石蜡切片的制备:取材选取新鲜皮损组织，在皮损边缘处切取1.4cm×1.4cm×0.2cm大小梭形皮损行组织病理学检查；所取组织使用8%***溶液固定，之后依次在浓度为80%、90%、95%、100%的酒精溶液里进行脱水处理，使用二甲苯透明，接着石蜡包埋组织，以5～6μm的厚度连续切片，脱蜡后行HE染色。
4、观察方法
①观察及皮损红斑评分
首次注射蠕形螨原虫混悬液后观察各组注射部位皮损变化，并对皮肤红斑给予评分，0分为无红斑，1分为隐约可见红斑，2分为明显可见淡红斑，边界模糊，3分为红斑明显且边界清晰，4分为红斑颜色深边界清晰。连续观察6周。
在观察过程中可见实验组蠕形螨感染1天后日本大耳兔背部皮损实验区仅出现炎症红斑，注射皮丘区域平复，未出现丘疹结节等临床表现（参见图2A）；2周后日本大耳兔背部皮损实验区仍有炎症红斑，注射皮丘区域红色炎性丘疹为***（参见图2B）；4周后日本大耳兔背部皮损实验区炎症红斑消退，注射皮丘区域炎性丘疹未消退平复，留有淡红色炎性丘疹、结节，触之有活动性（参见图2C）；6周后日本大耳兔背部皮损实验区未见炎症红斑，注射皮丘区域丘疹、结节未消退平复，可见丘疹结节为皮色，炎症消退（参见图2D）。图2E所示为病程为3个月的蠕形螨阳性玫瑰痤疮患者临床表现，为红斑基础上约0.3～1cm左右丘疹、结节。图2B、图2C和图2D为实验组日本大耳兔在第2周、第4周、及第6周实验区皮损表现，整个过程中可见日本大耳兔实验区散在炎性红斑基础上的丘疹、结节，图2B、图2C和图2D与图2E比照得出日本大耳兔实验区皮损临床表现与蠕形螨阳性玫瑰痤疮患者所出现皮损临床表现一致。
对照组在皮内注射1天后实验区皮肤未出现炎性红斑、丘疹，在之后的第2周、第4周、及第6周整个观察过程中未出现炎性红斑、丘疹及结节皮损表现。
②组织病理观察
切除皮肤组织行病理检查。所取组织进行固定、包埋，进行常规HE染色并在显微镜下观察。每2周切取一次皮损，共观察6周。
在显微镜下观察过程中，实验组日本大耳兔皮损病理组织切片中蠕形螨感染4周后皮损真皮内有炎性细胞浸润，肉芽肿组织形成（参见图3A）；蠕形螨感染6周后皮损真皮内有完整的肉芽肿组织形成（参见图3B）。图3C及图3D为病程为3个月的蠕形螨阳性玫瑰痤疮患者皮损病理组织表现，为真皮内炎性细胞浸润及肉芽肿组织形成。图3A、图3B为实验组日本大耳兔在第4周、及第6周的组织病理切片中可见炎性细胞浸润和完整的肉芽肿组织形成，图3C、图3D与图3A、图3B比照得出日本大耳兔实验区皮损病理组织表现与蠕形螨阳性玫瑰痤疮患者所出现组织病理学表现一致。
对照组在皮内注射1×PBS后的第2周、第4周、及第6周整个观察过程中未出现炎性细胞浸润和肉芽肿组织的组织病理学表现。
综上所述，日本大耳兔动物模型出现和蠕形螨阳性的玫瑰痤疮患者一样的临床表现，此外在日本大耳兔组织病理中可以观察到与蠕形螨阳性的玫瑰痤疮患者组织病理高度相似的肉芽肿组织。符合将日本大耳兔作为蠕形螨致玫瑰痤疮样皮损动物模型的要求，且能够反映出高度相似的临床及组织病理学表现。
本发明在以往对玫瑰痤疮与蠕形螨的研究基础上进一步拓宽思路，探索挖掘，提出观点：蠕形螨为玫瑰痤疮的主要致病因素之一。由于在人体组织无法实现连续活检行动态组织病理观察，限制了蠕形螨对玫瑰痤疮的进一步研究。因此，本发明一方面构建蠕形螨所致玫瑰痤疮样皮损的日本大耳兔动物模型，来进一步研究蠕形螨导致玫瑰痤疮的病因及发病机制，同时可以为玫瑰痤疮的诊断治疗提供一种新途径。另一方面可用于未来相关玫瑰痤疮药物的评估研究。
Claims (1)
1.一种构建蠕形螨致玫瑰痤疮样皮损动物模型的方法，其步骤是：
a.清洁蠕形螨原虫混悬液的制备
①供螨者：中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院皮肤科门诊患者，确诊为玫瑰痤疮，并且螨虫镜检阳性；
②制备方法：供螨者温水洗净皮肤，拭干，然后使用取螨器挤压刮取鼻翼或面部皮脂分泌物，在获得的皮脂分泌物中加入一滴2%洗洁精，混合至均匀乳液状，并将均匀乳液状转移至5ml的玻璃试管中，加入2ml的1× PBS进行稀释，用洗耳球吹打混匀，置于4℃冰箱静置自然沉淀2h，弃玻璃试管中的上清液后，再次加入2ml的1× PBS进行稀释并沉淀，弃上清液后，再次重复上述操作，将清洗后的沉淀物转移入1.5ml EP管中备用；
③将②中获得的最终混悬液一滴置于载玻片上，在光学显微镜下观察，若蠕形螨原虫混悬液中蠕形螨密度为＞5条/cm2，则所取蠕形螨原虫混悬液合格；
b.造模前准备
①选择健康的12周龄雌性普通级日本大耳兔，体重均在2.0～2.5kg之间；
②备皮：剔除日本大耳兔背部脊柱一侧4cm×4cm大小区域毛作为实验区域；
c.造模
①选择注射部位，注射部位为日本大耳兔已备皮的实验区皮肤；
②用75%酒精消毒实验皮肤区域；
③将a步骤③中制备的蠕形螨原虫混悬液转移至2ml皮试注射器中，排尽含有蠕形螨原虫混悬液的2ml皮试注射器内空气，一手绷紧日本大耳兔局部皮肤，一手持注射器针头斜面向上，与皮肤呈5°刺入日本大耳兔实验区皮肤，待针头斜面完全进入皮内，放平注射器；
用紧绷皮肤的手固定针栓，注入0.2ml蠕形螨原虫混悬液，使局部形成皮丘，迅速拔针，不可按压局部；
d.观察方法
①观察及皮损红斑评分
首次注射蠕形螨原虫混悬液后观察注射部位皮损变化，并对皮肤红斑给予0～4标准评分，连续观察6周；
②组织病理观察
切除日本大耳兔实验区皮肤病变组织行病理检查，将所取组织进行固定、包埋，进行常规HE染色和显微镜下观察；
每2周切取一次皮损，共观察6周。
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