CN110272496A - 利用磁珠纯化提高双特异性抗体的纯度的方法 - Google Patents

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郁博文
刘科梅
徐珊珊
王芳
陈俏梅
王卓智
李竞
顾继杰
陈智胜
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Wuxi Yaoming Biotechnology Co ltd
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies

Abstract

本发明公开一种利用磁珠纯化提高双特异性抗体的纯度的方法，包括步骤：将经活化的Protein A包被磁珠与待纯化的含双特异性抗体的上清液混合，孵育，待磁珠与双特异性抗体充分结合后，通过磁分离去除上清；先用平衡缓冲液清洗磁珠，清洗2～5次；再用水清洗磁珠；将得到的清洗后的磁珠用洗脱液进行洗脱，磁分离并收集洗脱液；分离后的磁珠再用洗脱液进行洗脱1～3次，合并洗脱液，得纯化后的双特异性抗体。本发明的方法无需澄清操作，节省了时间，并减少了设备需求，可以在较短的时间内完成更高通量、更大体积样品的双特异性抗体的纯化。

Description

利用磁珠纯化提高双特异性抗体的纯度的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种利用磁珠纯化提高双特异性抗体的纯度的方法。
背景技术
单克隆抗体是B淋巴细胞和骨髓瘤细胞杂交形成的杂交瘤产生的，其轻链和重链所形成的结构域可以识别和结合特异抗原。至1997年FDA批准第一个治疗淋巴癌的嵌合单克隆抗体上市以来，已有许多抗体药物获批，多个成为年销售额超十亿美元的“炸弹药物”。双特异性抗体是在单抗的基础上通过人工工程化产生，可以同时识别两个相同或不同的在抗原表位的免疫球蛋白，它的这种特点较于传统单抗具有显著的优越性。例如，双特异性抗体结合一个单一受体的两个抗原表位，可以启动针对该目标的不同抑制机制，从而显著提升结合单一表位的能力。此外，双特异性抗体可以同时结合两个致病中介物(如中和两个培基或阻碍两个受体)，限制两条通路，形成协同或叠加作用。其他情况下，同时标定肿瘤细胞和免疫细胞效应物的双特异性抗体可以有效偶联这两类细胞，启动细胞毒性。Catumaxomab(Removab， Trion)于2009年正式获得EMA批准在欧洲上市，用于治疗恶性腹水(腹腔转移癌晚期患者常见的一种并发症)，成为全球第一个上市的双特异性抗体。双特异性抗体的制备主要有双杂交瘤细胞法，化学偶联，重组基因等方法，其中重组基因是目前使用最多的技术。
抗体药物已成为全球生物制药领域的主旋律，其迅猛发展对抗体的分离纯化提出了更高的要求。抗体的纯化方法通常基于捕获亲和色谱，一般为Protein A，然后是离子交换/疏水/ 混合模式色谱步骤。Protein A是一种从金黄葡萄球菌细胞膜上提取的蛋白，具有5个IgG结合结构域，能特异性地与抗体Fc端结合。利用Protein A亲和纯化的优势在于在工艺初期就能获得高纯度产品。现阶段最常用的Protein A亲和层析介质是通过将ProteinA用化学偶联的方法固定在琼脂糖凝胶表面制成亲和填料，然后装填成层析柱。
虽然双特异性抗体有着单抗无法比拟的优势，然而，由于多达四个特异性多肽链的共同表达或涉及延展长度的多肽链的组装，IgG类双特异性抗体的重组生产通常伴随着由于重链同源二聚化，重链和轻链的错配，不同链的不平衡的表达以及分子间的错误分配等导致目的物类的杂质的增加(副产品或聚集体)。由于一些副产物展示出与目的双抗高度的相似性，它们的去除对生产工艺提出了很高的挑战。因此，寻找一种高效的Protein A亲和纯化方法，能在初步提纯时提高双特异性抗体的纯度，具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种双特异性抗体的纯化方法，提高双特异性抗体的纯度，相比传统的层析柱具有节省时间、操作简便、减少了设备需求等优点。
为解决上述技术问题，本发明提供一种利用磁珠纯化提高双特异性抗体的纯度的方法，包括步骤：
(1)结合：将经活化的Protein A包被磁珠与待纯化的含双特异性抗体的上清液混合，孵育，待磁珠与双特异性抗体充分结合后，通过磁分离去除上清，得到结合后的磁珠；
(2)清洗：先用平衡缓冲液清洗步骤(1)得到的磁珠，所述平衡缓冲液为0.05～0.5M Tris 缓冲液，pH 6.7～7.3，清洗2～5次；再用水清洗磁珠；
(3)洗脱：将步骤(2)得到的清洗后的磁珠用洗脱液进行洗脱，所述洗脱液为0.05～0.5M 甘氨酸溶液，pH 2.5～3.5，磁分离并收集洗脱液；分离后的磁珠再用洗脱液进行洗脱1～3次，合并洗脱液，得纯化后的双特异性抗体。
优选的，所述平衡缓冲液为0.06～0.4M Tris缓冲液；优选的，所述平衡缓冲液为0.07～0.3M Tris缓冲液；优选的，所述平衡缓冲液为0.08～0.2M Tris缓冲液；优选的，所述平衡缓冲液为 0.09～0.1M Tris缓冲液；优选的，所述平衡缓冲液为0.1M Tris缓冲液。
优选的，所述平衡缓冲液的pH值为pH 6.8～7.2；优选的，所述平衡缓冲液的pH值为pH 6.9～7.1；优选的，所述平衡缓冲液的pH值为pH 7.0。
优选的，所述步骤(2)中，用平衡缓冲液清洗3～4次；优选的，所述步骤(2)中，用平衡缓冲液清洗3次。
优选的，所述洗脱液为0.06～0.4M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.07～0.3M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.08～0.2M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.09～0.1M 甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.1M甘氨酸溶液。
优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.6～3.4；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.7～3.3；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.8～3.2；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.9～3.1；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 3.0。
优选的，所述步骤(3)中，用洗脱液共洗脱2～3次；优选的，所述步骤(3)中，用洗脱液共洗脱3次。
优选的，所述Protein A包被磁珠为AmMag Protein A磁珠。
具体的，所述步骤(1)中，磁珠的活化方法为：先通过磁分离将存储磁珠的溶液去除，得磁珠；然后用NaOH溶液清洗磁珠；再用平衡缓冲液清洗磁珠，清洗2～5次，得活化的磁珠。
具体的，所述步骤(1)中，孵育时间为0.5～24h。优选的，孵育时间为1～4小时。优选的，孵育时间为2～3小时。
具体的，所述步骤(3)中，完成洗脱后的磁珠先用NaOH溶液清洗，然后用水清洗，再加入20％乙醇，将磁珠于4℃保存。
本发明的方法中，Protein A包被磁珠是指以超顺磁微球为基质，表面通过共价连接的方式，包被上耐碱性的Protein A。Protein A包被磁珠耐受0.1M NaOH清洗，适用于需要控制内毒素样品的纯化。超顺磁微球具有超强的顺磁性，在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能够有助于磁珠均匀的分散开。其次，具有合适的且差别较小的粒径，比如直径为30-100μm，保证了足够强的磁响应性又不易沉降。再次，具有丰富的表面活性基团，以便可以和生化物质偶联，并在外磁场的作用下实现与待测样品的分离。与传统的分离方法相比，把磁珠用于生化样品复杂组分的分离，能够实现分离与富集的同时进行，有效地提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升。
本发明的方法，将含有抗体的样品加入磁珠中，在摇床上孵育一小段时间，使抗体与磁珠充分结合。当抗体结合到磁珠上之后，可通过酸性洗脱溶液使抗体与磁珠分离，再利用磁力架将磁珠吸附于管壁，方便样品的取出。磁分离消除了离心的需要，最大限度减少了样品的损失。
本发明将Protein A包被磁珠应用于双特异性抗体的亲和纯化，还具有以下优点：
(1)双特异性抗体表达上清液无需澄清操作，节省了时间，并减少了设备需求。
(2)相比传统的层析柱，本发明的方法可以在较短的时间内完成更高通量、更大体积样品的双特异性抗体的纯化。纯化操作简单，不需要价格高昂的层析设备。
(3)本发明的方法中，由于抗体表达上清液与磁珠的接触更加均匀，不容易产生局部浓度过大的问题，样品洗脱更加完全。
(4)磁珠纯化的双特异性抗体纯度普遍高于传统层析柱法得到的样品，降低了进行SEC、 IEX或CHT等多步纯化的需求，提高了样品回收率。
本发明采用Protein A包被的超顺磁性磁珠应用于双特异性抗体的纯化，以取代现有的亲和纯化操作。Protein A包被磁珠纯化技术无需复杂的层析设备，对样品的澄清度没有限制，只需要简单的磁性吸附步骤即可方便快捷地从抗体表达产物中分离出抗体，有效解决了传统层析技术的不足之处。但由于目前上市的Protein A包被磁珠的抗体结合能力对于传统琼脂糖填料仍有较大的差距，且Protein A包被磁珠的使用寿命相对来说也比较短，因此，仍未能大规模地应用于抗体纯化工业。本发明通过调节样品孵育时间，一定程度上改善了ProteinA包被磁珠与抗体结合效果。
WuXiBody是药明生物具有自主知识产权的双特异性抗体技术平台，该平台已经在国内外实现了商业化的运营，为业界最好的双特异性抗体平台之一。该平台允许将任何单抗序列对组装成双特异性结构，其独特的结构灵活性方便构建各种格式不同化合价的抗体，以满足不同项目的生物学特征需求。本发明提供的方法，尤其适用于WuXiBody双特异性抗体纯化。
附图说明
图1为Protein A包被磁珠的使用流程图。
图2为实施例1中单抗样品SDS-PAGE检测结果图
具体实施方式
下面将对本发明/发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明/发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明/发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明/发明保护的范围。
实施例1.AmMag Protein A磁珠应用于单克隆抗体纯化且控制内毒素
首先准备AmMag Protein A磁珠：(1)通过磁分离将存储磁珠的20％乙醇去除；(2)加入0.1M NaOH清洗磁珠，孵育0.5h后通过磁分离去除NaOH；(3)加入0.1M Tris,pH7.0 平衡磁珠，重复清洗3次；(4)加入三倍磁珠体积的0.1M Tris,pH7.0混匀，得到活化的磁珠悬浮液。
在20ml单克隆抗体表达上清中加入适量活化的磁珠悬浮液，在摇床上孵育2h，使磁珠与抗体充分结合，后通过磁分离去除上清。用0.1M Tris,pH7.0清洗磁珠，重复3次，再用 H2O清洗磁珠。加入1.5ml 0.1M Glycine,pH 3.0进行洗脱，孵育10分钟，磁分离后将洗脱液吸出，重复洗脱三次。
样品纯化结束清洗磁珠：(1)加入0.1M NaOH清洗磁珠，通过磁分离去除NaOH；(2)加入H2O清洗磁珠，通过磁分离去除H2O；(3)加入20％乙醇，将磁珠保存于4℃。
表1为样品纯化结果：一步纯化的纯度大于98％，且内毒素水平都低于2EU/mg。
表1：单抗样品纯化统计数据
本发明用0.1M NaOH处理AmMag Protein A磁珠，可以很好地控制样品的内毒素水平。
实施例2.AmMag Protein A磁珠与传统填料应用于WuXiBody双特异性抗体纯化的比较
首先将磁珠同实例1进行清洗并活化。同时准备传统GE MabSelect SuRe层析柱，先用 0.5M NaOH冲洗0.5h，再用0.1M Tris,pH7.0平衡后即可上样。将双特异性抗体表达上清样品平均分为两份，同时进行纯化。AmMag Protein A磁珠使用0.1M Glycine pH3.0洗脱，GE MabSelect SuRe层析柱使用0.1M Glycine pH3.5洗脱。
表2为四次试验的纯化结果比较：AmMag磁珠纯化的双特异性抗体纯度总体都高于MabSelect SuRe层析柱纯化所得的样品。
表2：双抗样品纯化统计数据
实施例3.AmMag Protein A应用于大体积的双特异性抗体样品的纯化
双特异性抗体结构较为复杂，尤其是当样品容易产生多聚的情况下，使用GEMabSelect SuRe层析柱进行纯化可能会出现难洗脱的现象。BsAb 5样品使用GE MabSelectSuRe层析柱进行纯化时，使用常规0.1M Glycine pH3.5洗脱时几乎得不到产物，更改洗脱条件使用0.1M Glycine，0.2M Arginine，pH3.0洗脱得到的抗体纯度较低。尝试用AmMag磁珠纯化后虽然得率仍然较低，但产物纯度较高，因此放大体积进行生产。首先将磁珠同实例1进行清洗并活化。为了使样品与磁珠结合更加充分，将2L的抗体表达上清均分为10份，加入适量磁珠放置于摇床上孵育3h。后同实例1进行清洗及洗脱，最后得到了的纯化数据如表3：
表3：大体积双抗样品纯化统计数据
Sample Amount(mg) Purity
BsAb 5 29.82 95.95％
综上所述，上述各实施例仅为本发明/发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明 /发明的保护范围，凡在本发明/发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明/发明的保护范围内。

Claims (11)

1.一种利用磁珠纯化提高双特异性抗体的纯度的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)结合：将经活化的Protein A包被磁珠与待纯化的含双特异性抗体的上清液混合，孵育，待磁珠与双特异性抗体充分结合后，通过磁分离去除上清，得到结合后的磁珠；
(2)清洗：先用平衡缓冲液清洗步骤(1)得到的磁珠，所述平衡缓冲液为0.05～0.5MTris缓冲液，pH 6.7～7.3，清洗2～5次；再用水清洗磁珠；
(3)洗脱：将步骤(2)得到的清洗后的磁珠用洗脱液进行洗脱，所述洗脱液为0.05～0.5M甘氨酸溶液，pH 2.5～3.5，磁分离并收集洗脱液；分离后的磁珠再用洗脱液进行洗脱1～3次，合并洗脱液，得纯化后的双特异性抗体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液为0.06～0.4M Tris缓冲液；优选的，所述平衡缓冲液为0.07～0.3M Tris缓冲液；优选的，所述平衡缓冲液为0.08～0.2M Tris缓冲液；优选的，所述平衡缓冲液为0.09～0.1M Tris缓冲液；优选的，所述平衡缓冲液为0.1M Tris缓冲液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液的pH值为pH 6.8～7.2；优选的，所述平衡缓冲液的pH值为pH 6.9～7.1；优选的，所述平衡缓冲液的pH值为pH 7.0。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，用平衡缓冲液清洗3～4次；优选的，所述步骤(2)中，用平衡缓冲液清洗3次。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱液为0.06～0.4M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.07～0.3M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.08～0.2M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.09～0.1M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.1M甘氨酸溶液。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱液的pH值为pH 2.6～3.4；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.7～3.3；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.8～3.2；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.9～3.1；优选的，所述洗脱液的pH值为pH3.0。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，用洗脱液共洗脱1～3次；优选的，所述步骤(3)中，用洗脱液共洗脱3次。
8.如权利要求1所述的方法，所述Protein A包被磁珠为AmMag Protein A磁珠。
9.如权利要求1所述的方法，所述步骤(1)中，磁珠的活化方法为：先通过磁分离将存储磁珠的溶液去除，得磁珠；然后用氢氧化钠溶液清洗磁珠；再用平衡缓冲液清洗磁珠，清洗2～5次，得活化的磁珠。
10.如权利要求1所述的方法，所述步骤(1)中，孵育时间为0.5～24h。优选的，孵育时间为1～4小时。优选的，孵育时间为2～3小时。
11.如权利要求1所述的方法，，所述步骤(3)中，完成洗脱后的磁珠先用NaOH溶液清洗，然后用水清洗，再加入20％乙醇，将磁珠于4℃保存。
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