CN110268067A - 用于产生立体异构纯的氨基环丙烷的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本披露涉及用于产生立体异构纯的氨基环丙烷的组合物和方法。
Description
本申请要求2016年8月16日提交的美国临时申请号62/375,719的权益，其全部内容以其全文通过引用特此并入(就像写在本文中一样)。
本披露涉及用于产生立体异构纯的氨基环丙烷的组合物和方法，更具体地涉及使用工程化的酮还原酶来合成氨基环丙烷的方法。
立体异构纯的经取代氨基环丙烷是用于合成KDM1A抑制化合物的关键手性中间体，这些KDM1A抑制化合物可用于治疗血液学疾病，如镰状细胞病、重型地中海贫血和其他血红蛋白病，以及肿瘤和克隆性障碍，诸如乳腺癌和***癌、急性髓性白血病、骨髓增殖性肿瘤和骨髓增生异常综合征。
虽然已经知道用于产生这些手性中间体的多种方法，但这些方法存在明显的缺点，使得它们不是用于商业规模合成的理想方案。这些缺点包括多次柱色谱分离、额外的反应步骤、低收率、高试剂成本、低效率(仅使用非对映异构体中间体的一半)、大量的溶剂以及对中间体和溶剂进行极端干燥，从而使得该方法难以放大规模。考虑到这些关键手性中间体在合成KDM1A抑制剂中的重要性，可用于以经济有效且高效的方式合成这些化合物的组合物和方法将是相当可取的。
因此，仍然需要用于合成立体异构纯的氨基环丙烷的经改进方法和组合物，更具体地讲，需要使用工程化的酮还原酶来合成经取代氨基环丙烷的方法。
因此，本文披露了用于合成立体异构纯的氨基环丙烷的组合物和方法。在某些实施例中，这些组合物和方法的优点包括以下一种或多种：1)无需柱色谱纯化；2)反应操作简单；3)无需极端无水的中间体和溶剂；4)后处理简单；5)利用生物转化引入立体异构源中心；以及6)总收率高。
在某些实施例中，这些方法使用工程化的酮还原酶来合成经取代氨基环丙烷。
因此，提供了一种组合物，该组合物包含：
a)式II的化合物：
或其盐；其中：
X选自Cl、Br和I；
R1选自芳基和杂芳基，这些基团中的任何基团任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代；
每个R3选自氢、卤素、烷基、烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、卤代烷氧基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、氰基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、C(O)R4、S(O)2R4、NHS(O)2R4、NHS(O)2NHR4、NHC(O)R4、NHC(O)NHR4、C(O)NHR4和C(O)NR4R5；
R4和R5独立地选自氢和低级烷基；
或者R4和R5可以合在一起形成含氮杂环烷基或杂芳基环，该含氮杂环烷基或杂芳基环任选地被低级烷基取代；以及
b)工程化或分离的酮还原酶，该工程化或分离的酮还原酶能够立体选择性地将式II的氧代基还原为羟基基团。
还提供了用于制备式III的手性卤代醇化合物：
或其盐的方法；其中：
X选自Cl、Br和I；
R1选自芳基和杂芳基，这些基团中的任何基团任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代；
每个R3选自氢、卤素、烷基、烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、卤代烷氧基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、氰基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、C(O)R4、S(O)2R4、NHS(O)2R4、NHS(O)2NHR4、NHC(O)R4、NHC(O)NHR4、C(O)NHR4和C(O)NR4R5；
R4和R5独立地选自氢和低级烷基；或者R4和R5可以合在一起形成含氮杂环烷基或杂芳基环，该含氮杂环烷基或杂芳基环任选地被低级烷基取代；该方法包括以下步骤：
a)用能够立体选择性地将氧代基还原为羟基基团的工程化或分离的酮还原酶对映选择性地还原式II的化合物：
或其盐，以提供该式III的手性卤代醇化合物：
提供了用于制备式I的手性环丙基化合物
或其盐的方法；其中：
R1选自芳基和杂芳基，这些基团中的任何基团任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代；
R2选自氢和C(O)OR3；
每个R3选自氢、卤素、烷基、烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、卤代烷氧基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、氰基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、C(O)R4、S(O)2R4、NHS(O)2R4、NHS(O)2NHR4、NHC(O)R4、NHC(O)NHR4、C(O)NHR4和C(O)NR4R5；
R4和R5各自独立地选自氢和低级烷基；
或者R4和R5可以合在一起形成含氮杂环烷基或杂芳基环，该含氮杂环烷基或杂芳基环任选地被低级烷基取代；该方法包括以下步骤：
a)用能够立体选择性地将氧代基还原为羟基基团的工程化或分离的酮还原酶对映选择性地还原式II的化合物：
或其盐；以提供式III的手性卤代醇化合物：
其中X选自Cl、Br和I，
b)用碱处理式III的化合物，以提供式IV的环氧化物或其盐：
c)用沃兹沃思-埃蒙斯(Wadsworth-Emmons)试剂和碱处理式IV的化合物，以提供式V的环丙基酯或其盐：
d)用试剂处理式V的化合物，以提供式VI的环丙基酸或其盐：
e)用叠氮化试剂、碱和式VII的醇处理式VI的化合物：
以提供式VIII的环丙基氨基甲酸酯或其盐：
以及任选地，
f)用合适的脱保护碱或酸处理式VIII的环丙基氨基甲酸酯，以提供式IX的环丙基胺或其盐：
附图说明
图1示出了分离的第1批卤代醇的RP-HPLC色谱图；小图片A：全色谱图；小图片B：色谱图的扩展版本；
图2示出了分离的第2批卤代醇的RP-HPLC色谱图；小图片A：全色谱图；小图片B：色谱图的扩展版本；
图3示出了分离的第1批S-卤代醇的手性HPLC色谱图；小图片A：全色谱图；小图片B：色谱图的扩展版本
图4示出了分离的第2批S-卤代醇的手性HPLC色谱图；小图片A：全色谱图；小图片B：色谱图的扩展版本；
图5示出了第1批卤代醇的1H NMR光谱(CDCl3，500MHz)；并且
图6示出了第2批卤代醇的1H NMR光谱(CDCl3，500MHz)。
图7示出了在35℃下对由KRED P1-F07酮还原得到的卤代醇进行手性HPLC分析获得的结果。
图8示出了在35℃下KRED P2-G03和KRED P1-F07(0.5g/L)将2-氯-4’-氟苯乙酮(150g/L)还原为S-卤代醇的时间进程。
具体实施方式
缩写与定义
为了有助于对本披露的理解，如本文所用的大量术语和缩写定义如下：
当介绍本披露或其一个或多个优选实施例的要素时，冠词“一个/一种”、“该”和“所述”旨在表示存在这些要素中的一个或多个。术语“包括”、“包含”和“具有”旨在有包含性，意指可以存在除所列要素之外的另外的要素。
当术语“和/或”在两个或更多个项目的清单中使用时，意指所列出项目中的任何一项可以单独采用，或与所列出项目中的任何一项或多项组合采用。例如，表述“A和/或B”旨在意指A和B中的任一者或两者，即，单独的A、单独的B，或者A与B组合。表述“A、B和/或C”旨在意指单独的A、单独的B、单独的C、A与B组合、A与C组合、B与C组合，或者A、B与C组合。
如本文所用的术语“约”当指代可测量的值诸如化合物的量、剂量、时间、温度等时，意在涵盖指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。
当披露数值范围，以及使用符号“从n1......至n2”或“介于n1......与n2之间”时，其中n1和n2是数字，则除非另外指明，否则该符号旨在包括这些数字本身以及它们之间的范围。该范围可以是在这些端值之间的完整或连续范围，并且包括这些端值。举例来说，范围“从2个至6个碳原子”旨在包括两个、三个、四个、五个以及六个碳原子，因为碳原子是以整数单位出现的。举例来说，将范围“从1μM至3μM(微摩尔)”(旨在包括1μM、3μM，以及这两者之间的所有数)与许多有效数字(例如，1.255μM、2.1μM、2.9999μM等)进行比较。当n在“0个碳原子”的上下文中被设定为0时，旨在表示化学键或无。
如本文所用的术语“烷基磺酰基”意指如本文所定义的通过磺酰基基团(如本文所定义)附加到母体分子部分上的烷基基团。烷基磺酰基的代表性实例包括但不限于甲磺酰基和乙磺酰基。
如本文所用的术语“烷基磺酰基烷基”意指如本文所定义的通过烷基基团(如本文所定义)附加到母体分子部分上的烷基磺酰基基团。烷基磺酰基烷基的代表性实例包括但不限于甲基磺酰基甲基和乙基磺酰基甲基。
如本文单独或组合使用的，术语“酰基”是指附接到烯基、烷基、芳基、环烷基、杂芳基、杂环或任何其他部分上的羰基，其中附接到羰基上的原子是碳。“乙酰基”基团是指-C(O)CH3基团。“烷基羰基”或“烷酰基”基团是指通过羰基基团附接到母体分子部分上的烷基基团。此类基团的实例包括甲基羰基和乙基羰基。酰基基团的实例包括甲酰基、烷酰基和芳酰基。
如本文单独或组合使用的，术语“烯基”是指具有一个或多个双键且含有从2个至20个碳原子的直链或支链烃基。在某些实施例中，所述烯基将包含从2个至6个碳原子。术语“亚烯基”是指附接在两个或更多个位置的碳-碳双键***，诸如亚乙烯基[(-CH＝CH-)，(-C：：C-)]。合适的烯基基团的实例包括乙烯基、丙烯基、2-甲基丙烯基、1，4-丁二烯基等。除非另外指明，否则术语“烯基”可以包括“亚烯基”基团。
如本文单独或组合使用的，术语“烷氧基”是指烷基醚基团，其中术语烷基如下所定义。合适的烷基醚基团的实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等。
如本文单独或组合使用的，术语“烷基”是指含有从1个至20个碳原子的直链或支链烷基基团。在某些实施例中，所述烷基将包含从1个至10个碳原子。在另外的实施例中，所述烷基将包含从1个至6个碳原子。烷基基团如本文限定的那样任选地被取代。烷基基团的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、辛基、壬基等。如本文单独或组合使用的，术语“亚烷基”是指衍生自附接在两个或更多个位置处的直链或支链饱和烃的饱和脂肪族基团，诸如亚甲基(-CH2-)。除非另外指明，否则术语“烷基”可以包括“亚烷基”基团。
如本文单独或组合使用的，术语“烷基氨基”是指通过氨基基团附接到母体分子部分上的烷基基团。合适的烷基氨基基团可以是单烷基化或二烷基化的形成基团，诸如N-甲基氨基、N-乙基氨基、N，N-二甲基氨基、N，N-乙基甲基氨基等。
如本文单独或组合使用的，术语“次烷基”是指这样的烯基基团：其中碳-碳双键的一个碳原子属于该烯基基团所附接的部分。
如本文单独或组合使用的，术语“烷硫基”是指烷基硫醚(R-S-)基团，其中术语烷基如上所定义，并且其中硫可以是单氧化或双氧化的。合适的烷基硫醚基团的实例包括甲硫基、乙硫基、正丙硫基、异丙硫基、正丁硫基、异丁硫基、仲丁硫基、叔丁硫基、甲磺酰基、乙亚磺酰基等。
如本文单独或组合使用的，术语“炔基”是指具有一个或多个三键并含有从2个至20个碳原子的直链或支链烃基。在某些实施例中，所述炔基包含从2个至6个碳原子。在另外的实施例中，所述炔基包含从2个至4个碳原子。术语“亚炔基”是指附接在两个位置处的碳-碳三键，诸如亚乙炔基(-C≡C-)。炔基基团的实例包括乙炔基、丙炔基、羟基丙炔基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、戊炔-1-基、3-甲基丁炔-1-基、己炔-2-基等。除非另外指明，否则术语“炔基”可以包括“亚炔基”基团。
如本文单独或组合使用的，术语“酰胺基”和“氨甲酰基”是指如下所述通过羰基基团附接到母体分子部分上的氨基基团，反之亦然。如本文单独或组合使用的，术语“C-酰胺基”是指-C(＝O)-NR2基团，其中R如本文所定义。如本文单独或组合使用的，术语“N-酰胺基”是指RC(＝O)NH-基团，其中R如本文所定义。如本文单独或组合使用的，术语“酰基氨基”包括通过氨基基团附接到母体部分上的酰基基团。“酰基氨基”基团的实例为乙酰基氨基(CH3C(O)NH-)。
如本文单独或组合使用的，术语“氨基”是指-NRR’，其中R和R’独立地选自氢、烷基、羟基烷基、酰基、杂烷基、芳基、环烷基、杂芳基和杂环烷基，这些基团中的任何基团本身可以任选地被取代。此外，R和R’可以结合形成杂环烷基，这两个基团中的任一者任选地被取代。
如本文单独或组合使用的，术语“氨基酸”是指-NHCHRC(O)O-基团，该基团可以附接到母体分子部分上，以产生N-末端或C-末端氨基酸，其中R独立地选自氢、烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基烷基、酰胺基、酰胺基烷基、羧基、羧基烷基、胍烷基、羟基、硫醇基和硫代烷基，这些基团中的任何基团本身任选地被取代。如本文单独或组合使用的，术语C-末端是指这样的母体分子部分：该部分在氨基基团处结合至氨基酸，以给出如本文所述的酰胺，伴有未结合的羧基基团，从而产生末端羧基基团，或对应的羧酸根阴离子。如本文单独或组合使用的，术语N-末端是指这样的母体分子部分：该部分在羧基基团处结合至氨基酸，以给出如本文所述的酯，伴有未结合的氨基基团，从而产生末端仲胺，或对应的铵阳离子。换句话讲，C-末端是指-NHCHRC(O)OH或-NHCHRC(O)O-，N-末端则是指H2NCHRC(O)O-或H3N+CHRC(O)O-。
如本文单独或组合使用的，术语“芳基”意指含有一个、两个或三个环的碳环芳香族***，其中此类多环的环***稠合在一起。术语“芳基”包括芳香族基团，诸如苯基、萘基、蒽基和菲基。
如本文单独或组合使用的，术语“芳基烯基”或“芳烯基”是指通过烯基基团附接到母体分子部分上的芳基基团。
如本文单独或组合使用的，术语“芳基烷氧基”或“芳烷氧基”是指通过烷氧基基团附接到母体分子部分上的芳基基团。
如本文单独或组合使用的，术语“芳基烷基”或“芳烷基”是指通过烷基基团附接到母体分子部分上的芳基基团。
如本文单独或组合使用的，术语“芳基炔基”或“芳炔基”是指通过炔基基团附接到母体分子部分上的芳基基团。
如本文单独或组合使用的，术语“芳基烷酰基”或“芳烷酰基”或“芳酰基”是指衍生自芳基取代的链烷羧酸的酰基基团，诸如苯甲酰基、萘甲酰基、苯基乙酰基、3-苯基丙酰基(氢肉桂酰基)、4-苯基丁酰基、(2-萘基)乙酰基、4-氯氢肉桂酰基等。
如本文单独或组合使用的，术语芳氧基是指通过氧基附接到母体分子部分上的芳基基团。
如本文单独或组合使用的，术语“苯并”是指衍生自苯的二价基团C6H4＝。实例包括苯并噻吩和苯并咪唑。
如本文所用的术语“联苯基”是指连接在每个环上的一个碳位点处的两个苯基基团。
如本文单独或组合使用的，术语“氨基甲酸酯”是指氨基甲酸的酯(-NHCOO-)，它可以从氮端或酸端附接到母体分子部分上，并且如本文所定义的任选地被取代。
如本文单独或组合使用的，术语“O-氨甲酰基”是指-OC(O)NRR’基团，其中R和R’如本文所定义。
如本文单独或组合使用的，术语“N-氨甲酰基”是指ROC(O)NR’-基团，其中R和R’如本文所定义。
如本文所用的术语“羰基”，在单独使用时包括甲酰基[-C(O)H]，在组合使用时为-C(O)-基团。
如本文所用，术语“羧基”是指-C(O)OH或对应的“羧酸根”阴离子，如在羧酸盐中的那种。“O-羧基”基团是指RC(O)O-基团，其中R如本文所定义。“C-羧基”基团是指-C(O)OR基团，其中R如本文所定义。
如本文单独或组合使用的，术语“氰基”是指-CN。
如本文单独或组合使用的，术语“环烷基”或替代性地“碳环”是指饱和或部分饱和的单环、二环或三环的烷基基团，其中每个环部分含有从3个至12个碳原子环成员，并且可以任选地为如本文所定义的任选地被取代的苯并稠合环***。在某些实施例中，所述环烷基将包含从5个至7个碳原子。此类环烷基基团的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、四氢萘基、茚满基、八氢萘基、2，3-二氢-1H-茚基、金刚烷基等。如本文所用，“二环的”和“三环的”旨在包括两种稠合环***，诸如十氢萘、八氢萘以及多环的(多中心的)饱和或部分不饱和类型。一般来讲，后一种类型的异构体通过以下各项来例示：二环[1，1，1]戊烷、樟脑、金刚烷和二环[3，2，1]辛烷。
如本文单独或组合使用的，术语“酯”是指对在碳原子处连接的两个部分进行桥接的羧基基团。
如本文单独或组合使用的，术语“醚”是指对在碳原子处连接的两个部分进行桥接的氧基基团。
如本文单独或组合使用的，术语“卤代醇”是指其中一个碳原子具有卤素取代基、另一个碳原子具有羟基取代基(典型地在相邻碳上)的化合物或官能团。
如本文单独或组合使用的，术语“胍”是指-NHC(＝NH)NH2，或对应的胍盐阳离子。
如本文单独或组合使用的，术语“卤基”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
如本文单独或组合使用的，术语“卤代烷氧基”是指通过氧原子附接到母体分子部分上的卤代烷基基团。
如本文单独或组合使用的，术语“卤代烷基”是指具有如上所定义的含义的烷基基团，其中一个或多个氢原子被卤素替代。明确地包括单卤代烷基、双卤代烷基和多卤代烷基这些基团。举个例子，单卤代烷基基团可以在该基团内具有碘、溴、氯或氟原子。二卤代烷基基团和多卤代烷基基团可以具有两个或更多个相同的卤原子或不同卤代基团的组合。卤代烷基基团的实例包括氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基和二氯丙基。“卤代亚烷基”是指附接在两个或更多个位置处的卤代烷基基团。实例包括氟亚甲基(-CFH-)、二氟亚甲基(-CF2-)、氯亚甲基(-CHCl-)等。
如本文单独或组合使用的，术语“杂烷基”是指稳定的直链或支链烃基、或环状烃基、或它们的组合，为完全饱和的或含有从1个至3个不饱和度，由规定数量的碳原子以及从1个至3个选自O、N和S的杂原子组成，并且其中氮原子和硫原子可以任选地氧化，氮杂原子可以任选地季铵化。一个或多个杂原子O、N和S可以放置在杂烷基基团的任意内部位置。多达两个杂原子可以是连续的，诸如-CH2-NH-OCH3。
如本文单独或组合使用的，术语“杂芳基”是指3元至7元不饱和的杂单环，或稠合的单环、二环或三环的环***，其中这些稠环中的至少一个为芳香族的，所述“杂芳基”含有至少一个选自O、S和N的原子。在某些实施例中，所述杂芳基将包含从5个至7个碳原子。所述术语还包括稠合的多环基团，其中将杂环与芳基环稠合，其中将杂芳基环与其他杂芳基环稠合，其中将杂芳基环与杂环烷基环稠合，或其中将杂芳基环与环烷基环稠合。杂芳基基团的实例包括吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、***基、吡喃基、呋喃基、噻吩基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、吲哚基、异吲哚基、吲嗪基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、吲唑基、苯并***基、苯并间二氧杂环戊烯、苯并吡喃基、苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、色酮基、香豆素基、苯并吡喃基、四氢喹啉基、四唑并哒嗪基、四氢异喹啉基、噻吩并吡啶基、呋喃并吡啶基、吡咯并吡啶基、氮杂基、二氮杂基、苯并氮杂基等。示例性三环杂环基团包括咔唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基、二苯并呋喃基、吖啶基、菲啶基、咕吨基等。
如本文单独使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“杂芳基烷基”是指具有杂芳基取代基的如上所定义的烷基基团。
如本文单独或组合使用的，术语“杂环烷基”和可互换的“杂环”各自是指含有至少一个杂原子作为环成员的饱和、部分不饱和或完全不饱和的单环、二环或三环杂环基团，其中每个所述杂原子可以独立地选自氮、氧和硫。在某些实施例中，所述杂环烷基将包含从1个至4个杂原子作为环成员。在另外的实施例中，所述杂环烷基将包含从1个至2个杂原子作为环成员。在某些实施例中，所述杂环烷基将在每个环中包含从3个至8个环成员。在另外的实施例中，所述杂环烷基将在每个环中包含从3个至7个环成员。在还有一些另外的实施例中，所述杂环烷基将在每个环中包含从5个至6个环成员。“杂环烷基”和“杂环”旨在包括砜、亚砜、具有叔氮环成员的N-氧化物，以及碳环稠合环***和苯并稠合环***；此外，这两个术语还包括如下***，其中杂环与如本文所定义的芳基基团或另外的杂环基团稠合。杂环基团的实例包括氮丙啶基、氮杂环丁烷基、1，3-苯并间二氧杂环戊基、二氢异吲哚基、二氢异喹啉基、二氢噌啉基、二氢苯并二噁英基、二氢[1，3]噁唑并[4，5-b]吡啶基、苯并噻唑基、二氢吲哚基、二氢吡啶基、1，3-二噁烷基、1，4-二噁烷基、1，3-二氧戊环基、咪唑烷基、异二氢吲哚基、吗啉基、噁唑烷基、异噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基、N-甲基哌嗪基、吡咯烷基、吡唑烷基、四氢呋喃基、四氢吡啶基、硫代吗啉基、噻唑烷基、二氮杂环庚烷基，等等。除非明确地禁止，否则任选地对杂环基团进行取代。
如本文单独或组合使用的，术语“肼基”是指由单键接合的两个氨基基团，即-N-N-。
如本文单独或组合使用的，术语“羟基”是指-OH。
如本文单独或组合使用的，术语“羟基烷基”是指通过烷基基团附接到母体分子部分上的羟基基团。
如本文单独或组合使用的，术语“异羟肟酸”是指-C(＝O)NHOH，其中母体分子部分借助于碳原子附接到异羟肟酸基团。
如本文单独或组合使用的，术语“亚氨基”是指＝N-。
如本文单独或组合使用的，术语“亚氨基羟基”是指＝N(OH)和＝N-O-。
短语“在主链中”是指起始于基团到具有本文所披露的式中任一项的化合物的附接点的碳原子的最长连续链或邻链。
术语“异氰酸基”是指-NCO基团。
术语“异硫氰酸基”是指-NCS基团。
短语“原子的线性链”是指原子的最长直链，这些原子独立地选自碳、氮、氧和硫。
如本文单独或组合使用的，在没有另外明确定义的情况下，术语“低级”意指含有从1个至6个碳原子，并且包括6个碳原子。
如本文单独或组合使用的，术语“低级芳基”意指如所提供的那样任选地被取代的苯基或萘基。
如本文单独或组合使用的，术语“低级杂芳基”意指1)包含五个或六个环成员的单环杂芳基，其中介于一个与四个之间的所述成员可以是选自O、S和N的杂原子，或2)二环杂芳基，其中每个稠环包含五个或六个环成员，这些环成员之间包含一个至四个选自O、S和N的杂原子。
如本文单独或组合使用的，术语“低级环烷基”意指具有介于三个与六个之间的环成员的单环环烷基。低级环烷基可以是不饱和的。低级环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
如本文单独或组合使用的，术语“低级杂环烷基”意指具有介于三个与六个之间的环成员的单环杂环烷基，其中介于一个与四个之间的环成员可以是选自O、S和N的杂原子。低级杂环烷基的实例包括吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、哌啶基、哌嗪基和吗啉基。低级杂环烷基可以是不饱和的。
如本文单独或组合使用的，术语“低级氨基”是指-NRR’，其中R和R’独立地选自氢、低级烷基和低级杂烷基，这些基团中的任何基团任选地被取代。此外，低级氨基基团的R和R’可以结合形成五元或六元杂环烷基，其中任一者任选地被取代。
如本文单独或组合使用的，术语“巯基”是指RS-基团，其中R如本文所定义。
如本文单独或组合使用的，术语“硝基”是指-NO2。
如本文单独或组合使用的，术语“氧基”或“氧杂”是指-O-。
如本文单独或组合使用的，术语“氧代基”是指＝O。
术语“全卤代烷氧基”是指其中所有的氢原子都被卤素原子替代的烷氧基基团。
如本文单独或组合使用的，术语“全卤代烷基”是指其中所有的氢原子都被卤素原子替代的烷基基团。
如本文单独或组合使用的，术语“膦酸酯”是指-P(＝O)(OR)2基团，其中R选自烷基和芳基。如本文单独或组合使用的，术语“膦酸”是指-P(＝O)(OH)2基团。
如本文单独或组合使用的，术语“磷酰胺”是指-P(＝O)(NR)3基团，其中R如本文所定义。
如本文单独或组合使用的，术语“磺酸酯”、“磺酸”和“磺酸基的”是指-SO3H基团，其作为磺酸的阴离子以盐形式使用。
如本文单独或组合使用的，术语“磺酰基”是指-S-。
如本文单独或组合使用的，术语“亚磺酰基”是指-S(O)-。
如本文单独或组合使用的，术语“磺酰基”是指-S(O)2-。
术语“N-磺酰胺基”是指RS(＝O)2NR’-基团，其中R和R’如本文所定义。
术语“S-磺酰胺基”是指-S(＝O)2NRR’基团，其中R和R’如本文所定义。
如本文单独或组合使用的，术语“硫杂”和“硫代”是指-S-基团或其中氧被硫替代的醚。硫代基团的氧化衍生物(即亚磺酰基和磺酰基)被包括在硫杂和硫代的定义中。
如本文单独或组合使用的，术语“硫醇”是指-SH基团。
如本文所用的术语“硫代羰基”，在单独使用时包括硫代甲酰基-C(S)H，在组合使用时为-C(S)-基团。
术语“N-硫代氨甲酰基”是指ROC(S)NR’-基团，其中R和R’如本文所定义。
术语“O-硫代氨甲酰基”是指-OC(S)NRR’基团，其中R和R’如本文所定义。
术语“硫氰酸基”是指-CNS基团。
术语“三卤甲氧基”是指X3CO-基团，其中X为卤素。
本文的任何定义都可以与任何其他定义结合使用，来描述复合结构基团。按照惯例，任何此类定义的尾随元素是附接到母体部分上的元素。例如，复合基团烷基酰胺基表示通过酰胺基基团附接到母体分子上的烷基基团，并且术语烷氧基烷基表示通过烷基基团附接到母体分子上的烷氧基基团。
当基团被定义为“无”时，意指所述基团是不存在的。类似地，当可以选自一组整数或一个整数范围的诸如“n”的指定被指定为0时，则其指定的组要么不存在(如果在末端位置)，要么缩合形成键(如果落在两个其他组之间)。
术语“任选地被取代的”意指前述基团可以被取代或不被取代。如果被取代，则“任选地被取代的”基团的取代基可以包括但不限于独立地选自下列多组或具体指定的一系列多组(单独的或组合的)的一种或多种取代基：低级烷基、低级烯基、低级炔基、低级酰基、低级杂烷基、低级杂环烷基、低级卤代烷基、低级卤烯基、低级卤炔基、低级全卤代烷基、低级全卤烷氧基、低级环烷基、苯基、芳基、芳氧基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、氧代基、低级酰氧基、羰基、羧基、低级烷基羰基、低级羧酸酯、低级甲酰胺基、氰基、氢、卤素、羟基、氨基、低级烷基氨基、芳基氨基、酰胺基、硝基、硫醇、低级烷硫基、低级卤代烷硫基、低级全卤烷硫基、芳硫基、磺酸酯、磺酸、三取代的甲硅烷基、N3、SH、SCH3、C(O)CH3、CO2CH3、CO2H、吡啶基、噻吩、呋喃基、低级氨基甲酸酯、以及低级脲。可以将两个取代基接合在一起，以形成稠合的五元、六元或七元的由零个至三个杂原子组成的碳环或杂环，例如形成亚甲基二氧基或亚乙基二氧基。任选地被取代的基团可以是未取代的(例如，-CH2CH3)、完全取代的(例如，-CF2CF3)、单取代的(例如，-CH2CH2F)或以完全取代与单取代之间的一定水平取代(例如，-CH2CF3)。在叙述取代基而未定性为取代的情况下，涵盖取代形式和未取代形式这两者。在取代基被定性为“取代的”情况下，明确地意指取代形式。此外，针对具体部分的不同组的任选取代基可以按需进行定义；在这些情况下，任选的取代将如定义的那样，通常紧跟着短语“任选地被......取代”。
除非另有定义，否则术语R或术语R’(独自出现并且没有数字指定的情况下)是指选自以下各项的部分：氢、烷基、环烷基、杂烷基、芳基、杂芳基以及杂环烷基，这些基团中的任何基团任选地被取代。应当理解，此类R基团和R’基团如本文所定义的任选地被取代。无论R基团是否具有数字指定，都应当理解，每个R基团(包括R、R’和Rn，其中n＝(1、2、3、...n))、每个取代基以及每个术语就从组的选择而论都独立于所有其他项。如果任何变量、取代基或术语(例如，芳基、杂环、R等)在式或通用结构中出现不止一次，那么在每次出现时其定义应当独立于在所有其他出现时的定义。本领域的技术人员将进一步认识到，某些基团可以附接到母体分子上，或者可以在从如所写的任一端的元素的链中占据位置。因此，仅以举例的方式，诸如-C(O)N(R)-等不对称基团可以在碳或氮处附接到母体部分上。
不对称中心存在于本文所披露的化合物中。这些中心根据Cahn-Ingold-Prelog优先权规则由符号“R”或“S”指定，具体取决于手性碳原子周围的取代基的构型。应当理解，本发明涵盖所有立体化学异构体形式，包括非对映异构体、对映异构体和差向异构体形式，连同d-异构体和1-异构体，以及它们的混合物。化合物的单独立体异构体可以用含有手性中心的可商购获得的起始材料合成制备，或者通过制备对映异构体产物的混合物，然后分离(诸如转化成非对映异构体的混合物)，然后是分离或重结晶、层析技术、在手性层析柱上直接分离对映异构体，或本领域已知的任何其他适当方法来制备。特定立体化学的起始化合物是可商购获得的，或者可以通过本领域已知的技术来制备和拆分。此外，本文所披露的化合物可以作为几何异构体存在。本发明包括所有顺式、反式、同式、逆式、异侧(E)和同侧(Z)异构体，以及它们的适当混合物。此外，化合物可以作为互变异构体存在；本发明提供了所有互变异构的异构体。此外，本文所披露的化合物可以以非溶剂化物的形式以及与药学上可接受的溶剂诸如水、乙醇等的溶剂化物的形式存在。一般来讲，将溶剂化物形式视为等效于非溶剂化物形式。
术语“键”是指当由所述键接合的原子被认为是较大子结构的一部分时两个原子或两个部分之间的共价连接。除非另外指明，否则键可以是单键、双键或三键。在分子图中的两个原子之间的虚线指示在那个位置处可以存在、也可以不存在另外的键。
如本文所用，术语“疾病”旨在大体与术语“障碍”和“病症”(如在医学症状中)同义并且可与之互换使用，因为所有这些都反映了人体或动物体或其中一部分的、损伤正常功能并且使人类或动物的寿命期限缩短或生活质量下降的异常状况，典型地表现为区别体征和症状。
“酮还原酶”和“KRED”在本文中可互换使用，是指能够对映选择性地还原1-卤代-2-氧代衍生物的2-氧代基团以产生对应的同式1-卤代-2-羟基衍生物(卤代醇)的多肽。该多肽典型地利用辅因子还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐(NADPH)作为还原剂。如本文所用的酮还原酶包括天然存在的(野生型)酮还原酶，以及通过人为操纵而产生的非天然存在的工程化多肽。酮还原酶可商购获得(例如，从克迪科斯股份有限公司(Codexis，Inc.)商购获得)，并且可以筛选(例如，经由KRED筛选试剂盒)以获得最佳特性。优选的酮还原酶是以下的那些：1)产生最大的起始材料向所需产物的转化率，2)以最高速率产生最大的起始材料向所需产物的转化率，3)产生所需的对映异构体(例如，(S)对映异构体)，和/或4)具有更好的溶剂和温度耐受性。酮还原酶可商购获得，例如，从商购获得。在某些实施例中，合适的酮还原酶是适用于将α-卤代酮和/或苯乙酮还原成对应的醇类的那些。实例包括在例如US 7879585、US 8617864、US 8796002、US 9029112、US 9296992、US 8512973、US 8748143 B2和US 8852909中所披露的酮还原酶。酮还原酶包括被确定为P1-A04、P1-B02、P1-B10、P1-B12、P1-C01、P1-H08、P1-H10、P2-B02、P2-C02、P2-C11、P2-D11、P1-F07(P1F07/CDX023)、P2-G03和P2-H07的酮还原酶。
“编码序列”是指核酸(例如，基因)中编码蛋白质的氨基酸序列的那部分。
“天然存在的”或“野生型”是指在自然界中发现的形式。例如，天然存在的或野生型多肽或多核苷酸序列是存在于生物体中的这样的序列：该序列可以从自然界中的来源分离，并且尚未通过人为操纵而有意修饰。
当关于例如细胞、核酸或多肽使用时，“重组”是指下述材料或对应于该材料的天然或自然形式的材料：该材料已经以原本不存在于自然中的方式进行修饰，或者虽与存在于自然中的方式相同，却是由合成材料和/或通过使用重组技术加以操纵而产生或得到的。其中，非限制性实例包括表达在细胞的天然(非重组)形式内未发现的基因的重组细胞，或者表达在其他情况下以不同水平表达的天然基因的重组细胞。
“序列同一性百分比”和“同源性百分比”在本文中可互换使用，是指多核苷酸和多肽之间的比较，是通过在比较窗口上比较两条最佳比对的序列来确定的，其中为了两条序列的最佳比对，多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的那部分可以包含与参考序列(不包含添加、也不包含缺失)相比的添加或缺失(即，缺口)。该百分比可以这样计算：确定在两条序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数，然后将结果乘以100，以产生序列同一性的百分比。替代性地，该百分比可以这样计算：确定在两条序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基、或者核酸碱基或氨基酸残基与缺口对齐的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数，然后将结果乘以100，以产生序列同一性的百分比。本领域的技术人员认识到，有许多已建立的算法可用于比对两条序列。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过以下各项来进行：Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.[应用数学进展]，2：482的局部同源性算法；Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学期刊]，48：443的同源比对算法；探寻Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，85：2444的相似性方法；这些算法的计算机化实施(GCGWisconsin软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或目视检查(大体上参见Current Protocols inMolecular Biology[最新分子生物学实验方法汇编]，F.M.Ausubel等人编辑，CurrentProtocols[实验室指南]，格林出版联合公司(Greene Publishing Associates，Inc.)和约翰威立父子出版公司(John Wiley&Sons，Inc.)的合资公司(1995年增刊)(Ausubel))。适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的实例为BLAST算法和BLAST 2.0算法，这两种算法分别在Altschul等人，1990，J.Mol.Bio1.[分子生物学期刊]，215：403-410以及Altschul等人，1977，Nucleic Acids Res.[核酸研究]，3389-3402中描述。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)网站公开地获得。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中具有长度W的短字符而识别高评分序列对(HSP)，这些短字符当与数据库序列中具有相同长度的字比对时匹配或满足某个正值的阈值评分T。T被称为相邻字符评分阈值(Altschul等人，出处同上)。这些初始的相邻字符命中作为启动检索的基础，用于发现含有它们的更长HSP。然后，在可以增加累加比对评分的前提下，将字符命中在两个方向上沿每一序列延伸。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是＞0)和N(错配残基的惩罚评分；总是＜0)来计算累加评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累加评分。当出现以下情况时停止每一方向的字符命中延伸：累加比对评分从其最大实现值下降X量；由于一个或多个负评分残基比对的累积而使累加评分达到零或低于零；或到达任一条序列的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff和Henikoff，1989，Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]，89：10915)。序列比对和序列同一性百分比的示例性确定可以采用GCG Wisconsin软件包(美国威斯康星州麦迪逊市Accelrys公司(Accelrys，Madison Wis.))中的BESTFIT程序或GAP程序，使用所提供的默认参数进行。
“参考序列”是指用作序列比较的基础的所限定序列。参考序列可以是较大序列的子序列，例如，全长基因或多肽序列的区段。通常，参考序列的长度至少为20个核苷酸或氨基酸残基、至少为25个残基、至少为50个残基，或者，参考序列为全长的核酸或多肽。由于两条多核苷酸或多肽可以各自(1)包含在这两条序列之间相似的序列(即，完整序列的一部分)，并且(2)还可以包含在这两条序列之间相异的序列，所以在两条(或更多条)多核苷酸或多肽之间的序列比较典型地通过在“比较窗口”内比较这两条多核苷酸的序列以鉴定和比较局部区域的序列相似性来执行。
“比较窗口”是指至少约20个连续核苷酸位置或氨基酸残基的概念性片段，其中序列可以与至少20个连续的核苷酸或氨基酸的参考序列进行比较，并且其中该序列在比较窗口中的那部分与用于两条序列的最佳比对的参考序列(不包含添加，也不包含缺失)相比，可以包含20％或更少的添加或缺失(即，缺口)。比较窗口可以比20个连续的残基更长，并且任选地包括30个、40个、50个、100个连续残基那么长或更长的窗口。
“基本同一性”是指在具有至少20个残基位置的比较窗口上，时常在具有至少30个至50个残基的窗口上，同参考序列相比有至少80％的序列同一性、至少85％的同一性和89％至95％的序列同一性，更通常地至少99％的序列同一性的多核苷酸或多肽序列，其中序列同一性百分比通过在比较窗口上将参考序列与包含缺失或添加(共计参考序列的20％或更少)的序列进行比较来计算。在应用于多肽的具体实施例中，术语“基本同一性”意指诸如通过程序GAP或BESTFIT，使用默认缺口权重进行最优比对时，两条多肽序列共有至少80％的序列同一性，优选地至少89％的序列同一性，至少95％的序列同一性或更高的序列同一性(例如，99％的序列同一性)。不同残基位置的区别优选地在于保守氨基酸置换。
“立体选择性”是指在化学反应或酶促反应中，一种立体异构体相比于另一种立体异构体优先形成。立体选择性可以是部分的，这时一种立体异构体的形成比另一种有利，或者立体选择性可以是完全的，这时只形成一种立体异构体。当立体异构体是对映异构体时，立体选择性称为对映选择性，即一种对映异构体在两种对映异构体总和中的分数(典型地报道为百分比)。立体选择性(典型地为百分比)在本领域中常常报道为根据如下公式由其计算的对映异构体过量百分比：[主要对映异构体-次要对映异构体]/[主要对映异构体+次要对映异构体]。在立体异构体是非对映异构体的情况下，立体选择性被称为非对映选择性，即一种非对映异构体在与其他非对映异构体的总和中的分数(典型地报道为百分比)。在本披露的上下文中，非对映选择性是指相对于转变为式IIb的逆式二羟基酯，转变为结构式IIa的同式二羟基酯的结构式(Ia)的羟基氧代酯的分数(典型地报道为百分比)。立体选择性(典型地为百分比)还可以报道为根据如下公式由其计算的非对映异构体过量百分比：[同式IIa-逆式IIb]/[同式IIa+逆式IIb]。
组合物
本披露提供了用于合成立体异构纯的氨基环丙烷的组合物。
提供了一种组合物，该组合物包含：
a)式II的化合物：
或其盐；其中：
X选自Cl、Br和I；
R1选自芳基和杂芳基，这些基团中的任何基团任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代；
每个R3选自氢、卤素、烷基、烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、卤代烷氧基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、氰基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、C(O)R4、S(O)2R4、NHS(O)2R4、NHS(O)2NHR4、NHC(O)R4、NHC(O)NHR4、C(O)NHR4和C(O)NR4R5；
R4和R5各自独立地选自氢和低级烷基；或者R4和R5可以合在一起形成含氮杂环烷基或杂芳基环，该含氮杂环烷基或杂芳基环任选地被低级烷基取代；以及
b)工程化或分离的酮还原酶，该工程化或分离的酮还原酶能够立体选择性地将式II的氧代基还原为羟基基团。
在某些实施例中，R1为芳基，该芳基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
在某些实施例中，R1为苯基，该苯基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
在某些实施例中，R1为杂芳基。
在某些实施例中，R1为5元至6元单环杂芳基或8元至12元双环杂芳基，在该杂芳基中介于1个与5个之间的环成员可以是选自N、O和S的杂原子，并且该杂芳基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
在某些实施例中，R1为5元至6元单环杂芳基，在该杂芳基中介于1个与5个之间的环成员可以是选自N、O和S的杂原子，并且该杂芳基任选地被1个或2个R3基团取代。
在某些实施例中，R3为卤素。在某些实施例中，R3为氟。
在某些实施例中，R1选自：
在某些实施例中，酮还原酶产生不小于95％的起始材料向所需产物的转化率；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于97％的起始材料向所需产物的转化率；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于98％的起始材料向所需产物的转化率；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于99％的起始材料向所需产物的转化率。在任何前述实施例中，起始材料可以是2-氯-4’-氟苯乙酮，所需产物可以是(S)-卤代醇((S)-2-氯-1-(4-氟苯基)乙醇)、(S)-2-(4-氟苯基)环氧乙烷，或(1R，2S)-2-(4-氟苯基)环丙胺盐酸盐。
在某些实施例中，酮还原酶产生不小于95％的(S)对映异构体过量百分比；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于97％的(S)对映异构体过量百分比；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于98％的(S)对映异构体过量百分比；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于99％的(S)对映异构体过量百分比。在任何前述实施例中，(S)对映异构体可以是(S)-卤代醇。
在某些实施例中，酮还原酶产生很高的起始材料向所需产物的转化率。在某些实施例中，酮还原酶具有良好的温度和溶剂耐受性。
在某些实施例中，酮还原酶选自P1-A04、P1-B02、P1-B10、P1-B12、P1-C01、P1-H08、P1-H10、P2-B02、P2-C02、P2-C11、P2-D11、P1-F07、P2-G03和P2-H07，该酮还原酶产生不小于97％的苯乙酮向卤代醇的转化率。在某些实施例中，酮还原酶选自P1-A04、P1-B02、P1-B10、P1-B12、P1-H10、P2-C11、P1-F07、P2-G03和P2-H07，该酮还原酶产生不小于97％的苯乙酮向卤代醇的转化率，以及不小于97％的(S)-卤代醇对映异构体过量百分比。在某些实施例中，酮还原酶选自P1-A04、P1-B02、P1-B12、P1-H10、P2-C11、P1-F07、P2-G03和P2-H07，该酮还原酶产生不小于97％的苯乙酮向卤代醇的转化率，以及不小于98％的(S)-卤代醇对映异构体过量百分比。％。在某些实施例中，酮还原酶选自P1-A04、P1-B12、P1-H10、P1-F07、P2-G03和P2-H07，该酮还原酶产生不小于97％的苯乙酮向卤代醇的转化率，以及不小于99％的(S)-卤代醇对映异构体过量百分比。在某些实施例中，酮还原酶选自P1-F07和P2-G03。
方法
本披露提供了用于合成立体异构纯的氨基环丙烷的方法。
提供了用于制备式III的手性卤代醇化合物：
或其盐的方法；其中：
X选自Cl、Br和I；
R1选自芳基和杂芳基，这些基团中的任何基团任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代；
每个R3选自氢、卤素、烷基、烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、卤代烷氧基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、氰基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、C(O)R4、S(O)2R4、NHS(O)2R4、NHS(O)2NHR4、NHC(O)R4、NHC(O)NHR4、C(O)NHR4和C(O)NR4R5；
R4和R5各自独立地选自氢和低级烷基；或者R7和R8可以合在一起形成含氮杂环烷基或杂芳基环，该含氮杂环烷基或杂芳基环任选地被低级烷基取代；该方法包括以下步骤：
a)用能够立体选择性地将氧代基还原为羟基基团的工程化或分离的酮还原酶对映选择性地还原式II的化合物：
或其盐；以提供该式III的手性卤代醇化合物：
在某些实施例中，该方法还包括以下步骤：
b)从该反应混合物中回收该式III的手性卤代醇化合物。
在某些实施例中，R1为芳基，该芳基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
在某些实施例中，R1为苯基，该苯基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
在某些实施例中，R1为杂芳基。
在某些实施例中，R1为5元至6元单环杂芳基或8元至12元双环杂芳基，在该杂芳基中介于1个与5个之间的环成员可以是选自N、O和S的杂原子，并且该杂芳基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
在某些实施例中，R1为5元至6元单环杂芳基，在该杂芳基中介于1个与5个之间的环成员可以是选自N、O和S的杂原子，并且该杂芳基任选地被1个或2个R3基团取代。
在某些实施例中，R1选自：
在某些实施例中，X为氯。
在某些实施例中，酮还原酶产生不小于95％的起始材料向所需产物的转化率；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于97％的起始材料向所需产物的转化率；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于98％的起始材料向所需产物的转化率；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于99％的起始材料向所需产物的转化率。在任何前述实施例中，起始材料可以是2-氯-4’-氟苯乙酮，所需产物可以是(S)-卤代醇((S)-2-氯-1-(4-氟苯基)乙醇)、(S)-2-(4-氟苯基)环氧乙烷，或(1R，2S)-2-(4-氟苯基)环丙胺盐酸盐。
在某些实施例中，酮还原酶产生不小于95％的(S)对映异构体过量百分比；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于97％的(S)对映异构体过量百分比；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于98％的(S)对映异构体过量百分比；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于99％的(S)对映异构体过量百分比。在任何前述实施例中，(S)对映异构体可以是(S)-卤代醇。
在某些实施例中，酮还原酶产生很高的起始材料向所需产物的转化率。在某些实施例中，酮还原酶具有良好的温度和溶剂耐受性。
在某些实施例中，酮还原酶选自P1-A04、P1-B02、P1-B10、P1-B12、P1-C01、P1-H08、P1-H10、P2-B02、P2-C02、P2-C11、P2-D11、P1-F07、P2-G03和P2-H07，该酮还原酶产生不小于97％的苯乙酮向卤代醇的转化率。在某些实施例中，酮还原酶选自P1-A04、P1-B02、P1-B10、P1-B12、P1-H10、P2-C11、P1-F07、P2-G03和P2-H07，该酮还原酶产生不小于97％的苯乙酮向卤代醇的转化率，以及不小于97％的(S)-卤代醇对映异构体过量百分比。在某些实施例中，酮还原酶选自P1-A04、P1-B02、P1-B12、P1-H10、P2-C11、P1-F07、P2-G03和P2-H07，该酮还原酶产生不小于97％的苯乙酮向卤代醇的转化率，以及不小于98％的(S)-卤代醇对映异构体过量百分比。％。在某些实施例中，酮还原酶选自P1-A04、P1-B12、P1-H10、P1-F07、P2-G03和P2-H07，该酮还原酶产生不小于97％的苯乙酮向卤代醇的转化率，以及不小于99％的(S)-卤代醇对映异构体过量百分比。在某些实施例中，酮还原酶选自P1-F07和P2-G03。
在某些实施例中，所提供的手性卤代醇化合物是基本上纯的结构式III的对映异构体。在某些实施例中，所提供的手性卤代醇化合物是至少99％纯的结构式III的对映异构体。
在某些实施例中，该方法是用表达酮还原酶的全细胞或此类细胞的提取物或裂解物来进行的。
在某些实施例中，酮还原酶被分离和/或纯化。
在某些实施例中，对映选择性还原反应在用于酮还原酶的辅因子的存在下，以及任选地在用于该辅因子的再生***的存在下进行。
在某些实施例中，该方法在约15℃至约75℃范围内的温度下进行。
在某些实施例中，该方法在约pH 5至pH 8范围内的pH下进行。
在某些实施例中，结构式II的氧代化合物与酮还原酶的重量比在约10∶1至200∶1范围内。
在某些实施例中，该方法在辅因子的存在下，以及任选地在辅因子再生***的存在下进行。在具体实施例中，辅因子为NADH和/或NADPH，并且其中辅因子与酮还原酶的重量比在约10∶1至100∶1范围内。在具体实施例中，辅因子再生***包含葡萄糖脱氢酶和葡萄糖；甲酸脱氢酶和甲酸(盐)；或异丙醇和仲醇脱氢酶。
提供了用于制备式I的手性环丙基化合物
或其盐的方法；其中：
R1选自芳基和杂芳基，这些基团中的任何基团任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代；
R2选自氢和C(O)OR3；
每个R3选自氢、卤素、烷基、烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、卤代烷氧基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、氰基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、C(O)R4、S(O)2R4、NHS(O)2R4、NHS(O)2NHR4、NHC(O)R4、NHC(O)NHR4、C(O)NHR4和C(O)NR4R5；
R4和R5各自独立地选自氢和低级烷基；或者R4和R5可以合在一起形成含氮杂环烷基或杂芳基环，该含氮杂环烷基或杂芳基环任选地被低级烷基取代；该方法包括以下步骤：
a)用能够立体选择性地将氧代基还原为羟基基团的工程化或分离的酮还原酶对映选择性地还原式II的化合物：
或其盐；以提供式III的手性卤代醇化合物：
其中X选自Cl、Br和I，
b)用碱处理式III的化合物，以提供式IV的环氧化物或其盐：
c)用沃兹沃思-埃蒙斯试剂和碱处理式IV的化合物，以提供式V的环丙基酯或其盐：
d)用试剂处理式V的化合物，以提供式VI的环丙基酸或其盐：
e)用叠氮化试剂、碱和式VII的醇处理式VI的化合物：
以提供式VIII的环丙基氨基甲酸酯或其盐：
以及任选地
f)用合适的脱保护碱或酸处理式VIII的环丙基氨基甲酸酯，以提供式IX的环丙基胺或其盐：
在某些实施例中，该方法还包括步骤f：用合适的脱保护碱或酸处理式VIII的环丙基氨基甲酸酯，以提供式IX的环丙基胺或其盐。
在某些实施例中，R1为芳基，该芳基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
在某些实施例中，R1为苯基，该苯基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
在某些实施例中，R1为杂芳基。
在某些实施例中，R1为5元至6元单环杂芳基或8元至12元双环杂芳基，在该杂芳基中介于1个与5个之间的环成员可以是选自N、O和S的杂原子，并且该杂芳基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
在某些实施例中，R1为5元至6元单环杂芳基，在该杂芳基中介于1个与5个之间的环成员可以是选自N、O和S的杂原子，并且该杂芳基任选地被1个或2个R3基团取代。
在某些实施例中，R1选自：
在某些实施例中，X为氯。
在某些实施例中，酮还原酶产生不小于95％的起始材料向所需产物的转化率；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于97％的起始材料向所需产物的转化率；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于98％的起始材料向所需产物的转化率；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于99％的起始材料向所需产物的转化率。在任何前述实施例中，起始材料可以是2-氯-4’-氟苯乙酮，所需产物可以是(S)-卤代醇((S)-2-氯-1-(4-氟苯基)乙醇)、(S)-2-(4-氟苯基)环氧乙烷，或(1R，2S)-2-(4-氟苯基)环丙胺盐酸盐。
在某些实施例中，酮还原酶产生不小于95％的(S)对映异构体过量百分比；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于97％的(S)对映异构体过量百分比；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于98％的(S)对映异构体过量百分比；在某些实施例中，酮还原酶产生不小于99％的(S)对映异构体过量百分比。在任何前述实施例中，(S)对映异构体可以是(S)-卤代醇。
在某些实施例中，酮还原酶产生很高的起始材料向所需产物的转化率。在某些实施例中，酮还原酶具有良好的温度和溶剂耐受性。
在某些实施例中，酮还原酶选自P1-A04、P1-B02、P1-B10、P1-B12、P1-C01、P1-H08、P1-H10、P2-B02、P2-C02、P2-C11、P2-D11、P1-F07、P2-G03和P2-H07，该酮还原酶产生不小于97％的苯乙酮向卤代醇的转化率。在某些实施例中，酮还原酶选自P1-A04、P1-B02、P1-B10、P1-B12、P1-H10、P2-C11、P1-F07、P2-G03和P2-H07，该酮还原酶产生不小于97％的苯乙酮向卤代醇的转化率，以及不小于97％的(S)-卤代醇对映异构体过量百分比。在某些实施例中，酮还原酶选自P1-A04、P1-B02、P1-B12、P1-H10、P2-C11、P1-F07、P2-G03和P2-H07，该酮还原酶产生不小于97％的苯乙酮向卤代醇的转化率，以及不小于98％的(S)-卤代醇对映异构体过量百分比。％。在某些实施例中，酮还原酶选自P1-A04、P1-B12、P1-H10、P1-F07、P2-G03和P2-H07，该酮还原酶产生不小于97％的苯乙酮向卤代醇的转化率，以及不小于99％的(S)-卤代醇对映异构体过量百分比。在某些实施例中，酮还原酶选自P1-F07和P2-G03。
在某些实施例中，所提供的手性卤代醇化合物是基本上纯的结构式III的对映异构体。在某些实施例中，所提供的手性卤代醇化合物是至少99％纯的结构式III的对映异构体。
在某些实施例中，该方法是用表达酮还原酶的全细胞或此类细胞的提取物或裂解物来进行的。
在某些实施例中，酮还原酶被分离和/或纯化。
在某些实施例中，对映选择性还原反应在用于酮还原酶的辅因子的存在下，以及任选地在用于该辅因子的再生***的存在下进行。
在某些实施例中，该方法在约15℃至约75℃范围内的温度下进行。
在某些实施例中，该方法在约pH 5至pH 8范围内的pH下进行。
在某些实施例中，结构式II的氧代化合物与酮还原酶的重量比在约10：1至200：1范围内。
在某些实施例中，该方法在辅因子的存在下，以及任选地在辅因子再生***的存在下进行。在具体实施例中，辅因子为NADH和/或NADPH，并且其中辅因子与酮还原酶的重量比在约10：1至100：1范围内。在具体实施例中，辅因子再生***包含葡萄糖脱氢酶和葡萄糖；甲酸脱氢酶和甲酸(盐)；或异丙醇和仲醇脱氢酶。
在某些实施例中，步骤b.中的碱选自无机碱、有机碱，以及它们的组合。在某些实施例中，步骤b.中的碱选自NaOH、叔丁醇钠、KOH、Mg(OH)2、K2HPO4、MgCO3、Na2CO3、K2CO3、三乙胺、二异丙基乙胺和N-甲基吗啉。在具体实施例中，步骤b.中的碱为叔丁醇钠。
在某些实施例中，步骤c.中的沃兹沃思-埃蒙斯试剂选自二乙基膦酰基乙酸叔丁酯、P，P-二甲基膦酰基乙酸钾、膦酰基乙酸三甲酯、二甲基膦酰基乙酸乙酯、二乙基膦酰基乙酸甲酯、P，P-双(2，2，2-三氟乙基)膦酰基乙酸甲酯、膦酰基乙酸三乙酯、P，P-二乙基膦酰基乙酸烯丙酯和P，P-二乙基膦酰基乙酸三甲基甲硅烷基酯。在具体实施例中，步骤c.中的沃兹沃思-埃蒙斯试剂为膦酰基乙酸三乙酯。
在某些实施例中，步骤c.中的碱选自二异丙基氨基锂、双(三甲基甲硅烷基)氨基钠、双(三甲基甲硅烷基)氨基钾四甲基哌啶锂、氢化钠、氢化钾、叔丁醇钠和叔丁醇钾。
在某些实施例中，步骤d.中的试剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸和硫酸。在具体实施例中，步骤d.中的试剂为氢氧化钠。
在某些实施例中，步骤e.中的叠氮化试剂选自叠氮化钠、二苯基磷酰基叠氮化物、甲苯磺酰基叠氮化物和三氟甲磺酰基叠氮化物。在具体实施例中，步骤e.中的叠氮化试剂为二苯基磷酰基叠氮化物。
在某些实施例中，步骤e.中的碱选自三乙胺、二异丙基乙胺和N-甲基吗啉。在具体实施例中，步骤e.中的碱为三乙胺。
在某些实施例中，步骤e.中的式VII的醇选自9-芴基甲醇、叔丁醇和苄醇。在具体实施例中，步骤e.中的式VII的醇为叔丁醇。
在某些实施例中，步骤f中的脱保护碱或酸选自在金属催化剂存在下的哌啶、吗啉、盐酸、氢溴酸、三氟乙酸、硫酸和氢气。在某些实施例中，金属催化剂选自铂、钯、铑、钌和镍。在具体实施例中，试剂为盐酸。
如本文所用，当某种立体异构体相对于化合物中存在的任何其他立体异构体过量存在时，称该化合物“富集”该特定的立体异构体。富集特定立体异构体的化合物典型地将包含至少约60％、70％、80％、90％或甚至更多的指定立体异构体。特定立体异构体的富集量可以使用本领域技术人员惯常使用的常规分析方法来确认，如下文将更详细讨论的。
在某些实施例中，不期望的立体异构体的量可以少于10％，例如，少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％，或甚至少于0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.2％或0.1％。含有至少约95％或更多的所需立体异构体的立体异构富集的化合物在本文中称为“基本上纯的”立体异构体。在某些实施例中，基本上是纯的指定立体异构体的化合物含有大于96％、97％、98％或99％的特定立体异构体。在某些实施例中，基本上是纯的指定立体异构体的化合物含有大于99.5％、99.6％、99.7％、99.８％、99.9％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％或甚至99.99％的特定立体异构体。含有约99.99％的所需立体异构体的立体异构富集的化合物在本文中称为“纯的”立体异构体。本文所述的任何手性化合物的立体异构纯度可以使用本领域已知的常规分析方法来确定或确认。
如本领域的技术人员所知，酮还原酶催化的还原反应典型地需要辅因子。由本文所述的工程化酮还原酶催化的还原反应典型地还需要辅因子，但工程化酮还原酶的许多实施例需要的辅因子比用野生型酮还原酶催化的反应少得多。如本文所用，术语“辅因子”是指与酮还原酶结合起作用的非蛋自质化合物。适合与本文所述的工程化酮还原酶一起使用的辅因子包括但不限于NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐)、NADPH(NADP+的还原形式)、NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADH(NAD+的还原形式)。
术语“辅因子再生***”是指参与还原辅因子的氧化形式(例如，将NADP+还原为NADPH)的反应的一组反应物。通过酮还原酶催化的卤代酮还原而氧化的辅因子由辅因子再生***以还原形式再生。辅因子再生***包括化学计量的还原剂，该还原剂为还原氢等同物的来源并且能够还原辅因子的氧化形式。辅因子再生***还可以包括催化剂，例如，催化辅因子的氧化形式被还原剂还原的酶催化剂。分别从NAD+或NADP+再生NADH或NADPH的辅因子再生***是本领域已知的，并且可以用于本文所述的方法中。
可以利用的合适的示例性辅因子再生***包括但不限于：葡萄糖和葡萄糖脱氢酶、甲酸(盐)和甲酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、仲醇(例如，异丙醇)和仲醇脱氢酶、亚磷酸(盐)和亚磷酸脱氢酶、分子氢和氢化酶，等等。这些***可以与作为辅因子的NADP+/NADPH或NAD+/NADH结合使用。使用氢化酶进行的电化学再生也可以用作辅因子再生***。化学辅因子再生***包括金属催化剂和还原剂。
术语“葡萄糖脱氢酶”和“GDH”在本文中可互换使用，是指分别催化D-葡萄糖和NAD+或NADP+转化为葡萄糖酸和NADH或NADPH的NAD+或NADP+依赖性酶。
适用于实施本文所述方法的葡萄糖脱氢酶既包括天然存在的葡萄糖脱氢酶，又包括非天然存在的葡萄糖脱氢酶。
可以使用已知的方法(诸如诱变、定向进化等)产生非天然存在的葡萄糖脱氢酶。
在本文所述的酮还原酶催化的还原反应中采用的葡萄糖脱氢酶可以表现出至少约10μmol/min/mg的活性，有时至少约102μmol/min/mg或约103μmol/min/mg、至多约104μmol/min/mg或更高的活性。
本文所述的酮还原酶催化的还原反应通常在溶剂中进行。合适的溶剂包括水、有机溶剂(例如，乙酸乙酯、乙酸丁酯、1-辛醇、庚烷、辛烷、甲基叔丁基醚(MTBE)、甲苯等)、离子液体(例如，1-乙基-4-甲基咪唑鎓四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑鎓四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑鎓六氟磷酸盐等)。在某些实施例中，使用水性溶剂，包括水和水性共溶剂体系。
示例性的水性共溶剂体系具有水和一种或多种有机溶剂。一般来讲，选择水性共溶剂体系的有机溶剂组分，使得该体系不完全使酮还原酶失活。
水性共溶剂体系的有机溶剂组分可以与水性组分混溶，从而提供单一液相；或者可以与水性组分部分混溶或不混溶，从而提供两个液相。通常，当采用水性共溶剂体系时，将其选择为双相的，水分散在有机溶剂中，反之亦然。通常，当利用水性共溶剂体系时，期望选择可以轻易地与水相分离的有机溶剂。一般来讲，共溶剂体系中水与有机溶剂的比率典型地在从约90∶10至约10∶90(体积/体积)的范围内，并且介于80∶20与20∶80(体积/体积)之间，这些比率都是有机溶剂与水的比率。共溶剂体系可以在添加到反应混合物中之前预先形成，或者可以在反应贮器中原位形成。
水性溶剂(水或水性共溶剂体系)可以是pH缓冲的或无缓冲的。将卤代酮还原成对应的卤代醇可以在约5或更高的pH下进行。通常，该还原在约10或比10低(通常在从约5至约10的范围内)的pH下进行。在某些实施例中，该还原在约9或比9低(通常在从约5至约9的范围内)的pH下进行。在某些实施例中，该还原在约8或比8低(通常在从约5至约8的范围内，并且通常在从约6至约8的范围内)的pH下进行。该还原还可以在约7.8或比7.8低，或者7.5或比7.5低的pH下进行。替代性地，该还原可以在中性pH(即，约7)下进行。
在还原反应过程期间，反应混合物的pH可能发生变化。反应混合物的pH可以通过在反应过程期间添加酸或碱而维持在期望的pH或维持在期望的pH范围之内。替代性地，pH可以通过使用包括缓冲液的水性溶剂来控制。用于维持期望的pH范围的合适缓冲液在本领域中是已知的，包括例如磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液，等等。还可以将缓冲与添加酸或碱结合起来。
当采用葡萄糖/葡萄糖脱氢酶辅因子再生***时，如果不以别的方式中和所得的水性葡萄糖酸，则葡萄糖酸(pKa＝3.6)的共同产生造成反应混合物的pH下降。反应混合物的pH可以通过标准缓冲技术(其中，缓冲液中和葡萄糖酸直到所提供的缓冲容量)或者通过在转化过程的同时添加碱而维持在期望的水平。还可以将缓冲与添加碱结合起来。用于维持期望的pH范围的合适缓冲液如上所述。用于中和葡萄糖酸的合适的碱是有机碱，例如胺、醇盐等，以及无机碱，例如氢氧化物盐(例如NaOH)、碳酸盐(例如K2CO3)、碳酸氢盐(例如NaHCO3)、碱性磷酸盐(例如，K2HPO4、Na3PO4)，等等。在转化过程的同时添加碱可以在监测反应混合物pH的同时手动进行，或者更方便地，通过使用自动滴定器，以恒pH滴定模式(pHstat)来进行。将部分缓冲容量与添加碱结合起来也可以用于过程控制。
在通过缓冲或通过在转化过程中添加碱维持pH的此类还原反应中，水性葡萄糖酸盐而非水性葡萄糖酸为全过程的产物。
当采用添加碱来中和酮还原酶催化的还原反应期间释放的葡萄糖酸时，转化进程可以通过维持pH所添加的碱的量来监测。典型地，在还原过程中向无缓冲或部分缓冲的反应混合物添加的碱是以水性溶液添加的。
在某些实施例中，当该方法使用宿主生物体的全细胞来进行时，该全细胞可以天然地提供辅因子。替代性地或与之组合，该细胞可以天然或重组地提供葡萄糖脱氢酶。
术语“甲酸脱氢酶”和“FDH”在本文中可互换使用，是指分别催化甲酸(盐)和NAD+或NADP+转化为二氧化碳和NADH或NADPH的NAD+或NADP+依赖性酶。适合在本文所述的酮还原酶催化的还原反应中用作辅因子再生***的甲酸脱氢酶既包括天然存在的甲酸脱氢酶，又包括非天然存在的甲酸脱氢酶。在本文所述的方法中采用的甲酸脱氢酶，无论是天然存在的还是非天然存在的，都可以表现出至少约1μmol/min/mg的活性，有时至少约10μmol/min/mg或至少约102μmol/min/mg、至多约103μmol/min/mg或更高的活性。
如本文所用，术语“甲酸(盐)”是指甲酸根阴离子(HCO2 -)、甲酸(HCO2H)，以及它们的混合物。甲酸(盐)可以以盐的形式(典型地为碱金属盐或铵盐，例如HCO2Na、KHCO2NH4等)、以甲酸(典型地为水性甲酸)或它们的混合物的形式提供。甲酸为弱酸。在位于其pKa(水中的pKa＝3.7)的若干个pH单位内的水性溶液中，甲酸(盐)以平衡浓度下的HCO2 -和HCO2H这两者存在。在高于约pH 4的pH值下，甲酸(盐)主要以HCO2 -存在。当甲酸(盐)以甲酸提供时，典型地通过添加碱来缓冲反应混合物或使其酸性降低，以提供所需的pH，典型地为约pH 5或高于pH 5。用于中和甲酸的合适的碱包括但不限于有机碱，例如胺、醇盐等，以及无机碱，例如氢氧化物盐(例如NaOH)、碳酸盐(例如K2CO3)、碳酸氢盐(例如NaHCO3)、碱性磷酸盐(例如，K2HPO4、Na3PO4)，等等。
当甲酸(盐)和甲酸脱氢酶用作辅因子再生***时，卤代酮酯被酮还原酶和NADH或NADPH还原，所得的NAD+或NADP+通过由甲酸脱氢酶将甲酸(盐)偶联氧化成二氧化碳而得以还原。
术语“仲醇脱氢酶”和“sADH”在本文中可互换使用，是指分别催化仲醇和NAD+或NADP+转化为酮和NADH或NADPH的NAD+或NADP+依赖性酶。
适合在本文所述的酮还原酶催化的还原反应中用作辅因子再生***的仲醇脱氢酶既包括天然存在的仲醇脱氢酶，又包括非天然存在的仲醇脱氢酶。天然存在的仲醇脱氢酶包括来自布氏热厌氧菌(Thermoanaerobium brockii)、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)、克菲尔乳酸杆菌(Lactobacillus kefiri)和短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)的已知醇脱氢酶，而非天然存在的仲醇脱氢酶包括由其衍生的工程化醇脱氢酶。在本文所述的方法中采用的仲醇脱氢酶，无论是天然存在的还是非天然存在的，都可以表现出至少约1μmol/min/mg的活性，有时至少约10μmol/min/mg或至少约102μmol/min/mg、至多约103μmol/min/mg或更高的活性。
合适的仲醇包括低级仲链烷醇和芳基-烷基原醇。低级仲醇的实例包括异丙醇、2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2-戊醇、3-戊醇、3，3-二甲基-2-丁醇等。在一个实施例中，仲醇为异丙醇。合适的芳基-烷基原醇包括未取代和取代的1-芳基乙醇。
当仲醇和仲醇脱氢酶用作辅因子再生***时，由于卤代酮被工程化的酮还原酶和NADH或NADPH还原，因此所得的NAD+或NADP+通过由仲醇脱氢酶将仲醇偶联氧化成酮而得以还原。
一些工程化的酮还原酶还具有使仲醇还原剂脱氢的活性。在使用仲醇作为还原剂的某些实施例中，工程化的酮还原酶和仲醇脱氢酶是同一种酶。
在采用辅因子再生***执行本文所述的酮还原酶催化还原反应的实施例时，最初可以提供氧化形式或还原形式的辅因子。在某些实施例中，不使用辅因子再生***。对于不使用辅因子再生***执行的还原反应，将辅因子以还原形式添加到反应混合物中。
在执行本文所述的对映选择性还原反应时，工程化的酮还原酶和包含任选的辅因子再生***的任何酶可以以下列形式添加到反应混合物中：经纯化的酶、用编码这些酶的一种或多种基因转化的全细胞，以及/或者此类细胞的细胞提取物和/或裂解物。编码工程化的酮还原酶和任选的辅因子再生酶的一种或多种基因可以分别转化到宿主细胞中或一起转化到相同的宿主细胞中。例如，在某些实施例中，一组宿主细胞可以用编码工程化的酮还原酶的一种或多种基因转化，而另一组则可以用编码辅因子再生酶的一种或多种基因转化。这两组转化的细胞可以在反应混合物中以全细胞的形式、或以由其衍生的裂解物或提取物的形式一起利用。在其他实施例中，宿主细胞可以用编码工程化的酮还原酶和辅因子再生酶这两者的一种或多种基因转化。
用编码工程化的酮还原酶和/或任选的辅因子再生酶或其细胞提取物和/或裂解物的一种或多种基因转化的全细胞可以以多种不同的形式采用，这些形式包括固体(例如，冻干、喷雾干燥等)或半固体(例如，粗制糊剂)。
这些细胞提取物或细胞裂解物可以通过沉淀(硫酸铵、聚乙烯亚胺、热处理或类似方法，随后在冻干之前进行脱盐程序(例如超滤、透析及类似方法)而部分纯化。任何细胞制剂都可以通过使用已知交联剂诸如戊二醛进行交联或固定到固相(例如，Eupergit C及类似固相)而得到稳定。
固体反应物(例如酶、盐等)可以以多种不同的形式提供给反应，这些形式包括粉末(例如，冻干、喷雾干燥等)、溶液、乳剂、悬浮液及类似形式。这些反应物可以使用本领域的普通技术人员已知的方法和设备而轻易地冻干或喷雾干燥。例如，蛋白溶液可以以小的等份在-80℃下冷冻，接着将其添加到预冷的冻干室中，随后施加真空。在从样品中除去水之后，但在释放真空和回收冻干样品之前，典型地将温度升至4℃维持两小时。
用于还原反应的反应物的量通常将根据期望的卤代醇的量和伴随采用的酮还原酶底物的量而变化。通常，卤代酮底物以约20克/升至300克/升的浓度应用，并使用从约50mg至约5g酮还原酶和约10mg至约150mg辅因子。本领域的普通技术人员将容易理解如何改变这些量以使其满足生产能力和生产规模的期望水平。任选的辅因子再生***的适宜量可以基于所利用的辅因子和/或酮还原酶的量经由常规实验来轻易测定。一般来讲，还原剂(例如，葡萄糖、甲酸(盐)、异丙醇)以高于酮还原酶底物的等摩尔水平的水平利用，以基本上实现酮还原酶底物的完全或接近完全的转化。
添加反应物的顺序并不重要。反应物可以同时一起添加到溶剂(例如，单相溶剂、双相水性共溶剂体系等)中，或替代性地，一些反应物可以单独添加，一些反应物则可以在不同的时间点一起添加。例如，可以首先将辅因子再生***、辅因子、酮还原酶和酮还原酶底物添加到溶剂中。
使用水性共溶剂体系时，为了提高混合效率，可以首先将辅因子再生***、酮还原酶和辅因子添加并混合到水相中。然后可以添加有机相并混合，接着添加酮还原酶底物。替代性地，酮还原酶底物在添加到水相中之前，可以在有机相中预混合。
用于执行本文所述的酮还原酶催化还原反应的合适条件包括可以通过常规试验轻易优化的多种条件，该常规试验包括但不限于在实验pH和温度下使工程化的酮还原酶与底物接触，然后检测产物(例如使用本文提供的实例中所述的方法)。
酮还原酶催化的还原典型地在从约15℃至约75℃范围内的温度下进行。对于一些实施例，该反应在从约20℃至约55℃范围内的温度下进行。在还有一些别的实施例中，该反应在从约20℃至约45℃范围内的温度下进行。该反应也可以在环境条件下进行。
通常允许该还原反应进行到获得底物的基本上完全或接近完全还原为止。底物还原为产物的过程可以使用已知方法，通过检测底物和/或产物来监测。合适的方法包括气相色谱法、HPLC，等等。在反应混合物中产生的卤代酮还原产物的转化收率一般大于约50％，还可以大于约60％，还可以大于约70％，还可以大于约80％，还可以大于90％，并且通常大于约97％。
实例
提供了用于产生立体异构纯的氨基环丙烷的方法的非限制性实例，更具体地提供了使用工程化的酮还原酶来合成氨基环丙烷的方法。
除非另有说明，否则按原样使用从商业供应商处得到的试剂和溶剂。去离子水在室内制备。质子核磁共振谱在BrukerAVANCE 300光谱仪上以300MHz或在BrukerAVANCE 500光谱仪上以500MHz获得。光谱以ppm(d)给出，耦合常数J值以赫兹报告。将四甲基硅烷用作内标物。使用安莱尔科技公司(Analtech)的硅胶板实施薄层色谱(TLC)，并通过紫外(UV)光或碘显现。
实例1
选择酮还原酶(KRED)：
在4mL透明玻璃小瓶中进行KRED筛选(KRED筛选试剂盒，克迪科斯股份有限公司)，总反应体积为1mL。向每个小瓶中添加约1mg冻干酶粉末，再添加pH为7.0且由125mM磷酸钾、1.25mM硫酸镁和1mMNADP+组成的0.8mL标准性能检查溶液(setup solution)。将130mg 2-氯-4’-氟苯乙酮溶解在2.47mL异丙醇和0.13mL乙腈中，得到澄清溶液。向每个小瓶中添加0.2mL含有约10mg酮的底物溶液并混合。将反应小瓶置于30℃下，伴随振荡(约220rpm)温育16小时。
后处理和分析：16小时之后，向每个小瓶中添加3mL乙酸乙酯并混合。分离乙酸乙酯层，用盐水洗涤后置于无水硫酸钠上方干燥。在氮气下除去溶剂，然后用100％乙醇将样品复溶。通过下面示出的手性HPLC法分析复溶的样品。
手性HPLC法：
柱：Chiralcel OJ-H，150mm×4.6mm，5μm颗粒
温度：环境温度；流量：1.0mL/min
梯度：10％乙醇(醇试剂)的庚烷溶液，含1％二乙胺
时间：20min；检测：264nm
结果在下表1至4中示出，其中“EE”表示对映异构体过量百分比，“成功的”KRED反应是产生不小于97％的转化率的那些反应。
酮还原酶(KRED)介导的2-氯-3’-羟基苯乙酮的还原：
表1：成功的KRED反应的手性HPLC分析结果
酮还原酶介导的受TBS保护的2-氯-3’-羟基苯乙酮的还原：
表2：受TBS保护的2-氯-3’-羟基苯乙酮的KRED筛选结果
酮还原酶(KRED)介导的2-氯-4’-氯苯乙酮的的还原：
表3：2-氯-4’-氟苯乙酮的KRED筛选结果
酮还原酶(KRED)介导的2-氯-4’-氟苯乙酮的还原：
表4：成功的KRED反应的手性HPLC分析结果
| KRED ID | 形成的主要异构体 | ee |
| P1-A04 | S | ＞99％ |
| P1-B02 | S | 97.9 |
| P1-B10 | S | 96.8 |
| P1-B12 | S | 98.6 |
| P1-C01 | S | 69.0 |
| P1-H08 | R | 91.8 |
| P1-H10 | S | 99.6 |
| P2-B02 | R | 9.0 |
| P2-C02 | R | 72.8 |
| P2-C11 | S | 98.4 |
| P2-D11 | S | 68.8 |
| P2-G03 | S | 99.6 |
| P2-H07 | S | ＞99％ |
优化对规模的放大
为了评估和识别酮还原酶(KRED)介导的从2-氯-4’-氟苯乙酮到S-卤代醇中间体的立体选择性还原(这是得到手性环氧化物的关键步骤)的最佳规模放大条件，将KRED P2-G03与另外一种酮还原酶KRED P1-F07进行了比较。使用以下条件设置了反应时间过程：150g/L酮，0.5g/LKRED，0.1g/LNADP，20体积％IPA在0.1M TEA缓冲液(pH 7)加1mM MgSO4中的溶液，温度为35℃。
P1-F07被鉴定为用于将酮以放大规模还原成期望的S-卤代醇的最佳酶，既显示出与P2-G03类似的可用性，还显示出略微改善的对映选择性和速率。P1-F07被设计用于具有更佳的温度和溶剂耐受性：24小时之后，P1-F07实现了大于99％的对映异构体过量百分比，且实现的向期望的S-卤代醇的转化率为99％，这与P2-G03形成对照，后者实现了大于98％的对映异构体过量百分比。在35℃下与P2-G03相比，P1-F07在4小时和6小时的时间段实现的向该卤代醇的转化率明显更高。
实例2
合成(1R，2S)-2-(4-氟苯基)环丙胺盐酸盐
步骤1：合成(S)-2-氯-1-(4-氟苯基)乙醇
制备含有1mM MgSO4的10 L 0.1M三乙醇胺HCl(TEA)缓冲液(pH 7.0)：在环境温度下，将三乙醇胺HCl盐(186g，1mol)溶解在8L去离子水中，边溶解边混合。发现pH为5.3。使用三乙醇胺(游离碱)将该溶液的pH调节到7.0。使用去离子水将溶液补足到10L。向该缓冲溶液中添加1.2g硫酸镁并混合。在添加MgSO4之后测量溶液的pH，发现该溶液在pH 7.0下稳定。
制备缓冲液-酶-NADP+溶液：在环境温度下，将来自克迪科斯股份有限公司的酮还原酶(3.33g，P1F07/CDX023，批号D12109；最终浓度0.5g/L)和NADP+(666mg，0.87mmol)溶解在1.33L三乙醇胺HCl缓冲液中，边溶解边轻轻混合，历时20分钟。
制备氯酮-IPA溶液：将2-氯-4’-氟苯乙酮(1kg，5.79mol)装入配备有顶置式搅拌器、加料口和温度探头的4L反应器(3L工作容积)中。在搅拌下装入异丙醇(1.33L，17.4mol，3当量，最终浓度为20体积％)，将最初形成的悬浮液升温至50℃，直到获得澄清溶液为止。
酮还原酶反应程序：将4L三乙醇胺缓冲液装入配备有顶置式搅拌器、加料口、温度探头、氮气入口和液位传感器控制器的12L反应器(10L工作容积)中。将先前制备的1.33L缓冲液-酶-NADP+溶液装入反应器中。搅拌速率设定为185rpm，温度设定为35℃，氮气流量设定为10L/min。在缓冲液-酶-NADP+溶液最高升温至35℃(约20min)之后，将温热的氯酮-IPA溶液快速装入反应器中，得到浑浊的悬浮液。对液位传感器控制器进行设置，以便补充在反应过程期间由于蒸发而损失的异丙醇/缓冲液。液位传感器控制器的一条臂放置在表面上，刚好与悬浮液接触，另一条臂则深深地***该悬浮液中。液位传感器控制器连接到蠕动泵，以便通过加料口自动地输送1∶1比率的缓冲液-IPA(预混合)。控制器被设置为在反应器中的悬浮液的液位降到传感器的臂下方时添加缓冲液-IPA混合物。在使用该自动加料***的情况下，24小时内添加到反应中的缓冲液-IPA(1∶1)的总体积为约1L。
反应监测和HPLC分析：以周期性的时间间隔(4h、10h和23h)取出小等份的反应物(约2mL)，使用乙腈(HPLC级)稀释到10mL。将所得的悬浮液离心(微量离心，14,000rpm，5min)，在使用乙腈(通常为40倍体积)适当稀释之后，采用反相HPLC分析上清液。RP-HPLC法的细节在下面的HPLC法-1中示出。
反应后处理：在反应完成(24h)之后，将悬浮液排入配有顶置式搅拌器的20L分液漏斗中。用7L MTBE冲洗反应贮器，将MTBE层排入同一个20L分液漏斗中。充分混合之后，使各层分离。用7L MTBE再次萃取水层。用盐水洗涤合并的MTBE层，置于无水硫酸钠上方干燥，过滤并浓缩，得到浅黄色的油状物。将该油状物在高真空下放置约48小时，以除去任何残留的异丙醇和MTBE。在高真空干燥之后，发现所得的两批目标S-卤代醇(第1批和第2批)分别重500.5g和506.5g(分离收率为约98.5％)。通过1HNMR、RP-HPLC和手性HPLC对这两批物质进行分析。HPLC结果显示，分离的S-卤代醇具有大于99.2％的化学纯度(％AUC，220nm，图1和图2)，以及大于99.2％的手性纯度(％AUC，264nm，图3和图4)。手性HPLC法的细节在HPLC法-2中示出。1H NMR(CDCl3，500MHz)显示，目标卤代醇中的总残留溶剂(IPA和MTBE)为估计值，即约1％(图5和图6)。1H NMR(500Hz，CDCl3)：第1批，7.36-7.33(m，2H)，7.07-7.03(m，2H)，4.86(dd，J＝8.5，3.5Hz，1H)，3.69(dd，J＝11.5，3.5Hz，1H)，3.60(dd，J＝11.0，8.5Hz，1H)，2.80(s，1H)；第2批，7.37-7.34(m，2H)，7.07-7.04(m，2H)，4.87(dd，J＝8.5，3.5Hz，1H)，3.70(dd，J＝11.0，3.5Hz，1H)，3.61(dd，J＝11.0，8.5Hz，1H)，2.71(s，1H)。
步骤2：合成(S)-2-(4-氟苯基)环氧乙烷
方法1：tBuOK的THF溶液。将(S)-2-氯-1-(4-氟苯基)乙醇(91.7g，525mmol)装入配备有顶置式搅拌器、附加的漏斗、温度探头和氮气入口的2L三颈圆底烧瓶中。添加THF(220mL，2.4倍体积，99.9％纯度)。用水-冰浴将该溶液冷却到0℃至10℃。在20min内缓缓地添加KOtBu(1M的THF溶液，657mL，657mmol，7.1倍体积，1.25当量)，保持内部温度低于15℃。在0℃至15℃之间将反应搅拌4小时(注意：HPLC指示1小时之后的转化率大于99％)。添加水(去离子水，275mL，3倍体积)以淬灭反应，同时保持内部温度低于20℃。移走冰水浴，搅拌反应混合物，直到形成了澄清溶液为止。将批料转移到圆底烧瓶中，利用旋转蒸发仪在低于40℃和减压下浓缩，以除去大部分THF。用二氯甲烷(500mL，400mL，纯度99.96％)萃取该混合物，置于无水Na2SO4上方干燥之后加以过滤，接着利用旋转蒸发仪在低于30℃和减压下小心地浓缩(注意：环氧乙烷是挥发性的)，得到(S)-2-(4-氟苯基)环氧乙烷，为浅棕色油状物(69.2g，93.1％，HPLC分析得到纯度(AUC)大于99.7％，tR＝8.53min)；1H NMR分析与指定的结构相符。
方法2：NaOH在混合的DCM/水中的溶液。将(S)-2-氯-1-(4-氟苯基)乙醇(104g，600mmol)装入配备有顶置式搅拌器、附加的漏斗和温度探头的2L三颈圆底烧瓶中。添加DCM(600mL，6倍体积，纯度99.96％)，在环境温度下对溶液进行搅拌。添加2M NaOH溶液[制备方式为：将36g固体NaOH(97％纯度)溶解在去离子水中，达到450mL，900mmol，3倍体积，1.5当量]。在环境温度下将反应搅拌23小时，然后转移到2L分液漏斗中。分离DCM层，用DCM(100mL)萃取水相。将合并的有机萃取物置于无水硫酸钠(Na2SO4，20g)上方干燥3小时，过滤，接着利用旋转蒸发仪在低于30℃和减压下小心地浓缩(注意：环氧乙烷是挥发性的)至约90g。在环境温度下和高真空中，将产物继续干燥至82.0g：(浅黄色油状物，收率99.7％；HPLC分析得到纯度(AUC)大于99.5％，tR＝8.52min)；1H NMR分析与指定的结构相符；1H NMR(500Hz，CDC13)∶7.27-7.23(m，2H)，7.06-7.01(m，2H)，3.85(dd，J＝4.0，2.5Hz，1H)，3.14(dd，J＝5.5，4.0Hz，1H)，2.77(dd，J＝5.0，2.5Hz，1H)。
步骤3：合成(1R，2R)-2-(4-氟苯基)环丙烷羧酸
将叔丁醇钠(Tert-BuONa)(53.4g，556mmol，1.34当量，纯度98.9％)装入配备有顶置式搅拌器、加料漏斗、温度探头和氮气入口的1L四颈圆底烧瓶中。添加甲苯(无水，230mL，为环氧化物的4倍体积，纯度99.8％，纯度99.96％)和THF(无水，57mL，为环氧化物的1倍体积，纯度99.9％)。用冰水浴冷却到低于15℃之后，缓缓添加2-(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(130g(115mL)，581mmol，1.4当量，纯度98.6％)，同时保持内部温度低于30℃。添加之后，移走冰水浴。在环境温度下将反应混合物搅拌1小时，得到澄清溶液。然后，用加热套在15分钟内将反应混合物加热到65℃，接着在20分钟内缓缓添加环氧化物(S)-2-(4-氟苯基)环氧乙烷(57.4g，41.5mmol)，同时对反应加热(注意：放热反应)。内部温度达到70.5℃，然后返回到65℃)。在65℃下加热16小时之后，将反应混合物在80℃下再加热4小时。将反应混合物冷却到45℃，通过加水(50mL，1.4倍体积)淬灭，然后在该温度下减压浓缩以除去大部分甲苯，得到稠溶液。添加MeOH(170mL，3倍体积，纯度99.99％)和NaOH溶液(制备方式为：将33.2g固体NaOH(纯度97％)溶解在去离子水中，达到170mL，830mmol，3倍体积)。将溶液在65℃下加热4小时，然后在环境温度下搅拌15小时。通过在30℃至45℃下加热，将该混合物减压浓缩成浆液。除去约150mL MeOH之后，加水(去离子水，300mL，5倍体积)，将得到的溶液转移到1L加料漏斗中。将6N HCl(制备方式为：将浓HCl(105mL，37％w/w)在去离子水中稀释到210mL，1.3mol，3倍体积)装入配备有顶置式搅拌器、附加的漏斗和温度探头的单独的2L三颈圆底烧瓶中。在环境温度下添加酸(50mg)，作为用于结晶的晶种。用冰水浴冷却到0℃至5℃之后，在搅拌下缓缓添加上述反应混合物，同时保持内部温度低于20℃。形成了灰白色固体，将混合物在环境温度下继续搅拌5小时。(注意：如果没有形成固体，则将混合物浓缩并中和至pH大于8；重复上述程序。)过滤灰白色固体，用水洗涤之后在空气中干燥7天，然后在40℃下高真空干燥10小时，得到(1R，2R)-2-(4-氟苯基)环丙烷羧酸，为浅黄色固体：72.7g；收率96.9％；KF＝0.1％；HPLC分析得到纯度(AUC)为95.6％，tR＝7.49min；1H NMR分析与指定的结构相符；1HNMR(500Hz，CDCl3)∶7.10-7.06(m，2H)，7.10-7.06(m，2H)，2.61-2.57(m，1H)，1.87-1.83(m，1H)，1.67-1.63(m，1H)，1.38-1.34(m，1H)。
步骤4至步骤5：合成(1R，2S)-2-(4-氟苯基)环丙胺盐酸盐
步骤4：库尔提斯(Curtius)重排
将(1R，2R)-2-(4-氟苯基)环丙烷羧酸(68.0g，378mmol)装入配备有顶置式搅拌器、附加的漏斗、温度探头、回流冷凝器和氮气入口的2L四颈圆底烧瓶中。在搅拌下添加tBuOH(无水，500mL，7.4倍体积，纯度99.7％)。在形成澄清溶液(注意：可以将混合物最高加热到30℃，以更快地溶解酸)之后，在环境温度下添加DPPA(89.6mL，416mmol，1.1当量，纯度98.2％)。然后在环境温度下在5分钟内滴加三乙胺(TEA)(79.0mLg，567mmol，1.5当量，纯度99.99％)。内部温度在30分钟内升高到37℃，然后降回到环境温度。将反应混合物在80℃下加热(注意：放热反应；反应在第一个小时内迅速发生；如果固体叔丁醇(tBuOH)在回流冷凝器中聚积，则停止冷却水；在第一个小时之后反应将平稳下来)20小时。
在40℃至45℃下将反应混合物减压浓缩成稠溶液(除去约250mL叔丁醇)，用MTBE(800mL，12倍体积，纯度99.96％)稀释，然后用下列物质洗涤：2N HCl水性溶液(2×100mL，制备方式为：将浓HCl(33.6mL，37％w/w)在去离子水中稀释到200mL)、2N NaOH水性溶液(2×100mL，制备方式为：将16g纯度为97％的固体NaOH溶解在去离子水中，达到200mL)和水(100mL，去离子水)。将有机相转移到配备有顶置式搅拌器、附加的漏斗、温度探头和氮气入口的2L四颈圆底烧瓶中。在40℃下将混合物减压浓缩到约4倍体积，并用于下一步骤。
步骤5：脱保护
在环境温度下，在20分钟内将HCl(4N Hcl的二氧六环溶液，378mL，4.0当量，4倍体积)添加到上述MTBE悬浮液中，形成了棕色溶液。内部温度升高到37℃，然后降回到环境温度。在环境温度下搅拌18小时之后，未观察到期望的白色针状固体。用冰水浴冷却该混合物，形成了白色晶体。在该温度下搅拌2小时之后，过滤白色晶体，用MTBE洗涤，在40℃下高真空干燥过夜，得到第一批产物：14.5g；HPLC分析得到纯度(AUC)为100％，tR＝7.49min；估计的ee：＞99％；1HNMR分析与指定的结构相符；1HNMR(300Hz，DMSO-d6)∶8.53(br s，3H)，7.24-7.18(m，2H)，7.16-7.09(m，2H)，2.80-2.74(m，1H)，2.39-2.32(m，1H)，1.43-1.36(m，1H)，1.22-1.15(m，1H)。
减压浓缩滤液，在环境温度下高真空干燥过夜。将残余物悬浮在MTBE和二氧六环中。在环境温度下将混合物搅拌2小时。过滤灰白色固体，用MTBE洗涤，在40℃下高真空干燥度过周末，得到第二批产物：26.5g；HPLC分析得到纯度(AUC)为96.1％，tR＝7.49min；1HNMR分析与指定的结构相符。
浓缩棕色滤液，将残余物在二氧六环(120mL)和MTBE(30mL)中搅拌3小时。过滤白色固体，用MTBE洗涤，在40℃下高真空干燥度过周末，得到第三批产物：9.1g；HPLC分析得到纯度(AUC)大于99.0％，tR＝7.49min；1HNMR分析与指定的结构相符。将所有三批产物合并，得到(1R，2S)-2-(4-氟苯基)环丙胺盐酸盐：50.1g，收率70.6％。
HPLC法：
HPLC法-1：沿循形成卤代醇的RP-HPLC法
样品制备：取出2mL反应混合物，使用乙腈(HPLC级)稀释到10mL。将所得的悬浮液离心(微量离心，14,000rpm，5min)。使用乙腈将25μL上清液稀释到1mL，然后通过以下HPLC法分析稀释的样品。
柱：SunFire C18，150mm×4.6mm，3.5μm颗粒
温度：环境温度
流量：1.0mL/min
进样量：5μL
梯度：
检测：光电二极管阵列，从190nm至370nm(在220nm处提取)
使用上述方法观察到的酮和卤代醇的保留时间分别为约9.0min和约7.9min。
HPLC法-2：手性HPLC法。
样品制备：通过将约1.5mg目标卤代醇溶解在1mL HPLC级乙醇中来制备HPLC样品。
柱：Chiralcel OJ-H，150mm×4.6mm，5μm颗粒
温度：环境温度
流量：1.0mL/min
进样量：3μL至5μL
梯度：10％乙醇(醇试剂)和90％庚烷(体积/体积)，含0.1体积％二乙胺，等梯度洗脱20分钟
检测：264nm
使用上述方法观察到的(S)-卤代醇的保留时间在12.6min至13.1min之间变化，而(R)-卤代醇的保留时间则在11.4min至11.9min之间变化。
其他实施例
提供以上列出的详细描述是为了帮助本领域的技术人员实践本披露。然而，本文描述和要求权利的本披露的范围并不受本文所披露的具体实施例的限制，因为这些实施例旨在阐明本披露的若干方面。任何等效的实施例都旨在处于本披露的范围之内。事实上，除了本文示出并描述的那些，本披露的各种修改从前述说明书对于本领域技术人员来说也将变得清楚，这并不偏离本发明的实质和范围。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围之内。
Claims (83)
1.一种组合物，该组合物包含：
a.式II的化合物：
或其盐；其中：
X选自Cl、Br和I；
R1选自芳基和杂芳基，这些基团中的任何基团任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代；
每个R3选自氢、卤素、烷基、烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、卤代烷氧基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、氰基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、C(O)R4、S(O)2R4、NHS(O)2R4、NHS(O)2NHR4、NHC(O)R4、NHC(O)NHR4、C(O)NHR4和C(O)NR4R5；并且
R4和R5独立地选自氢和低级烷基；或者R7和R8可以合在一起形成含氮杂环烷基或杂芳基环，该含氮杂环烷基或杂芳基环任选地被低级烷基取代；以及
b.工程化或分离的酮还原酶，该工程化或分离的酮还原酶能够立体选择性地将式II的氧代基还原为羟基基团。
2.如权利要求1所述的组合物，其中R1为芳基，该芳基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
3.如权利要求1所述的组合物，其中R1为苯基，该苯基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
4.如权利要求1所述的组合物，其中R1为杂芳基。
5.如权利要求1所述的组合物，其中R1为5元至6元单环杂芳基或8元至12元双环杂芳基，在该杂芳基中介于1个与5个之间的环成员可以是选自N、O和S的杂原子，并且该杂芳基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
6.如权利要求1所述的组合物，其中R1为5元至6元单环杂芳基，在该杂芳基中介于1个与5个之间的环成员可以是选自N、O和S的杂原子，并且该杂芳基任选地被1个或2个R3基团取代。
7.如权利要求1所述的组合物，其中R1选自：
8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中R3为卤素。
9.如权利要求8中任一项所述的组合物，其中R3为氟。
10.如权利要求1所述的组合物，其中该酮还原酶将超过约90％的底物转变为手性卤代醇的(S)对映异构体。
11.如权利要求10所述的组合物，其中该酮还原酶为P1F07/CDX023。
12.一种用于制备式III的手性卤代醇化合物：
或其盐的方法；其中：
X选自Cl、Br和I；
R1选自芳基和杂芳基，这些基团中的任何基团任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代；
每个R3选自氢、卤素、烷基、烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、卤代烷氧基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、氰基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、C(O)R4、S(O)2R4、NHS(O)2R4、NHS(O)2NHR4、NHC(O)R4、NHC(O)NHR4、C(O)NHR4和C(O)NR4R5；并且
R4和R5独立地选自氢和低级烷基；或者R7和R8可以合在一起形成含氮杂环烷基或杂芳基环，该含氮杂环烷基或杂芳基环任选地被低级烷基取代；
该方法包括以下步骤：
a.用能够立体选择性地将氧代基还原为羟基基团的工程化或分离的酮还原酶对映选择性地还原式II的化合物：
或其盐；以提供该式III的手性卤代醇化合物：
13.如权利要求12所述的方法，该方法还包括以下步骤：
b.从反应混合物中回收该式III的手性卤代醇化合物。
14.如权利要求12所述的方法，其中R1为芳基，该芳基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
15.如权利要求12所述的方法，其中R1为苯基，该苯基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
16.如权利要求12所述的方法，其中R1为杂芳基。
17.如权利要求12所述的方法，其中R1为5元至6元单环杂芳基或8元至12元双环杂芳基，在该杂芳基中介于1个与5个之间的环成员可以是选自N、O和S的杂原子，并且该杂芳基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
18.如权利要求12所述的方法，其中R1为5元至6元单环杂芳基，在该杂芳基中介于1个与5个之间的环成员可以是选自N、O和S的杂原子，并且该杂芳基任选地被1个或2个R3基团取代。
19.如权利要求12所述的方法，其中R1选自：
20.如权利要求12至19中任一项所述的方法，其中R3为卤素。
21.如权利要求12至19中任一项所述的方法，其中R3为氟。
22.如权利要求12所述的方法，其中该酮还原酶将超过约90％的底物转变为该手性卤代醇的(S)对映异构体。
23.如权利要求22所述的方法，其中该酮还原酶为P1F07/CDX023。
24.如权利要求12所述的方法，其中所提供的手性卤代醇化合物是基本上纯的结构式III的对映异构体。
25.如权利要求12所述的方法，其中所提供的手性卤代醇化合物是至少99％纯的结构式III的对映异构体。
26.如权利要求12所述的方法，该方法是用表达该酮还原酶的全细胞或此类细胞的提取物或裂解物来进行的。
27.如权利要求12所述的方法，其中该酮还原酶被分离和/或纯化。
28.如权利要求12所述的方法，其中对映选择性还原反应在用于该酮还原酶的辅因子的存在下，以及任选地在用于该辅因子的再生***的存在下进行。
29.如权利要求12所述的方法，该方法在约15℃至约75℃范围内的温度下进行。
30.如权利要求12所述的方法，该方法在约pH5至pH8范围内的pH下进行。
31.如权利要求12所述的方法，其中该结构式II的氧代化合物与该酮还原酶的重量比在约10∶1至200∶1范围内。
32.如权利要求12所述的方法，其中X为氯。
33.如权利要求12所述的方法，该方法在用于该酮还原酶的辅因子的存在下，以及任选地在用于该辅因子的辅因子再生***的存在下进行。
34.如权利要求33所述的方法，其中该辅因子为NADH和/或NADPH，并且其中该辅因子与该酮还原酶的重量比在约10∶1至100∶1范围内。
35.如权利要求33所述的方法，其中该辅因子再生***包含葡萄糖脱氢酶和葡萄糖；甲酸脱氢酶和甲酸(盐)；或异丙醇和仲醇脱氢酶。
36.一种用于制备式I的手性环丙基化合物
或其盐的方法；其中：
R1选自芳基和杂芳基，这些基团中的任何基团任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代；
R2选自氢和C(O)OR3；
每个R3选自氢、卤素、烷基、烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、卤代烷氧基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、氰基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、C(O)R4、S(O)2R4、NHS(O)2R4、NHS(O)2NHR4、NHC(O)R4、NHC(O)NHR4、C(O)NHR4和C(O)NR4R5；并且
R4和R5各自独立地选自氢和低级烷基；或者R7和R8可以合在一起形成含氮杂环烷基或杂芳基环，该含氮杂环烷基或杂芳基环任选地被低级烷基取代；
该方法包括以下步骤：
a.用能够立体选择性地将氧代基还原为羟基基团的工程化或分离的酮还原酶对映选择性地还原式II的化合物：
或其盐，其中R1至R5如上所定义；以提供式III的手性卤代醇化合物：
其中X选自Cl、Br和I，
b.用碱处理该式III的化合物，以提供式IV的环氧化物或其盐，其中R1至R5如上所定义：
c.用沃兹沃思-埃蒙斯试剂和碱处理该式IV的化合物，以提供式V的环丙基酯或其盐，其中R1至R5如上所定义：
d.用试剂处理该式V的化合物，以提供式VI的环丙基酸或其盐，其中R1至R5如上所定义：
e.用叠氮化试剂、碱和式VII的醇处理该式VI的化合物：
其中R3如上所定义，以提供式VIII的环丙基氨基甲酸酯或其盐，其中R1至R5如上所定义：
以及任选地，
f.用合适的脱保护碱或酸处理该式VIII的环丙基氨基甲酸酯，以提供式IX的环丙基胺或其盐，其中R1至R5如上所定义：
其中R1至R5如上所定义，或其盐。
37.如权利要求36所述的方法，该方法还包括步骤f：用合适的脱保护碱或酸处理该式VIII的环丙基氨基甲酸酯或其盐，其中R1至R5如上所定义，以提供该式IX的环丙基胺或其盐，其中R1至R5如上所定义。
38.如权利要求36所述的方法，其中R1为芳基，该芳基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
39.如权利要求36所述的方法，其中R1为苯基，该苯基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
40.如权利要求36所述的方法，其中R1为杂芳基。
41.如权利要求36所述的方法，其中R1为5元至6元单环杂芳基或8元至12元双环杂芳基，在该杂芳基中介于1个与5个之间的环成员可以是选自N、O和S的杂原子，并且该杂芳基任选地被介于1个与3个之间的R3基团取代。
42.如权利要求36所述的方法，其中R1为5元至6元单环杂芳基，在该杂芳基中介于1个与5个之间的环成员可以是选自N、O和S的杂原子，并且该杂芳基任选地被1个或2个R3基团取代。
43.如权利要求36所述的方法，其中R1选自：
44.如权利要求36至43中任一项所述的方法，其中R3为卤素。
45.如权利要求44中任一项所述的方法，其中R3为氟。
46.如权利要求36所述的方法，其中该酮还原酶将超过约90％的底物转变为该手性卤代醇的(S)对映异构体。
47.如权利要求46所述的方法，其中该酮还原酶为P1F07/CDX023。
48.如权利要求36所述的方法，其中所提供的手性卤代醇化合物是基本上纯的结构式III的对映异构体。
49.如权利要求36所述的方法，其中所提供的手性卤代醇化合物是至少99％纯的结构式III的对映异构体。
50.如权利要求36所述的方法，该方法是用表达该酮还原酶的全细胞或此类细胞的提取物或裂解物来进行的。
51.如权利要求36所述的方法，其中该酮还原酶被分离和/或纯化。
52.如权利要求36所述的方法，其中该对映选择性还原反应在用于该酮还原酶的辅因子的存在下，以及任选地在用于该辅因子的再生***的存在下进行。
53.如权利要求36所述的方法，该方法在约15℃至约75℃范围内的温度下进行。
54.如权利要求36所述的方法，该方法在约pH5至pH8范围内的pH下进行。
55.如权利要求36所述的方法，其中该结构式II的氧代化合物与该酮还原酶的重量比在约10∶1至200∶1范围内。
56.如权利要求36所述的方法，其中X为氯。
57.如权利要求36所述的方法，该方法在用于该酮还原酶的辅因子的存在下，以及任选地在用于该辅因子的辅因子再生***的存在下进行。
58.如权利要求57所述的方法，其中该辅因子为NADH和/或NADPH，并且其中该辅因子与该酮还原酶的重量比在约10∶1至100∶1范围内。
59.如权利要求57的方法，其中该辅因子再生***包含葡萄糖脱氢酶和葡萄糖；甲酸脱氢酶和甲酸(盐)；或异丙醇和仲醇脱氢酶。
60.如权利要求36所述的方法，其中步骤b.中的该碱选自NaOH、叔丁醇钠、KOH、Mg(OH)2、K2HPO4、MgCO3、Na2CO3、K2CO3、三乙胺、二异丙基乙胺和N-甲基吗啉。
61.如权利要求36所述的方法，其中步骤b.中的该碱为叔丁醇钠。
62.如权利要求36所述的方法，其中步骤c.中的该沃兹沃思-埃蒙斯试剂选自二乙基膦酰基乙酸叔丁酯、P，P-二甲基膦酰基乙酸钾、膦酰基乙酸三甲酯、二甲基膦酰基乙酸乙酯、二乙基膦酰基乙酸甲酯、P，P-双(2，2，2-三氟乙基)膦酰基乙酸甲酯、膦酰基乙酸三乙酯、P，P-二乙基膦酰基乙酸烯丙酯和P，P-二乙基膦酰基乙酸三甲基甲硅烷基酯。
63.如权利要求36所述的方法，其中步骤c.中的该沃兹沃思-埃蒙斯试剂为膦酰基乙酸三乙酯。
64.如权利要求36所述的方法，其中步骤c.中的该碱选自二异丙基氨基锂、双(三甲基甲硅烷基)氨基钠、双(三甲基甲硅烷基)氨基钾四甲基哌啶锂、氢化钠、氢化钾、叔丁醇钠和叔丁醇钾。
65.如权利要求36所述的方法，其中步骤c.中的该碱为叔丁醇钠。
66.如权利要求36所述的方法，其中步骤c.在包含选自甲苯、四氢呋喃及其混合物的一种或多种溶剂的溶液中进行。
67.如权利要求36所述的方法，其中步骤c.在四体积的甲苯和一体积的四氢呋喃中进行。
68.如权利要求36所述的方法，其中步骤d.中的该试剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸和硫酸。
69.如权利要求36所述的方法，其中步骤d.中的该试剂为氢氧化钠。
70.如权利要求68所述的方法，其中该式VI的化合物基本上不含无机盐，或经处理以基本上不含无机盐。
71.如权利要求68所述的方法，其中在处于或低于20℃的温度下将反应混合物添加到6M盐酸(HCl)中。
72.如权利要求68所述的方法，其中添加了(1R，2R)-2-(4-氟苯基)环丙烷羧酸晶种。
73.如权利要求36所述的方法，其中步骤e.中的该叠氮化试剂选自叠氮化钠、二苯基磷酰基叠氮化物、甲苯磺酰基叠氮化物和三氟甲磺酰基叠氮化物。
74.如权利要求36所述的方法，其中步骤e.中的该叠氮化试剂为二苯基磷酰基叠氮化物。
75.如权利要求36所述的方法，其中步骤e.中的该碱选自三乙胺、二异丙基乙胺和N-甲基吗啉。
76.如权利要求36所述的方法，其中步骤e.中的该碱为三乙胺。
77.如权利要求36所述的方法，其中步骤e.中的该式VII的醇选自9-芴基甲醇、叔丁醇和苄醇。
78.如权利要求36所述的方法，其中步骤e.中的该式VII的醇为叔丁醇。
79.如权利要求36所述的方法，其中该试剂选自哌啶、吗啉、盐酸、氢溴酸、三氟乙酸、硫酸和氢气，这些试剂中的每一者在金属催化剂存在下提供。
80.如权利要求79所述的方法，其中该金属催化剂选自铂、钯、铑、钌和镍。
81.如权利要求36所述的方法，其中该试剂为盐酸。
82.如权利要求36所述的方法，其中该式VIII的环丙基氨基甲酸酯基本上不含叔丁醇，或经处理以基本上不含叔丁醇。
83.如权利要求36所述的方法，其中该式VIII的环丙基氨基甲酸酯的悬浮液在MTBE中制备。
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