CN110267990B - 结合共刺激性和检查点受体的双特异性免疫调节抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及双特异性异二聚体免疫调节抗体。

Description

结合共刺激性和检查点受体的双特异性免疫调节抗体
相关申请交叉引用
本申请要求于2016年8月30日提交的美国临时专利申请62/381,239、2017年2月7日提交的美国临时专利申请62/456,033、2017年3月31日提交的美国临时专利申请62/479,723和2017年6月14日提交的美国专利申请15/623,314的优先权，它们的内容明确地通过引用整体并入。
序列表
本申请包含序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。2017年8月29日创建的所述ASCII拷贝命名为067461_5198-WO_SL.txt，大小为26,061,282千字节。
背景技术
由于抑制性免疫检查点如PD-1和CTLA-4的上调，肿瘤反应性T细胞随时间丧失其细胞毒性能力。正在寻求两种平行的治疗策略来去抑制肿瘤反应性T细胞，以便它们可以继续杀死肿瘤细胞。
第一种方法是免疫的免疫调节阻断，其是通过与免疫调节本身(PD-1、CTLA-4等)或其配体(PD-L1、PD-L2、CD80、CD86等)结合的拮抗性单克隆抗体进行治疗，从而去除抑制肿瘤反应性T细胞免受肿瘤细胞杀伤的抑制信号。免疫调节受体如CTLA-1、PD-1(程序性细胞死亡1)、TIM-3(T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3)、LAG-3(淋巴细胞活化基因3)、TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)和其他，抑制T细胞和其他细胞类型的活化、增殖和/或效应活性。在免疫调节受体抑制对肿瘤细胞的内源性T细胞反应的假设指导下，抗-CTLA4和抗PD1抗体(包括纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、伊匹单抗(ipilimumab)和曲美单抗(tremelimumab))的临床前和临床研究确实证明了免疫调节阻断导致令人印象深刻的抗肿瘤反应、刺激内源性T细胞攻击肿瘤细胞、导致一小部分各种恶性肿瘤患者长期癌症缓解。不幸的是，只有一部分患者对这些疗法有反应，取决于适应症和其他因素，每种单一疗法的反应率一般在10％至30％之间，有时甚至更高。
用于去抑制肿瘤反应性T细胞的第二种方法是通过用结合诸如ICOS的共刺激蛋白的激动性抗体进行T细胞共刺激，从而添加阳性信号以克服免疫检查点的阴性信号传导。
因此，本发明涉及结合共刺激受体(例如ICOS、GITR、OX40、4-1BB)以及检查点受体(例如PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、BTLA和TIGIT)的双特异性抗体。
发明内容
因此，在一个方面，本发明提供双特异性抗体，其单价结合人共刺激受体并单价结合人检查点受体，用于激活T细胞以治疗癌症。
在某些方面，共刺激受体选自ICOS、GITR、OX40和4-1BB。
在另外的方面，检查点受体选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT和TIM-3。
在进一步的方面，抗体结合选自以下的抗原对：ICOS和PD-1、ICOS和CTLA-4、ICOS和LAG-3、ICOS和TIM-3、ICOS和PD-L1、ICOS和BTLA、ICOS和TIGIT、GITR和TIGIT、GITR和PD-1、GITR和CTLA-4、GITR和LAG-3、GITR和TIM-3、GITR和PD-L1、GITR和BTLA、OX40和PD-1、OX40和TIGIT、OX40和CTLA-4、IC OX40 OS和LAG-3、OX40和TIM-3、OX40和PD-L1、OX40和BTLA、4-1BB和PD-1、4-1BB和CTLA-4、4-1BB和LAG-3、4-1BB和TIM-3、4-1BB和PD-L1、TIGIT和4-1BB以及4-1BB和BTLA。
在另外的方面，双特异性抗体具有选自图2A-2N中概述的那些的形式。
在其他方面，本发明提供了异二聚体抗体，其包含：a)第一重链，第一重链包含第一Fc结构域、任选的结构域接头和第一抗原结合结构域，第一抗原结合结构域包含结合第一抗原的scFv；b)第二重链，其包含的重链包含重链恒定结构域，所述重链恒定结构域包含第二Fc结构域、铰链结构域、CH1结构域和可变重结构域；和c)包含可变轻结构域和轻链恒定结构域的轻链；其中所述可变重结构域和所述可变轻结构域形成结合第二抗原的第二抗原结合结构域，其中所述第一和第二抗原结合结构域的一个结合人ICOS而另一个结合人PD-1。
另一方面，本发明提供了异二聚体双特异性抗体，其包含：a)第一重链，其包含：i)第一变体Fc结构域；和ii)结合第一抗原的单链Fv区(scFv)，其中所述scFv区包含第一可变重链、可变轻链和带电荷的scFv接头，其中所述带电荷的scFv接头共价连接所述第一可变重链和所述可变轻链；和b)包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3单体的第二重链，其中VH是第二可变重链，CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链；其中所述第二变体Fc结构域包含氨基酸取代N208D/Q295E/N384D/Q418E/N241D，其中所述第一和第二变体Fc结构域各自包含氨基酸取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；并且其中所述第一变体Fc结构域包含氨基酸取代S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包含氨基酸取代L368D/K370S，其中所述第一和第二抗原结合结构域的一个结合人ICOS，另一个结合人PD-1，并且其中编号是根据Kabat中的EU索引。
在一些方面，异二聚体抗体具有第一和第二变体Fc结构域，每个Fc结构域包含M428L/N434S。
另一方面，本发明提供了异二聚体抗体，其包含：a)第一重链，其包含：i)第一变体Fc结构域；和ii)结合第一抗原的单链Fv区(scFv)，其中所述scFv区包含第一可变重链、可变轻链和带电荷的scFv接头，其中所述带电荷的scFv接头共价连接所述第一可变重链和所述可变轻链；和b)包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3单体的第二重链，其中VH是第二可变重链，CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)轻链；其中所述第一和第二变体Fc结构域包括一组异源二聚变体，其选自L368D/K370S：S364K/E357Q；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K；和T366S/L368A/Y407V：T366W，并且其中所述第一和第二抗原结合结构域的一个结合人ICOS而另一个结合人PD-1，并且其中编号是根据如Kabat中的EU索引。
在另一方面，本发明提供了包含编码本发明的异二聚体抗体的核酸的核酸组合物、包含所述核酸的表达载体组合物、和包含所述表达载体组合物的宿主细胞。
另一方面，本发明提供了用于激活T细胞以治疗癌症的异二聚体抗体。
附图说明
图1呈现从The Cancer Genome Atlas(TCGA)汇编的PD-1和T细胞共刺激受体对于膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、头颈部癌、肾癌、肺腺癌、肺鳞状癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌和黑色素瘤的表达数据(RNAseq V2 RSEM)。计算针对T细胞共刺激受体的PD-1的Pearson相关系数的平方。
图2A至2N描绘本发明的双特异性抗体的几种形式。第一种是“开瓶器”形式，具有第一和第二抗-抗原结合结构域。另外，mAb-Fv、mAb-scFv、中心-scFv、中心-Fv、单臂中心-scFv、一种scFv-mAb、scFv-mAb双scFv形式都被示出。图2J描绘了“中心-scFv2”形式，其具有两个Fab-scFv臂，其中Fab结合第一抗原和scFv结合第二抗原。图2K描绘了双特异性mAb形式，其具有第一Fab臂结合第一抗原和第二Fab臂结合第二抗原。图2L描绘了DVD-IgG形式(参见例如美国专利7,612,181，其通过引用明确地并入本文并且如下所讨论)。图2M描述了三齿形形式(参见例如WO 2015/184203，在此明确地通过引用并入且如下所讨论)。对于所描绘的所有scFv结构域，它们可以是N-至C-末端可变重-(任选的接头)-可变轻的，或相反。另外，对于单臂scFv-mAb，scFv可以连接重链单体的N末端或轻链的N末端。
图3A-3B描绘XENP23104的序列，其为开瓶器形式，其中ICOS作为Fab侧([ICOS]_H0.66_L0)和PD-1作为scFv(1G6_L1.94_H1.279)，并包括M428L/434S变体，以延长血清半衰期。CDR加下划线，scFv接头双下划线(在序列中，scFv接头是带正电荷的scFv(GKPGS)4接头，但是如本领域技术人员所理解的，该接头可以被其他接头取代，包括不带电荷或带负电荷的接头，其中的一些在图8中描绘)，和斜线指示可变结构域的边界。另外，命名惯例说明了scFv从N-末端到C-末端的方向；本文中的一些序列定向为VH-scFv接头-VL(从N-末端到C-末端)，而一些序列定向为VL-scFv接头-VH(从N-末端到C-末端)，尽管如本领域技术人员所理解的，这些序列也可以用于与本文描述的相反的方向。如本文所述并且对于本文包含CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确鉴定可以根据表1中所示使用的编号略微不同，因此本文包括的不仅是下划线的CDR而且是使用其他编号***在VH和VL域内包括的CDR。
图4A至4F描绘异二聚变体组的有用对(包括偏斜和pI变体)。在图4C和4F上，存在没有对应的“单体2”变体的变体；这些是pI变体，其可以单独用于任一单体，或例如包含在开瓶器的Fab侧，并且适当的带电荷scFv接头可以用于利用scFv作为第二抗原结合结构域的第二单体上。合适的带电荷接头示于图8中。
图5描绘等构变体抗体恒定区和它们各自的取代的列表。pI_(-)表示较低的pI变体，而pI_(+)表示较高的pI变体。这些可以任选地和独立地与本发明的其他异二聚变体(以及如本文所概述的其他变体类型)组合。
图6描绘有用消融变体，其消融FcγR结合(有时被称为“敲除”或“KO”变体)。通常，在两种单体上都发现了消融变体，尽管在某些情况下它们可能仅在一种单体上。
图7A-7B示出了本发明的两个特别有用的实施方案。本实施方案的“非Fv”组分被示出在图9A中，但也可以使用图9的其他形式。
图8A和8B示出许多带电荷的scFv接头，其用于增加或减少利用一个或多个scFv作为组分的异二聚体抗体的pI。(+H)阳性接头在本文中特别有用。具有单电荷的单个现有技术scFv接头被称为“Whitlow”，来自Whitlow等，Protein Engineering 6(8)：989-995(1993)。应注意，该接头用于减少scFv中的聚集和增强蛋白水解稳定性。
图9A-9D示出基于人IgG1的几个有用的开瓶器形式主链的序列，其没有Fv序列(例如Fab侧的scFv以及vh和vl)。开瓶器主链1基于人IgG1(356E/358M同种异型)，包括S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体、Fab侧的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。开瓶器主链2基于人IgG1(356E/358M同种异型)，包括不同的偏斜变体、Fab侧的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。开瓶器主链3基于人IgG1(356E/358M同种异型)，包括不同的偏斜变体、Fab侧的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。开瓶器主链4基于人IgG1(356E/358M同种异型)，包括不同的偏斜变体、Fab侧的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。开瓶器主链5基于人IgG1(356D/358L同种异型)，包括S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体、Fab侧的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。开瓶器主链6基于人IgG1(356E/358M同种异型)，包括S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体、Fab侧的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体以及两条链上的N297A变体。除了突变是N297S之外，开瓶器主链7与6相同。开瓶器主链6和7的替代形式可以不含两个链中的消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。主链8基于人IgG4，包括S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体、Fab侧的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和在两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体，以及两条链上的S228P(EU编号，这是Kabat中的S241P)变体，其如本领域已知的消融了Fab臂交换。开瓶器主链8的替代形式可以不含两个链中的消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。主链9基于人IgG2，并且包括S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体，Fab侧的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体。主链10基于人IgG2，并且包括S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体，Fab侧的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的S267K变体。
如本领域技术人员所理解和下面概述的，这些序列可与本文概述的任何vh和vl对一起使用，其中一种单体包括scFv(任选地包括带电荷的scFv接头)和其他单体包含Fab序列(例如，连接到“Fab侧重链”的vh和连接到“恒定轻链”的v1)。也就是说，本文概述的抗-CTLA-4、抗-PD-1、抗-LAG-3、抗-TIM-3、抗-TIGIT和抗-BTLA的任何Fv序列，无论是作为scFv(再次，任选地带电荷的scFv接头)或作为Fab，可以以任何组合掺入这些图37主链中。图9A描绘的恒定轻链可用于所有在该图中的构建体，虽然κ恒定轻链也可以被取代。
应当注意，这些开瓶器主链可用于图1的中心-scFv形式，其中将与第一Fab具有相同抗原结合的另外的第二Fab(vh-CH1和v1-恒定轻链)添加到“开瓶器侧”的scFv的N-末端。
在这些主链的每一个内包括与所述序列90％、95％、98％和99％相同的(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代的序列(与图的“亲本”相比，如本领域技术人员所理解的，与亲本人IgG1(或IgG2或IgG4，这取决于主链)相比，其已含有许多氨基酸修饰)。也就是说，除了包含在该图的主链内的偏斜、pI和消融变体之外，所述主链还可以包含额外的氨基酸修饰(通常是氨基酸取代)。
图10A-10E描绘选定数量的抗PD-1抗体的序列。需要注意的是基于人IgG1产生这些序列，其中消融变体(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，“IgG1_PVA_/S267K”)描绘于图6中。CDR加下划线。如本文所述并且对于本文包含CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确鉴定可以根据表1中所示使用的编号略微不同，因此本文包括的不仅是下划线的CDR而且是使用其他编号***在VH和VL域内包括的CDR。
图11A-11E描绘了选择数目的PD-1 ABDS，其中另外的抗PD-1 ABD列为SEQ 1-2392、3125-3144、4697-7594和4697-21810。CDR加下划线，scFv接头双下划线(在序列中，scFv接头是带正电荷的scFv(GKPGS)4接头，但是如本领域技术人员所理解的，该接头可以被其他接头取代，包括不带电荷或带负电荷的接头，其中的一些在图8中描绘)，和斜线指示可变结构域的边界。另外，命名惯例说明了scFv从N-末端到C-末端的方向；该图中的一些序列定向为VH-scFv接头-VL(从N-末端到C-末端)，而一些序列定向为VL-scFv接头-VH(从N-末端到C-末端)，尽管如本领域技术人员所理解的，这些序列也可以用于与本文描述的相反的方向。如本文所述并且对于本文包含CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确鉴定可以根据表1中所示使用的编号略微不同，因此本文包括的不仅是下划线的CDR而且是使用其他编号***在VH和VL域内包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以以scFv形式或Fab形式使用。
图12A-12PP描绘了选择数目的CTLA-4ABD，其中另外的抗CTLA-4ABD列为SEQ IDNO：2393-2414和3737-3816。CDR加下划线，scFv接头双下划线(在序列中，scFv接头是带正电荷的scFv(GKPGS)4接头，但是如本领域技术人员所理解的，该接头可以被其他接头取代，包括不带电荷或带负电荷的接头，其中的一些在图8中描绘)，和斜线指示可变结构域的边界。另外，命名惯例说明了scFv从N-末端到C-末端的方向；该图中的一些序列定向为VH-scFv接头-VL(从N-末端到C-末端)，而一些序列定向为VL-scFv接头-VH(从N-末端到C-末端)，尽管如本领域技术人员所理解的，这些序列也可以用于与本文描述的相反的方向。如本文所述并且对于本文包含CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确鉴定可以根据表1中所示使用的编号略微不同，因此本文包括的不仅是下划线的CDR而且是使用其他编号***在VH和VL域内包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以以scFv形式或Fab形式使用。
图13A-13N描绘选择数目的LAG-3ABD，其中另外的抗LAG-3ABD被列为SEQ ID NO：2415-2604和3817-3960。CDR加下划线，scFv接头双下划线(在序列中，scFv接头是带正电荷的scFv(GKPGS)4接头(SEQ ID NO:XXX)，但是如本领域技术人员所理解的，该接头可以被其他接头取代，包括不带电荷或带负电荷的接头，其中的一些在图8中描绘)，和斜线指示可变结构域的边界。另外，命名惯例说明了scFv从N-末端到C-末端的方向；该图中的一些序列定向为VH-scFv接头-VL(从N-末端到C-末端)，而一些序列定向为VL-scFv接头-VH(从N-末端到C-末端)，尽管如本领域技术人员所理解的，这些序列也可以用于与本文描述的相反的方向。如本文所述并且对于本文包含CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确鉴定可以根据表1中所示使用的编号略微不同，因此本文包括的不仅是下划线的CDR而且是使用其他编号***在VH和VL域内包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以以scFv形式或Fab形式使用。
图14A-14I描绘选定数量的抗TIM-3抗体的序列。值得注意的是，这些序列基于人IgG1主链生成，具有消融变体(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K,“IgG1_PVA_/S267K”)，但也可以使用其他格式。CDR加下划线。如本文所述并且对于本文包含CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确鉴定可以根据表1中所示使用的编号略微不同，因此本文包括的不仅是下划线的CDR而且是使用其他编号***在VH和VL域内包括的CDR。
图15A-15C描绘选定数量的抗PD-L1抗体的序列。值得注意的是，这些序列基于人IgG1主链生成，具有如本文描绘的消融变体(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K,“IgG1_PVA_/S267K”)，但也可以使用其他格式。CDR加下划线。如本文所述并且对于本文包含CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确鉴定可以根据表1中所示使用的编号略微不同，因此本文包括的不仅是下划线的CDR而且是使用其他编号***在VH和VL域内包括的CDR。
图16描绘了原型抗4-1BB抗体的序列。值得注意的是，这些序列基于人IgG1主链生成，具有消融变体(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K,“IgG1_PVA_/S267K”)，但也可以使用其他格式。CDR加下划线。如本文所述并且对于本文包含CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确鉴定可以根据表1中所示使用的编号略微不同，因此本文包括的不仅是下划线的CDR而且是使用其他编号***在VH和VL域内包括的CDR。
图17描绘了原型抗OX40抗体的序列。值得注意的是，这些序列基于人IgG1主链生成，具有消融变体(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K,“IgG1_PVA_/S267K”)，但也可以使用其他格式。CDR加下划线。如本文所述并且对于本文包含CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确鉴定可以根据表1中所示使用的编号略微不同，因此本文包括的不仅是下划线的CDR而且是使用其他编号***在VH和VL域内包括的CDR。
图18描绘了原型抗GITR抗体的序列。值得注意的是，这些序列基于人IgG1主链生成，具有消融变体(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K,“IgG1_PVA_/S267K”)，但也可以使用其他格式。CDR加下划线。如本文所述并且对于本文包含CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确鉴定可以根据表1中所示使用的编号略微不同，因此本文包括的不仅是下划线的CDR而且是使用其他编号***在VH和VL域内包括的CDR。
图19A-19G描绘了用于原型抗ICOS抗体的序列。值得注意的是，这些序列基于人IgG1主链生成，具有消融变体(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K,“IgG1_PVA_/S267K”)，但也可以使用其他格式。CDR加下划线。如本文所述并且对于本文包含CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确鉴定可以根据表X中所示使用的编号略微不同，因此本文包括的不仅是下划线的CDR而且是使用其他编号***在VH和VL域内包括的CDR。
图20A-20G描绘了用于示例性抗ICOS Fab的序列。CDR加下划线并且斜线(/)表示可变区域的边界。如本文所述并且对于本文包含CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确鉴定可以根据表X中所示使用的编号略微不同，因此本文包括的不仅是下划线的CDR而且是使用其他编号***在VH和VL域内包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以以scFv形式或Fab形式使用。重要的是要注意这些序列是在重链的C-末端使用六组氨酸(His6或HHHHHH)C-末端标签产生的，这些标签已被除去。
图21A-21B描绘熔融温度(TM)和在熔融温度下从亲本Fab(XENP22050)的变化，如通过改造用于稳定性的变体抗ICOS Fab的DSF所确定的。
图22A-22C描绘变体抗ICOS Fab用于人ICOS的鼠Fc融合的平衡解离常数(KD)、缔合速率(ka)以及解离速率(kd)，其在AMC生物传感器上捕获，如用Octet确定的。
图23描绘变体抗ICOS Fab用于人ICOS的生物素化的IgG1 Fc融合的平衡解离常数(KD)、缔合速率(ka)以及解离速率(kd)，其在SA生物传感器上捕获，如用Octet确定的。
图24A-24M描绘了用于示例性抗ICOS scFv的序列。CDR加下划线，scFv接头双下划线(在序列中，scFv接头是带正电荷的scFv(GKPGS)4接头，但是如本领域技术人员所理解的，该接头可以被其他接头取代，包括不带电荷或带负电荷的接头，其中的一些在图24A-24M中描绘)，和斜线(/)指示可变区的边界。命名惯例说明了scFv从N-末端到C-末端的方向；该图中的一些序列定向为VH-scFv接头-VL(从N-末端到C-末端，见图24A-24M)，而一些序列定向为VL-scFv接头-VH(从N-末端到C-末端，见图24B)，尽管如本领域技术人员所理解的，这些序列也可以用于与本文描述的相反的方向。如本文所述并且对于本文包含CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确鉴定可以根据表X中所示使用的编号略微不同，因此本文包括的不仅是下划线的CDR而且是使用其他编号***在VH和VL域内包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以以scFv形式或Fab形式使用。重要的是要注意这些序列是在重链的C-末端使用聚组氨酸(His6或HHHHHH)C-末端标签产生的，这些标签已被除去。
图25描绘熔融温度(TM)和在熔融温度下从亲本scFv(XENP24352；定向为VH-scFv接头-VL，从N-至C-末端)的变化，如通过改造用于稳定性的变体抗ICOS scFvs的DSF所确定的。
图26A-26D描绘了开瓶器格式(Fab-scFv-Fc)中原型抗共刺激x抗检查点抗体的氨基酸序列。首先使用Fab可变区命名抗体，然后使用scFv可变区命名，用短划线分隔，然后是链名称(Fab-Fc重链、scFv-Fc重链或轻链)。CDR加下划线并且斜线表示可变区的边界。scFv结构域具有如所示的VH-scFv接头-VL或VL-scFv接头-VH的不同取向(N-至C-末端)，尽管这可以颠倒。此外，本文概述的每个序列可以在一个或优选两个Fc结构域中包括或不包括M428L/N434S变体，这导致血清中的半衰期更长。
图27描绘在SEB刺激的PBMC测定法中由原型共刺激/检查点开瓶器诱导细胞因子分泌。
图28描绘在天然(非SEB刺激的)和SEB刺激的PBMC中诱导IL-2分泌，然后用所指示的测试物品处理。
图29描绘了与共刺激x检查点阻断双特异性抗体的益处相关的示意图，显示出因为肿瘤的TIL共表达免疫检查点受体和共刺激受体，双特异性抗体增加了特异性，增强了抗肿瘤活性并避免了外周毒性。
图30描绘了与单臂抗PD-1抗体(XENP20111)和单臂抗ICOS抗体(XENP20266)比较，双阳性细胞被示例性抗ICOS X抗PD-1抗体(XENP20896)选择性地占据。
图31A-31B显示在SEB刺激人PBMC后，抗ICOS x抗PD-1双特异性抗体(XENP20896)、单臂抗ICOS抗体(XENP20266)以及单臂抗PD-1抗体(XENP20111)在A)PDB1和ICOS双阳性T细胞及B)PD-1和ICOS双阴性T细胞上的受体占据。
图32A-32D描绘开瓶器形式(Fab-scFv-Fc)的示例性抗ICOS x抗PD-1抗体的氨基酸序列。首先使用Fab可变区命名抗体，然后使用scFv可变区命名，用短划线分隔，然后是链名称(Fab-Fc重链、scFv-Fc重链或轻链)。CDR加下划线并且斜线表示可变区的边界。scFv结构域具有如所示的VH-scFv接头-VL或VL-scFv接头-VH的不同取向(N-至C-末端)，尽管这可以颠倒。此外，本文概述的每个序列可以在一个或优选两个Fc结构域中包括或不包括M428L/N434S变体，这导致血清中的半衰期更长。
图33A-33C描绘开瓶器形式(Fab-scFv-Fc)的示例性抗ICOS x抗PD-1抗体的氨基酸序列，其在一个或优选两个Fc结构域中包括M428L/N434S变体，其导致血清中的半衰期更长。首先使用Fab可变区命名抗体，然后使用scFv可变区命名，用短划线分隔，然后是链名称(Fab-Fc重链、scFv-Fc重链或轻链)。CDR加下划线并且斜线表示可变区的边界。scFv结构域具有如所示的VH-scFv接头-VL或VL-scFv接头-VH的不同取向(N-至C-末端)，尽管这可以颠倒。
图34A-34C描绘变体抗ICOS x抗-PD-1双特异性抗体用于人ICOS的鼠Fc融合的平衡解离常数(KD)、缔合速率(ka)以及解离速率(kd)，其在AMC生物传感器上捕获，如用Octet确定的。
图35描绘变体抗ICOS x抗-PD-1双特异性抗体用于人ICOS的生物素化IgG1 Fc融合的平衡解离常数(KD)、缔合速率(ka)以及解离速率(kd)，其在SA/SAX生物传感器上捕获，如用Octet确定的。
图36A-36B描绘在A)和B)中所描绘的两个单独实验中，在SEB刺激的PBMC测定法中，对人T细胞双特异性的变体抗ICOS x抗PD-1的细胞表面结合。
图37显示在SEB刺激人PBMC后，变体抗ICOS x抗PD-1双特异性抗体、单臂抗ICOS抗体以及单臂抗PD-1抗体(XENP20111)在PD-1和ICOS双阳性T细胞上的受体占据。
图38A-38B显示变体抗ICOS x抗PD-1双特异性抗体促进从SEB刺激的PBMC的A)IL-2和B)IFNγ分泌。
图39A-39B显示变体抗ICOS x抗PD-1双特异性抗体促进从SEB刺激的PBMC的A)IL-2和B)IFNγ分泌。
图40A-40B描绘在移植人PBMC和用所指示的测试物品治疗后在A)第7天和B)第11天在小鼠中的IFNγ的浓度。
图41A-41B描绘在移植人PBMC和用所指示的测试物品治疗后在A)第11天和B)第14天如通过流式细胞术测定的小鼠中CD45+细胞计数。
图42A-42B描绘在移植人PBMC和用所指示的测试物品治疗后在第14天如通过流式细胞术测定的小鼠中A)CD8+T细胞和B)CD4+T细胞计数(**p≤0.01)。
图43描绘了在移植人PBMC和用所指示的测试物品治疗后在第14天小鼠体重的变化(**p≤0.01)。
图44A-44B描绘在移植人PBMC和用所指示的测试物品治疗后在A)第7天和B)第14天在小鼠中IFNγ浓度。
图45描绘在移植人PBMC和用所指示的测试物品治疗后在第14天如通过流式细胞术测定的小鼠中CD45+细胞计数。
图46A-46C描绘在移植人PBMC和用所指示的测试物品治疗后在第14天如通过流式细胞术测定的小鼠中A)CD8+T细胞和B)CD4+T细胞计数。
图47A-47B描绘了在移植人PBMC和用所指示的测试物品治疗后在第12和15天小鼠体重的变化。
图48A-48D描绘具有替代性ICOS ABD的开瓶器形式(Fab-scFv-Fc)的示例性抗ICOS x抗PD-1抗体的氨基酸序列。首先使用Fab可变区命名抗体，然后使用scFv可变区命名，用短划线分隔，然后是链名称(Fab-Fc重链、scFv-Fc重链或轻链)。CDR加下划线并且斜线表示可变区的边界。scFv结构域具有如所示的VH-scFv接头-VL或VL-scFv接头-VH的不同取向(N-至C-末端)，尽管这可以颠倒。此外，本文概述的每个序列可以在一个或优选两个Fc结构域中包括或不包括M428L/N434S变体，这导致血清中的半衰期更长。
图49描绘在人PBMC的SEB刺激和用替代性抗ICOS x抗PD-1双特异性抗体治疗后对于IL-2的细胞因子释放测定。
图50描绘在人PBMC的SEB刺激和用替代性抗ICOS x抗PD-1双特异性抗体治疗后对于IL-2的细胞因子释放测定(相对于二价抗RSV mAb为倍数诱导)。
图51描绘了在用抗ICOS x抗PD-1双特异性抗体治疗后在SEB刺激的纯化CD3+T细胞中的AKT磷酸化。
图52描绘通过NanoString测定的相对于二价抗RSV的诱导，A)IL-17A、B)IL17F、C)IL-22、D)IL-10、E)IL-9和F)IFNγ基因表达由指示的测试物品的倍数诱导。
图53A-53F描绘通过NanoString测定的相对于用二价抗RSV mAb治疗，由指示的测试物品平均倍数诱导选定免疫应答基因的表达。阴影强度对应于倍数变化的幅度。
图54描绘在移植人PBMC和用所指示的测试物品治疗后在第14天如通过流式细胞术测定的小鼠中CD45+细胞计数。
图55A-55D类似于图9和图75，描绘了许多另外形式的“主链”部分(例如没有Fv)的序列，其包括图2F的中心scFv、图2J的中心scFv2形式、图2K的双特异性mAb、图2L的DVD-Ig和图2M的三齿形形式。在图2L中，接头用双下划线显示，其他接头可见于WO2007/024715中，将其全部通过引用在此并入，特别是那些序列。在三齿形形式中，其他三齿形接头和卷曲螺旋序列显示在WO 2015/184203中，将其全部通过引用在此并入，特别是那些序列。如本领域技术人员所理解的，粗体结构域(例如“VH1”、VH2-scFv接头-VL2等)用斜线“/”分开，并且可根据需要包括任选的结构域接头。所有这些主链都利用κ恒定区作为轻链，尽管也可以使用λ链。至于图9和图75，这些主链可以用任何vh和vl结构域进行组合，如本文中所概述的。
图56A-56B描绘开瓶器形式(Fab-scFv-Fc)的示例性抗PD-1x抗ICOS抗体的氨基酸序列。首先使用Fab可变区命名抗体，然后使用scFv可变区命名，用短划线分隔，然后是链名称(Fab-Fc重链、scFv-Fc重链或轻链)。CDR加下划线并且斜线表示可变区的边界。scFv结构域具有如所示的VH-scFv接头-VL或VL-scFv接头-VH的不同取向(N-至C-末端)，尽管这可以颠倒。此外，本文概述的每个序列可以在一个或优选两个Fc结构域中包括或不包括M428L/N434S变体，这导致血清中的半衰期更长。
图57A-57C描绘中心scFv形式的示例性抗PD-1x抗ICOS抗体的氨基酸序列。首先使用第一Fab-Fc可变区命名抗体，然后使用Fab-scFv-Fc可变区命名，用短划线分隔，然后是链名称(Fab-Fc重链、Fab-scFv-Fc重链或轻链)。CDR加下划线并且斜线表示可变区的边界。scFv结构域具有如所示的VH-scFv接头-VL或VL-scFv接头-VH的不同取向(N-至C-末端)，尽管这可以颠倒。此外，本文概述的每个序列可以在一个或优选两个Fc结构域中包括或不包括M428L/N434S变体，这导致血清中的半衰期更长。
图58描绘中心scFv2形式的示例性抗PD-1x抗ICOS抗体的氨基酸序列。首先使用Fab可变区命名抗体，然后使用scFv可变区命名，然后是链名称(重链或轻链)。CDR加下划线并且斜线表示可变区的边界。scFv结构域具有如所示的VH-scFv接头-VL或VL-scFv接头-VH的不同取向(N-至C-末端)，尽管这可以颠倒。此外，本文概述的每个序列可以在一个或优选两个Fc结构域中包括或不包括M428L/N434S变体，这导致血清中的半衰期更长。
图59描绘双特异性mAb形式的示例性抗PD-1x抗ICOS抗体的氨基酸序列。使用用短划线分隔的第一抗原的第一Fab变体区域和第二抗原的第二Fab变体区域命名抗体，然后是链名称(第一抗原的重链1或轻链1和第二抗原的重链2或轻链2)。CDR加下划线并且斜线表示可变区的边界。本文概述的每个序列可以在一个或优选两个Fc结构域中包括或排除M428L/N434S变体，这导致血清中的半衰期更长。
图60描绘DVD-IgG形式的示例性抗PD-1x抗ICOS抗体的氨基酸序列。使用第一抗原的第一可变区和第二抗原的第二Fab可变区命名抗体，然后是链名称(重链或轻链)。CDR加下划线并且斜线表示可变区的边界。本文概述的每个序列可以在一个或优选两个Fc结构域中包括或排除M428L/N434S变体，这导致血清中的半衰期更长。
图61A-61B描绘三齿形形式的示例性抗PD-1x抗ICOS抗体的氨基酸序列。使用由短划线分开的包含DART的第一抗原的VL和VH以及第二抗原的Fab可变区命名抗体，然后是链名称(重链或轻链)。CDR加下划线并且斜线表示可变区的边界。本文概述的每个序列可以在一个或优选两个Fc结构域中包括或排除M428L/N434S变体，这导致血清中的半衰期更长。
图62描绘了在SEB刺激的PBMC测定法中由替代性形式共刺激x检查点阻断双特异性抗体诱导细胞因子分泌(IL-2)。
图63描绘开瓶器形式(Fab-scFv-Fc)的示例性抗ICOS x抗CTLA-4抗体的氨基酸序列。首先使用Fab可变区命名抗体，然后使用scFv可变区命名，用短划线分隔，然后是链名称(Fab-Fc重链、scFv-Fc重链或轻链)。CDR加下划线并且斜线表示可变区的边界。scFv结构域具有如所示的VH-scFv接头-VL或VL-scFv接头-VH的不同取向(N-至C-末端)，尽管这可以颠倒。此外，本文概述的每个序列可以在一个或优选两个Fc结构域中包括或不包括M428L/N434S变体，这导致血清中的半衰期更长。
图64A-64B描绘双特异性mAb形式的示例性抗LAG-3x抗ICOS抗体的氨基酸序列。使用用短划线分隔的第一抗原的第一Fab变体区域和第二抗原的第二Fab变体区域命名抗体，然后是链名称(第一抗原的重链1或轻链1和第二抗原的重链2或轻链2)。CDR加下划线并且斜线表示可变区的边界。本文概述的每个序列可以在一个或优选两个Fc结构域中包括或排除M428L/N434S变体，这导致血清中的半衰期更长。
图65描绘双特异性mAb形式的示例性抗TIM-3x抗ICOS抗体的氨基酸序列。使用用短划线分隔的第一抗原的第一Fab变体区域和第二抗原的第二Fab变体区域命名抗体，然后是链名称(第一抗原的重链1或轻链1和第二抗原的重链2或轻链2)。CDR加下划线并且斜线表示可变区的边界。本文概述的每个序列可以在一个或优选两个Fc结构域中包括或排除M428L/N434S变体，这导致血清中的半衰期更长。
图66A-66C描绘开瓶器形式(Fab-scFv-Fc)和中心-scFv2形式的抗ICOS x抗PD-L1抗体的氨基酸序列。首先使用Fab可变区命名开瓶器，然后使用scFv可变区命名，用短划线分隔，然后是链名称(Fab-Fc重链、scFv-Fc重链或轻链)。首先使用Fab可变区，然后使用scFv可变区，然后是链名称(重链或轻链)，命名中心-scFv2。CDR加下划线并且斜线表示可变区的边界。CDR加下划线并且斜线表示可变区的边界。scFv结构域具有如所示的VH-scFv接头-VL或VL-scFv接头-VH的不同取向(N-至C-末端)，尽管这可以颠倒。此外，本文概述的每个序列可以在一个或优选两个Fc结构域中包括或不包括M428L/N434S变体，这导致血清中的半衰期更长。
图67描绘了在SEB刺激的PBMC测定法中由另外的共刺激x检查点阻断双特异性抗体诱导细胞因子分泌(IL-2)。
图68A-68G描绘了示例性单臂抗ICOS Fab-Fc抗体的氨基酸序列。CDR加下划线并且斜线表示可变区的边界。这些被称为“单臂”或“单臂的”形式，因为一个氨基酸链仅是Fc结构域，另一侧是抗-ICOS Fab侧。Fc结构域包含S364K/E357Q偏斜变体，以及图68A-68G中描绘的pI(-)_等构_A变体。Fab Fc结构域含有L368D/K370S偏斜变体以及图68A-68G中描绘的pI ISO(+RR)变体。两个Fc结构域均包括消融变体(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K)。
图69描绘变体单臂抗ICOS Fab-Fc抗体用于人ICOS的鼠Fc融合的平衡解离常数(KD)、缔合速率(ka)以及解离速率(kd)，其在AMC生物传感器上捕获，如用Octet确定的。
图70描绘了在用二价和单价抗PD-1抗体以及抗ICOS x抗PD-1双特异性抗体治疗后在SEB刺激的纯化CD3+T细胞中的AKT磷酸化。
图71描绘了在用具有替代性抗ICOS ABD的单价抗ICOS Fab-Fc抗体治疗后在纯化CD3+T细胞中的AKT磷酸化。
图72A-72C描绘一些原型双特异性抗体(OX40 X PD-1、GITR X PD-1、4-1BB X PD-1、CTLA-4X ICOS)。
图73A-73H描绘一些原型mAb(4-1BB、OX40、GITR、ICOS、PD-L1和PD-1)，其Fvs可以与本发明的其它Fvs组合使用并且以任何形式(开瓶器、mAb-Fv、mAb-scFv、中心scFv、双特异性mAb、中心-Fv、单臂中心-scFv、单臂scFv-mAb、双重scFv、DVD-Ig或三齿形)。还显示了一些额外的ICOS X PD-L1开瓶器序列。
图74A-74F描绘附加PD-1X ICOS开瓶器，在某些情况下其中PD-1Fv为Fab形式和ICOS Fv以scFv形式，在其它情况中相反。
图75A到75D显示了向其中添加本发明Fv序列的在本发明中使用的mAb-scFv主链的序列。mAb-scFv主链1基于人IgG1(356E/358M同种异型)，包括S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体、Fab侧的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链2基于人IgG1(356D/358L同种异型)，包括S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体、Fab侧的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链3基于人IgG1(356E/358M同种异型)，包括S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体、Fab侧的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421DpI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体以及两条链上的N297A变体。除了突变是N297S之外，主链4与3相同。mAb-scFv主链3和4的替代形式可以不含两个链中的消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。主链5基于人IgG4，包括S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体、Fab侧的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和在两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体，以及两条链上的S228P(EU编号，这是Kabat中的S241P)变体，其如本领域已知的消融了Fab臂交换。主链6基于人IgG2，并且包括S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体，Fab侧的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体。主链7基于人IgG2，并且包括S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体，Fab侧的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的S267K变体。
如本领域技术人员所理解和下面概述的，这些序列可与本文概述的任何vh和vl对一起使用，其中一种单体包括Fab和scFv(任选地包括带电荷的scFv接头)和其他单体包含Fab序列(例如，连接到“Fab侧重链”的vh和连接到“恒定轻链”的vl)。也就是说，本文概述的抗-CTLA-4、抗-PD-1、抗-LAG-3、抗-TIM-3、抗-TIGIT、抗-BTLA、抗-ICOS、抗-GITR、抗-OX40和抗-4-1BB的任何Fv序列，无论是作为scFv(再次，任选地带电荷的scFv接头)或作为Fab，可以以任何组合掺入该图75A-75D主链中。单体1侧是Fab-scFv pI阴性侧，并且包括异二聚变体L368D/K370S、等构pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，(所有相对于IgG1)。单体2侧是scFv pI阳性侧，并包括异二聚变体364K/E357Q。然而，其他偏斜变体对可以被替代，特别是[S364K/E357Q：L368D/K370S]；[L368D/K370S：S364K]；[L368E/K370S：S364K]；[T411T/E360E/Q362E：D401K]；[L368D/K370S：S364K/E357L]、[K370S：S364K/E357Q]、[T366S/L368A/Y407V：T366W]和[T366S/L368A/Y407V/Y394C：T366W/S354C]。
图75A描绘的恒定轻链可用于所有在该图中的构建体，虽然κ恒定轻链也可以被取代。
应当注意，这些mAb-scFv主链可用于图1的mAb-Fv形式(其中一个单体在C-末端包含vl，另一个在C-末端包含vh)以及scFv-mAb形式(将scFv结构域添加到一个单体的C末端)。
在这些主链的每一个内包括与所述序列90％、95％、98％和99％相同的(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代的序列(与图的“亲本”相比，如本领域技术人员所理解的，与亲本人IgG1(或IgG2或IgG4，这取决于主链)相比，其已含有许多氨基酸修饰)。也就是说，除了包含在该图的主链内的偏斜、pI和消融变体之外，所述主链还可以包含额外的氨基酸修饰(通常是氨基酸取代)。
图76A-76F描绘了结合人PD-1的Fv的许多现有技术序列作为vh和vl序列。如本领域技术人员所理解的，这些Fv中的任何一种可以与结合共刺激受体(例如ICOS、GITR、OX40或4-1BB，包括本文包含的Fv序列)的Fv组合并以任何形式(开瓶器、mAb-Fv、mAb-scFv、中心-scFv、双特异性mAb、中心-Fv、单臂中心-scFv、单臂scFv-mAb、双scFv、DVD-Ig或三齿形)。特别是它们可以与ICOS]_H0L0和[ICOS]H0.66_L0 ABD组合使用。
图77A-77B描绘了结合人ICOS的Fv的许多现有技术序列作为vh和vl序列。如本领域技术人员所理解的，这些Fv中的任何一种可以与结合共刺激受体(例如PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT和BTLA，包括本文包含的Fv序列)的Fv组合并以任何形式(开瓶器、mAb-Fv、mAb-scFv、中心-scFv、双特异性mAb、中心-Fv、单臂中心-scFv、单臂scFv-mAb、双scFv、DVD-Ig或三齿形)。特别地，它们可以与具有标识符1G6_H1.279_L1.194；1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279；1G6_L1.210_H1.288；和2E9_H1L1的PD-1ABD组合。
图78A-78J描绘了结合人PD-L1的Fv的许多现有技术序列作为vh和vl序列。如本领域技术人员所理解的，这些Fv中的任何一种可以与结合共刺激受体(例如ICOS、GITR、OX40或4-1BB，包括本文包含的Fv序列)的Fv组合并以任何形式(开瓶器、mAb-Fv、mAb-scFv、中心-scFv、双特异性mAb、中心-Fv、单臂中心-scFv、单臂scFv-mAb、双scFv、DVD-Ig或三齿形)。特别是它们可以与ICOS]_H0L0和[ICOS]H0.66_L0 ABD组合使用。
图79A-79B描绘了结合人CTLA-4的Fv的许多现有技术序列作为vh和vl序列。如本领域技术人员所理解的，这些Fv中的任何一种可以与结合共刺激受体(例如ICOS、GITR、OX40或4-1BB，包括本文包含的Fv序列)的Fv组合并以任何形式(开瓶器、mAb-Fv、mAb-scFv、中心-scFv、双特异性mAb、中心-Fv、单臂中心-scFv、单臂scFv-mAb、双scFv、DVD-Ig或三齿形)。特别是它们可以与ICOS]_H0L0和[ICOS]H0.66_L0 ABD组合使用。
图80A-80C描绘了结合人LAG-3的Fv的许多现有技术序列作为vh和vl序列。如本领域技术人员所理解的，这些Fv中的任何一种可以与结合共刺激受体(例如ICOS、GITR、OX40或4-1BB，包括本文包含的Fv序列)的Fv组合并以任何形式(开瓶器、mAb-Fv、mAb-scFv、中心-scFv、双特异性mAb、中心-Fv、单臂中心-scFv、单臂scFv-mAb、双scFv、DVD-Ig或三齿形)。特别是它们可以与ICOS]_H0L0和[ICOS]H0.66_L0 ABD组合使用。
图81A-81C描绘了结合人TIM-3的Fv的许多现有技术序列作为vh和vl序列。如本领域技术人员所理解的，这些Fv中的任何一种可以与结合共刺激受体(例如ICOS、GITR、OX40或4-1BB，包括本文包含的Fv序列)的Fv组合并以任何形式(开瓶器、mAb-Fv、mAb-scFv、中心-scFv、双特异性mAb、中心-Fv、单臂中心-scFv、单臂scFv-mAb、双scFv、DVD-Ig或三齿形)。特别是它们可以与ICOS]_H0L0和[ICOS]H0.66_L0 ABD组合使用。
图82描绘了结合人BTLA的Fv的许多现有技术序列作为vh和vl序列。如本领域技术人员所理解的，这些Fv中的任何一种可以与结合共刺激受体(例如ICOS、GITR、OX40或4-1BB，包括本文包含的Fv序列)的Fv组合并以任何形式(开瓶器、mAb-Fv、mAb-scFv、中心-scFv、双特异性mAb、中心-Fv、单臂中心-scFv、单臂scFv-mAb、双scFv、DVD-Ig或三齿形)。特别是它们可以与ICOS]_H0L0和[ICOS]H0.66_L0 ABD组合使用。
图83A-83D描绘了结合人TIGIT的Fv的许多现有技术序列作为vh和vl序列。如本领域技术人员所理解的，这些Fv中的任何一种可以与结合共刺激受体(例如ICOS、GITR、OX40或4-1BB，包括本文包含的Fv序列)的Fv组合并以任何形式(开瓶器、mAb-Fv、mAb-scFv、中心-scFv、双特异性mAb、中心-Fv、单臂中心-scFv、单臂scFv-mAb、双scFv、DVD-Ig或三齿形)。特别是它们可以与ICOS]_H0L0和[ICOS]H0.66_L0 ABD组合使用。
图84A至84C描绘了许多BTLA ABDS，其中另外的抗BTLA ABD被列为SEQ ID NO：3705-3736。CDR加下划线，scFv接头双下划线(在序列中，scFv接头是带正电荷的scFv(GKPGS)4接头，但是如本领域技术人员所理解的，该接头可以被其他接头取代，包括不带电荷或带负电荷的接头，其中的一些在图8A-8B中描绘)，和斜线指示可变结构域的边界。如上所述，命名惯例说明了scFv从N-末端到C-末端的方向；在该图中列出的序列中，它们全部定向为vh-scFv接头-v1(从N-末端到C-末端)，尽管这些序列也可以以相反的方向使用，(从N-末端到C-末端)vl-接头-vh。如本文所述并且对于本文包含CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确鉴定可以根据表1中所示使用的编号略微不同，因此本文包括的不仅是下划线的CDR而且是使用其他编号***在vh和vl域内包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些vh和vl序列可以以scFv形式或Fab形式使用。
图85是共刺激和检查点ABD的可能组合的矩阵，具有可能的所有可能的组合。框中的“A”表示PD-1ABD为1G6_L1.194_H1.279。框中的“B”表示ICOS ABD为[ICOS]H.066_L0。框中的“C”表示PD-1是该对中的scFv。框中的“D”表示CTLA-4ABD是Fab并且是[CTLA-4]_H3_L0.22。框中的“E”表示CTLA-4ABD是scFv并且是[CTLA-4]_H3.23_L0.22。框中的“F”表示LAG-3ABD为7G8_H3.30_L1.34。框中的“G”表示BTLA ABD为9C6_H1.1_L1。框中的“H”表示组合是开瓶器。框中的“I”表示组合是中心-scFv形式。
图86描绘了两个更多ICOS X PD-1开瓶器。
具体实施方式
I.命名法
本发明的双特异性抗体以几种不同的形式列出。给予每种多肽独特的“XENP”编号，尽管如本领域所理解的，较长的序列可能包含较短的序列。例如，给定序列的开瓶器形式的scFv侧单体的重链将具有第一个XENP编号，而scFv结构域将具有不同的XENP编号。一些分子具有三个多肽，因此使用具有组分的XENP编号作为名称。因此，开瓶器形式的分子XENP包含三个序列，通常称为“XENP23104-HC-Fab”、XENP23104 HC-scFv”和“XENP23104LC”或等同物，但本领域技术人员将能够通过序列比对容易识别这些。这些XENP编号在序列表中以及标识符中，并在图中使用。另外，包含三种组分的一种分子产生多个序列标识符。例如，Fab单体的列表具有全长序列、可变重链序列和可变重链序列的三个CDR；轻链具有全长序列、可变轻序列和可变轻序列的三个CDR；scFv-Fc结构域具有全长序列、scFv序列、可变轻链序列、3个轻CDR、scFv接头、可变重链序列和3个重CDR；注意，本文中具有scFv结构域的所有分子都使用单个带电荷的scFv接头(+H)，但也可以使用其他。此外，特定可变结构域的命名法使用“Hx.xx_Ly.yy”类型的格式，其中数字是特定可变链序列的唯一标识符。因此，XENP23104(其结合PD-1)的scFv侧的可变结构域是“1G6_L1.194_H1.279”，这表示可变重结构域H1.279与轻结构域L1.194组合。在这些序列用作scFv的情况下，名称“1G6_L1.194_H1.279”表示可变重结构域H1.279与轻结构域L1.194组合并且从N-到C-末端处于v1-接头-vh方向。具有相同重链和轻链可变结构域序列但具有相反顺序的该分子将命名为“1G6_H1.279_L1.194”。类似地，不同的构建体可以“混合和匹配”重链和轻链，如从序列表和附图中显而易见的。
II.材料的并入
A.附图和图例
通过引用具体地并入的是来自USSN 62/479,723的附图、图例和序列以及来自USSN 15/623,314的附图、图例和序列。此外，还特别并入USSN 62/479,723的权利要求。
B.序列
靶抗原：人PD-1(sp|Q15116)的序列是SEQ ID NO：26226。人PD-1，细胞外结构域(sp|Q15116|21-170)的序列是SEQ ID NO：26227。食蟹猴(Macaca fascicularis)PD-1(tr|B0LAJ3)的序列是SEQ ID NO：26228。食蟹猴PD-1，细胞外结构域(预测的)(tr|B0LAJ3|21-170)的序列是SEQ ID NO：26229。人CTLA-4(sp|P16410)的序列是SEQ ID NO：26230。人CTLA-4，细胞外结构域(sp|P16410|36-161)的序列是SEQ ID NO：26231。食蟹猴CTLA-4(tr|G7PL88)的序列是SEQ ID NO：26232。食蟹猴CTLA-4，细胞外结构域(预测的)(tr|G7PL88)的序列是SEQ ID NO：26233。人LAG-3(sp|P18627)的序列是SEQ ID NO：26234。人LAG-3，细胞外结构域(sp|P18627|29-450)的序列是SEQ ID NO：26235。食蟹猴LAG-3(预测的)(gi|544467815|ref|XP_005570011.1)的序列是SEQ ID NO：26236。食蟹猴LAG-3，细胞外结构域(预测的)(gi|544467815|ref|XP_005570011.1|29-450)的序列是SEQ ID NO：26237。人TIM-3(sp|Q8TDQ0)的序列是SEQ ID NO：26238。人TIM-3，细胞外结构域(sp|Q8TDQ0|22-202)的序列是SEQ ID NO：26239。食蟹猴TIM-3(预测的)(gi|355750365|gb|EHH54703.1)的序列是SEQ ID NO：26240。食蟹猴TIM-3，细胞外结构域(预测的)(gi|355750365|gb|EHH54703.1|22-203)的序列是SEQ ID NO：26241。人PD-L1(sp|Q9NZQ7)的序列是SEQ IDNO：26242。人PD-L1，细胞外结构域(sp|Q9NZQ7|19-238)的序列是SEQ ID NO：26243。食蟹猴PD-L1(预测的)(gb|XP_005581836.1)的序列是SEQ ID NO：26244。食蟹猴PD-L1，细胞外结构域(预测的)(gb|XP_005581836.1|19-238)的序列是SEQ ID NO：26245。人ICOS(sp|Q9Y6W8)的序列是SEQ ID NO：26246。人ICOS，细胞外结构域(sp|Q9Y6W8|21-140)的序列是SEQ ID NO：26247。食蟹猴ICOS(gi|544477053|ref|XP_005574075.1)的序列是SEQ ID NO：26248。食蟹猴ICOS，细胞外结构域(预测的)(gi|544477053|ref|XP_005574075.1|21-140)的序列是SEQ ID NO：26249。人GITR(sp|Q9Y5U5)的序列是SEQ ID NO：26250。人GITR，细胞外结构域(sp|Q9Y5U5|26-162)的序列是SEQ ID NO：26251。食蟹猴GITR(预测)(ref|XP_005545180.1)的序列是SEQ ID NO：26252。食蟹猴GITR，细胞外结构域(预测的)(ref|XP_005545180.1|26-162)的序列是SEQ ID NO：26253。人OX40(sp|P43489)的序列是SEQ IDNO：26254。人OX40，细胞外结构域(sp|P43489|29-214)的序列是SEQ ID NO：26255。食蟹猴OX40(预测的)(ref|XP_005545179.1)的序列是SEQ ID NO：26256。食蟹猴OX40，细胞外结构域(预测的)(ref|XP_005545179.1|29-214)的序列是SEQ ID NO：26257。人4-1BB(sp|Q07011)的序列是SEQ ID NO：26258。人4-1BB，细胞外结构域(sp|Q07011|24-186)的序列是SEQ ID NO：26259。食蟹猴4-1BB(预测的)(ref|XP_005544945.1)的序列是SEQ ID NO：26260。食蟹猴4-1BB，细胞外结构域(预测的)(ref|XP_005544945.1|24-186)的序列是SEQID NO：26261。
ICOS结合结构域：除了图19、图20A-20G和图24中所示的序列外，SEQ ID NO：27869-28086还含有许多ICOS Fab序列(重链VH1-CH1和轻链VL1-CL)，如命名法所示。对于CDR和对于可变连接之间的连接的参考显示在USSN 62/479,723的图40中(通过引用以及图例并入本文)，尽管从SEQ列表中，本领域技术人员将能够确定CDR(参见表1的编号和/或通过序列比对)以及连接(例如重链CH1通常以序列“ASTK...”开始和轻链恒定结构域通常以“RTVA...”开始。SEQ ID NO：28087-28269显示“单臂mAb”的三个序列(图2N；Fab-Fc、仅Fc和轻链)，如命名法所示。对于CDR和对于可变连接之间的连接的参考显示在USSN 62/479,723的图41中(通过引用以及图例并入本文)，尽管从SEQ列表中，本领域技术人员将能够确定CDR(参见表1的编号和/或通过序列比对)以及连接(例如重链CH1通常以序列“ASTK...”开始和轻链恒定结构域通常以“RTVA...”开始。另外的单臂ICOS分子示于图68A-68G。SEQ IDNO：28549-28556显示了一些对照抗体(HC和LC)，其中Fv也可以用作ICOS ABD；对于CDR和对于可变连接之间的连接的参考显示在USSN 62/479,723的图44中(通过引用以及图例并入本文)，尽管从SEQ列表中，本领域技术人员将能够确定CDR(参见表1的编号和/或通过序列比对)以及连接(例如重链CH1通常以序列“ASTK...”开始和轻链恒定结构域通常以“RTVA...”开始。SEQ ID NO：28557-28665显示了一些可在本发明中组合使用的ICOS scFv；对于CDR和对于可变连接之间的连接的参考显示在USSN 62/479,723的图45中(通过引用以及图例并入本文)，尽管从SEQ列表中，本领域技术人员将能够确定CDR(参见表1的编号和/或通过序列比对)以及连接，因为scFv利用vh和v1结构域之间的带电荷接头(GKPGS)4。因此，与检查点受体的ABD组合使用的合适的ICOS ABD示于图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665以及[ICOS]_H0.66_L0和[ICOS]_H0_L0。
此外，合适的ICOS X PD-1开瓶器序列包括在图3中的那些以及在SEQ ID NO：28270-28548中的那些，其对应于在USSN 62/479,723的图42和43中所描绘的序列(两者都在此通过引用并入以及其中的图例和序列)，再次使用这些图来显示CDR、连接点等。
III.概述
针对免疫的免疫调节抑制剂如PD-1的治疗性抗体在临床上用于治疗癌症的有限环境中显示出巨大的希望。癌症可以被认为是患者无法识别和消除癌细胞。在许多情况下，这些转化的(例如癌性)细胞抵消免疫监视。存在限制体内T细胞活化的自然控制机制以防止无限制的T细胞活性，其可被癌细胞利用以逃避或抑制免疫反应。恢复免疫效应细胞(尤其是T细胞)识别和消除癌症的能力是免疫疗法的目标。免疫肿瘤学领域，有时被称为“免疫疗法”，正在迅速发展，最近批准了T细胞检查点抑制性抗体，如Yervoy、Keytruda和Opdivo。这些抗体通常被称为“检查点抑制剂”，因为它们阻断T细胞免疫的正常负调节因子。通常理解的是，共刺激和共抑制的各种免疫调节信号可用于协调最佳抗原特异性免疫反应。
检查抑制剂单克隆抗体结合免疫调节抑制剂，例如PD-1，其在正常情况下预防或抑制细胞毒性T细胞(CTL)的活化。通过抑制免疫调节蛋白，例如通过使用结合这些蛋白质的抗体，可以实现针对肿瘤的T细胞反应增加。也就是说，这些癌症免疫调节蛋白抑制免疫反应；当例如使用针对免疫调节蛋白的抗体阻断蛋白质时，免疫***被活化，产生免疫刺激，从而治疗如癌症和传染病的病况。针对PD-1蛋白或其结合配偶体PD-L1的抗体导致T细胞活化。
目前利用患者的免疫***对抗疾病的另一个感兴趣领域涉及使用与共刺激蛋白如ICOS(诱导性T细胞共刺激蛋白(Inducible T cell Co-Stimulator)，也称为CD278)结合的激动性抗体共刺激T细胞，ICOS增加了阳性信号，以克服T细胞上免疫检查点蛋白的阴性信号。ICOS是I型跨膜蛋白，其包含细胞外(Ig)V样结构域，并且充当B7h共刺激分子的受体。
最近的工作表明，一些肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)共表达PD-1和ICOS(参见Gros，J.Clinical Invest.124(5):2246(2014))。
可以同时结合两种不同靶标的双特异性抗体提供了提高靶向TIL相对于外周T细胞的选择性的潜力，同时还降低了治疗成本。在一些情况下，抗体与细胞表面上的两个靶标的二价相互作用应当导致相对于一次与一个靶标的单价相互作用更高的结合亲合力。因此，正常的二价抗体倾向于对细胞表面上的其靶标具有高亲合力。对于双特异性抗体，存在对同时表达两种不同靶标的细胞产生更高选择性的潜力，其利用同时结合两种靶标所提供的更高的亲合力。
因此，本发明提供双特异性免疫调节抗体，其结合表达两种抗原的细胞，和激活T细胞和/或NK细胞以治疗疾病诸如癌症和感染性疾病以及其中免疫活性增加导致治疗的其他病症的方法。
因此，在某些情况下，本发明涉及通过提供与单个细胞上的两种不同免疫调节分子(一种是检查点受体和另一种是共刺激受体)结合的双特异性抗体并且有利地仅需要施用一种治疗物质来解决施用多种抗体的毒性和费用问题。
双特异性抗体提供了将免疫的免疫调节阻断与共刺激结合在一个分子中的机会。然而，并不明显的是免疫的免疫调节加共刺激蛋白的什么组合或什么结合化学计量(单价+单价、单价+二价等)将是有效的。在这里，我们鉴定单价结合共刺激蛋白(如ICOS)和单价结合检查点受体(如PD-1)能够诱导强大的T细胞活化的双特异性抗体。
令人惊讶的是，尽管传统观点认为单价抗体不会产生激动作用，但本工作显示ICOS受体与本发明的单价双特异性抗体激动作用的意外结果。参见Merchant等，PNAS2013年7月23日E2987-E2996，“[w]hile initial screening of bivalent antibodiesproduced agonists of MET,engineering theminto monovalent antibodies producesantagonists instead”。与ICOS仅单价结合的这种阳性结果是出乎意料的，因为认为至少与共刺激蛋白的二价结合对于在细胞表面上提供所需水平的受体聚集以触发信号传导是必需的。如Fos等人J.Immunol.2008:1969-1977所示，ICOS连接诱导AKT磷酸化。这里的研究使用AKT磷酸化作为ICOS激动作用的指示，并且对于“单臂ICOS”(参见实施例5A(a))和对于单价结合ICOS的双特异性抗体都观察到这种效应。如实施例7和图70所示，仅与ICOS单价结合的单臂XENP20266比XENP16435促进更多的AKT磷酸化，XENP16435二价结合ICOS(例如作为传统的mAb)。
因此，本发明涉及新的构建体，以提供异二聚体双特异性抗体，其允许结合检查点受体以及人ICOS。
注意，通常这些双特异性抗体被命名为“抗-PD-1X抗-ICOS”，或者通常简单地或容易地(并因此可互换地)作为每对的“PD-1X ICOS”等。
本发明的异二聚体双特异性免疫调节抗体可用于治疗多种类型的癌症。如本领域技术人员所理解的，与结合肿瘤抗原的传统单克隆抗体或与结合例如CD3和肿瘤抗原的新型双特异性抗体(举例而言，如USSN 15/141,350中所述)相反，免疫调节抗体用于增加免疫应答，但在其作用中通常不具有肿瘤特异性。也就是说，本发明的双特异性免疫调节抗体抑制免疫***的抑制，通常导致T细胞活化，这进而导致对癌细胞的更大免疫应答并因此导致治疗。
如下所述，有多种方法可以测量T细胞活化。双特异性免疫调节抗体对NK和T细胞的功能效应可以通过测量以下参数的变化来体外评估(并且在一些情况下在体内，如下文更全面描述的)：增殖、细胞因子释放和细胞表面标志物。对于NK细胞，细胞增殖、细胞毒性(通过增加CD107a、颗粒酶和穿孔素表达，或通过直接测量靶细胞杀伤测定的杀死靶细胞的能力)、细胞因子产生(例如IFN-γ和TNF)和细胞表面受体表达(例如CD25)的增加指示免疫调节，例如增强的癌细胞杀伤。对于T细胞，增殖增加、细胞表面活化标志物(例如CD25、CD69、CD137和PD1)的表达增加、细胞毒性(杀死靶细胞的能力)和细胞因子产生(例如IL-2、IL-4、IL-6、IFN、TNF-α、IL-10、IL-17A)指示免疫调节，例如增强的癌细胞杀伤。因此，可以使用评估以下中的一个或多个的分析来评定治疗：(i)免疫反应的增加；(ii)αβ和/或γδT细胞活化的增加；(iii)细胞毒性T细胞活性的增加；(iv)NK和/或NKT细胞活性的增加；(v)αβ和/或γδT细胞抑制的缓解；(vi)促炎性细胞因子分泌的增加；(vii)IL-2分泌的增加；(viii)干扰素-γ产生的增加；(ix)Th1反应的增加；(x)Th2反应的减少；(xi)减少或消除调节性T细胞中的至少一种的细胞数量和/或活性，(xii)IL-2分泌的增加。
因此，在一些实施方案中，本发明提供双特异性免疫调节抗体在有需要的受试者中进行以下一种或多种的用途：(a)上调促炎细胞因子；(b)增加T细胞增殖和/或扩张；(c)增加T细胞的干扰素-γ或TNF-α产生；(d)增加IL-2分泌；(e)刺激抗体反应；(f)抑制癌细胞生长；(g)促进抗原特异性T细胞免疫；(h)促进CD4+和/或CD8+T细胞活化；(i)减轻T细胞抑制；(j)促进NK细胞活动；(k)促进癌细胞的凋亡或裂解；和/或(l)对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制作用。
因此，本发明提供双特异性免疫调节抗体。有许多可以在本发明中使用的形式，如一般地在图2中所示，其中许多是异二聚体的(虽然不是全部，举例而言，如DVD-Ig)。
异二聚体抗体构建体基于抗体重链的两个Fc结构域例如组装成“二聚体”的两个“单体”的自组装性质。异二聚体抗体通过改变每种单体的氨基酸序列来制备，如下面更充分讨论的。因此，本发明一般涉及异二聚体抗体的产生，其可以以几种方式共同接合两种抗原，这依赖于每条链上不同的恒定区中的氨基酸变体，以促进异二聚体形成和/或允许异二聚体比同型二聚体易于纯化。
因此，本发明提供了双特异性免疫调节抗体。抗体技术中持续存在的问题是需要同时结合两种(或更多种)不同抗原的“双特异性”抗体，因此通常允许不同的抗原接近并产生新的功能和新疗法。通常，通过将每条重链和轻链的基因包括在宿主细胞中来制备这些抗体(通常，在本发明中，本文所述的两种重链单体和一轻链的基因)。这通常导致形成所需的异二聚体(A-B)，以及两个同型二聚体(A-A和B-B)。然而，双特异性抗体形成的主要障碍是难以从同型二聚体抗体中纯化异二聚体抗体和/或比起同型二聚体的形成偏向异二聚体的形成。
为了解决该问题，存在许多可用于产生本发明的异二聚体的机制。另外，如本领域技术人员所理解的，可以组合这些机制以确保高异二聚化。因此，导致产生异二聚体抗体的氨基酸变体被称为“异二聚化变体”。如下所述，异二聚化变体可包括空间变体(例如下文所述的“杵和臼”或“偏斜”变体和下文描述的“电荷对”变体)以及允许从异二聚体中纯化同型二聚体的“pI变体”。
还可以任选地使用一种机制，在本领域通常称为“杵和臼”(“KIH”)或有时在本文中称为“偏斜”变体，指的是产生空间影响以利于异二聚体形成和不利于同型二聚体形成的氨基酸工程；这有时被称为“杵和臼”；如Ridgway等，Protein Engineering 9(7)：617(1996)；Atwell等，J.Mol.Biol.1997270：26；美国专利8,216,805、US2012/0149876中所述，所有这些均通过引用整体并入本文。附图标识了许多“单体A-单体B”对，其包括“杵和臼”氨基酸取代。另外，如Merchant等人，Nature Biotech.16：677(1998)中所述，这些“杵和臼”突变可以与二硫键结合以使形成偏向异二聚化。在本发明中使用的是与T366W配对的T366S/L368A/Y407V，以及具有桥接二硫化物的该变体，T366S/L368A/Y407V/Y349C与T366W/S354C配对，特别是与包括pI变体的其他异二聚体变体组合，如下面概述的。
可用于产生异二聚体抗体的另一种机制有时被称为“静电转向”或“电荷对”，如Gunasekaran等，J.Biol.Chem.285(25)：19637(2010)中所述，其全部内容通过引用并入本文。这有时在本文中称为“电荷对”。在该实施方案中，静电用于使形成偏向异二聚化。如本领域技术人员所理解的，这些也可能对pI有影响，因此对纯化也有影响，并因此在某些情况下也可以认为是pI变体。然而，由于产生这些以强制异二聚化并且不用作纯化工具，因此它们被归类为“空间变体”。这些包括但不限于D221E/P228E/L368E与D221R/P228R/K409R配对(例如这些是“单体对应组”)和C220E/P228E/368E配对C220R/E224R/P228R/K409R以及图中显示的其他。
在本发明中，在一些实施方案中，pI变体用于改变一种或两种单体的pI，从而允许A-A、A-B和B-B二聚体蛋白的等电纯化。
在本发明中，有几种基本机制可以导致易于纯化异二聚体蛋白质；一种机制依赖于pI变体的使用，使得每种单体具有不同的pI，因此允许A-A、A-B和B-B二聚体蛋白的等电纯化。或者，一些支架形式，例如“三F”或“开瓶器”形式，也允许基于尺寸进行分离。如下面进一步概述的，还可以“偏斜”异二聚体相对于同型二聚体的形成。因此，空间异二聚化变体和pI或电荷对变体的组合在本发明中特别有用。另外，如下文更全面概述的，利用scFv(例如三F形式)的支架可包括带电荷的scFv接头(阳性或阴性)，其为纯化目的提供进一步的pI加强。如本领域技术人员所理解的，一些三F形式仅对带电荷的scFv接头有用且没有额外的pI调节，尽管本发明确实还提供了带有带电荷的scFv接头的偏斜变体的用途(以及本文讨论的Fc、FcRn和KO变体的组合)。
在利用pI作为分离机制以允许异二聚体蛋白质的纯化的本发明中，可以将氨基酸变体引入一种或两种单体多肽中；也就是说，其中一种单体(本文简称为“单体A”)的pI可以设计远离单体B，或者单体A和B都改变，单体A的pI增加，单体B的pI减少。如下面更全面地概述的，可以通过去除或添加带电荷残基(例如，中性氨基酸被带正电荷或带负电荷的氨基酸残基代替，例如甘氨酸至谷氨酸)、将带电荷残基从正或负变为相反电荷(天冬氨酸至赖氨酸)或将带电荷残基改变为中性残基(例如电荷丢失；赖氨酸变为丝氨酸)，进行任一种或两种单体的pI变化。许多这些变体显示在图中。此外，用于产生本文异二聚体抗体的合适的pI变体是同种型的那些，例如从不同IgG同种型中导入pI变体，使得pI在不引入显著免疫原性的情况下改变；参见美国公开号20140288275的图29，其全部内容通过引用并入本文。
因此，在本发明的该实施方案中，提供在至少一种单体中产生足够的pI变化，使得异二聚体可以与同型二聚体分离。如本领域技术人员所理解的，并且如下文进一步讨论的，这可以通过使用“野生型”重链恒定区和已经改造以增加或降低其pI的变体区域(wt A-+B或wt A--B)或通过增加一个区域并减少其他区域(A+-B-或A-B+)来完成。
因此，通常，本发明的一些实施方案的组分是抗体恒定区中的氨基酸变体，其旨在改变二聚体蛋白的至少一种(如果不是两种)单体的等电点(pI)，以通过将氨基酸取代(“pI变体”或“pI取代”)掺入一种或两种单体中形成“pI异二聚体”(当蛋白质是抗体时，这些被称为“pI抗体”)。如本文所示，如果两种单体的pI差别小至0.1pH单位，则可以实现异二聚体与两种同型二聚体的分离，其中0.2、0.3、0.4和0.5或更高都可用于本发明。
如本领域技术人员所理解的，为了获得良好分离而包含在每种或两种单体上的pI变体的数量将部分取决于感兴趣的scFv和Fab的起始pI。也就是说，为了确定要设计哪种单体或在哪种“方向”(例如更正或更负)，计算两种靶抗原的Fv序列并由那里做出决定。如本领域所知，不同的Fv将具有在本发明中利用的不同起始pI。通常，如本文所概述的，pI被设计成导致每种单体的总pI差异为至少约0.1log，优选0.2至0.5，如本文所述。此外，如本领域技术人员所理解和本文概述的，在一些情况下(取决于形式)，可以基于大小(例如分子量)将异二聚体与同型二聚体分离。例如，如在图2的一些实施方案中所示，一些形式导致不同尺寸的同型二聚体和异二聚体(例如，对于开瓶器，一个同型二聚体是“双重scFv”形式，一个同型二聚体是标准抗体，异二聚体具有一个Fab和一个scFv)。
在使用pI变体获得对同型二聚体纯化的异二聚体的情况下，通过使用重链的恒定区，提供了设计和纯化多特异性蛋白质(包括抗体)的更模块化方法。因此，在一些实施方案中，异二聚化变体(包括偏斜和纯化异二聚化变体)不包括在可变区中，使得必须改造每种单独的抗体。另外，在一些实施方案中，通过从不同IgG同种型导入pI变体，使得pI在不引入显著免疫原性的情况下改变，显著降低了由pI变体产生的免疫原性的可能性。因此，要解决的另一个问题是阐明具有高人序列含量的低pI恒定结构域，例如在任何特定位置最小化或避免非人残基。
该pI工程可能发生的副作用还包括血清半衰期的延长和FcRn结合的增加。也就是说，如USSN 13/194,904(通过引用整体并入)中所述，降低抗体恒定结构域(包括在抗体和Fc融合体中发现的那些)的pI可导致体内更长的血清保留。这些用于增加血清半衰期的pI变体也促进用于纯化的pI变化。
此外，应该注意的是，异二聚化变体的pI变体为双特异性抗体的分析和质量控制过程提供了额外的益处，因为消除、最小化和区分同型二聚体何时存在的能力是显著的。类似地，可靠地测试异二聚体蛋白质产生的再现性的能力是重要的。
本发明的第一和第二抗原在本文中分别称为抗原-1和抗原-2，其中一种是共刺激受体，一种是检查点受体。在本发明中特别有用的一种异二聚体支架是“三F”或“开瓶器”支架形式。在该实施方案中，抗体的一条重链含有单链fv(“scfv”，如下定义)，另一条重链是“常规”fab形式，其包含可变重链和轻链。这种结构有时在本文中称为“三F”形式(scfv-fab-fc)或者“开瓶器”形式，这是由于与开瓶器的大略视觉相似性(见图2)。通过使用促进异二聚体抗体形成的恒定区(例如Fc结构域和/或铰链区)中的氨基酸变体将两条链结合在一起，如下文更全面描述的。
目前的“三F”形式有几个明显的优点。如本领域所知，依赖于两种scFv构建体的抗体类似物通常具有稳定性和聚集问题，这可通过添加“常规”重链和轻链配对而在本发明中得到缓解。此外，与依赖于两条重链和两条轻链的形式相反，重链和轻链的错误配对没有问题(例如重1与轻2配对等等)。
此外，如本文所概述，可以将另外的氨基酸变体引入本发明的双特异性抗体中，以增加额外的功能。例如，可以添加Fc区内的氨基酸变化(对一个单体或两者)，以促进增加ADCC或CDC(例如改变与Fcγ受体的结合)以及增加与FcRn的结合和/或增加所得分子的血清半衰期。如本文进一步描述的并且如本领域技术人员将理解的，本文概述的任何和所有变体可任选地和独立地与其他变体组合。
类似地，另一类功能变体是“Fcγ消融变体”或“Fc敲除(FcKO或KO)变体”。在这些实施方案中，对于一些治疗应用，期望减少或去除Fc结构域与一种或多种或所有Fcγ受体(例如FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合，以避免其他作用机制。即，例如，通常需要消除FcγRIIIa结合以消除或显著降低ADCC活性。合适的变体消融示于图6。
IV.定义
为了能更全面地了解本申请，下文阐述若干定义。这些定义意味着包含语法等同物。
本文的“消融”是指活性的降低或除去。因此，例如，“消融FcγR结合”意指与不含特定变体的Fc区相比，Fc区氨基酸变体具有小于50％的起始结合，其中小于70-80-90-95-98％的活性损失是优选的，并且通常，活性低于Biacore分析中可检测的结合水平。在FcγR结合的消融中特别有用的是在图6所示的那些。
如本文使用的“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”是指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞的裂解。ADCC与FcγRIIIa的结合相关；与FcγRIIIa的结合增加导致ADCC活性增加。如本文所讨论的，本发明的许多实施方案完全消除ADCC活性。
本文所用的“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用是指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，并随后引起靶细胞的吞噬作用。
“抗原结合结构域”或“ABD”在本文中是指一组六个互补决定区(ComplementaryDetermining Region，CDR)，当作为多肽序列的一部分存在时，特异性结合如本文所论述的靶抗原。因此，“免疫调节抗原结合结构域”结合如本文所述的靶免疫调节抗原。如本领域中已知，这些CDR通常作为第一组可变重链CDR(vhCDR或VHCDR)和第二组可变轻链CDR(vlCDR或VLCDR)存在，其各自包含三个CDR：重链的vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3和轻链的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3。CDR分别存在于重链可变结构域和轻链可变结构域中，并且一起形成Fv区。因此，在一些情况下，抗原结合结构域的六个CDR由可变重链和可变轻链贡献。在“Fab”形式中，6个CDR的集合由两个不同的多肽序列贡献，重链可变结构域(vh或VH；含有vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)和轻链可变结构域(vl或VL；含有vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)，其中vh结构域的C端连接到重链CH1结构域的N端，v1结构域的C端连接到轻链恒定结构域的N端(从而形成轻链)。在scFv形式中，vh和v1结构域通常通过使用如本文所述的接头共价连接成单个多肽序列，其可以是(从N-末端开始)vh-接头-v1或vl-接头-vh，前者通常是优选的(包括每侧的可选结构域接头，这取决于使用的形式)。
本文的“修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、***和/或缺失或与蛋白质化学连接的部分的改变。例如，修饰可以是连接于蛋白质的改变的碳水化合物或PEG结构。本文的“氨基酸修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、***和/或缺失。为清楚起见，除非另有说明，否则氨基酸修饰始终是由DNA编码的氨基酸，例如在DNA和RNA中具有密码子的20个氨基酸。
本文的“氨基酸取代”或“取代”是指用不同的氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置的氨基酸。特别地，在一些实施例中，取代是针对并非天然存在于特定位置、并非天然存在于生物体内或任何生物体内的氨基酸。例如，取代E272Y是指在位置272处的谷酰胺被酪氨酸替换的变体多肽，在这种情况下是Fc变体。为了清楚起见，已经过工程改造以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)换成CGA(仍然编码精氨酸)来提高宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管创建了编码相同蛋白质的新基因，但是如果蛋白质在其起始的特定位置具有相同的氨基酸，那么它就不是氨基酸取代。
本文所用的“氨基酸***”或“***”是指在亲本多肽序列的特定位置添加氨基酸序列。例如，-233E或233E表示在位置233之后和位置234之前***谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE表示在位置233之后和位置234之前***AlaAspGlu。
本文所用的“氨基酸缺失”或“缺失”是指除去亲本多肽序列中特定位置的氨基酸序列。例如，E233-或E233#，E233()或E233del表示在位置233处的谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#表示从位置233开始的序列GluAspAla的缺失。
本文所用的“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”是指通过至少一个氨基酸修饰而不同于亲本蛋白质的蛋白质。蛋白质变体可以指蛋白质本身、包含蛋白质的组合物或编码它的氨基酸序列。优选地，蛋白质变体与亲本蛋白质相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比，约1个至约70个氨基酸修饰，优选约1个至约5个氨基酸修饰。如下所述，在一些实施例中，亲本多肽，例如Fc亲本多肽，是人野生型序列，例如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区，尽管具有变体的人序列也可以充当“亲本多肽”，例如可包括IgG1/2杂合物。本文的蛋白质变体序列优选与亲本蛋白质序列具有至少约80％的同一性，最优选至少约90％的同一性，更优选至少约95-98-99％的同一性。变体蛋白质可以指变体蛋白质本身、包含蛋白质变体的组合物或编码它的DNA序列。
因此，本文所用的“抗体变体”或“变体抗体”是指通过至少一个氨基酸修饰与亲本抗体不同的抗体，本文所用的“IgG变体”或“变体IgG”是指通过至少一个氨基酸修饰与亲本IgG(同样，在许多情况下，来自人IgG序列)不同的抗体，并且本文所用的“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”是指通过至少一个氨基酸修饰与亲本免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。本文所用的“Fc变体”或“变体Fc”是指包含Fc结构域中的氨基酸修饰的蛋白质。本发明的Fc变体是根据构成它们的氨基酸修饰来定义。因此，例如，N434S或434S是相对于亲本Fc多肽在434位具有取代丝氨酸的Fc变体，其中编号是根据EU索引。同样地，M428L/N434S定义了相对于亲本Fc多肽具有取代M428L和N434S的Fc变体。WT氨基酸的身份可以是未指定的，在这种情况下，前述变体称为428L/434S。应注意，提供取代的顺序是任意的，也就是说，例如，428L/434S是与M428L/N434S相同的Fc变体，等等。对于本发明中讨论的与抗体有关的所有位置，除非另有说明，否则氨基酸位置编号是根据EU索引。EU索引或如Kabat或EU编号方案中的EU索引是指EU抗体的编号(Edelman等人,1969,美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)63:78-85，在此通过引用整体并入)。修饰可以是添加、缺失或取代。取代可包括天然存在的氨基酸，在某些情况下，可包括合成氨基酸。实例包括美国专利第6,586,207号；WO 98/48032；WO 03/073238；US2004-0214988A1；WO 05/35727A2；WO05/74524A2；J.W.Chin等人,(2002),美国化学会志(Journal of the American ChemicalSociety)124:9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz,(2002),生物化学(ChemBioChem)11:1135-1137；J.W.Chin等人,(2002),《美国PICAS》99:11020-11024；以及L.Wang和P.G.Schultz,(2002),《化学(Chem.)》1-10，全部通过引用并入。
如本文所用，“蛋白质”在本文中是指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。肽基可包含天然存在的氨基酸和肽键，或合成的拟肽结构，即“类似物”，例如拟肽(参见Simon等人,《美国科学院院报》(PNAS USA)89(20):9367(1992)，通过引用整体并入)。氨基酸可以是天然存在的或合成的(例如不是由DNA编码的氨基酸)；如本领域技术人员所理解的。例如，出于本发明的目的，同型苯丙氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和正亮氨酸被认为是合成氨基酸，并且可以使用D-和L-(R或S)构型的氨基酸。本发明的变体可包含修饰，其包括使用例如Schultz和同事开发的技术掺入的合成氨基酸，所述技术包括但不限于Cropp和Shultz,2004,《遗传学趋势(Trends Genet.)》20(12):625-30，Anderson等人,2004,《美国国家科学院院刊》101(2):7566-71，Zhang等人,2003,303(5656):371-3和Chin等人,2003,《科学(Science)》301(5635):964-7所描述的方法，均通过引用整体并入。另外，多肽可包括一个或多个侧链或末端的合成衍生、糖基化、聚乙二醇化、环状排列、环化、与其它分子的接头、与蛋白质或蛋白质结构域的融合以及肽标签或标记的添加。
本文所用的“残基”是指蛋白质中的位置及其相关的氨基酸身份标识。例如，天冬酰胺297(也称为Asn297或N297)是人抗体IgG1中位置297处的残基。
本文所用的“Fab”或“Fab区”是指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以单独指代该区域，或者在全长抗体、抗体片段或Fab融合蛋白的背景下指代该区域。
本文所用的“Fv”或“Fv片段”或“Fv区”是指包含单一ABD的VL和VH结构域的多肽。如本领域技术人员所理解的，这些通常由两条链组成，或者可以组合(通常与本文所述的接头)以形成scFv。在某些情况下，例如在“中心-Fv”和“DVD-Ig”形式中，添加了“额外的”vh和vl结构域，其用作scFv，但其中vh和vl结构域在它们之间未使用scFv接头连接。
本文中的“单链Fv”或“scFv”是指通常使用如本文所讨论的scFv接头将重链可变结构域共价连接至轻链可变结构域，以形成scFv或scFv结构域。scFv结构域从N端至C端可呈任一定向(vh-接头-vl或vl-接头-vh)。
本文所用的“IgG亚类修饰”或“同种型修饰”是指将一种IgG同种型的一个氨基酸转化为不同的比对IgG同种型中的相应氨基酸的氨基酸修饰。例如，因为在EU位置296处IgG1包含酪氨酸并且IgG2包含苯丙氨酸，所以IgG2中的F296Y取代被认为是IgG亚类修饰。
本文所用的“非天然存在的修饰”是指不是同种型的氨基酸修饰。例如，因为没有IgG在位置434处包含丝氨酸，所以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(或其杂合体)中的取代434S被认为是非天然存在的修饰。
本文所用的“氨基酸”和“氨基酸身份标识”是指由DNA和RNA编码的20种天然存在的氨基酸之一。
本文所用的“效应功能”是指由抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用产生的生物化学事件。效应功能包括但不限于ADCC、ADCP和CDC。
本文所用的“IgG Fc配体”是指与IgG抗体Fc区结合以形成Fc/Fc配体复合物的任何生物体的分子，优选多肽。Fc配体包括但不限于FcγRI、FcγRII、FcγRIII、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒FcγR。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH)，其是与FcγR同源的Fc受体家族(Davis等人,2002,《免疫评论(Immunological Reviews)》190:123-136，通过引用整体并入)。Fc配体可包括结合Fc的未发现分子。特定的IgG Fc配体是FcRn和Fcγ受体。本文所用的“Fc配体”是指与抗体Fc区结合以形成Fc/Fc配体复合物的任何生物体的分子，优选多肽。
本文所用的“Fcγ受体”、“FcγR”或“FcγR(FcgammaR)”是指结合IgG抗体Fc区并由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人类中，该家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；和FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等人,2002,《免疫学快报(Immunol Lett)》82:57-65，通过引用整体并入)，以及任何未发现的人FcγR或FcγR同种型或同种异型。FcγR可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII-1(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)，以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或同种异型。
本文使用的“FcRn”或“新生儿Fc受体”是指结合IgG抗体Fc区并至少部分由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域所知，功能性FcRn蛋白包含两个多肽，通常称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白，重链由FcRn基因编码。除非本文另有说明，否则FcRn或FcRn蛋白是指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合物。用于增加与FcRn受体的结合并且在一些情况下增加血清半衰期的多种FcRn变体显示在图83的图例中。
本文所用的“亲本多肽”是指随后经过修饰以产生变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽，或天然存在的多肽的变体或工程改造版本。亲本多肽可以指多肽本身、包含亲本多肽的组合物或编码它的氨基酸序列。因此，本文所用的“亲本免疫球蛋白”是指未修饰的免疫球蛋白多肽，其被修饰以产生变体，并且本文所用的“亲本抗体”是指未修饰的抗体，其被修饰以产生变体抗体。应注意，“亲本抗体”包括如下概述的已知的商业重组产生的抗体。
本文使用的“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”是指包含抗体恒定区(不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域)的多肽，并且在一些情况下是铰链的一部分。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域N端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc结构域包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)以及Cγ1(Cγ1)和Cγ2(Cγ2)之间的下铰链区。尽管Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常被定义为包括其羧基端的残基C226或P230，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。在一些实施方案中，如下文更全面地描述，对Fc区进行氨基酸修饰，例如改变与一种或多种FcγR受体或FcRn受体的结合。
“重链恒定区”在本文中是指抗体的CH1-铰链-CH2-CH3部分。
本文中的“Fc融合蛋白”或“免疫粘附素”是指包含Fc区的蛋白质，通常与不同的蛋白质连接(任选通过如本文所述的接头部分)，例如与靶蛋白质的结合部分，如本文所述。在一些情况下，异二聚体抗体的一个单体包含抗体重链(包括scFv或进一步包括轻链)，而另一个单体是Fc融合体，其包含变体Fc结构域和配体。在一些实施方案中，这些“半抗体-半融合蛋白”被称为“融合体”。
本文所用的“位置”是指蛋白质序列中的位置。位置可以顺序编号，或根据确定的形式(例如用于抗体编号的EU索引)编号。
本文所用的“靶抗原”是指由给定抗体的可变区特异性结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、脂质或其他化学化合物。合适的靶抗原在下面描述。
本发明的异二聚体抗体的单体背景中的“链状(strandedness)”是指，与“匹配”的两条DNA链相似，将异二聚化变体掺入每种单体中以保持“匹配”以形成异二聚体的能力。例如，如果将一些pI变体工程化为单体A(例如使pI更高)，则还可以利用的“电荷对”的空间变体不会干扰pI变体，例如将使pI更高的电荷变体放在相同的“链”或“单体”上以保持两种功能。类似地，对于组中成对出现的“偏斜”变体，如下面更全面概述的，技术人员在决定将进入合并一组对的哪一条链或单体时将考虑pI，使得也使用偏斜的pI使pI分离最大化。
本文使用的“靶细胞”是指表达靶抗原的细胞。
本文所用的“可变区”是指免疫球蛋白的区域，其包含一个或多个基本上由分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白基因座的V.κ、V.λ和/或VH基因编码的Ig结构域。
“野生型或WT”在本文中是指在自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。WT蛋白质具有未经有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
本发明的抗体通常是分离的或重组的。当用于描述本文公开的各种多肽时，“分离的”是指多肽已经从表达其的细胞或细胞培养物中鉴定和分离和/或回收。通常，通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体。“重组”是指使用重组核酸技术在外源宿主细胞中产生抗体。
相对于蛋白质序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列和如果需要引入缺口以实现最大百分比序列同一性并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中氨基酸残基与特定(亲本)序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。一个特定的程序是在美国公布号20160244525的第[0279]至[0280]段中概述的ALIGN-2程序，在此通过引用并入。
本发明的氨基酸序列(“发明序列”)与亲本氨基酸序列之间的同一性程度计算为两个序列比对中的精确匹配数除以“发明序列”的长度或亲本序列的长度，以最短者为准。结果以百分比同一性表示。
在一些实施方案中，两个或更多个氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％相同。在一些实施方案中，两个或更多个氨基酸序列具有至少95％、97％、98％、99％或甚至100％相同。
“特异性结合”或“特异性结合于”特定抗原或表位，或“对”特定抗原或表位“具有特异性”意指与非特异性相互作用可测量地不同的结合。特异性结合可以例如通过相较于对照分子的结合测定分子的结合来测量，对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，可以通过与类似于靶标的对照分子竞争来确定特异性结合。
针对特定抗原或表位的特异性结合可以例如通过抗体对抗原或表位的KD为至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、或者至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M、或更大来展现，其中KD是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。通常，特异性结合抗原的抗体的KD是对照分子相对于抗原或表位的20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。
另外，可以例如通过抗体对抗原或表位的KA或Ka对于表位相对于对照大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍来展现对特定抗原或表位的特异性结合，其中KA或Ka是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率。通常使用Biacore测定法测量结合亲和力。
V.抗体
本发明涉及结合如本文所讨论的两种不同免疫调节抗原的双特异性免疫调节抗体的产生。如下所述，通常使用术语“抗体”。可用于本发明的抗体可呈现如本文所述的多种形式。
传统的抗体结构单元通常包含四聚体。每个四聚体通常由两对相同的多肽链构成，每对具有一个“轻链”(通常具有约25kDa的分子量)和一个“重链”(通常具有约50-70kDa的分子量)。人轻链被分类为κ和λ轻链。本发明涉及通常基于IgG类的双特异性抗体，其具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。通常，IgG1、IgG2和IgG4比IgG3更频繁地使用。应注意，IgG1具有不同的同种异型，其在356(D或E)和358(L或M)处具有多态性。本文描述的序列使用356D/358M同种异型，然而本文包括其它同种异型。也就是说，本文包括的包括IgG1 Fc结构域的任何序列可以具有356E/358L替代356D/358M同种异型。
此外，本文中的许多序列在220位的至少一个半胱氨酸被丝氨酸取代；通常，这是在本文所述的大多数序列的“scFv单体”侧，尽管它也可以在“Fab单体”侧或两者上，以减少二硫化物的形成。本文序列中特别包括这些半胱氨酸中的一个或两个被取代(C220S)。
因此，本文所用的“同种型”是指由其恒定区的化学和抗原特征限定的免疫球蛋白的任何亚类。应当理解，治疗性抗体还可以包含同种型和/或亚类的杂合体。例如，如通过引用并入的美国公布2009/0163699中所示，本发明涵盖IgG1/G2杂合体的pI工程化。
每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区，在本领域和本文中通常称为“Fv结构域”或“Fv区”。在可变区中，重链和轻链的每个V结构域聚集三个环以形成抗原结合位点。每个环被称为互补决定区(下文中称为“CDR”)，其中氨基酸序列的变化是最显著的。“可变”是指可变区的某些区段在抗体之间序列差异很大的事实。可变区内的可变性不是均匀分布的。相反，V区由通过称为“高变区”的极端可变的较短区分隔开的称为框架区(FR)的15-30个氨基酸的相对不变的区段组成，所述高变区各自9-15个氨基酸长或更长。
每个VH和VL由三个高变区(“互补决定区”，“CDR”)和四个FR构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
高变区通常包含来自轻链可变区中约氨基酸残基24-34(LCDR1；“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)以及重链可变区中约31-35B(HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)的氨基酸残基；Kabat等人,《免疫学相关蛋白质的序列(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST)》,第5版.马里兰州贝塞斯达美国国家卫生研究院公共卫生服务部(Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.)(1991)和/或那些形成高变环的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)以及重链可变区中的26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3)；Chothia和Lesk(1987)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.196:901-917。下面描述本发明的特定CDR。
如本领域技术人员所理解，CDR的确切编号和放置在不同编号***之间可以是不同的。然而，应理解，可变重链和/或可变轻链序列的公开内容包括相关(固有)CDR的公开内容。因此，每个重链可变区的公开内容是vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的公开内容，并且每个轻链可变区的公开内容是vlCDR(例如vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的公开内容。
CDR编号的有用比较如下，参见Lafranc等人,《发育与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》27(1):55-77(2003)：
表1
在整个本说明书中，当提及可变结构域(大致是轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)中的残基以及用于Fc区的EU编号***时，通常使用Kabat编号***(例如Kabat等人,见上文(1991))。
本发明提供了大量不同的CDR组。在这种情况下，“完整CDR组”包含三个可变轻链和三个可变重链CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3。这些可以分别是较大轻链可变结构域或重链可变结构域的一部分。另外，如本文中更全面概述，当使用重链和轻链时(例如当使用Fabs时)，重链可变结构域和轻链可变结构域可以在分开的多肽链上，或者在scFv序列的情况下，可以在单个多肽链上。
CDR有助于形成抗体的抗原结合位点，或更具体地，表位结合位点。“表位”是指与称为互补位的抗体分子可变区中的特定抗原结合位点相互作用的决定簇。表位是分子的分组，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单个抗原可具有多于一个表位。
表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和其它不直接参与结合的氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的覆盖面积内。
表位可以是构象的也可以是线性的。通过来自线性多肽链的不同区段的空间并置的氨基酸产生构象表位。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，与前者而非后者的结合丧失。
表位通常包含独特空间构象中的至少3个，更通常至少5个或8-10个氨基酸。识别相同表位的抗体可以在简单的免疫分析中验证，所述免疫分析显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力，例如“分箱”。如下所述，本发明不仅包括本文列举的抗原结合结构域和抗体，还包括竞争与所列举的抗原结合结构域结合的表位结合的抗原结合结构域和抗体。
每条链的羧基端部分限定了主要负责效应功能的恒定区。Kabat等人收集了重链和轻链可变区的许多一级序列。基于序列的保守程度，他们将单个一级序列分类为CDR和框架并列出其列表(参见《免疫学相关序列(SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST)》,第5版,NIH公开第91-3242号,E.A.Kabat等人，通过引用完全并入本文)。
在免疫球蛋白的IgG亚类中，重链中存在数个免疫球蛋白结构域。“免疫球蛋白(Ig)结构域”在本文中是指具有不同三级结构的免疫球蛋白区域。本发明所关注的是重链结构域，包括重链恒定(CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的情况下，IgG同种型各自具有三个CH区。因此，IgG背景下的“CH”结构域如下：“CH1”根据如Kabat中的EU索引是指位置118-220。“CH2”根据如Kabat中的EU索引是指位置237-340，“CH3”根据如Kabat中的EU索引是指位置341-447。如本文所示和下文所述，pI变体可以在一个或多个CH区以及铰链区中，在下面讨论。
重链的另一种类型的Ig结构域是铰链区。“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”在本文中是指包含抗体的第一和第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置220处终止，并且IgG CH2结构域在残基EU位置237处开始。因此，对于IgG，抗体铰链在本文中定义为包括位置221(IgG1中的D221)至236(IgG1中的G236)，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。在一些实施方案中，例如在Fc区的背景下，包括下铰链，“下铰链”通常指的是位置226或230。如本文所述，pI变体也可以在铰链区中制备。
轻链通常包含两个结构域，即轻链可变结构域(含有轻链CDR并与重链可变结构域一起形成Fv区)和轻链恒定区(通常称为CL或Cκ)。
下文概述的用于其它取代的另一所关注区是Fc区。
因此，本发明提供了不同的抗体结构域。如本文所述和本领域已知的，本发明的异二聚体抗体包含重链和轻链内的不同结构域，其也可以重叠。这些结构域包括但不限于Fc结构域、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链结构域、重恒定结构域(CH1-铰链-Fc结构域或CH1-铰链-CH2-CH3)、可变重结构域、可变轻结构域、轻恒定结构域、Fab结构域和scFv结构域。
因此，“Fc结构域”包括-CH2-CH3结构域，和任选的铰链结构域。在本文的实施方案中，当scFv连接于Fc结构域时，scFv构建体的C-末端连接于Fc结构域的全部或部分铰链；例如，它通常连接到是铰链的开始的序列EPKS。重链包含可变重结构域和恒定结构域，其包括包含CH2-CH3的CH1-任选的铰链-Fc结构域。轻链包含可变轻链和轻恒定结构域。scFv包含可变重链、scFv接头和可变轻链结构域。在本文概述的大多数构建体和序列中，可变轻链的C末端连接至scFv接头的N末端，其C末端连接至可变重链的N末端(N-vh-接头-v1-C)，尽管其可以被转换(N-v1-接头-vh-C)。本发明的一些实施方案包含至少一个scFv结构域，其虽然不是天然存在的，但通常包括通过scFv接头连接在一起的可变重结构域和可变轻结构域。如本文所概述的，虽然scFv结构域通常从N-末端到C-末端定向为vh-scFv接头-v1，但对于任何scFv结构域(或使用来自Fab的vh和v1序列构建的那些)，这可以是相反为vl-scFv接头-vh，其中在一端或两端具有可选的接头，这取决于形式(参见图2)。
如本文所示，可以使用许多合适的scFv接头，包括通过重组技术产生的传统肽键。接头肽可主要包括以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。接头肽应具有足以连接两个分子的长度，使得它们相对于彼此呈现正确的构象，从而使得它们保留所需的活性。在一个实施方案中，接头为约1至50个氨基酸长，优选约1至30个氨基酸长。在一个实施方案中，可以使用1至20个氨基酸长的接头，在一些实施例中发现使用约5至约10个氨基酸。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少一(通常为3至4)的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物和其它柔性接头。或者，各种非蛋白质聚合物，包括但不限于可用作接头的聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，可用作接头。
其他接头序列可包括任何长度的CL/CH1结构域的任何序列，但不包括CL/CH1结构域的所有残基；例如，CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基。接头可以衍生自免疫球蛋白轻链，例如Cκ或Cλ。接头可以衍生自任何同种型的免疫球蛋白重链，包括例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cμ。接头序列还可以衍生自其他蛋白质，例如Ig样蛋白质(例如TCR、FcR、KIR)、铰链区衍生的序列和来自其他蛋白质的其他天然序列。
在一些实施方案中，接头是“结构域接头”，用于将本文概述的任何两个结构域连接在一起。虽然可以使用任何合适的接头，但许多实施方案使用甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少一的整数(并且通常为3至4至5)以及允许具有足够的长度和柔性的两个结构域重组连接的任何肽序列以允许每个结构域保留其生物学功能。。在一些情况下，并且注意“链状”，如下所述，可以使用如在scFv接头的一些实施方案中使用的带电荷结构域接头。
在一些实施方案中，scFv接头是带电荷scFv接头，其中的一些在图8示出。因此，本发明进一步提供带电荷的scFv接头，以促进第一和第二单体之间的pI分离。也就是说，通过掺入带正电荷或负电荷的scFv接头(或者在对不同单体使用scFv的支架的情况下为两者)，这允许包含带电荷接头的单体以改变pI而不进一步改变Fc结构域。这些带电荷的接头可以被取代成任何含有标准接头的scFv。同样，如本领域技术人员所理解的，根据pI的期望变化，带电荷的scFv接头用于正确的“链”或单体上。例如，如本文所讨论的，为了制备三F形式异二聚体抗体，计算每个期望抗原结合结构域的Fv区域的原始pI，并选择一个制备scFv，并且取决于pI，选择正或负接头。
带电荷结构域接头也可以用来增加本发明的单体的pI分离，并因此包括在图8中的那些可以用于利用接头的本文任何实施方案中。
在一个实施方案中，抗体是抗体片段，只要其含有至少一个恒定结构域，其可以被工程化以产生异二聚体，例如pI工程化。可以使用的其他抗体片段包括含有一个或多个已经过pI工程改造的本发明的CH1、CH2、CH3、铰链和CL结构域的片段。特别地，图1中描绘的形式是抗体，通常称为“异二聚体抗体”，意味着该蛋白质具有至少两个相关的Fc序列自组装成异二聚体Fc结构域和至少两个Fv区域，无论是作为Fab或作为scFv。
A.嵌合和人源化抗体
在一些实施方案中，本文的抗体可衍生自来自不同物种的混合物，例如嵌合抗体和/或人源化抗体。通常，“嵌合抗体”和“人源化抗体”均指组合来自不止一种物种的区域的抗体。例如，“嵌合抗体”传统上包含来自小鼠(或在某些情况下为大鼠)的可变区和来自人的恒定区。“人源化抗体”通常是指非人抗体，其具有与人抗体中发现的序列交换的可变结构域框架区。通常，在人源化抗体中，除CDR之外的整个抗体由人源多核苷酸编码或除了其CDR之外与这种抗体相同。CDR(部分或全部由源自非人生物体的核酸编码)被移植到人抗体可变区的β-折叠框架中以产生抗体，其特异性由移植的CDR决定。此类抗体的产生描述于例如WO 92/11018，Jones,1986,《自然(Nature)》321:522-525，Verhoeyen等人,1988,《科学》239:1534-1536，所有这些都通过引用整体并入。所选择的受体框架残基“回复突变”到相应的供体残基通常需要重新获得在初始移植构建体中丧失的亲和力(US 5530101；US5585089；US 5693761；US 5693762；US 6180370；US 5859205；US 5821337；US 6054297；US6407213，均通过引用整体并入)。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分，因此通常包含人Fc区。使用具有基因工程改造的免疫***的小鼠也可以产生人源化抗体。Roque等人,2004,《生物技术进展(Biotechnol.Prog.)》20:639-654，通过引用整体并入。用于人源化和重塑非人抗体的多种技术和方法是本领域熟知的(参见Tsurushita和Vasquez,2004,《单克隆抗体的人源化(Humanization of Monoclonal Antibodies)》,《B细胞分子生物学(Molecular Biologyof B Cells)》,533-545,Elsevier Science(USA)和其中引用的参考文献，全部通过引用整体并入)。人源化方法包括但不限于Jones等人,1986,《自然》321:522-525；Riechmann等人,1988；《自然》332:323-329；Verhoeyen等人,1988,《科学》,239:1534-1536；Queen等人,1989,《美国国家科学院院刊》86:10029-33；He等人,1998,《免疫学杂志(J.Immunol.)》160:1029-1035；Carter等人,1992,《美国国家科学院院刊》89:4285-9；Presta等人,1997,《癌症研究》57(20):4593-9；Gorman等人,1991,《美国国家科学院院刊》88:4181-4185；O’Connor等人,1998,《蛋白质工程(Protein Eng)》11:321-8中所描述的方法，均通过引用整体并入。人源化或降低非人抗体可变区的免疫原性的其它方法可包括表面重修方法，如例如Roguska等人,1994,《美国国家科学院院刊》91:969-973中所述，通过引用整体并入。
在某些实施方案中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。例如，此类抗体可包含人抗体或由人抗体组成，所述人抗体包含作为特定种系序列“的产物”或“衍生自”特定种系序列的重链或轻链可变区。通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择序列与人抗体序列最接近(即，最大％同一性)的人种系免疫球蛋白，可以鉴定人抗体是人种系免疫球蛋白序列“的产物”或“衍生自”人种系免疫球蛋白序列。由于例如天然存在的体细胞突变或有意引入定点突变，作为特定人种系免疫球蛋白序列“的产物”或“衍生自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体与种系序列相比可含有氨基酸差异。然而，人源化抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列通常至少90％相同，并且与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种系序列)相比时，含有将抗体鉴定为衍生自人类序列的氨基酸残基。在某些情况下，人源化抗体的氨基酸序列与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可以至少95、96、97、98或99％，或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。通常，衍生自特定人种系序列的人源化抗体将显示与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过10-20个氨基酸差异(在本文中在引入任何偏斜、pI和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体的数量通常较低)。在某些情况下，人源化抗体可显示与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个或1个氨基酸差异(再次，在本文中在引入任何偏斜、pI和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体的数量通常较低)。
在一个实施方案中，亲本抗体已经亲和力成熟，如本领域已知的。基于结构的方法可用于人源化和亲和力成熟，例如USSN 11/004,590中所述。基于选择的方法可用于使抗体可变区人源化和/或亲和成熟，包括但不限于Wu等人,1999,《J.Mol.Biol.294:151-162；Baca等人,1997,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.272(16):10678-10684；Rosok等人,1996,J.Biol.Chem.271(37):22611-22618；Rader等人,1998,《美国国家科学院院刊》95:8910-8915；Krauss等人,2003,《蛋白质工程》16(10):753-759中所描述的方法，均通过引用整体并入。其它人源化方法可涉及仅移植部分CDR，包括但不限于USSN 09/810,510；Tan等人,2002,J.Immunol.169:1119-1125；De Pascalis等人,2002,J.Immunol.169:3076-3084中所描述的方法，均通过引用整体并入。
VI.异二聚体抗体
因此，在一些实施方案中，本发明提供异二聚体免疫调节抗体，其依赖于使用两种不同的重链变体Fc序列，其将自组装以形成异二聚体Fc结构域和异二聚体抗体。
本发明涉及提供异二聚体抗体的新构建体，其允许结合一种以上的免疫调节抗原或配体，例如以允许双特异性结合。异二聚体抗体构建体基于抗体重链的两个Fc结构域的自组装性质，例如组装成“二聚体”的两个“单体”。异二聚体抗体通过改变每种单体的氨基酸序列来制备，如下面更充分讨论的。因此，本发明一般涉及异二聚体免疫调节抗体的产生，其可以以几种方式共同接合抗原，这依赖于每条链上不同的恒定区中的氨基酸变体，以促进异二聚体形成和/或允许异二聚体比同型二聚体易于纯化。
因此，本发明提供双特异性抗体。抗体技术中持续存在的问题是需要同时结合两种不同抗原的“双特异性”抗体，因此通常允许不同的抗原接近并产生新的功能和新疗法。通常，通过将每条重链和轻链的基因包括在宿主细胞中来制备这些抗体。这通常导致形成所需的异二聚体(A-B)，以及两个同型二聚体(A-A和B-B(不包括轻链异二聚体问题))。然而，双特异性抗体形成的主要障碍是难以从同型二聚体抗体中纯化异二聚体抗体和/或比起同型二聚体的形成偏向异二聚体的形成。
有许多机制可用于产生本发明的异二聚体。另外，如本领域技术人员所理解的，可以组合这些机制以确保高异二聚化。因此，导致产生异二聚体的氨基酸变体被称为“异二聚化变体”。如下所述，异二聚化变体可包括空间变体(例如下文所述的“杵和臼”或“偏斜”变体和下文描述的“电荷对”变体)以及允许从异二聚体中纯化同型二聚体的“pI变体”。如在通过引用整体并入的WO2014/145806中一般性描述的，特别是如下用于讨论“异二聚化变体”，异二聚化的有用机制包括“杵和臼”(“KIH”；有时在本文中称为“偏斜”变体(参见WO2014/145806中的讨论)、WO2014/145806中描述的“静电转向”或“电荷对”、WO2014/145806中描述的pI变体和WO2014/145806和下文中概述的一般另外的Fc变体。
在本发明中，有几种基本机制可以导致易于纯化异二聚体抗体；一种机制依赖于pI变体的使用，使得每种单体具有不同的pI，因此允许A-A、A-B和B-B二聚体蛋白的等电纯化。或者，一些支架形式，例如“三F”形式，也允许基于尺寸进行分离。如下面进一步概述的，还可以“偏斜”异二聚体相对于同型二聚体的形成。因此，空间异二聚化变体和pI或电荷对变体的组合在本发明中特别有用。
一般而言，本发明中特定使用的实施方案依赖于包括偏斜变体的变体组，其相对于同型二聚体形成促进异二聚体形成，与pI变体偶联，这增加两个单体之间的pI差异。
另外，如下面更全面概述的，取决于异二聚体抗体的形式，pI变体可以包含在单体的恒定和/或Fc结构域内，或者可以使用带电荷的接头(结构域接头或scFv接头)。也就是说，利用scFv(例如三F形式)的支架可包括带电荷的scFv接头(阳性或阴性)，其为纯化目的提供进一步的pI加强。如本领域技术人员所理解的，一些三F形式仅对带电荷的scFv接头有用且没有额外的pI调节，尽管本发明确实也提供在一种或两种单体上的pI变体和/或带电荷结构域接头。此外，用于替代功能的额外氨基酸工程化也可赋予pI变化，例如Fc、FcRn和KO变体。
在利用pI作为分离机制以允许异二聚体蛋白质的纯化的本发明中，可以将氨基酸变体引入一种或两种单体多肽中；也就是说，其中一种单体(本文简称为“单体A”)的pI可以设计远离单体B，或者单体A和B都改变，单体A的pI增加，单体B的pI减少。如讨论的，可以通过去除或添加带电荷残基(例如，中性氨基酸被带正电荷或带负电荷的氨基酸残基代替，例如甘氨酸至谷氨酸)、将带电荷残基从正或负变为相反电荷(例如天冬氨酸至赖氨酸)或将带电荷残基改变为中性残基(例如电荷丢失；赖氨酸变为丝氨酸)，进行任一种或两种单体的pI变化。许多这些变体显示在图中。
因此，在本发明的该实施方案中，提供在至少一种单体中产生足够的pI变化，使得异二聚体可以与同型二聚体分离。如本领域技术人员所理解的，并且如下文进一步讨论的，这可以通过使用“野生型”重链恒定区和已经改造以增加或降低其pI的变体区域(wt A-+B或wt A--B)或通过增加一个区域并减少其他区域(A+-B-或A-B+)来完成。
因此，通常，本发明的一些实施方案的组分是抗体恒定区中的氨基酸变体，其旨在改变二聚体蛋白的至少一种(如果不是两种)单体的等电点(pI)，以通过将氨基酸取代(“pI变体”或“pI取代”)掺入一种或两种单体中形成“pI抗体”)。如本文所示，如果两种单体的pI差别小至0.1pH单位，则可以实现异二聚体与两种同型二聚体的分离，其中0.2、0.3、0.4和0.5或更高都可用于本发明。
如本领域技术人员所理解的，为了获得良好分离而包含在每种或两种单体上的pI变体的数量将部分取决于例如在三F形式中的组分的起始pI,感兴趣的scFv和Fab的起始pI。也就是说，为了确定要设计哪种单体或在哪种“方向”(例如更正或更负)，计算两种靶抗原的Fv序列并由那里做出决定。如本领域所知，不同的Fv将具有在本发明中利用的不同起始pI。通常，如本文所概述的，pI被设计成导致每种单体的总pI差异为至少约0.1log，优选0.2至0.5，如本文所述。此外，如本领域技术人员所理解和本文概述的，在一些实施方案中，异二聚体可以基于大小与同型二聚体分离。如在图2所示，例如，数个形式允许基于尺寸分离异二聚体和同型二聚体。
A.异二聚化变体
本发明提供了异二聚体蛋白质，包括多种形式的异二聚体抗体，其利用异二聚体变体以允许异二聚体形成和/或从同型二聚体纯化。许多异二聚化变体示于图4。
存在许多合适的异二聚化偏斜变体组的对。这些变体以“组”的“对”出现。也就是说，一对中的一组结合到第一单体中，该对中的另一组结合到第二单体中。应该注意的是，这些组不一定表现为“臼中杵”变体，其中一个单体上的残基与另一个单体上的残基之间具有一对一的对应关系；也就是说，这些成对的组形成了两个单体之间的界面，促进了异二聚体的形成并阻碍了同型二聚体的形成，使得在生物条件下自发形成的异二聚体的百分比超过90％，而不是预期的50％(25％同型二聚体A/A：50％异二聚体A/B：25％同型二聚体B/B)。
B.空间变体
在一些实施方案中，可通过添加空间变体来促进异二聚体的形成。也就是说，通过改变每条重链中的氨基酸，相比于形成具有相同Fc氨基酸序列的同型二聚体，不同的重链更可能结合形成异二聚体结构。合适的空间变体包括在附图中。
还可以任选地使用一种机制，在本领域通常称为“杵和臼”，指的是产生空间影响以利于异二聚体形成和不利于同型二聚体形成的氨基酸工程；这有时被称为“杵和臼”；如在USSN 61/596,846，Ridgway等，Protein Engineering 9(7)：617(1996)；Atwell等，J.Mol.Biol.1997 270：26；美国专利8,216,805中所述，所有这些均通过引用整体并入本文。附图标识了许多依赖于“杵和臼”的“单体A-单体B”对。另外，如Merchant等人，NatureBiotech.16：677(1998)中所述，这些“杵和臼”突变可以与二硫键结合以使形成偏向异二聚化。
可用于产生异二聚体的另一种机制有时被称为“静电转向”，如在Gunasekaran等人，J.Biol.Chem.285(25)：19637(2010)中所述，其全部内容通过引用并入本文。这有时在本文中称为“电荷对”。在该实施方案中，静电用于使形成偏向异二聚化。如本领域技术人员所理解的，这些也可能对pI有影响，因此对纯化也有影响，并因此在某些情况下也可以认为是pI变体。然而，由于产生这些以强制异二聚化并且不用作纯化工具，因此它们被归类为“空间变体”。这些包括但不限于D221E/P228E/L368E与D221R/P228R/K409R配对(例如这些是“单体对应组”)和C220E/P228E/368E配对C220R/E224R/P228R/K409R。
另外的单体A和单体B变体可以与任选和独立地以任何量的其他变体组合，例如本文概述的pI变体或US2012/0149876的图37中显示的其他空间变体，其图和图例以及SEQ IDNO通过引用明确地并入本文。
在一些实施方案中，本文概述的空间变体可以任选地和独立地与任何pI变体(或其他变体，例如Fc变体、FcRn变体等)并入一个或两个单体中，并且可以独立地和任选地包括或不包括在本发明的蛋白质中。
合适的偏斜变体的列表可见于图4中，其显示在许多实施方案中具有特定效用的一些对。在许多实施方案中特别有用的是成对的组，包括但不限于S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411T/E360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L，K370S：S364K/E357Q和T366S/L368A/Y407V：T366W(任选地包括桥接二硫化物，T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)。就命名而言，对“S364K/E357Q：L368D/K370S”表示其中一种单体具有双变体组S364K/E357Q，另一种单体具有双变体组L368D/K370S；如上所述，这些对的“链状”取决于起始pI。
C.异二聚体的pI(等电点)变体
通常，如本领域技术人员所理解的，pI变体有两大类：增加蛋白质pI的那些(碱性变化)和降低蛋白质pI的那些(酸性变化)。如本文所述，可以进行这些变体的所有组合：一种单体可以是野生型，或者不显示与野生型显著不同的pI的变体，另一种可以是更碱性或更酸性的。或者，改变每种单体，一种更碱性，一种更酸性。
pI变体的优选组合示于图5。如本文所概述和图中所示，这些变化相对于IgG1显示，但所有同种型可以这种方式改变，以及同种型杂合体。在重链恒定结构域来自IgG2-4的情况下，也可以使用R133E和R133Q。
在一个实施方案中，例如在开瓶器形式中，pI变体的优选组合具有一种单体(负Fab侧)，其包含208D/295E/384D/418E/421D变体(当相对于人IgG1时，N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)和包含带正电荷的scFv接头的第二单体(正scFv侧)，其包括(GKPGS)4。然而，如本领域技术人员所理解的，第一单体包括CH1结构域，包括位置208。因此，在不包含CH1结构域的构建体中(例如对于在其中一个结构域上不利用CH1结构域的异二聚体Fc融合蛋白，例如以双scFv形式)，优选的负pI变体Fc组包括295E/384D/418E/421D变体(当相对于人IgG1时，Q295E/N384D/Q418E/N421D)。
因此，在一些实施方案中，一种单体具有图5的一组取代，另一种单体具有带电荷接头(以带电荷scFv接头的形式，因为该单体包含scFv，或以带电荷结构域接头的形式，如该形式决定的)。
1.同种型变体
此外，本发明的许多实施方案依赖于将pI氨基酸在特定位置从一个IgG同种型“输入”到另一个IgG同种型，从而减少或消除了将不需要的免疫原性引入变体中的可能性。这些的许多显示在美国公布2014/0370013的图21中，在此通过引用并入。也就是说，IgG1是治疗性抗体的常见同种型，其原因有多种，包括高效功能。然而，IgG1的重恒定区具有比IgG2更高的pI(8.10对7.31)。通过将特定位置的IgG2残基引入IgG1主链，所得单体的pI降低(或增加)并且另外表现出更长的血清半衰期。例如，IgG1在137位具有甘氨酸(pI5.97)，IgG2具有谷氨酸(pI 3.22)；输入谷氨酸会影响所得蛋白质的pI。如下所述，通常需要许多氨基酸取代来显著影响变体抗体的pI。然而，应该注意，如下所述，即使IgG2分子的变化也允许增加血清半衰期。
在其他实施方案中，进行非同种型氨基酸改变，以减少所得蛋白质的总电荷状态(例如通过将更高的pI氨基酸改变为更低的pI氨基酸)，或允许在结构中调节稳定性，等等，如下面进一步描述的。
此外，通过pI工程化重和轻恒定结构域，可以看到异二聚体的每个单体的显著变化。如本文所讨论的，使两种单体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱或等电聚焦或对等电点敏感的其他方法进行分离。
D.计算pI
每个单体的pI可取决于变体重链恒定结构域的pI和总单体的pI，包括变体重链恒定结构域和融合配偶体。因此，在一些实施方案中，使用美国公布2014/0370013的图19中的图表，基于变体重链恒定域计算pI的变化。如本文所讨论的，要设计的单体通常由Fv和支架区域的固有pI决定。或者，可以比较每种单体的pI。
E.也赋予更好的FcRn体内结合的pI变体
在pI变体降低单体的pI的情况下，它们可具有改善体内血清保留的附加益处。
虽然仍在研究中，但据信Fc区在体内具有更长的半衰期，因为在内体中与pH6的FcRn结合会使Fc隔离(Ghetie和Ward,1997Immunol Today.18(12)：592-598，通过引用全部并入)。然后，内体区室将Fc再循环至细胞表面。一旦区室打开到细胞外空间，较高的pH(～7.4)诱导Fc释放回血液中。在小鼠中，Dall'Acqua等人表明在pH6和pH7.4下FcRn结合增加的Fc突变体实际上具有降低的血清浓度和与野生型Fc相同的半衰期(Dall'Acqua等2002,J.Immunol.169:5171-5180，通过引用整体并入)。认为Fc在pH 7.4下对FcRn的亲和力增加禁止了Fc释放回血液中。因此，将在体内增加Fc半衰期的Fc突变将理想地在较低pH下增加FcRn结合，同时仍允许在较高pH下释放Fc。氨基酸组氨酸在6.0至7.4的pH范围内改变其电荷状态。因此，在Fc/FcRn复合物的重要位置发现His残基并不奇怪。
最近有人提出，具有较低等电点的可变区的抗体也可具有较长的血清半衰期(Igawa等，2010PEDS.23(5)：385-392，通过引用全部并入)。但是，其机制仍然知之甚少。此外，可变区在抗体与抗体之间不同。如本文所述，具有降低的pI和延长的半衰期的恒定区变体将提供更加模块化的方法来改善抗体的药代动力学特性。
F.用于附加功能的附加Fc变体
除了pI氨基酸变体之外，还存在许多有用的Fc氨基酸修饰，其可以由于多种原因而制备，包括但不限于，改变与一种或多种FcγR受体的结合，改变与FcRn受体的结合，等等。
因此，本发明的蛋白质可包括氨基酸修饰，包括本文概述的异二聚化变体，其包括pI变体和空间变体。每组变体可以独立地和任选地包括或不包括在任何特定的异二聚体蛋白质中。
G.FcγR变体
因此，可以进行许多有用的Fc取代以改变与一种或多种FcγR受体的结合。导致结合增加以及结合降低的取代可能是有用的。例如，已知增加与FcγRIIIa的结合导致ADCC增加(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞的裂解。类似地，在一些情况下，与FcγRIIb(抑制性受体)的结合降低也是有益的。可用于本发明的氨基酸取代包括USSN 11/124,620(特别是图41)、11/174,287、11/396,495、11/538,406中列出的那些，所有这些都通过引用整体地并且具体地对于其中公开的变体明确地并入本文。可以使用的特定变体包括但不限于236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、243A、243L、264A、264V和299T。
另外，存在额外的Fc取代，其可用于增加与FcRn受体的结合和增加血清半衰期，如USSN 12/341,769中具体公开的，其通过引用整体并入本文，包括但不限于434S、434A、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I或V/434S、436V/428L和259I/308F/428L。
H.消融变体
类似地，另一类功能变体是“FcγR消融变体”或“Fc敲除(FcKO或KO)”变体。在这些实施方案中，对于一些治疗应用，期望减少或去除Fc结构域与一种或多种或所有Fcγ受体(例如FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合，以避免其他作用机制。即，例如，在许多实施方案中，特别是在使用双特异性免疫调节抗体时，需要消除FcγRIIIa结合以消除或显著降低ADCC活性，使得一个Fc结构域包含一个或多个Fcγ受体消融变体。这些消融变体在图6中描绘，并且每一个都可以独立地和任选地被包括或不包括，其中优选的方面利用选自下述的消融变体：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。应当注意，本文提及的消融变体消除FcγR结合，但通常不消除FcRn结合。
I.异二聚体变体和Fc变体的组合
如本领域技术人员所理解的，所有所述的异二聚化变体(包括偏斜和/或pI变体)可以任选地和独立地以任何方式组合，只要它们保持其“链状”或“单体分配”即可。此外，所有这些变体可以组合成任何异二聚化形式。
在pI变体的情况下，虽然在图中显示了发现特定用途的实施方案，但是可以根据改变两种单体之间的pI差异以促进纯化的基本规则产生其他组合。
此外，任何异二聚化变体，偏斜和pI，也独立地和任选地与Fc消融变体、Fc变体、FcRn变体组合，如本文一般概述的。
VII.本发明的有用形式
如本领域技术人员可以理解和下面更充分地讨论的，本发明的双特异性异二聚体抗体可以采取各种各样的构型，如在图2中一般描绘的。一些图描绘了“单端”构型，其中在分子的一个“臂”上存在一种特异性，而在另一个“臂”上存在不同的特异性。其他图描绘了“双端”构型，其中在分子的“顶部”存在至少一种类型的特异性，在分子的“底部”存在一种或多种不同的特异性。因此，本发明涉及与不同的第一和第二抗原共同结合的新型免疫球蛋白组合物。
如本领域技术人员可以理解的，本发明的异二聚体的形式(参见图2)可具有不同的化合价，以及是双特异性的。也就是说，本发明的抗体可以是二价和双特异性的，其中检查点靶标由一个ABD结合，共刺激靶标由第二个ABD结合(参见例如为异二聚体的开瓶器形式或为同型二聚体的双特异性mAb)。异二聚体抗体也可以是三价和双特异性的，其中第一抗原由两个ABD结合而第二抗原通过第二ABD结合(参见例如中心-scFv形式和三齿形形式)。异二聚体抗体也可以是双特异性和四价的(例如中心scFv2形式和DVD-Ig形式)。
同样，除了DVD-Ig形式和中心-scFv2形式之外，通常将抗体格式化为使得共刺激靶标单价结合。
A.开瓶器形式
在本发明中特别使用的一种异二聚体支架是“三F”或“开瓶器”支架形式。在该实施方案中，抗体的一条重链含有单链Fv(“scFv”，如下定义)，另一条重链是“常规”Fab形式，包含可变重链和轻链。这种结构在本文中有时称为“三F”形式(scFv-Fab-Fc)或由于与开瓶器的大略视觉相似性称为“开瓶器”形式。通过使用促进异二聚体抗体形成的恒定区(例如Fc结构域、CH1结构域和/或铰链区)中的氨基酸变体将两条链结合在一起，如下文更全面描述的。
目前的“三F”形式有几个明显的优点。如本领域所知，依赖于两种scFv构建体的抗体类似物通常具有稳定性和聚集问题，这可通过添加“常规”重链和轻链配对而在本发明中得到缓解。此外，与依赖于两条重链和两条轻链的形式相反，重链和轻链的错误配对没有问题(例如重1与轻2配对等等)。
本文概述的许多实施方案通常依赖于开瓶器形式，其包含含有scFv的第一单体，所述scFv包含可变重链和可变轻链结构域，使用scFv接头共价连接(在许多但不是所有的情况下带电荷)，其中scFv通常通过结构域接头共价连接到第一Fc结构域的N末端(如本文所概述的，其可以是不带电荷的或带电荷的并且可以是外源的或内源的(例如天然铰链结构域的全部或部分)。开瓶器形式的第二单体是重链，并且组合物还包含轻链。
此外，开瓶器形式的Fc结构域一般包括偏斜变体(例如，如在图4中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411T/E360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L，K370S：S364K/E357Q，T366S/L368A/Y407V：T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)，任选地消融变体(包括在图6中示出的那些)，任选地带电荷的scFv接头(包括在图8中所示的那些)和重链包括pI变体(包括在图5示出的那些)。
在一些实施方案中，开瓶器形式包括偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括开瓶器形式，其包含：a)第一单体(“scFv单体”)，其包括带电荷scFv接头(在一些实施方案中优选图8的+H序列)、偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，以及与本文所述的一个靶标结合的Fv；b)第二单体(“Fab单体”)，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和可变重结构域，所述可变重结构域与可变轻结构域一起构成与本文所述的第二靶标结合的Fv；以及c)轻链。在该具体实施方案中，合适的单体Fv对包括(Fabs首先列出、scFv其次列出)ICOS XPD-1、ICOS X PD-L1、ICOS X CTLA-4、ICOS X LAG-3、ICOS X TIM-3、ICOS X BTLA、ICOS X TIGIT、TIGIT X ICOS、PD-1X ICOS、PD-L1 X ICOS、CTLA-4X ICOS、LAG-3X ICOS、TIM-3X ICOS、BTLA X ICOS、OX40 X TIGIT、OX40 X PD-1、OX40 X PD-L1、OX40 X CTLA-4、OX40 X LAG-3、OX40 X TIM-3、OX40 X BTLA、TIGIT XOX40、PD-1X OX40、PD-L1 X OX40、CTLA-4X OX40、LAG-3X OX40、TIM-3X OX40、BTLA XOX40、GITR X TIGIT、GITR X PD-1、GITR X PD-L1、GITR X CTLA-4、GITR X LAG-3、GITR XTIM-3、GITR X BTLA、TIGIT x GITR、PD-1X GITR、PD-L1 X GITR、CTLA-4X GITR、LAG-3XGITR、TIM-3X GITR、BTLA X GITR、4-1BB X TIGIT、4-1BB X PD-1、4-1BB X PD-L1、4-1BB XCTLA-4、4-1BB X LAG-3、4-1BB X TIM-3、4-1BB X BTLA、TIGIT X 4-1BB、PD-1X 4-1BB、PD-L1 X 4-1BB、CTLA-4X 4-1BB、LAG-3X4-1BB、TIM-3X 4-1BB和BTLA X 4-1BB。
因此，一些实施方案包括开瓶器形式，其包含：a)第一单体(“scFv单体”)，其包括带电荷scFv接头(在一些实施方案中优选图8的+H序列)、偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，以及与本文所述的一个靶标结合的Fv；b)第二单体(“Fab单体”)，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和可变重结构域，所述可变重结构域与可变轻结构域一起构成与本文所述的第二靶标结合的Fv；以及c)轻链。在具有该形式的这些变体的一些特定实施方案中：
(1)形式包括Fab ABD与ICOS结合，ICOS的ABD为[ICOS]H0.66_L0；
(2)形式包括与scFv ABD结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv ABD包含与PD-1结合的ABD 1G6_L1.194_H1.279；
(3)形式包括与scFv结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv包含与CTLA-4结合的ABDH3.23_L0.129；
(4)形式包括H0.66_L0的ICOS ABD，与结合LAG-3的ABD 7G8_H.303_L1.34组合；
(5)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合GITR；
(6)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合OX40；
(7)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合ICOS；
8)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合4-1BB；和
(9)形式包括与ICOS结合的H0.66_L0的ABD和与PD-L1结合的ABD。
在一些实施方案中，开瓶器形式包括偏斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施方案包括开瓶器形式，其包含：a)第一单体(“scFv单体”)，其包括带电荷scFv接头(在一些实施方案中优选图8的+H序列)、偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及与本文所述的第一受体(共刺激受体或检查点受体)结合的Fv；b)第二单体(“Fab单体”)，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S和可变重结构域，所述可变重结构域与可变轻结构域一起构成与本文所述的第二受体(所述共刺激受体或检查点受体的另一个)结合的Fv；以及c)轻链。在具有该形式的这些变体的一些特定实施方案中：
(1)形式包括Fab ABD与ICOS结合，ICOS的ABD为[ICOS]H0.66_L0；
(2)形式包括与scFv ABD结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv ABD包含与PD-1结合的ABD 1G6_L1.194_H1.279；
(3)形式包括与scFv结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv包含与CTLA-4结合的ABDH3.23_L0.129；
(4)形式包括H0.66_L0的ICOS ABD，与结合LAG-3的ABD 7G8_H.303_L1.34组合；
(5)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合GITR；
(6)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合OX40；
(7)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合ICOS；
8)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合4-1BB；和
(9)形式包括与ICOS结合的H0.66_L0的ABD和与PD-L1结合的ABD。
具体而言，图9示出一些开瓶器“主链”序列，其丢失了可以在本发明中使用的Fv序列。也就是说，scFv部分和Fab部分的Fv序列可以从以下的任何组合使用：ICOS和PD-1、ICOS和CTLA-4、ICOS和LAG-3、ICOS和TIM-3、ICOS和PD-L1、ICOS和BTLA、ICOS和TIGIT、GITR和TIGIT、GITR和PD-1、GITR和CTLA-4、GITR和LAG-3、GITR和TIM-3、GITR和PD-L1、GITR和BTLA、OX40和PD-1、OX40和TIGIT、OX40和CTLA-4、IC OX40 OS和LAG-3、OX40和TIM-3、OX40和PD-L1、OX40和BTLA、4-1BB和PD-1、4-1BB和CTLA-4、4-1BB和LAG-3、4-1BB和TIM-3、4-1BB和PD-L1、TIGIT和4-1BB以及4-1BB和BTLA，与主链1至10的任何或所有组合，在这些组合中具有特别使用的主链1。
对于图9的开瓶器主链1(任选地包括428L/434S变体)，在本发明中使用的特定的Fv组合包括ICOS和PD-1、ICOS和PD-L1和ICOS和CTLA-4。
对于图9的开瓶器主链1(任选地包括428L/434S变体)，结合人ICOS的特定ABD包括但不限于[ICOS]_H0L0和[ICOS]H0.66_L0和在图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B中示出的那些以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665。
对于图9的开瓶器主链1(任选地包括428L/434S变体)，结合人GITR的特定的ABD包括但不限于在图18、图72和图73中的那些和在SEQ ID NO：26282-26290中列出的那些。
对于图9的开瓶器主链1(任选地包括428L/434S变体)，结合OX40的特定的ABD包括但不限于图17、图72和图73和在SEQ ID NO：26272-26281中列出的那些。
对于图9的开瓶器主链1(任选地包括428L/434S变体)，结合人4-1BB的特定的ABD包括但不限于图16、图72和图73和SEQ ID NO：26262-2671。
对于图9的开瓶器主链1(任选地包括428L/434S变体)，结合人PD-L1的特定的ABD包括但不限于图15A-15C、图73和图78和SEQ ID NO：3961-4432。
具体的开瓶器实施方案在下面概述。
B.mAb-Fv形式
在本发明中特别有用的一种异二聚体支架是mAb-Fv形式。在该实施方案中，该形式依赖于使用“额外”可变重链结构域的C-末端连接到一个单体和“额外”可变轻链结构域的C-末端连接到另一个单体，从而形成第三个抗原结合结构域(即“额外的”Fv结构域)，其中两个单体的Fab部分结合一个检查点靶标，“额外的”Fv结构域结合共刺激靶标。
在该实施方案中，第一单体包含第一重链，其包含第一可变重结构域和包含第一Fc结构域的第一恒定重结构域，其中第一可变轻结构域使用结构域接头(vh1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选的接头]-vl2)共价连接至第一Fc结构域的C末端。第二单体包含第二可变重结构域、包含第二Fc结构域的第二恒定重结构域和第三可变重结构域，第三可变重结构域使用结构域接头(vh1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选的接头]-vh2共价连接至第二Fc结构域的C末端。该实施方案进一步利用包含可变轻链结构域和恒定轻链结构域的共同轻链，其与重链缔合以形成包含两个相同Fv的两个相同Fab。两个C末端连接的可变结构域构成“额外的”第三Fv。对于本文的许多实施方案，这些构建体包括如本文所需和描述的偏斜变体、pI变体、消融变体、额外的Fc变体等。在该实施方案中，合适的Fv对包括(Fabs首先列出、“额外”Fv其次列出)ICOS X PD-1、ICOS X PD-L1、ICOS X CTLA-4、ICOS X LAG-3、ICOS X TIM-3、ICOS X BTLA、ICOS X TIGIT、TIGIT X ICOS、PD-1X ICOS、PD-L1 X ICOS、CTLA-4X ICOS、LAG-3X ICOS、TIM-3X ICOS、BTLA X ICOS、OX40 X TIGIT、OX40 X PD-1、OX40 X PD-L1、OX40 X CTLA-4、OX40 X LAG-3、OX40 X TIM-3、OX40 X BTLA、TIGIT X OX40、PD-1X OX40、PD-L1 X OX40、CTLA-4X OX40、LAG-3X OX40、TIM-3X OX40、BTLA X OX40、GITR X TIGIT、GITR X PD-1、GITR X PD-L1、GITR X CTLA-4、GITR X LAG-3、GITR X TIM-3、GITR X BTLA、TIGIT x GITR、PD-1X GITR、PD-L1 X GITR、CTLA-4X GITR、LAG-3X GITR、TIM-3X GITR、BTLA X GITR、4-1BB X TIGIT、4-1BB X PD-1、4-1BB X PD-L1、4-1BB XCTLA-4、4-1BB XLAG-3、4-1BB X TIM-3、4-1BB X BTLA、TIGIT X 4-1BB、PD-1X 4-1BB、PD-L1 X 4-1BB、CTLA-4X 4-1BB、LAG-3X 4-1BB、TIM-3X4-1BB和BTLA X 4-1BB。
这些组合的ABD序列可以如序列表中所公开的或如图中所示的。
此外，mAb-Fv形式的Fc结构域包括偏斜变体(例如，如在图4中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411T/E360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L，K370S：S364K/E357Q，T366S/L368A/Y407V：T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)，任选地消融变体(包括在图6中示出的那些)，任选地带电荷的scFv接头(包括在图8中所示的那些)和重链包括pI变体(包括在图5示出的那些)。
在一些实施方案中，mAb-Fv形式包括偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括mAb-Fv形式，其包含：a)第一单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及第一可变重结构域，其中第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域一起构成与第一检查点抑制剂结合的Fv，和第二可变重结构域；b)第二单体，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及第一可变重结构域，其与第一可变轻结构域一起构成与本文所述的第一受体(共刺激受体或检查点受体)结合的Fv，和第二可变轻链，其与第二可变重链一起形成结合第二受体(例如共刺激或检查点受体中的另一个)的Fv(ABD)；和c)包含第一可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链。在该形式的一些实施方案中特别有用的是(Fab-scFv顺序)ICOS XPD-1、PD-1X ICOS、PD-L1 X ICOS、ICOS x PD-L1、GITRX PD-1、OX40 XPD-1和4-1BB X PD-1。在具有该形式的这些变体的一些特定实施方案中：
(1)形式包括Fab ABD与ICOS结合，ICOS的ABD为[ICOS]H0.66_L0；
(2)形式包括与scFv ABD结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv ABD包含与PD-1结合的ABD 1G6_L1.194_H1.279；
(3)形式包括与scFv结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv包含与CTLA-4结合的ABDH3.23_L0.129；
(4)形式包括H0.66_L0的ICOS ABD，与结合LAG-3的ABD 7G8_H.303_L1.34组合；
(5)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合GITR；
(6)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合OX40；
(7)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合ICOS；
8)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合4-1BB；和
(9)形式包括与ICOS结合的H0.66_L0的ABD和与PD-L1结合的ABD。
在一些实施方案中，mAb-Fv形式包括偏斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施方案包括mAb-Fv形式，其包含：a)第一单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及第一可变重结构域，其中第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域一起构成与第一检查点抑制剂结合的Fv，和第二可变重结构域；b)第二单体，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及第一可变重结构域，其与第一可变轻结构域一起构成与本文所述的第一检查点受体结合的Fv，和第二可变轻链，其与第二可变重链一起形成结合第二检查点受体的Fv(ABD)；和c)包含第一可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链。在该形式的一些实施方案中特别有用的是(Fab-scFv顺序)ICOS X PD-1、ICOS x PD-L1、GITR X PD-1、OX40 X PD-1和4-1BB X PD-1。
对于图75的类似于mAb-scFv主链1(可选地包括M428L/N434S)的mAb-Fv序列，结合人ICOS的特定ABD是[ICOS]_H0L0和[ICOS]_H0.66_L0，以及在图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中示出的那些。
对于图75的类似于mAb-scFv主链1(可选地包括M428L/N434S)的mAb-Fv序列，结合人PD-L1的特定ABD显示在图15A-15C、图73和图78以及SEQ ID NO：3961-4432中。
对于图75的类似于mAb-scFv主链1(可选地包括M428L/N434S)的mAb-Fv序列，结合人GITR的特定ABD是在图18、图72和图73中的那些以及在SEQ ID NO：26282-26290中列出的那些。
对于图75的类似于mAb-scFv主链1(可选地包括M428L/N434S)的mAb-Fv序列，结合人4-1BB的特定ABD是在图16、图72和图73以及SEQ ID NO：26262-2671中的那些。
对于图75的类似于mAb-scFv主链1(可选地包括M428L/N434S)的mAb-Fv序列，结合人OX40的特定ABD是在图17、图72和图73中的那些以及在SEQ ID NO：26272-26281中列出的那些。
对于图75的类似于mAb-scFv主链1(可选地包括M428L/N434S)的mAb-Fv序列，结合人PD-L1的特定ABD来自图15A-15C、图73和图78以及SEQ ID NO：3961-4432。
C.mAb-scFv
在本发明中特别有用的一种异二聚体支架是mAb-scFv形式。在该实施方案中，该形式依赖于使用scFv与单体之一的C-末端连接，从而形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分结合一个受体靶标并且“额外”scFv结构域结合其他受体靶标(通常是单价结合的共刺激受体)。
在该实施方案中，第一单体包含第一重链(其包含可变重结构域和恒定结构域)，其中C末端共价连接的scFv包含scFv可变轻结构域、scFv接头和scFv可变重结构域，其以任一取向(vh1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选的接头]-vh2-scFv接头-vl2或vh1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选的接头]-vl2-scFv接头-vh2)。该实施方案进一步利用包含可变轻结构域和恒定轻结构域的共同轻链，其与重链缔合以形成结合靶受体之一的两个相同Fab。对于本文的许多实施方案，这些构建体包括如本文所需和描述的偏斜变体、pI变体、消融变体、额外的Fc变体等。在该实施方案中，合适的Fv对包括(Fabs首先列出、scFv其次列出)ICOS X PD-1、ICOS X PD-L1、ICOS X CTLA-4、ICOS X LAG-3、ICOS XTIM-3、ICOS X BTLA、ICOS X TIGIT、TIGIT X ICOS、PD-1X ICOS、PD-L1 XICOS、CTLA-4X ICOS、LAG-3X ICOS、TIM-3X ICOS、BTLAX ICOS、OX40 XTIGIT、OX40 X PD-1、OX40 X PD-L1、OX40 X CTLA-4、OX40 X LAG-3、OX40XTIM-3、OX40 X BTLA、TIGIT X OX40、PD-1X OX40、PD-L1 X OX40、CTLA-4X OX40、LAG-3XOX40、TIM-3X OX40、BTLA X OX40、GITR X TIGIT、GITR X PD-1、GITR X PD-L1、GITR XCTLA-4、GITR X LAG-3、GITR X TIM-3、GITR X BTLA、TIGIT x GITR、PD-1X GITR、PD-L1 XGITR、CTLA-4X GITR、LAG-3X GITR、TIM-3X GITR、BTLA X GITR、4-1BB X TIGIT、4-1BB XPD-1、4-1BB X PD-L1、4-1BB X CTLA-4、4-1BB X LAG-3、4-1BB X TIM-3、4-1BB XBTLA、TIGIT X 4-1BB、PD-1X 4-1BB、PD-L1 X 4-1BB、CTLA-4X 4-1BB、LAG-3X 4-1BB、TIM-3X 4-1BB和BTLA X 4-1BB。
这些组合的ABD序列可以如序列表中所公开的或如图中所示的。
此外，mAb-scFv形式的Fc结构域一般包括偏斜变体(例如，如在图4中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411T/E360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L，K370S：S364K/E357Q，T366S/L368A/Y407V：T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)，任选地消融变体(包括在图6中示出的那些)，任选地带电荷的scFv接头(包括在图8中所示的那些)和重链包括pI变体(包括在图5示出的那些)。
在一些实施方案中，mAb-scFv形式包括偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括开瓶器形式，其包含：a)第一单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及第一可变重结构域，其中第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域一起构成与第一受体结合的Fv，和与第二受体结合的scFv；b)第二单体，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及第一可变重结构域，其与第一可变轻结构域一起构成与本文所述的第一受体结合的Fv；和c)包含第一可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链。在具有该形式的这些变体的一些特定实施方案中：
(1)形式包括Fab ABD与ICOS结合，ICOS的ABD为[ICOS]H0.66_L0；
(2)形式包括与scFv ABD结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv ABD包含与PD-1结合的ABD 1G6_L1.194_H1.279；
(3)形式包括与scFv结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv包含与CTLA-4结合的ABDH3.23_L0.129；
(4)形式包括H0.66_L0的ICOS ABD，与结合LAG-3的ABD 7G8_H.303_L1.34组合；
(5)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合GITR；
(6)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合OX40；
(7)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合ICOS；
8)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合4-1BB；和
(9)形式包括与ICOS结合的H0.66_L0的ABD和与PD-L1结合的ABD。
在一些实施方案中，mAb-scFv形式包括偏斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施方案包括mAb-scFv形式，其包含：a)第一单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及第一可变重结构域，其中第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域一起构成与第一受体结合的Fv，和与第二受体结合的scFv；b)第二单体，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及第一可变重结构域，其与第一可变轻结构域一起构成与本文所述的第一检查点受体结合的Fv；和c)包含第一可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链。
在图75的mAb-scFv主链1(可选地包括M428L/N434S)中，结合人ICOS的特定ABD显示在图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中。
在图75的mAb-scFv主链1(可选地包括M428L/N434S)中，结合人GITR的特定ABD是在图18、图72和图73中的那些以及在SEQ ID NO：26282-26290中列出的那些。
在图75的mAb-scFv主链1(可选地包括M428L/N434S)中，结合人4-1BB的特定ABD包括在图16、图72和图73以及SEQ ID NO：26262-2671中的那些。
在图75的mAb-scFv主链1(可选地包括M428L/N434S)中，结合人OX-40的特定ABD是在图17、图72和图73中的那些以及在SEQ ID NO：26272-26281中列出的那些。
在图75的mAb-scFv主链1(可选地包括M428L/N434S)中，结合人PD-L1的特定ABD包括图15A-15C、图73和图78以及SEQ ID NO：3961-4432。
D.中心scFv
在本发明中特别有用的一种异二聚体支架是中心-scFv形式。在该实施方案中，该形式依赖于***的scFv结构域的使用，从而形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分结合一个受体靶标并且“额外的”scFv结构域结合另一个(再次，通常地共刺激受体是单价结合的)。将scFv结构域***Fc结构域和单体之一的CH1-Fv区之间，从而提供第三抗原结合结构域。
在该实施方案中，一种单体包含第一重链，其包含第一可变重结构域、CH1结构域(和任选的铰链)和Fc结构域，其中scFv包含scFv可变轻结构域、scFv接头和scFv可变重结构域。使用任选的结构域接头共价连接在重恒定结构域的CH1结构域的C-末端和第一Fc结构域的N-末端之间(vh1-CH1-[任选的接头]-vh2-scFv接头-vl2-[包括铰链的任选接头]-CH2-CH3，或者对于scFv的相反方向，vh1-CH1-[任选的接头]-vl2-scFv接头-vh2-[包含铰链的任选接头]-CH2-CH3)。在一些实施方案中，任选的接头是其铰链或片段。其他单体是标准Fab侧(例如vh1-CH1-铰链-CH2-CH3)。该实施方案进一步利用包含可变轻结构域和恒定轻结构域的共同轻链，其与重链缔合以形成结合检查点抑制剂的两个相同Fab。对于本文的许多实施方案，这些构建体包括如本文所需和描述的偏斜变体、pI变体、消融变体、额外的Fc变体等。在该实施方案中，合适的Fv对包括(Fabs首先列出、scFv其次列出)ICOS X PD-1、ICOS X PD-L1、ICOS X CTLA-4、ICOS X LAG-3、ICOS X TIM-3、ICOS X BTLA、ICOS XTIGIT、TIGIT X ICOS、PD-1X ICOS、PD-L1 X ICOS、CTLA-4X ICOS、LAG-3X ICOS、TIM-3XICOS、BTLA X ICOS、OX40 X TIGIT、OX40 X PD-1、OX40 X PD-L1、OX40 X CTLA-4、OX40 XLAG-3、OX40 X TIM-3、OX40 X BTLA、TIGIT X OX40、PD-1X OX40、PD-L1 X OX40、CTLA-4XOX40、LAG-3X OX40、TIM-3X OX40、BTLA X OX40、GITR X TIGIT、GITR X PD-1、GITR X PD-L1、GITR X CTLA-4、GITR X LAG-3、GITR X TIM-3、GITR X BTLA、TIGIT x GITR、PD-1XGITR、PD-L1 X GITR、CTLA-4X GITR、LAG-3X GITR、TIM-3X GITR、BTLA X GITR、4-1BB XTIGIT、4-1BB X PD-1、4-1BB X PD-L1、4-1BB X CTLA-4、4-1BB XLAG-3、4-1BB X TIM-3、4-1BB X BTLA、TIGIT X 4-1BB、PD-1X 4-1BB、PD-L1 X 4-1BB、CTLA-4X 4-1BB、LAG-3X 4-1BB、TIM-3X 4-1BB和BTLA X 4-1BB。
这些组合的ABD序列可以如序列表中所公开的或如图中所示的。
此外，中心scFv形式的Fc结构域一般包括偏斜变体(例如，如在图4中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411T/E360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L，K370S：S364K/E357Q，T366S/L368A/Y407V：T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)，任选地消融变体(包括在图6中示出的那些)，任选地带电荷的scFv接头(包括在图8中所示的那些)和重链包括pI变体(包括在图5示出的那些)。
在一些实施方案中，中心scFv形式包括偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括中心scFv形式，其包含：a)第一单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及第一可变重结构域，其中第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域一起构成与第一受体结合的Fv；b)第二单体，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及第一可变重结构域，其与第一可变轻结构域一起构成与本文所述的第二受体结合的Fv；和c)包含第一可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链。在具有该形式的这些变体的一些特定实施方案中：
(1)形式包括Fab ABD与ICOS结合，ICOS的ABD为[ICOS]H0.66_L0；
(2)形式包括与scFv ABD结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv ABD包含与PD-1结合的ABD 1G6_L1.194_H1.279；
(3)形式包括与scFv结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv包含与CTLA-4结合的ABDH3.23_L0.129；
(4)形式包括H0.66_L0的ICOS ABD，与结合LAG-3的ABD 7G8_H.303_L1.34组合；
(5)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合GITR；
(6)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合OX40；
(7)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合ICOS；
8)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合4-1BB；和
(9)形式包括与ICOS结合的H0.66_L0的ABD和与PD-L1结合的ABD。
在一些实施方案中，中心scFv形式包括偏斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施方案包括中心-scFv形式，其包含：a)第一单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及第一可变重结构域，其中第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域一起构成与第一受体结合的Fv，和与第二受体结合的scFv结构域；b)第二单体，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及第一可变重结构域，其与第一可变轻结构域一起构成与本文所述的第一检查点受体结合的Fv；和c)包含第一可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链。在该实施方案中，合适的Fv对包括(Fabs首先列出，scFv其次列出)ICOS X PD-1、PD-1X ICOS、ICOS XPD-L1、PD-L1 X ICOS、ICOS X CTLA-4和CTLA-4X ICOS。
对于利用图55的中心scFv序列的中心scFv序列，结合ICOS的合适的Fv包括但不限于在图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中显示的。
对于利用图55的中心scFv序列的中心scFv序列，结合PD-L1的合适的Fv包括但不限于在图15A-15C、图73和图78以及SEQ ID NO：3961-4432中显示的那些。
对于利用图55的中心scFv序列的中心scFv序列，结合GITR的合适的Fv包括但不限于在图18、图72和图73以及SEQ ID NO：26282-26290中显示的那些。
对于利用图55的中心scFv序列的中心scFv序列，结合OX40的合适的Fv包括但不限于图17、图72和图73以及在SEQ ID NO：26272-26281中显示的那些。
对于利用图55的中心scFv序列的中心scFv序列，结合4-1BB的合适的Fv包括但不限于图16、图72和图73以及在SEQ ID NO：26262-2671。
E.中心-scFv2
在本发明中特别有用的一种异二聚体支架是中心-scFv2形式，其是双特异性的和四价的。在该实施方案中，该形式依赖于使用两个***的scFv结构域，从而形成第三和第四抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分结合一个受体靶标并且“额外的”scFv结构域结合另一个。将scFv结构域***Fc结构域和单体的CH1-Fv区之间。
在该实施方案中，两种单体均包含第一重链，其包含第一可变重结构域、CH1结构域(和任选的铰链)和Fc结构域，其中scFv包含scFv可变轻结构域、scFv接头和scFv可变重结构域。使用任选的结构域接头共价连接在重恒定结构域的CH1结构域的C-末端和第一Fc结构域的N-末端之间(vh1-CH1-[任选的接头]-vh2-scFv接头-vl2-[包括铰链的任选接头]-CH2-CH3，或者对于scFv的相反方向，vh1-CH1-[任选的接头]-vl2-scFv接头-vh2-[包含铰链的任选接头]-CH2-CH3)。在一些实施方案中，任选的接头是其铰链或片段。该实施方案进一步利用包含可变轻结构域和恒定轻结构域的共同轻链，其与重链缔合以形成结合受体的两个相同Fab。对于本文的许多实施方案，这些构建体包括如本文所需和描述的偏斜变体、pI变体、消融变体、额外的Fc变体等。在该实施方案中，合适的Fv对包括(Fabs首先列出、scFv其次列出)ICOS X PD-1、ICOS X PD-L1、ICOS X CTLA-4、ICOS X LAG-3、ICOS X TIM-3、ICOS X BTLA、ICOS X TIGIT、TIGIT X ICOS、PD-1X ICOS、PD-L1 X ICOS、CTLA-4X ICOS、LAG-3X ICOS、TIM-3X ICOS、BTLA X ICOS、OX40 X TIGIT、OX40 X PD-1、OX40 X PD-L1、OX40 X CTLA-4、OX40 X LAG-3、OX40 X TIM-3、OX40 X BTLA、TIGIT X OX40、PD-1X OX40、PD-L1 X OX40、CTLA-4X OX40、LAG-3X OX40、TIM-3X OX40、BTLA X OX40、GITR X TIGIT、GITR X PD-1、GITR X PD-L1、GITR X CTLA-4、GITR X LAG-3、GITR X TIM-3、GITR X BTLA、TIGIT x GITR、PD-1X GITR、PD-L1 X GITR、CTLA-4X GITR、LAG-3X GITR、TIM-3X GITR、BTLA X GITR、4-1BB X TIGIT、4-1BB X PD-1、4-1BB X PD-L1、4-1BB XCTLA-4、4-1BB XLAG-3、4-1BB X TIM-3、4-1BB X BTLA、TIGIT X 4-1BB、PD-1X 4-1BB、PD-L1 X 4-1BB、CTLA-4X 4-1BB、LAG-3X 4-1BB、TIM-3X4-1BB和BTLA X 4-1BB。
这些组合的ABD序列可以如序列表中所公开的或如图中所示的。
此外，中心scFv2形式的Fc结构域一般包括偏斜变体(例如，如在图4中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411T/E360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L，K370S：S364K/E357Q，T366S/L368A/Y407V：T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)，任选地消融变体(包括在图6中示出的那些)，任选地带电荷的scFv接头(包括在图8中所示的那些)和重链包括pI变体(包括在图5示出的那些)。
在一些实施方案中，中心scFv2形式包括偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括中心scFv形式，其包含：a)第一单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及第一可变重结构域，其中第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域一起构成与第一受体结合的Fv；b)第二单体，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及第一可变重结构域，其与第一可变轻结构域一起构成与本文所述的第二受体结合的Fv；和c)包含第一可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链。在具有该形式的这些变体的一些特定实施方案中：
(1)形式包括Fab ABD与ICOS结合，ICOS的ABD为[ICOS]H0.66_L0；
(2)形式包括与scFv ABD结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv ABD包含与PD-1结合的ABD 1G6_L1.194_H1.279；
(3)形式包括与scFv结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv包含与CTLA-4结合的ABDH3.23_L0.129；
(4)形式包括H0.66_L0的ICOS ABD，与结合LAG-3的ABD7G8_H.303_L1.34组合；
(5)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合GITR；
(6)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合OX40；
(7)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合ICOS；
8)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合4-1BB；和
(9)形式包括与ICOS结合的H0.66_L0的ABD和与PD-L1结合的ABD。
在一些实施方案中，中心scFv2形式包括偏斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施方案包括中心-scFv形式，其包含：a)第一单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及第一可变重结构域，其中第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域一起构成与第一受体结合的Fv，和与第二受体结合的scFv结构域；b)第二单体，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及第一可变重结构域，其与第一可变轻结构域一起构成与本文所述的第一检查点受体结合的Fv；和c)包含第一可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链。在该实施方案中，合适的Fv对包括(Fabs首先列出，scFv其次列出)ICOS X PD-1、PD-1X ICOS、ICOS XPD-L1、PD-L1 X ICOS、ICOS X CTLA-4和CTLA-4X ICOS。
对于利用图55的中心scFv2序列的中心scFv2序列，结合ICOS的合适的Fv包括但不限于在图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中显示的。
对于利用图55的中心scFv2序列的中心scFv2序列，结合PD-L1的合适的Fv包括但不限于在图15A-15C、图73和图78以及SEQ ID NO：3961-4432中显示的那些。
对于利用图55的中心scFv序列的中心scFv2序列，结合GITR的合适的Fv包括但不限于在图18、图72和图73以及SEQ ID NO：26282-26290中显示的那些。
对于利用图55的中心scFv序列的中心scFv2序列，结合OX40的合适的Fv包括但不限于图17、图72和图73以及在SEQ ID NO：26272-26281中显示的那些。
对于利用图55的中心scFv序列的中心scFv2序列，结合4-1BB的合适的Fv包括但不限于图16、图72和图73以及在SEQ ID NO：26262-2671。
F.单臂mAb
如上所述，令人惊讶和出乎意料的是，包含针对靶标的单个ABD的单价共刺激抗体显示出激活T细胞的功效。
因此，在一些实施方案中，本发明提供一价的单特异性抗体，如图2N中所示，其包含异二聚体Fc结构域(为了稳定性)。在该实施方案中，在该实施方案中，一种单体仅包含Fc结构域，而另一种单体是HC(VH1-CH1-铰链-CH2-CH3)。该实施方案进一步利用包含可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链，其与重链缔合以形成Fab。对于本文的许多实施方案，这些构建体包括如本文所需和描述的偏斜变体、pI变体、消融变体、额外的Fc变体等。在该实施方案中，合适的ABD结合共刺激受体，例如ICOS、GITR、OX40或4-1BB。
这些组合的ABD序列可以如序列表中所公开的或如图中所示的。
此外，Fc结构域包括偏斜变体(例如，如在图4中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411T/E360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L，K370S：S364K/E357Q，T366S/L368A/Y407V：T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)，任选地消融变体(包括在图6中示出的那些)，和重链包括pI变体(包括在图5示出的那些)。
在一些实施方案中，单臂scFv-mAb形式包括偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括包含以下的形式：a)第一(Fc)单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；b)第二单体，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及第一可变重结构域，其与第一可变轻结构域一起构成与本文所述的共刺激受体结合的Fv。
在该形式中，结合人ICOS的特定的ABD包括但不限于[ICOS]_H0L0和[ICOS]H0.66_L0以及在图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中显示的那些。
在该形式中，结合人GITR的特定的ABD包括但不限于在图18、图72和图73中的那些和在SEQ ID NO：26282-26290中列出的那些。
在该形式中，结合OX40的特定的ABD包括但不限于图17、图72和图73以及在SEQ IDNO：26272-26281中列出的那些。
在该形式中，结合人4-1BB的特定的ABD包括但不限于图16、图72和图73以及SEQID NO：26262-2671。
在该形式中，结合人PD-L1的特定的ABD包括但不限于图15A-15C、图73和图78以及SEQ ID NO：3961-4432。
具体的“单臂mAb”显示在图和序列表中。
G.双特异性mAb
在本发明中特别使用的一种异二聚体支架是双特异性mAb形式，其是双特异性的和四价的。在该实施方案中，该形式依赖于产生单独的同型二聚体抗体，然后将其重组。在该形式中，存在一个HC-LC对(VH1-CH1-铰链-CH2-CH3和VL1-LC)和第二个Hc-LC对(VH2-CH1-铰链-CH2-CH3和VL2-LC)，例如两种不同的重链和两种不同的轻链。参考实施例5I(d)。
在该形式中，合适的对包括：ICOS和PD-1、ICOS和CTLA-4、ICOS和LAG-3、ICOS和TIM-3、ICOS和PD-L1、ICOS和BTLA、ICOS和TIGIT、GITR和TIGIT、GITR和PD-1、GITR和CTLA-4、GITR和LAG-3、GITR和TIM-3、GITR和PD-L1、GITR和BTLA、OX40和PD-1、OX40和TIGIT、OX40和CTLA-4、IC OX40 OS和LAG-3、OX40和TIM-3、OX40和PD-L1、OX40和BTLA、4-1BB和PD-1、4-1BB和CTLA-4、4-1BB和LAG-3、4-1BB和TIM-3、4-1BB和PD-L1、TIGIT和4-1BB以及4-1BB和BTLA。
在具有该形式的这些变体的一些特定实施方案中：
(1)形式包括Fab ABD与ICOS结合，ICOS的ABD为[ICOS]H0.66_L0；
(2)形式包括与ABD结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv ABD包含与PD-1结合的ABD1G6_L1.194_H1.279；
(3)形式包括与结合至CTLA-4的ABD H3.23_L0.129结合的H0.66_L0的ICOS ABD；
(4)形式包括H0.66_L0的ICOS ABD，与结合LAG-3的ABD 7G8_H.303_L1.34组合；
(5)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合GITR；
(6)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合OX40；
(7)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合ICOS；
8)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合4-1BB；和
(9)形式包括与ICOS结合的H0.66_L0的ABD和与PD-L1结合的ABD。
在该形式中，结合人ICOS的特定的ABD包括但不限于[ICOS]_H0L0和[ICOS]H0.66_L0以及在图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中显示的那些。
在该形式中，结合人GITR的特定的ABD包括但不限于在图18、图72和图73中的那些和在SEQ ID NO：26282-26290中列出的那些。
在该形式中，结合OX40的特定的ABD包括但不限于图17、图72和图73以及在SEQ IDNO：26272-26281中列出的那些。
在该形式中，结合人4-1BB的特定的ABD包括但不限于图16、图72和图73以及SEQID NO：26262-2671。
在该形式中，结合人PD-L1的特定的ABD包括但不限于图15A-15C、图73和图78以及SEQ ID NO：3961-4432。
H.中心-Fv形式
在本发明中特别使用的一种异二聚体支架是图2中所示的中心-Fv形式。在该实施方案中，该形式依赖于使用***的Fv结构域，从而形成“额外的”第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分结合一个受体，而“额外的”中心-Fv结构域结合另一个(通常为共刺激受体)。Fv结构域***Fc结构域和单体的CH1-Fv区之间，从而提供第三抗原结合结构域，其中每个单体含有Fv的组分(例如，一个单体包含可变重结构域，另一个单体包含“额外”中心Fv结构域的可变轻结构域)。
在该实施方案中，一种单体包含第一重链，其包含第一可变重结构域、CH1结构域和Fc结构域以及另外的可变轻结构域。使用结构域接头(vh1-CH1-[任选的接头]-vl2-铰链-CH2-CH3)将额外的可变轻链结构域共价连接在重恒定结构域的CH1结构域的C末端和第一Fc结构域的N末端之间。其他单体包含第一重链，其包含第一可变重结构域、CH1结构域和Fc结构域以及另外的可变重结构域(vh1-CH1-[任选的接头]-vh2-铰链-CH2-CH3)。使用结构域接头将额外的可变重链结构域共价连接在重恒定结构域的CH1结构域的C末端和第一Fc结构域的N末端之间。该实施方案利用包含可变轻结构域和恒定轻结构域的共同轻链，其与重链缔合以形成每个结合受体的两个相同Fab。另外的可变重链结构域和另外的可变轻链结构域形成结合第二受体的“额外”中心Fv。对于本文的许多实施方案，这些构建体包括如本文所需和描述的偏斜变体、pI变体、消融变体、额外的Fc变体等。在该实施方案中，合适的Fv对包括(Fabs首先列出、“额外的”中心Fv其次列出)ICOS X PD-1、ICOS X PD-L1、ICOSXCTLA-4、ICOS X LAG-3、ICOS X TIM-3、ICOS X BTLA、ICOS X TIGIT、TIGIT X ICOS、PD-1XICOS、PD-L1 X ICOS、CTLA-4X ICOS、LAG-3X ICOS、TIM-3X ICOS、BTLA X ICOS、OX40 XTIGIT、OX40 X PD-1、OX40 X PD-L1、OX40X CTLA-4、OX40 X LAG-3、OX40 X TIM-3、OX40 XBTLA、TIGIT X OX40、PD-1X OX40、PD-L1 X OX40、CTLA-4X OX40、LAG-3X OX40、TIM-3XOX40、BTLA X OX40、GITR X TIGIT、GITR X PD-1、GITR X PD-L1、GITR X CTLA-4、GITR XLAG-3、GITR X TIM-3、GITR X BTLA、TIGIT x GITR、PD-1X GITR、PD-L1 X GITR、CTLA-4XGITR、LAG-3X GITR、TIM-3X GITR、BTLA X GITR、4-1BB X TIGIT、4-1BB X PD-1、4-1BB XPD-L1、4-1BB X CTLA-4、4-1BB XLAG-3、4-1BB X TIM-3、4-1BB X BTLA、TIGIT X 4-1BB、PD-1X 4-1BB、PD-L1 X 4-1BB、CTLA-4X 4-1BB、LAG-3X 4-1BB、TIM-3X 4-1BB和BTLA X 4-1BB。
这些组合的ABD序列可以如序列表中所公开的或如图中所示的。
此外，中心Fv形式的Fc结构域一般包括偏斜变体(例如，如在图4中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411T/E360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L，K370S：S364K/E357Q，T366S/L368A/Y407V：T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)，任选地消融变体(包括在图6中示出的那些)，任选地带电荷的scFv接头(包括在图8中所示的那些)和重链包括pI变体(包括在图5示出的那些)。
在一些实施方案中，中心-Fv形式包括偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括中心scFv形式，其包含：a)第一单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及第一可变重结构域，其中第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域一起构成与第一受体结合的Fv；b)第二单体，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及第一可变重结构域，其与第一可变轻结构域一起构成与本文所述的第二受体结合的Fv；和c)包含第一可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链。在具有该形式的这些变体的一些特定实施方案中：
(1)形式包括Fab ABD与ICOS结合，ICOS的ABD为[ICOS]H0.66_L0；
(2)形式包括与scFv ABD结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv ABD包含与PD-1结合的ABD 1G6_L1.194_H1.279；
(3)形式包括与scFv结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv包含与CTLA-4结合的ABDH3.23_L0.129；
(4)形式包括H0.66_L0的ICOS ABD，与结合LAG-3的ABD 7G8_H.303_L1.34组合；
(5)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合GITR；
(6)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合OX40；
(7)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合ICOS；
8)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合4-1BB；和
(9)形式包括与ICOS结合的H0.66_L0的ABD和与PD-L1结合的ABD。
在一些实施方案中，中心-Fv形式包括偏斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施方案包括中心-scFv形式，其包含：a)第一单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及第一可变重结构域，其中第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域一起构成与第一受体结合的Fv，和与第二受体结合的scFv结构域；b)第二单体，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及第一可变重结构域，其与第一可变轻结构域一起构成与本文所述的第一检查点受体结合的Fv；和c)包含第一可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链。在该实施方案中，合适的Fv对包括(Fabs首先列出，scFv其次列出)ICOS X PD-1、PD-1X ICOS、ICOS X PD-L1、PD-L1 X ICOS、ICOS X CTLA-4和CTLA-4X ICOS。
对于中心Fv形式，结合ICOS的合适的Fv包括但不限于在图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中显示的。
对于中心Fv形式，结合PD-L1的合适的Fv包括但不限于在图15A-15C、图73和图78以及SEQ ID NO：3961-4432中显示的那些。
对于中心Fv形式，结合GITR的合适的Fv包括但不限于在图18、图72和图73以及SEQID NO：26282-26290中显示的那些。
对于中心Fv形式，结合OX40的合适的Fv包括但不限于图17、图72和图73以及在SEQID NO：26272-26281中列出的那些。
对于中心Fv形式，结合4-1BB的合适的Fv包括但不限于图16、图72和图73以及SEQID NO：26262-2671中。
对于中心Fv形式，结合PD-L1的合适的Fv包括但不限于图15A-15C、图73和图78以及SEQ ID NO：3961-4432中的那些。
I.单臂中心-scFv
在本发明中特别使用的一种异二聚体支架是图1中所示的单臂中心-scFv形式。在该实施方案中，一种单体仅包含Fc结构域，而另一种单体包含Fab结构域(第一抗原结合结构域)、scFv结构域(第二抗原结合结构域)和Fc结构域，其中scFv结构域***在Fc结构域和Fc结构域之间。在该形式中，Fab部分结合一个受体靶标，scFv结合另一个受体靶标。
在该实施方案中，一种单体包含第一重链，其包含第一可变重结构域、CH1结构域和Fc结构域，其中scFv包含scFv可变轻结构域、scFv接头和scFv可变重结构域。scFv使用结构域接头在任一方向上共价连接在重恒定结构域的CH1结构域的C末端和第一Fc结构域的N末端之间，VH1-CH1-[任选的结构域接头]-VH2-scFv接头-VL2-[任选的结构域接头]-CH2-CH3或VH1-CH1-[任选的结构域接头]-VL2-scFv接头-VH2-[任选的结构域接头]-CH2-CH3。第二单体包含Fc结构域(CH2-CH3)。该实施方案进一步利用包含可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链，其与重链缔合以形成Fab。对于本文的许多实施方案，这些构建体包括如本文所需和描述的偏斜变体、pI变体、消融变体、额外的Fc变体等。在该实施方案中，合适的Fv对包括(Fabs首先列出、scFv其次列出)ICOS X PD-1、ICOS X PD-L1、ICOS X CTLA-4、ICOS XLAG-3、ICOS XTIM-3、ICOS X BTLA、ICOS X TIGIT、TIGIT X ICOS、PD-1X ICOS、PD-L1XICOS、CTLA-4X ICOS、LAG-3X ICOS、TIM-3X ICOS、BTLA X ICOS、OX40 XTIGIT、OX40 X PD-1、OX40 X PD-L1、OX40 X CTLA-4、OX40 X LAG-3、OX40X TIM-3、OX40 X BTLA、TIGIT XOX40、PD-1X OX40、PD-L1 X OX40、CTLA-4X OX40、LAG-3X OX40、TIM-3X OX40、BTLA XOX40、GITR X TIGIT、GITR X PD-1、GITR X PD-L1、GITR X CTLA-4、GITR X LAG-3、GITR XTIM-3、GITR X BTLA、TIGIT x GITR、PD-1X GITR、PD-L1 X GITR、CTLA-4X GITR、LAG-3XGITR、TIM-3X GITR、BTLA X GITR、4-1BB X TIGIT、4-1BB X PD-1、4-1BB X PD-L1、4-1BB XCTLA-4、4-1BB X LAG-3、4-1BB X TIM-3、4-1BB XBTLA、TIGIT X 4-1BB、PD-1X 4-1BB、PD-L1 X 4-1BB、CTLA-4X 4-1BB、LAG-3X 4-1BB、TIM-3X 4-1BB和BTLA X 4-1BB。
这些组合的ABD序列可以如序列表中所公开或如图中所示。
此外，单臂中心-scFv形式的Fc结构域一般包括偏斜变体(例如，如在图4中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411T/E360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L，K370S：S364K/E357Q，T366S/L368A/Y407V：T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)，任选地消融变体(包括在图6中示出的那些)，任选地带电荷的scFv接头(包括在图8中所示的那些)和重链包括pI变体(包括在图5示出的那些)。
在一些实施方案中，单臂中心-scFv形式包括偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括包含以下的形式：a)第一单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及可变重结构域，其中可变重结构域与轻链的可变轻结构域一起构成与第一受体结合的Fv和与其他受体结合的scFv；b)第二单体，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和c)包含第一可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链。在具有该形式的这些变体的一些特定实施方案中：
(1)形式包括Fab ABD与ICOS结合，ICOS的ABD为[ICOS]H0.66_L0；
(2)形式包括与scFv ABD结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv ABD包含与PD-1结合的ABD 1G6_L1.194_H1.279；
(3)形式包括与scFv结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv包含与CTLA-4结合的ABDH3.23_L0.129；
(4)形式包括H0.66_L0的ICOS ABD，与结合LAG-3的ABD 7G8_H.303_L1.34组合；
(5)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合GITR；
(6)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合OX40；
(7)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合ICOS；
8)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合4-1BB；和
(9)形式包括与ICOS结合的H0.66_L0的ABD和与PD-L1结合的ABD。
在一些实施方案中，单臂中心-scFv形式包括偏斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施方案包括包含以下的形式：a)第一单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及第一可变重结构域，其中第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域一起构成与第一受体结合的Fv，和与第二受体结合的scFv结构域；b)第二单体，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S；和c)包含第一可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链。
在该形式中，结合人ICOS的特定的ABD包括但不限于[ICOS]_H0L0和[ICOS]H0.66_L0以及在图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中显示的那些。
在该形式中，结合人GITR的特定的ABD包括但不限于在图18、图72和图73中的那些和在SEQ ID NO：26282-26290中列出的那些。
在该形式中，结合OX40的特定的ABD包括但不限于图17、图72和图73以及在SEQ IDNO：26272-26281中列出的那些。
在该形式中，结合人4-1BB的特定的ABD包括但不限于图16、图72和图73以及SEQID NO：26262-2671。
在该形式中，结合人PD-L1的特定的ABD包括但不限于图15A-15C、图73和图78以及SEQ ID NO：3961-4432。
J.单臂scFv-mAb
在本发明中特别使用的一种异二聚体支架是图2D中所示的单臂scFv-mAb形式。在该实施方案中，一种单体仅包含Fc结构域，而另一种单体使用一般通过使用接头连接在重链N-末端的scFv结构域：vh1-scFv接头-vl1-[任选的结构域接头]-VH2-CH1-铰链-CH2-CH3或(以相反方向)vl1-scFv接头-vh1-[任选结构域接头]-VH2-CH1-铰链-CH2-CH3。在该形式中，任一Fab部分结合一个受体靶标，scFv结合另一个受体靶标。该实施方案进一步利用包含可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链，其与重链缔合以形成Fab。对于本文的许多实施方案，这些构建体包括如本文所需和描述的偏斜变体、pI变体、消融变体、额外的Fc变体等。在该实施方案中，合适的Fv对包括(Fabs首先列出、scFv其次列出)ICOS X PD-1、ICOS X PD-L1、ICOS X CTLA-4、ICOS X LAG-3、ICOS XTIM-3、ICOS X BTLA、ICOS X TIGIT、TIGIT XICOS、PD-1X ICOS、PD-L1 XICOS、CTLA-4X ICOS、LAG-3X ICOS、TIM-3X ICOS、BTLA X ICOS、OX40 XTIGIT、OX40 X PD-1、OX40 X PD-L1、OX40 X CTLA-4、OX40 X LAG-3、OX40X TIM-3、OX40 X BTLA、TIGIT X OX40、PD-1X OX40、PD-L1 X OX40、CTLA-4X OX40、LAG-3X OX40、TIM-3X OX40、BTLA X OX40、GITR X TIGIT、GITR X PD-1、GITR X PD-L1、GITR X CTLA-4、GITR X LAG-3、GITR X TIM-3、GITR X BTLA、TIGIT x GITR、PD-1X GITR、PD-L1 X GITR、CTLA-4X GITR、LAG-3X GITR、TIM-3X GITR、BTLA X GITR、4-1BB X TIGIT、4-1BB X PD-1、4-1BB X PD-L1、4-1BB X CTLA-4、4-1BB X LAG-3、4-1BB X TIM-3、4-1BB XBTLA、TIGIT X4-1BB、PD-1X 4-1BB、PD-L1 X 4-1BB、CTLA-4X 4-1BB、LAG-3X 4-1BB、TIM-3X 4-1BB和BTLAX 4-1BB。
这些组合的ABD序列可以如序列表中所公开的或如图中所示的。
此外，Fc结构域一般包括偏斜变体(例如，如在图4中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411T/E360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L，K370S：S364K/E357Q，T366S/L368A/Y407V：T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)，任选地消融变体(包括在图6中示出的那些)，任选地带电荷的scFv接头(包括在图8中所示的那些)和重链包括pI变体(包括在图5示出的那些)。
在一些实施方案中，单臂scFv-mAb形式包括偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括包含以下的形式：a)第一单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及第一可变重结构域，其中第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域一起构成与第一检查点抑制剂结合的Fv，和第二可变重结构域；b)第二单体，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及第一可变重结构域，其与第一可变轻结构域一起构成与本文所述的第一检查点受体结合的Fv，和第二可变轻链，其与第二可变重链一起形成结合第二检查点受体的Fv(ABD)；和c)包含第一可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链。在具有该形式的这些变体的一些特定实施方案中：
(1)形式包括Fab ABD与ICOS结合，ICOS的ABD为[ICOS]H0.66_L0；
(2)形式包括与scFv ABD结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv ABD包含与PD-1结合的ABD 1G6_L1.194_H1.279；
(3)形式包括与scFv结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv包含与CTLA-4结合的ABDH3.23_L0.129；
(4)形式包括H0.66_L0的ICOS ABD，与结合LAG-3的ABD 7G8_H.303_L1.34组合；
(5)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合GITR；
(6)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合OX40；
(7)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合ICOS；
8)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合4-1BB；和
(9)形式包括与ICOS结合的H0.66_L0的ABD和与PD-L1结合的ABD。
在一些实施方案中，单臂scFv-mAb形式包括偏斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施方案包括开瓶器形式，其包含：a)第一单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及第一可变重结构域，其中第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域一起构成与第一检查点抑制剂结合的Fv，和第二可变重结构域；b)第二单体，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及第一可变重结构域，其与第一可变轻结构域一起构成与本文所述的第一检查点受体结合的Fv，和第二可变轻链，其与第二可变重链一起形成结合第二检查点受体的Fv(ABD)；和c)包含第一可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链。
在该形式中，结合人ICOS的特定的ABD包括但不限于[ICOS]_H0L0和[ICOS]H0.66_L0以及在图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中显示的那些。
在该形式中，结合人GITR的特定的ABD包括但不限于在图18、图72和图73中的那些和在SEQ ID NO：26282-26290中列出的那些。
在该形式中，结合OX40的特定的ABD包括但不限于图17、图72和图73以及在SEQ IDNO：26272-26281中列出的那些。
在该形式中，结合人4-1BB的特定的ABD包括但不限于图16、图72和图73以及SEQID NO：26262-2671。
在该形式中，结合人PD-L1的特定的ABD包括但不限于图15A-15C、图73和图78以及SEQ ID NO：3961-4432。
K.scFv-mAb形式
在本发明中特别使用的一种异二聚体支架是图2E中所示的mAb-scFv形式。在该实施方案中，该形式依赖于使用scFv的N-末端连接至单体之一，从而形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分各自结合一个靶标并且“额外”scFv结构域结合不同的靶标。
在该实施方案中，第一单体包含第一重链(其包含可变重结构域和恒定结构域)，其中N末端共价连接的scFv包含scFv可变轻结构域、scFv接头和scFv可变重结构域，以任一方向((vh1-scFv接头-vl1-[任选的结构域接头]-vh2-CH1-铰链-CH2-CH3)或(对于scFv在相反方向)((vl1-scFv接头-vh1-[任选的结构域接头]-vh2-CH1-铰链-CH2-CH3))。第二单体包含重链VH20CH1-铰链-CH2-CH3。该实施方案进一步利用包含可变轻结构域和恒定轻结构域的共同轻链，其与重链缔合以形成结合靶抗原之一的两个相同Fab。对于本文的许多实施方案，这些构建体包括如本文所需和描述的偏斜变体、pI变体、消融变体、额外的Fc变体等。在该实施方案中，合适的Fv对包括(Fabs首先列出、scFv其次列出)ICOS X PD-1、ICOS XPD-L1、ICOS X CTLA-4、ICOS X LAG-3、ICOS X TIM-3、ICOS X BTLA、ICOS X TIGIT、TIGITX ICOS、PD-1X ICOS、PD-L1 X ICOS、CTLA-4X ICOS、LAG-3X ICOS、TIM-3X ICOS、BTLA XICOS、OX40 X TIGIT、OX40 X PD-1、OX40 X PD-L1、OX40 X CTLA-4、OX40 X LAG-3、OX40 XTIM-3、OX40 X BTLA、TIGIT X OX40、PD-1X OX40、PD-L1 X OX40、CTLA-4X OX40、LAG-3XOX40、TIM-3X OX40、BTLA X OX40、GITR X TIGIT、GITR X PD-1、GITR X PD-L1、GITR XCTLA-4、GITR X LAG-3、GITR X TIM-3、GITR X BTLA、TIGIT x GITR、PD-1X GITR、PD-L1 XGITR、CTLA-4X GITR、LAG-3X GITR、TIM-3X GITR、BTLA X GITR、4-1BB X TIGIT、4-1BB XPD-1、4-1BB X PD-L1、4-1BB X CTLA-4、4-1BB X LAG-3、4-1BB X TIM-3、4-1BB XBTLA、TIGIT X 4-1BB、PD-1X 4-1BB、PD-L1 X 4-1BB、CTLA-4X 4-1BB、LAG-3X 4-1BB、TIM-3X 4-1BB和BTLA X 4-1BB。
这些组合的ABD序列可以如序列表或附图中所公开。
此外，scFv-mAb形式的Fc结构域一般包括偏斜变体(例如，如在图4中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411T/E360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L，K370S：S364K/E357Q，T366S/L368A/Y407V：T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)，任选地消融变体(包括在图6中示出的那些)，任选地带电荷的scFv接头(包括在图8中所示的那些)和重链包括pI变体(包括在图5示出的那些)。
在一些实施方案中，mAb-scFv形式包括偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括开瓶器形式，其包含：a)第一单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及第一可变重结构域，其中第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域一起构成与第一检查点抑制剂结合的Fv，和第二可变重结构域；b)第二单体，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及第一可变重结构域，其与第一可变轻结构域一起构成与本文所述的第一检查点受体结合的Fv，和第二可变轻链，其与第二可变重链一起形成结合第二检查点受体的Fv(ABD)；和c)包含第一可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链。在具有该形式的这些变体的一些特定实施方案中：
(1)形式包括Fab ABD与ICOS结合，ICOS的ABD为[ICOS]H0.66_L0；
(2)形式包括与scFv ABD结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv ABD包含与PD-1结合的ABD 1G6_L1.194_H1.279；
(3)形式包括与scFv结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv包含与CTLA-4结合的ABDH3.23_L0.129；
(4)形式包括H0.66_L0的ICOS ABD，与结合LAG-3的ABD 7G8_H.303_L1.34组合；
(5)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合GITR；
(6)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合OX40；
(7)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合ICOS；
8)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合4-1BB；和
(9)形式包括与ICOS结合的H0.66_L0的ABD和与PD-L1结合的ABD。
在一些实施方案中，mAb-scFv形式包括偏斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施方案包括开瓶器形式，其包含：a)第一单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及第一可变重结构域，其中第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域一起构成与第一检查点抑制剂结合的Fv，和第二可变重结构域；b)第二单体，其包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及第一可变重结构域，其与第一可变轻结构域一起构成与本文所述的第一检查点受体结合的Fv，和第二可变轻链，其与第二可变重链一起形成结合第二检查点受体的Fv(ABD)；和c)包含第一可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链。
在该形式中，结合人ICOS的特定的ABD包括但不限于[ICOS]_H0L0和[ICOS]H0.66_L0以及在图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中显示的那些。
在该形式中，结合人GITR的特定的ABD包括但不限于在图18、图72和图73中的那些和在SEQ ID NO：26282-26290中列出的那些。
在该形式中，结合OX40的特定的ABD包括但不限于图17、图72和图73以及在SEQ IDNO：26272-26281中列出的那些。
在该形式中，结合人4-1BB的特定的ABD包括但不限于图16、图72和图73以及SEQID NO：26262-2671。
在该形式中，结合人PD-L1的特定的ABD包括但不限于图15A-15C、图73和图78以及SEQ ID NO：3961-4432。
L.双scFv形式
本发明还提供了如在本领域中已知的并且在图2B中显示的双scFv形式。在该实施方案中，异二聚体双特异性抗体由两种scFv-Fc单体组成(均为(vh-scFv接头-v1-[任选结构域接头]-CH2-CH3)形式或(v1-scFv接头-vh-[任选结构域接头]-CH2-CH3)形式，或一种单体在一个取向和另一种单体在另一个取向。
在这种情况下，所有ABD都采用scFv形式，其中ICOS和PD-1、ICOS和CTLA-4、ICOS和LAG-3、ICOS和TIM-3、ICOS和PD-L1、ICOS和BTLA、GITR和PD-1、GITR和CTLA-4、GITR和LAG-3、GITR和TIM-3、GITR和PD-L1、GITR和BTLA、OX40和PD-1、OX40和CTLA-4、OX40和LAG-3、OX40和TIM-3、OX40和PD-L1、OX40和BTLA、4-1BB和PD-1、4-1BB和CTLA-4、4-1BB和LAG-3、4-1BB和TIM-3、4-1BB和PD-L1以及4-1BB和BTLA中的任一组合是有用的。这些组合的ABD序列可以如序列表中所公开的或如图中所示的。
此外，双scFv形式的Fc结构域一般包括偏斜变体(例如，如在图4中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411T/E360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L，K370S：S364K/E357Q，T366S/L368A/Y407V：T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)，任选地消融变体(包括在图6中示出的那些)，任选地带电荷的scFv接头(包括在图8中所示的那些)和重链包括pI变体(包括在图5示出的那些)。
在一些实施方案中，双scFv形式包括偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括包含以下的形式：a)第一单体，其包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和结合第一受体的scFv(VH1-scFv接头-VL1-[任选的结构域接头]-CH2-CH3或VL1-scFv接头-VH1-[任选的结构域接头]-CH2-CH3)和b)第一单体，其包含偏斜变体L368D/K370S的、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和结合第一受体的scFv(VH1-scFv接头-VL1-[任选的结构域接头]-CH2-CH3或VL1-scFv接头-VH1-[任选的结构域接头]-CH2-CH3)。pI变体可以如本文所概述，但最常见的是对每种单体带相反电荷的带电荷scFv接头。可任选地包括FcRn变体，特别是428L/434S。在具有该形式的这些变体的一些特定实施方案中：
(1)形式包括ABD与ICOS结合，ICOS的ABD为[ICOS]H0.66_L0；
(2)形式包括与ABD结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv ABD包含与PD-1结合的ABD1G6_L1.194_H1.279；
(3)形式包括与结合至CTLA-4的ABD H3.23_L0.129结合的H0.66_L0的ICOS ABD；
(4)形式包括H0.66_L0的ICOS ABD，与结合LAG-3的ABD 7G8_H.303_L1.34组合；
(5)形式包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合GITR；
(6)形式包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fv结合OX40；
(7)形式包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且ABD结合ICOS；
8)形式包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且ABD结合4-1BB；和
(9)形式包括与ICOS结合的H0.66_L0的ABD和与PD-L1结合的ABD。
在该形式中，结合人ICOS的特定的ABD包括但不限于[ICOS]_H0L0和[ICOS]H0.66_L0以及在图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中显示的那些。
在该形式中，结合人GITR的特定的ABD包括但不限于在图18、图72和图73中的那些和在SEQ ID NO：26282-26290中列出的那些。
在该形式中，结合OX40的特定的ABD包括但不限于图17、图72和图73以及在SEQ IDNO：26272-26281中列出的那些。
在该形式中，结合人4-1BB的特定的ABD包括但不限于图16、图72和图73以及SEQID NO：26262-2671。
在该形式中，结合人PD-L1的特定的ABD包括但不限于图15A-15C、图73和图78以及SEQ ID NO：3961-4432。
M.非异二聚体双特异性抗体
如本领域技术人员所理解的，本文概述的Fv序列也可用于两种单特异性抗体(例如，“传统的单克隆抗体”)或非异二聚体双特异性形式(见图2J、2K和2L)。
在该形式中，结合人ICOS的特定的ABD包括但不限于[ICOS]_H0L0和[ICOS]H0.66_L0以及在图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中显示的那些。
在该形式中，结合人GITR的特定的ABD包括但不限于在图18、图72和图73中的那些和在SEQ ID NO：26282-26290中列出的那些。
在该形式中，结合OX40的特定的ABD包括但不限于图17、图72和图73以及在SEQ IDNO：26272-26281中列出的那些。
在该形式中，结合人4-1BB的特定的ABD包括但不限于图16、图72和图73以及SEQID NO：26262-2671。
在该形式中，结合人PD-L1的特定的ABD包括但不限于图15A-15C、图73和图78以及SEQ ID NO：3961-4432。
合适的非异二聚体双特异性形式是本领域已知的，并且包括许多不同的形式，如Spiess等，Molecular Immunology(67)：95-106(2015)和Kontermann，mAbs 4：2,182-197(2012)中一般描述的，两者均明确地通过引用并入，特别是其中的图、图例和形式的引用。
N.DVD-Ig形式
在一些实施方案中，双特异性抗体呈“双重可变结构域-Ig”或“DVD-IgTM”形式(见图2L)，例如在美国专利7,612,181一般描述的，特此通过引用明确地并入本文，特别是其中的图和图例。在DVD-Ig形式中，抗体是四价和双特异性的，并且包含4个链：两个同型二聚体重链和两个相同的轻链。重链各自具有VH1-(任选的接头)-VH2-CH1-铰链-CH2-CH3结构，并且两条轻链各自具有VL1-任选的接头-VL2-CL结构，其中VH1和VL1形成第一ABD以及VH2和VL2形成第二ABD，其中第一和第二ABD结合共刺激和检查点受体。在该实施方案中，合适的组合包括ICOS和PD-1、ICOS和CTLA-4、ICOS和LAG-3、ICOS和TIM-3、ICOS和PD-L1、ICOS和BTLA、GITR和PD-1、GITR和CTLA-4、GITR和LAG-3、GITR和TIM-3、GITR和PD-L1、GITR和BTLA、OX40和PD-1、OX40和CTLA-4、OX40和LAG-3、OX40和TIM-3、OX40和PD-L1、OX40和BTLA、4-1BB和PD-1、4-1BB和CTLA-4、4-1BB和LAG-3、4-1BB和TIM-3、4-1BB和PD-L1以及4-1BB和BTLA。
DVD-IgTM和中心-scFv2是双特异性和四价的两种形式，因此不以单价方式结合共刺激受体。示例性的DVD-IgTM构建体示于图61。
在具有该形式的这些变体的一些特定实施方案中：
(1)形式包括[ICOS]H0.66_L0的ABD；
(2)形式包括与ABD结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv ABD包含与PD-1结合的ABD1G6_L1.194_H1.279；
(3)形式包括与结合至CTLA-4的ABD H3.23_L0.129结合的H0.66_L0的ICOS ABD；
(4)形式包括H0.66_L0的ICOS ABD，与结合LAG-3的ABD 7G8_H.303_L1.34组合；
(5)形式包括与PD-1结合的ABD 1G6_L1.194_H1.279和与GITR结合的ABD；
(6)形式包括与PD-1结合的ABD 1G6_L1.194_H1.279和与OX40结合的ABD；
(7)形式包括与PD-1结合的ABD 1G6_L1.194_H1.279和与ICOS结合的ABD；
8)形式包括与PD-1结合的ABD 1G6_L1.194_H1.279和与4-1BB结合的ABD；和
(9)形式包括与ICOS结合的H0.66_L0的ABD和与PD-L1结合的ABD。
在该形式中，结合人ICOS的特定的ABD包括但不限于[ICOS]_H0L0和[ICOS]H0.66_L0以及在图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中显示的那些。
在该形式中，结合人GITR的特定的ABD包括但不限于在图18、图72和图73中的那些和在SEQ ID NO：26282-26290中列出的那些。
在该形式中，结合OX40的特定的ABD包括但不限于图17、图72和图73以及在SEQ IDNO：26272-26281中列出的那些。
在该形式中，结合人4-1BB的特定的ABD包括但不限于图16、图72和图73以及SEQID NO：26262-2671。
在该形式中，结合人PD-L1的特定的ABD包括但不限于图15A-15C、图73和图78以及SEQ ID NO：3961-4432。
O.三齿形形式
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体是如WO2015/184203中一般描述的“三齿形”形式，其通过引用整体明确地并入本文，特别是“异二聚体促进结构域”或“HPD”的图、图例、定义和序列，包括“K卷曲螺旋”和“E卷曲螺旋”序列。三齿形依赖使用缔合以形成异二聚体结构作为结构的一个组成部分的两个不同HPD，见图2M。在该实施方案中，三齿形形式包括“传统的”重链和轻链(例如VH1-CH1-铰链-CH2-CH3和VL1-CL)，第三链，其包含第一“双抗体型结合结构域”或VH2-(接头)-VL3-HPD1，和第四链，其包含第二/>VH3-(接头)-(接头)-VL2-HPD2。VH1和VL1形成第一ABD，VH2和VL2形成第二ABD，VH3和VL3形成第三ABD。在一些情况下，如示于图2M中，第二和第三ABDS结合相同抗原，在这种情况下通常是检查点受体，例如二价地结合，其中第一ABD单价结合共刺激受体。在该实施方案中，合适的组合包括ICOS和PD-1、ICOS和CTLA-4、ICOS和LAG-3、ICOS和TIM-3、ICOS和PD-L1、ICOS和BTLA、GITR和PD-1、GITR和CTLA-4、GITR和LAG-3、GITR和TIM-3、GITR和PD-L1、GITR和BTLA、OX40和PD-1、OX40和CTLA-4、OX40和LAG-3、OX40和TIM-3、OX40和PD-L1、OX40和BTLA、4-1BB和PD-1、4-1BB和CTLA-4、4-1BB和LAG-3、4-1BB和TIM-3、4-1BB和PD-L1以及4-1BB和BTLA。
在具有该形式的这些变体的一些特定实施方案中：
(1)形式包括Fab ABD与ICOS结合，ICOS的ABD为[ICOS]H0.66_L0；
(2)形式包括与scFv ABD结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv ABD包含与PD-1结合的ABD 1G6_L1.194_H1.279；
(3)形式包括与scFv结合的H0.66_L0的ICOS ABD，scFv包含与CTLA-4结合的ABDH3.23_L0.129；
(4)形式包括H0.66_L0的ICOS ABD，与结合LAG-3的ABD 7G8_H.303_L1.34组合；
(5)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合GITR；
(6)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合OX40；
(7)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合ICOS；
8)形式包含scFv，其包含结合PD-1的ABD 1G6_L1.194_H1.279，并且Fab结合4-1BB；和
(9)形式包括与ICOS结合的H0.66_L0的ABD和与PD-L1结合的ABD。
在该形式中，结合人ICOS的特定的ABD包括但不限于[ICOS]_H0L0和[ICOS]H0.66_L0以及在图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中显示的那些。
在该形式中，结合人GITR的特定的ABD包括但不限于在图18、图72和图73中的那些和在SEQ ID NO：26282-26290中列出的那些。
在该形式中，结合OX40的特定的ABD包括但不限于图17、图72和图73以及在SEQ IDNO：26272-26281中列出的那些。
在该形式中，结合人4-1BB的特定的ABD包括但不限于图16、图72和图73以及SEQID NO：26262-2671。
在该形式中，结合人PD-L1的特定的ABD包括但不限于图15A-15C、图73和图78以及SEQ ID NO：3961-4432。
P.单特异性单克隆抗体
如本领域技术人员所理解的，本文概述的新型Fv序列也可用于单特异性抗体(例如“传统单克隆抗体”)或非异二聚体双特异性形式。因此，本发明提供了单克隆(单特异性)抗体，其包含附图中的6个CDR和/或vh和v1序列，通常具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区，其中IgG1、IgG2和IgG4(包括IgG4恒定区，其包含S228P氨基酸取代)在一些实施方案中发现特定用途。也就是说，本文中具有“H_L”名称的任何序列可以与人IgG1抗体的恒定区连接。
VIII.抗原结合结构域(ABD)与靶抗原
本发明的双特异性抗体具有两种不同的抗原结合结构域(ABD)，其以二价双特异性形式或三价双特异性形式结合两种不同的靶受体抗原(“靶对”)，如图2中一般所示。
双特异性抗体与包含检查点受体的第一靶抗原和包含共刺激受体的第二靶抗原结合。本文概述的合适的检查点受体包括PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、BTLA和TIGIT。本文概述的合适的共刺激受体包括ICOS、GITR、OX40和4-1BB。如上所述
合适的靶标检查点抗原包括人(有时是cyno)PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT和BTLA(序列表中的序列)。因此，合适的双特异性抗体结合ICOS和PD-1、ICOS和CTLA-4、ICOS和LAG-3、ICOS和TIM-3、ICOS和PD-L1、ICOS和BTLA、ICOS和TIGIT、GITR和TIGIT、GITR和PD-1、GITR和CTLA-4、GITR和LAG-3、GITR和TIM-3、GITR和PD-L1、GITR和BTLA、OX40和PD-1、OX40和TIGIT、OX40和CTLA-4、IC OX40 OS和LAG-3、OX40和TIM-3、OX40和PD-L1、OX40和BTLA、4-1BB和PD-1、4-1BB和CTLA-4、4-1BB和LAG-3、4-1BB和TIM-3、4-1BB和PD-L1、TIGIT和4-1BB以及4-1BB和BTLA。
注意，通常这些双特异性抗体被命名为“抗-PD-1X抗-CTLA-4”，或者通常简单地或容易地(并因此可互换地)作为每对的“PD-1X CTLA-4”等。注意，除非此处另有说明，否则名称中抗原列表的顺序不会赋予结构；即PD-1XCTLA-4开瓶器抗体可以具有与PD-1或CTLA-4结合的scFv，尽管在某些情况下，该顺序指定了所示的结构。
如本文中更全面概述的，ABD的这些组合可以是各种形式，如下所述，通常是一种ABD是Fab形式而另一种是scFv形式的组合。如本文所讨论和图2中所示，一些形式使用单个Fab和单个scFv(A、C和D)，并且一些形式使用两个Fab和单个scFv(E、F、G、H和I)。
A.抗原结合结构域
如本文所讨论的，本发明的双特异性检查点异二聚体抗体包括两个抗原结合结构域(ABD)，每个与不同的检查点蛋白结合。如本文所概述，这些异二聚体抗体可以是双特异性和二价的(每种抗原由单个ABD结合，例如，以图2A中描绘的形式)，双特异性和三价(一种抗原由单一ABD结合，而另一个由两个ABD结合，例如，如在图2F、2G、2H、2I或2M中描绘的)，或双特异性和四价(两种抗原由两个ABD结合，例如，如在图2J和2L中描绘)。
另外，通常，ABD之一包含本文概述的scFv，其在vh-scFv接头-v1或v1-scFv接头-vh的N-至C-末端的方向上。根据该形式，一种或两种其他ABD通常是Fab，其包含一条蛋白质链上的vh结构域(通常作为重链的组分)和另一条蛋白质链上的v1(通常作为轻链的组分)。注意，“三齿形”形式使用它与scFv类似，但方向不同，并且通常接头可能稍长。
本发明提供了许多与许多不同受体蛋白结合的ABD，如下所述。如本领域技术人员所理解的，任何一组6个CDR或vh和v1结构域可以是scFv形式或Fab形式，然后将其加入重和轻恒定结构域，其中重恒定结构域包含变体(包括在CH1结构域内以及Fc结构域内)。在序列表中包含的scFv序列利用特定带电荷接头，但如本文中所概述的，不带电荷的或其它带电荷的接头也可以被使用，包括在图8中描绘的那些。
另外，如上所述，序列表中用于鉴定CDR的编号是Kabat，然而，可以使用不同的编号，其将改变CDR的氨基酸序列，如表1所示。
对于本文列出的所有可变重和轻结构域，可以制备其他变体。如本文所概述的，在一些实施方案中，该组6个CDR可具有0、1、2、3、4或5个氨基酸修饰(具有特定用途的氨基酸取代)以及可变重和轻结构域的框架区的变化，只要框架(不包括CDR)与选自美国专利7,657,380的图1中所列的人种系序列保持至少约80％、85％或90％同一性，其中图和图例通过引用整体并入本文。因此，例如，如本文所述的相同CDR可以与来自人种系序列的不同框架序列组合，只要框架区与选自美国专利7,657,380的图1中列出的那些的人种系序列保持至少80％、85％或90％同一性。或者，CDR可以具有氨基酸修饰(例如，在CDR组中的1、2、3、4或5个氨基酸修饰(即，CDR可以被修饰，只要该组中的变化的总数少于6个氨基酸修饰，其中CDR的任何组合被改变；例如，vlCDR1可能有一个变化，vhCDR2中有两个变化，vhCDR3中没有变化等))，以及具有框架区变化，只要框架区与选自美国专利7,657,380的图1中所列的人种系序列保持至少约80％、85％或90％同一性。
B.PD-1抗原结合结构域
在一些实施方案中，ABD之一结合PD-1。6个CDR和/或vh和vl结构域的合适的组以及scFv序列被描绘在图3、图11、图72、图73、图74、图76和SEQ ID NO：1-2392、3125-3144、4697-7594和4697-21810中，并且包括在序列中具有标识符1G6_H1.279_L1.194；1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279；1G6_L1.210_H1.288；和2E9_H1L1的那些序列。
如本领域技术人员所理解的，合适的抗PD-1ABD可以包括如这些序列和图中所示的一组6个CDR，或者它们加了下划线，或者如本文所述和如表1中所示在使用不同编号方案的情况下，作为在这些序列的vh和v1序列内使用其他比对鉴定的CDR。合适的ABD还可以包括如这些序列和附图中所描绘的整个vh和v1序列，用作scFv或Fab。在本文的许多含有Fv至PD-1的实施方案中，是scFv单体结合PD-1。如本文中所讨论的，当PD-1是抗原之一时靶标对的另一个选自ICOS(合适的序列示于图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列))、GITR、OX40和4-1BB。
特别有用的结合人PD-1的ABD包括但不限于1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288和2E9_H1L1。
结合人PD-1的另外有用的vh和vl序列示于图76中。
除了在序列表中公开的形成ABD至PD-1的亲本CDR组之外，本发明还提供了变体CDR组。在一个实施方案中，一组6个CDR可以与亲本CDR具有1、2、3、4或5个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，BLI在许多实施方案中特别使用。
除了本文公开的形成ABD至PD-1的亲本可变重链和可变轻结构域之外，本发明还提供了变体vh和v1结构域。在一个实施方案中，变体vh和v1结构域各自可以具有与亲本vh和v1结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。在另一个实施方案中，变体vh和v1与相应的亲本vh或v1至少90、95、97、98或99％相同，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。
具体优选的实施方案包括1G6_L1.194_H1.279抗PD-1Fv，其以scFv形式，包括在图9的开瓶器形式主链的任一个内。
具体优选的实施方案包括1G6_L1.194_H1.279抗PD-1Fv，其以scFv形式，包括在图55的形式主链的任一个内。
具体优选的实施方案包括1G6_L1.194_H1.279抗PD-1Fv，其以scFv形式，包括在图75的mAb-scFv形式主链的任一个内。
其它实施方案利用任何抗PD-1VH和VL结构域对(作为scFv或Fab)，如图76中所示，以图2所示的任何形式。
C.CTLA-4抗原结合结构域
在一些实施方案中，ABD之一结合CTLA-4。6个CDR和/或vh和vl结构域的合适的组以及scFv序列被描绘在SEQ ID NOs:2393-2414和3737-3816中，以及在一些实施方案中特别感兴趣的序列在图12和图79中显示，并且还包括在序列表中具有下述标识符的那些序列：[CTLA-4]_H0.25_L0；[CTLA-4]_H0.26_L0；[CTLA-4]_H0.27_L0；[CTLA-4]_H0.29_L0；[CTLA-4]_H0.38_L0；[CTLA-4]_H0.39_L0；0[CTLA-4]_H0.40_L0；[CTLA-4]_H0.70_L0；[CTLA-4]_H0_L0.22；[CTLA-4]_H2_L0；[CTLA-4]_H3.21_L0.124；[CTLA-4]_H3.21_L0.129；[CTLA-4]_H3.21_L0.132；[CTLA-4]_H3.23_L0.124；[CTLA-4]_H3.23_L0.129；[CTLA-4]_H3.23_L0.132；[CTLA-4]_H3.25_L0.124；[CTLA-4]_H3.25_L0.129；[CTLA-4]_H3.25_L0.132；[CTLA-4]_H3.4_L0.118；[CTLA-4]_H3.4_L0.119；[CTLA-4]_H3.4_L0.12；[CTLA-4]_H3.4_L0.121；[CTLA-4]_H3.4_L0.122；[CTLA-4]_H3.4_L0.123；[CTLA-4]_H3.4_L0.124；[CTLA-4]_H3.4_L0.125；[CTLA-4]_H3.4_L0.126；[CTLA-4]_H3.4_L0.127；[CTLA-4]_H3.4_L0.128；[CTLA-4]_H3.4_L0.129；[CTLA-4]_H3.4_L0.130；[CTLA-4]_H3.4_L0.131；[CTLA-4]_H3.4_L0.132；[CTLA-4]_H3.5_L2.1；[CTLA-4]_H3.5_L2.2；[CTLA-4]_H3.5_L2.3；[CTLA-4]_H3_L0；[CTLA-4]_H3_L0.22；[CTLA-4]_H3_L0.44；[CTLA-4]_H3_L0.67；和[CTLA-4]_H3_L0.74。
如本领域技术人员所理解的，合适的抗CTLA-4ABD可以包括如这些序列和图中所示的一组6个CDR，或者它们加了下划线，或者如本文所述和如表1中所示在使用不同编号方案的情况下，作为在本文所述的vh和v1序列内使用其他比对鉴定的CDR。合适的ABD还可以包括如这些序列和附图中所描绘的整个vh和v1序列，用作scFv或Fab。在本文的许多含有Fv至CTLA-4的实施方案中，是scFv单体结合CTLA-4。
如本文中所讨论的，当CTLA-4是抗原之一时靶标对的另一个选自ICOS(合适的序列示于图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中，以及具有标识符[ICOS]_H0.66_L0和[ICOS]_H0L0的那些)、GITR、OX40和4-1BB。
除了在序列表中公开的形成ABD至CTLA-4的亲本CDR组之外，本发明还提供了变体CDR组。在一个实施方案中，一组6个CDR可以与亲本CDR具有1、2、3、4或5个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，BLI在许多实施方案中特别使用。
除了本文公开的形成ABD至CTLA-4的亲本可变重链和可变轻结构域之外，本发明还提供了变体vh和v1结构域。在一个实施方案中，变体vh和v1结构域各自可以具有与亲本vh和v1结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。在另一个实施方案中，变体vh和v1与相应的亲本vh或v1至少90、95、97、98或99％相同，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。
D.TIM-3抗原结合结构域
在一些实施方案中，ABD之一结合TIM-3。6个CDR和/或vh和vl结构域的合适的组以及scFv序列被描绘在图14和图81A-81C以及SEQ ID NO：3345-3704、4585-4696中。在一些实施方案中特别感兴趣的ABD序列包括序列表中具有标识符1D10_H0L0；1D12_H0L0；3H3_H1_L2.1；6C8_H0L0；6D9_H0_1D12_L0；7A9_H0L0；7B11_H0L0；7B11var_H0L0；和7C2_H0L0的那些序列。
如本领域技术人员所理解的，合适的抗TIM-3ABD可以包括如这些序列和图中所示的一组6个CDR，或者它们加了下划线，或者如本文所述和如表1中所示在使用不同编号方案的情况下，作为在本文所述那些的vh和v1序列内使用其他比对鉴定的CDR。合适的ABD还可以包括如这些序列和附图中所描绘的整个vh和v1序列，用作scFv或Fab。在本文的许多含有Fv至TIM-3的实施方案中，是Fab单体结合TIM-3。如本文中所讨论的，当TIM-3是抗原之一时靶标对的另一个选自ICOS(合适的序列示于图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中，以及具有标识符[ICOS]_H0.66_L0和[ICOS]_H0L0的那些)、GITR、OX40和4-1BB。
除了在序列表中公开的形成ABD至TIM-3的亲本CDR组之外，本发明还提供了变体CDR组。在一个实施方案中，一组6个CDR可以与亲本CDR具有1、2、3、4或5个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，BLI在许多实施方案中特别使用。
除了本文公开的形成ABD至TIM-3的亲本可变重链和可变轻结构域之外，本发明还提供了变体vh和v1结构域。在一个实施方案中，变体vh和v1结构域各自可以具有与亲本vh和v1结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。在另一个实施方案中，变体vh和v1与相应的亲本vh或v1至少90、95、97、98或99％相同，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。
LAG-3抗原结合结构域
在一些实施方案中，ABD之一结合LAG-3。6个CDR和/或vh和vl结构域的合适的组以及scFv序列被描绘在图13、图80和SEQ ID NO：2415-2604、3817-3960中，还包括序列表中具有下述标识符的那些序列：2A11_H0L0；2A11_H1.125_L2.113；2A11_H1.144_L2.142；2A11_H1_L2.122；2A11_H1_L2.123；2A11_H1_L2.124；2A11_H1_L2.25；2A11_H1_L2.47；2A11_H1_L2.50；2A11_H1_L2.91；2A11_H1_L2.93；2A11_H1_L2.97；2A11_H1L1；2A11_H1L2；2A11_H2L2；2A11_H3L1；2A11_H3L2；2A11_H4L1；2A11_H4L2；7G8_H0L0；7G8_H1L1；7G8_H3.18_L1.11；7G8_H3.23_L1.11；7G8_H3.28_L1；7G8_H3.28_L1.11；7G8_H3.28_L1.13；7G8_H3.30_L1.34；7G8_H3.30_L1.34；和7G8_H3L1。
如本领域技术人员所理解的，合适的抗LAG-3ABD可以包括如这些序列和图中所示的一组6个CDR，或者它们加了下划线，或者如本文所述和如表1中所示在使用不同编号方案的情况下，作为在本文序列的vh和v1序列内使用其他比对鉴定的CDR。合适的ABD还可以包括如这些序列和附图中所描绘的整个vh和v1序列，用作scFv或Fab。在本文的许多含有Fv至LAG-3的实施方案中，是Fab单体结合LAG-3。如本文中所讨论的，当LAG-3是抗原之一时靶标对的另一个选自ICOS(合适的序列示于图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中，以及具有标识符[ICOS]_H0.66_L0和[ICOS]_H0L0的那些)、GITR、OX40和4-1BB。
除了在序列表中公开的形成ABD至LAG-3的亲本CDR组之外，本发明还提供了变体CDR组。在一个实施方案中，一组6个CDR可以与亲本CDR具有1、2、3、4或5个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，BLI在许多实施方案中特别使用。
除了本文公开的形成ABD至LAG-3的亲本可变重链和可变轻结构域之外，本发明还提供了变体vh和v1结构域。在一个实施方案中，变体vh和v1结构域各自可以具有与亲本vh和v1结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。在另一个实施方案中，变体vh和v1与相应的亲本vh或v1至少90、95、97、98或99％相同，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。
E.BTLA抗原结合结构域
在一些实施方案中，ABD之一结合BTLA。6个CDR和/或vh和vl结构域的合适的组以及scFv序列被描绘于图82、图84A-84C和SEQ ID NO：3705-3736中，并且还包括序列表中具有标识符9C6_H0L0；9C6_H1.1_L1；和9C6_H1.11_L1的那些序列。
如本领域技术人员所理解的，合适的抗BTLA ABD可以包括如这些序列和图中所示的一组6个CDR，或者它们加了下划线，或者如本文所述和如表1中所示在使用不同编号方案的情况下，作为在本文所述的vh和v1序列内使用其他比对鉴定的CDR。合适的ABD还可以包括如这些序列和附图中所描绘的整个vh和v1序列，用作scFv或Fab。在本文的许多含有Fv至BTLA的实施方案中，是Fab单体结合BTLA。如本文中所讨论的，当BTLA是抗原之一时靶标对的另一个选自ICOS(合适的序列示于图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中，以及具有标识符[ICOS]_H0.66_L0和[ICOS]_H0L0的那些)、GITR、OX40和4-1BB。
除了在序列表中公开的形成ABD至BTLA的亲本CDR组之外，本发明还提供了变体CDR组。在一个实施方案中，一组6个CDR可以与亲本CDR具有1、2、3、4或5个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，BLI在许多实施方案中特别使用。
除了本文公开的形成ABD至BTLA的亲本可变重链和可变轻结构域之外，本发明还提供了变体vh和v1结构域。在一个实施方案中，变体vh和v1结构域各自可以具有与亲本vh和v1结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。在另一个实施方案中，变体vh和v1与相应的亲本vh或v1至少90、95、97、98或99％相同，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。
F.TIGIT抗原结合结构域
在一些实施方案中，ABD之一结合TIGIT。6个CDR和/或vh和v1结构域的合适的组以及scFv序列如在图8A-8B和在SEQ ID NO：4433-4585中所示。
如本领域技术人员所理解的，合适的抗TIGIT ABD可以包括如这些序列和图中所示的一组6个CDR，或者它们加了下划线，或者如本文所述和如表1中所示在使用不同编号方案的情况下，作为在本文所述的vh和v1序列内使用其他比对鉴定的CDR。合适的ABD还可以包括如这些序列和附图中所描绘的整个vh和v1序列，用作scFv或Fab。在本文的许多含有Fv至TIGIT的实施方案中，是Fab单体结合TIGIT。如本文中所讨论的，当TIGIT是抗原之一时靶标对的另一个选自ICOS(合适的序列示于图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中，以及具有标识符[ICOS]_H0.66_L0和[ICOS]_H0L0的那些)、GITR、OX40和4-1BB。
G.PD-L1抗原结合结构域
在一些实施方案中，ABD之一结合PD-L1。6个CDR和/或vh和v1结构域的合适的组以及scFv序列描绘于图15A-15C、图73和图78以及SEQ ID NO：3961-4432中。
如本领域技术人员所理解的，合适的抗TIGIT ABD可以包括如这些序列和图中所示的一组6个CDR，或者它们加了下划线，或者如本文所述和如表1中所示在使用不同编号方案的情况下，作为在本文所述的vh和v1序列内使用其他比对鉴定的CDR。合适的ABD还可以包括如这些序列和附图中所描绘的整个vh和v1序列，用作scFv或Fab。在本文的许多含有Fv至TIGIT的实施方案中，是Fab单体结合TIGIT。如本文中所讨论的，当TIGIT是抗原之一时靶标对的另一个选自ICOS(合适的序列示于图19、图20、图24、图68和图77以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中，以及具有标识符[ICOS]_H0.66_L0和[ICOS]_H0L0的那些)、GITR、OX40和4-1BB。
H.ICOS抗原结合结构域
在一些实施方案中，ABD之一结合ICOS。6个CDR和/或vh和v1结构域的合适的组以及scFv序列ICOS(合适的序列示于图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B以及SEQID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665中，以及具有标识符[ICOS]_H0.66_L0和[ICOS]_H0L0的那些。
如本领域技术人员所理解的，合适的抗ICOS ABD可以包括如这些序列和图中所示的一组6个CDR，或者它们加了下划线，或者如本文所述和如表1中所示在使用不同编号方案的情况下，作为在本文公开的序列内使用其他比对鉴定的CDR。合适的ABD还可以包括如这些序列和附图中所描绘的整个vh和v1序列，用作scFv或Fab。在本文的许多含有Fv至ICOS的实施方案中，是Fab单体结合ICOS。如本文中所讨论的，当ICOS是抗原之一时靶标对的另一个选自PD-1，其在图3、图10、图11、图72、图73、图74、图76和SEQ ID NO：1-2392、3125-3144、4697-7594和4697-21810中描绘并包括在序列表中具有下述标识符的那些：1G6_H1.279_L1.194；1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279；1G6_L1.210_H1.288；和2E9_H1L1(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和v1序列))，CTLA-4(合适的序列描绘于图12、72和79，以及SEQ ID NO：2393-2414和3737-3816(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和v1序列))，TIM-3(合适的序列描述于图14、图81和SEQ ID NO：3345-3704、4585-4696(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列))，LAG-3(合适的序列描绘于图13、图80和SEQ ID NO：2415-2604、3817-3960(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh)和vl序列))，BTLA(合适的序列描述于图82和84以及SEQ ID NO：3705-3736(可以是scFv序列、CDR序列组或vh和v1序列))和TIGIT(合适的序列描述于图XX和SEQ ID NO：4433-4585中(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和v1序列))。
除了在序列表中公开的形成ABD至ICOS的亲本CDR组之外，本发明还提供了变体CDR组。在一个实施方案中，一组6个CDR可以与亲本CDR具有1、2、3、4或5个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，BLI在许多实施方案中特别使用。
除了本文公开的形成ABD至ICOS的亲本可变重链和可变轻结构域之外，本发明还提供了变体vh和v1结构域。在一个实施方案中，变体vh和v1结构域各自可以具有与亲本vh和v1结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。在另一个实施方案中，变体vh和v1与相应的亲本vh或v1至少90、95、97、98或99％相同，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。
具体优选的实施方案包括[ICOS]_H0.66_L0抗ICOS Fv，其以Fab形式，包括在图9的开瓶器形式主链的任一个内。
具体优选的实施方案包括[ICOS]_H0_L0抗ICOS Fv，其以scFv形式，包括在图9的开瓶器形式主链的任一个内。
具体优选的实施方案包括[ICOS]_H0.66_L0抗ICOS Fv，其以scFv形式，包括在图75的mAb-scFv形式主链的任一个内。
具体优选的实施方案包括[ICOS]_H0.66_L0抗ICOS Fv，其以Fab形式，包括在图75的mAb-scFv形式主链的任一个内。
具体优选的实施方案包括[ICOS]_H0.66_L0抗ICOS Fv，其以Fab形式，包括在图55的形式主链的任一个内。
I.GITR抗原结合结构域
在一些实施方案中，ABD之一结合GITR。6个CDR和/或vh和v1结构域的合适的组以及scFv序列FITR(合适的序列显示在图18、图72和图73中，以及SEQ ID NO：26282-26290中。
如本领域技术人员所理解的，合适的抗GITR ABD可以包括如这些序列和图中所示的一组6个CDR，或者它们加了下划线，或者如本文所述和如表1中所示在使用不同编号方案的情况下，作为在本文公开的序列内使用其他比对鉴定的CDR。合适的ABD还可以包括如这些序列和附图中所描绘的整个vh和v1序列，用作scFv或Fab。在本文的许多含有Fv至GITR的实施方案中，是Fab单体结合GITR。如本文中所讨论的，当GITR是抗原之一时靶标对的另一个选自PD-1，其在图3、图10、图11、图72、图73、图74、图76和SEQ ID NO：1-2392、3125-3144、4697-7594和4697-21810中描绘并包括在序列表中具有下述标识符的那些：1G6_H1.279_L1.194；1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279；1G6_L1.210_H1.288；和2E9_H1L1(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和v1序列))，CTLA-4(合适的序列描绘于图12、72和79，以及SEQ ID NO：2393-2414和3737-3816(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和v1序列))，TIM-3(合适的序列描述于图14、图81A-81C和SEQ ID NO：3345-3704、4585-4696(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列))，LAG-3(合适的序列描绘于图13、图80和SEQ ID NO：2415-2604、3817-3960(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh)和vl序列))，BTLA(合适的序列描述于图82和84以及SEQ ID NO：3705-3736(可以是scFv序列、CDR序列组或vh和v1序列))和TIGIT(合适的序列描述于图83A-83D和SEQ ID NO：4433-4585中(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和v1序列))。
除了在序列表中公开的形成ABD至GITR的亲本CDR组之外，本发明还提供了变体CDR组。在一个实施方案中，一组6个CDR可以与亲本CDR具有1、2、3、4或5个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，BLI在许多实施方案中特别使用。
除了本文公开的形成ABD至GITR的亲本可变重链和可变轻结构域之外，本发明还提供了变体vh和v1结构域。在一个实施方案中，变体vh和v1结构域各自可以具有与亲本vh和v1结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。在另一个实施方案中，变体vh和v1与相应的亲本vh或v1至少90、95、97、98或99％相同，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。
J.OX40抗原结合结构域
在一些实施方案中，ABD之一结合OX40。提供了6个CDR和/或vh和v1结构域的合适的组以及OX40的scFv序列(合适的序列显示于图17、图72和图73中，以及SEQ ID NO：26272-26281中。
如本领域技术人员所理解的，合适的抗OX40 ABD可以包括如这些序列和图中所示的一组6个CDR，或者它们加了下划线，或者如本文所述和如表1中所示在使用不同编号方案的情况下，作为在本文公开的序列内使用其他比对鉴定的CDR。合适的ABD还可以包括如这些序列和附图中所描绘的整个vh和v1序列，用作scFv或Fab。在本文的许多含有Fv至OX40的实施方案中，是Fab单体结合GITR。如本文中所讨论的，当OX40是抗原之一时靶标对的另一个选自PD-1，其在图3、图10、图11、图72、图73、图74、图76和SEQ ID NO：1-2392、3125-3144、4697-7594和4697-21810中描绘并包括在序列表中具有下述标识符的那些：1G6_H1.279_L1.194；1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279；1G6_L1.210_H1.288；和2E9_H1L1(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和v1序列))，CTLA-4(合适的序列描绘于图12、72和79，以及SEQ ID NO：2393-2414和3737-3816(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和v1序列))，TIM-3(合适的序列描述于图14、图81A-81C和SEQ ID NO：3345-3704、4585-4696(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列))，LAG-3(合适的序列描绘于图13、图80和SEQ ID NO：2415-2604、3817-3960(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列))，BTLA(合适的序列描述于图82和84以及SEQ ID NO：3705-3736(可以是scFv序列、CDR序列组或vh和v1序列))和TIGIT(合适的序列描述于图83A-83D和SEQ ID NO：4433-4585中(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和v1序列))。
除了在序列表中公开的形成ABD至OX40的亲本CDR组之外，本发明还提供了变体CDR组。在一个实施方案中，一组6个CDR可以与亲本CDR具有1、2、3、4或5个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，BLI在许多实施方案中特别使用。
除了本文公开的形成ABD至OX40的亲本可变重链和可变轻结构域之外，本发明还提供了变体vh和v1结构域。在一个实施方案中，变体vh和v1结构域各自可以具有与亲本vh和v1结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。在另一个实施方案中，变体vh和v1与相应的亲本vh或v1至少90、95、97、98或99％相同，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。
K.4-1BB抗原结合结构域
在一些实施方案中，ABD之一结合4-1BB。6个CDR和/或vh和v1结构域的合适的组以及scFv序列4-1BB(合适的序列显示在图16、图72和图73中，以及SEQ ID NO：26262-2671中。
如本领域技术人员所理解的，合适的抗4-1BB ABD可以包括如这些序列和图中所示的一组6个CDR，或者它们加了下划线，或者如本文所述和如表1中所示在使用不同编号方案的情况下，作为在本文公开的序列内使用其他比对鉴定的CDR。合适的ABD还可以包括如这些序列和附图中所描绘的整个vh和v1序列，用作scFv或Fab。在本文的许多含有Fv至4-1BB的实施方案中，是Fab单体结合4-1BB。如本文中所讨论的，当ICOS是抗原之一时靶标对的另一个选自PD-1，其在图3、图10、图11、图72、图73、图74、图76和SEQ ID NO：1-2392、3125-3144、4697-7594和4697-21810中描绘并包括在序列表中具有下述标识符的那些：1G6_H1.279_L1.194；1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279；1G6_L1.210_H1.288；和2E9_H1L1(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和v1序列))，CTLA-4(合适的序列描绘于图12、72和79，以及SEQ ID NO：2393-2414和3737-3816(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和v1序列))，TIM-3(合适的序列描述于图14、图81和SEQ ID NO：3345-3704、4585-4696(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列))，LAG-3(合适的序列描绘于图13、图80和SEQ IDNO：2415-2604、3817-3960(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列))，BTLA(合适的序列描述于图82和84以及SEQ ID NO：3705-3736(可以是scFv序列、CDR序列组或vh和v1序列))和TIGIT(合适的序列描述于图83A-83D和SEQ ID NO：4433-4585中(其可以是scFv序列、CDR序列组或vh和v1序列))。
除了在序列表中公开的形成ABD至4-1BB的亲本CDR组之外，本发明还提供了变体CDR组。在一个实施方案中，一组6个CDR可以与亲本CDR具有1、2、3、4或5个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，BLI在许多实施方案中特别使用。
除了本文公开的形成ABD至4-1BB的亲本可变重链和可变轻结构域之外，本发明还提供了变体vh和v1结构域。在一个实施方案中，变体vh和v1结构域各自可以具有与亲本vh和v1结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。在另一个实施方案中，变体vh和v1与相应的亲本vh或v1至少90、95、97、98或99％相同，只要ABD仍然能够结合靶抗原，如通过Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量，例如Octet测定)的至少一种测量的，其中BLI在许多实施方案中特别使用。
L.具体的双特异性实施方案
本发明提供了许多如下概述的具体双特异性抗体。
1.ICOS X PD-1
本发明提供了双特异性异二聚体抗体，其各自单价结合ICOS和PD-1，并且在本文中概述的一些情况下，二价结合。
在一个实施方案中，PD-1ABD是1G6_L1.194_H1.279并且ICOS ABD选自图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B中显示的序列以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665和具有标识符[ICOS]_H0.66_L0和[ICOS]_H0L0的那些。
在一个实施方案中，ICOS X PD-1双特异性抗体选自XENP编号20261、20730、20896、22432-22438、22731-22748、22878-22894、22931-22932、22950-22961、23090-23093、23295-23296、23301、23405、23408、23410(全部没有428L/434S，虽然它们可以有那些取代)；XENP编号22730、22917-22928、22935-22937、22974-22979、22995-22996、23001、23103、23104(均具有428L/434S，尽管它们可能不具有那些)；XENP编号23411、21828、21829、21830、21831、22348、23059(使用现有技术ICOS序列)；XENP编号18920、24125、24130(另外的开瓶器)；XENP 23406、23407、24128(ICOS x PD-1中心-scFv)，XENP24123(ICOS xPD-1中心-scFv2)；XENP24134(ICOS x PD-1双特异性mAb)、24122(ICOS x PD-1DVD-Ig)，XENP 24132、24133(ICOS x PD-1三齿)。
2.ICOS X PD-L1
在该实施方案中，ICOS ABD选自图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B中显示的序列以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665和具有标识符[ICOS]_H0.66_L0和[ICOS]_H0L0的那些。
3.ICOS X CTLA-4
在该实施方案中，ICOS ABD选自图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B中显示的序列以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665和具有标识符[ICOS]_H0.66_L0和[ICOS]_H0L0的那些。
在一个实施方案中，具有[ICOS]H0.66_L0的Fab ICOS ABD的开瓶器形式与[CTLA-4]_H3.32_L0.129的scFv CTLA-4ABD配对，特别是在图9的开瓶器主链1中。
4.ICOS X LAG-3
在该实施方案中，ICOS ABD选自图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B中显示的序列以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665和具有标识符[ICOS]_H0.66_L0和[ICOS]_H0L0的那些。
5.ICOS X TIM-3
在该实施方案中，ICOS ABD选自图19、图20A-20G、图24、图68A-68G和图77A-77B中显示的序列以及SEQ ID NO：27869-28086、28087-28269、27193-27335、28549-28556和28557-28665和具有标识符[ICOS]_H0.66_L0和[ICOS]_H0L0的那些。
M.同源抗体
本发明还提供了与本文概述的抗体共享氨基酸序列同一性的抗体。
在一个实施方案中，制备双特异性抗体，其在本文和附图中概述的Vh和V1序列的一个或多个CDR中具有氨基酸变体。在一个实施方案中，提供了抗体，其在本文概述的vh和v1链的一个或多个CDR中具有1、2、3、4或5个氨基酸差异。这些氨基酸变体可以在一个CDR中或在多于一个CDR之间展开。这些氨基酸变体也可以在双特异性抗体的一个或两个Fv中；例如，在ICOS Fv侧的CDR中可以有2个氨基酸变体(通常是Fab但可以是如本文所述的scFv)和在PD-1侧有一个，等等。
类似地，本发明提供了与本文概述的序列具有至少95、96、97、98或99％氨基酸同一性的抗体，并且特别是在可变重和/或可变轻结构域中。该序列同一性也可以在双特异性抗体的一个Fv或两个Fv上。即，提供与图中概述的可变重和/或可变轻结构域95-99％相同的双特异性抗体。
IX.本发明的核酸
本发明进一步提供了编码本发明双特异性抗体的核酸组合物(或者，在“单特异性”抗体的情况下，也是编码那些的核酸)。
如本领域技术人员所理解的，核酸组合物将取决于异二聚体蛋白质的形式和支架。因此，例如，当形式需要三个氨基酸序列时，可以将三个核酸序列掺入一个或多个表达载体中用于表达。类似地，一些形式(例如，如图2中公开的双scFv形式)仅需要两个核酸；再次，它们可以被放入一个或两个表达载体中。一些形式需要4个氨基酸(双特异性mAb)。
如本领域已知的，编码本发明组分的核酸可以如本领域已知的那样掺入表达载体中，并且取决于用于产生本发明的异二聚体抗体的宿主细胞。通常，核酸与任何数量的调节元件(启动子、复制起点、选择标记、核糖体结合位点、诱导物等)可操作地连接。表达载体可以是染色体外的或整合载体。
然后将本发明的核酸和/或表达载体转化到本领域众所周知的任何数量的不同类型的宿主细胞中，包括哺乳动物、细菌、酵母、昆虫和/或真菌细胞，其中哺乳动物细胞(例如CHO细胞)在许多实施方案中使用。
在一些实施方案中，编码每种单体的核酸和编码轻链的任选核酸(取决于形式适用)各自包含在单一表达载体内，通常在不同或相同的启动子控制下。在本发明中具体使用的实施方案中，这两种或三种核酸中的每一种都包含在不同的表达载体上。如本文和62/025,931中所示(通过引用并入本文)，不同的载体比可用于驱动异二聚体形成。即，令人惊讶的是，尽管蛋白质以比例1：1：2包含第一单体：第二单体：轻链(在本文的许多实施方案的情况下具有包含异二聚体抗体的三种多肽)，但这些不是给出最好结果的比率。
如本领域所熟知的，通过培养包含表达载体的宿主细胞制备本发明的异二聚体抗体。一旦产生，就进行传统的抗体纯化步骤，包括离子交换色谱步骤。如本文所讨论的，使两种单体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱或等电聚焦或对等电点敏感的其他方法进行分离。也就是说，包含改变每个单体的等电点(pI)的pI取代使得每个单体具有不同的pI并且异二聚体也具有不同的pI，从而促进“三F”异二聚体的等电纯化(例如，阴离子交换柱、阳离子交换柱)。这些取代还有助于确定和监测纯化后任何污染的双scFv-Fc和mAb同型二聚体(例如，IEF凝胶、cIEF和分析IEX柱)。
X.异二聚体免疫调节抗体的生物学和生物化学功能
通常，将本发明的双特异性免疫调节抗体给予患有癌症的患者，并且以本文所述的多种方式评估功效。因此，虽然可以进行标准的功效分析，如癌症负荷、肿瘤大小、转移的存在或程度的评估等，但也可以基于免疫状态评估来评定免疫肿瘤学治疗。这可以通过多种方式完成，包括体外和体内分析。例如，可以进行免疫状态变化(例如，ipi治疗后ICOS+CD4+T细胞的存在)的评估以及“老式”测量，例如肿瘤负荷、大小、侵袭性、LN受累、转移等。因此，可以评估以下中的任一个或全部：PVRIG对CD4+T细胞活化或增殖、CD8+T(CTL)细胞活化或增殖、CD8+T细胞介导的细胞毒性活性和/或CTL介导的细胞耗竭、NK细胞活性和NK介导的细胞耗竭的抑制作用；PVRIG对Treg细胞分化和增殖和Treg或骨髓来源的抑制细胞(MDSC)介导的免疫抑制或免疫耐受的增强作用；和/或PVRIG对通过免疫细胞产生的促炎性细胞因子的影响，例如通过T细胞或其它免疫细胞产生的IL-2、IFN-或TNF-α。
在一些实施例中，通过使用例如CFSE稀释法、免疫效应细胞的Ki67细胞内染色以及3H-胸苷掺入法评估免疫细胞增殖来评定治疗。
在一些实施例中，通过评估基因表达的增加或活化相关标志物的蛋白质水平的增加来评定治疗，所述标志物包括以下中的一个或多个：CD25、CD69、CD137、ICOS、PD1、GITR、OX40以及通过CD107A的表面表达测量的细胞脱粒。
通常，如本领域已知的那样进行基因表达分析。
通常，蛋白质表达测量也类似地进行，如本领域已知的。
在一些实施例中，通过估计许多细胞参数，例如酶活性(包括蛋白酶活性)、细胞膜渗透性、细胞粘附、ATP产生、辅酶产生和核苷酸摄取活性来评定由靶细胞活力检测测量的细胞毒活性，从而评定治疗。这些分析的具体实例包括但不限于台盼蓝(Trypan Blue)或PI染色、51Cr或35S释放法、LDH活性、MTT和/或WST分析、钙黄绿素-AM分析、基于发光的分析以及其它分析。
在一些实施例中，通过评定由细胞因子产生测量的T细胞活性，使用细胞因子，使用众所周知的技术，细胞内测量培养物上清液来评定治疗，所述细胞因子包括但不限于：IFNγ、TNFα、GM-CSF、IL2、IL6、IL4、IL5、IL10、IL13。
因此，可以使用评估以下中的一个或多个的分析来评定治疗：(i)免疫反应的增加；(ii)αβ和/或γδT细胞活化的增加；(iii)细胞毒性T细胞活性的增加；(iv)NK和/或NKT细胞活性的增加；(v)αβ和/或γδT细胞抑制的缓解；(vi)促炎性细胞因子分泌的增加；(vii)IL-2分泌的增加；(viii)干扰素γ产生的增加；(ix)Th1反应的增加；(x)Th2反应的减少；(xi)减少或消除调节性T细胞(Treg)中的至少一种的细胞数量和/或活性。
测量功效的分析
在一些实施例中，使用如本领域已知的混合淋巴细胞反应(MLR)分析来评定T细胞活化。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量免疫反应的增加或减少，如例如通过不同因子的磷酸化或去磷酸化或通过测量其它翻译后修饰所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量αβ和/或γδT细胞活化的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量细胞毒性T细胞活性的增加或减少，如例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量NK和/或NKT细胞活性的增加或减少，如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过如例如CD107a等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量αβ和/或γδT细胞抑制的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量促炎性细胞因子分泌的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量IL-2分泌的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量干扰素γ产生的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量Th1反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量Th2反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量调节性T细胞(Treg)中的至少一种的细胞数量和/或活性的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量。反应减少指示免疫刺活化性。适当的减少与增加相同，如下所述。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量M2巨噬细胞细胞数量的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量。反应减少指示免疫刺活化性。适当的减少与增加相同，如下所述。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量M2巨噬细胞促肿瘤发生活性的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺活化性。适当的减少与增加相同，如下所述。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量N2嗜中性粒细胞增量的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量。反应减少指示免疫刺活化性。适当的减少与增加相同，如下所述。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量N2嗜中性粒细胞促肿瘤发生活性的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺活化性。适当的减少与增加相同，如下所述。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量T细胞活化抑制的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量CTL活化抑制的增加或减少，如例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量αβ和/或γδT细胞耗竭的增加或减少，如例如通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺活化性。适当的减少与增加相同，如下所述。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量αβ和/或γδT细胞反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量抗原特异性记忆反应的刺激的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD45RA、CCR7等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量癌细胞的细胞凋亡或裂解的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、Cr释放、Calcine AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制作用的刺激的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、Cr释放、Calcine AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量癌细胞的直接杀伤的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、Cr释放、Calcine AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量Th17活性的增加或减小，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的诱导的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、Cr释放、Calcine AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或活化标志物(例如CD137，CD107a，PD1等)的表达变化来测量T细胞活化。对于T细胞，增殖、细胞表面活化标志物(例如CD25、CD69、CD137、PD1)、细胞毒性(杀伤靶细胞的能力)和细胞因子产生(例如IL-2、IL-4、IL-6、IFNγ、TNF-a、IL-10、IL-17A)的增加将指示免疫调节，这将符合癌细胞的杀伤增强。
在一个实施例中，例如通过直接杀死靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过活化标志物(例如CD107a等)的表达变化来测量NK细胞活化。对于NK细胞，增殖、细胞毒性(杀死靶细胞并增加CD107a、颗粒酶和穿孔素表达的能力)、细胞因子产生(例如IFNγ和TNF)和细胞表面受体表达(例如CD25)的增加将指示免疫调节，这将符合癌细胞的杀伤增强。
在一个实施例中，例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过活化标志物的表达变化来测量γδT细胞活化。
在一个实施例中，例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化来测量Th1细胞活化。
相比参考样品或对照样本，例如不含本发明的抗PVRIG抗体的测试样品中的信号，活性或反应的适当增加(或如上所述适当减少)是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％至99％的增加。类似地，与参考或对照样品相比，增加至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍显示功效。
XI.治疗
一旦制备，通过治疗癌症，通常通过与本发明的双特异性免疫调节抗体的结合抑制T细胞活化的抑制(例如不再抑制T细胞)，本发明的组合物可用于许多肿瘤学应用。
因此，本发明的异二聚体组合物可用于治疗这些癌症。
XII.用于体内施用的抗体组合物
通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备根据本发明使用的抗体的制剂用于储存(如Remington's PharmaceuticalSciences第16版，Osol,A.Ed.[1980]概述的)，以冻干制剂或水溶液的形式。可接受的载体、缓冲剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属配合物(如锌-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
施用方式
根据已知方法将本发明的抗体和化学治疗剂施用于受试者，例如以推注静脉内施用或在一段时间内连续输注。
治疗方式
在本发明的方法中，疗法用于提供关于疾病或病症的阳性治疗反应。“阳性治疗反应”旨在改善疾病或病症，和/或改善与疾病或病症相关的症状。例如，阳性治疗反应是指疾病中的一种或多种以下改善：(1)肿瘤细胞数量的减少；(2)肿瘤细胞死亡增加；(3)抑制肿瘤细胞存活；(5)肿瘤生长的抑制(即，在某种程度上减慢，优选停止)；(6)提高患者生存率；(7)与疾病或病症相关的一种或多种症状有所缓解。
在任何给定疾病或病症中的阳性治疗反应可以通过对该疾病或病症特异的标准化反应标准来确定。可以使用诸如磁共振成像(MRI)扫描、x射线照相成像、计算机断层扫描(CT)扫描、骨骼扫描成像、内窥镜检查和肿瘤活检取样(包括骨髓穿刺(BMA)和循环中肿瘤细胞的计数)的筛选技术评估肿瘤响应的肿瘤形态学变化(即总肿瘤负荷、肿瘤大小等)。
除了这些阳性治疗反应之外，接受治疗的受试者可以经历改善与疾病相关的症状的有益效果。
根据本发明的治疗包括所用药物的“治疗有效量”。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现期望治疗结果的量。
治疗有效量可根据诸如疾病状态、年龄、性别和个体体重等因素以及药物在个体中引发期望反应的能力而变化。治疗有效量也是其中抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用超过治疗有益效果的量。
用于肿瘤治疗的“治疗有效量”还可以通过其稳定疾病进展的能力来测量。可以在预测人肿瘤中功效的动物模型***中评估化合物抑制癌症的能力。
或者，组合物的这种性质可以通过检查化合物抑制细胞生长或通过本领域技术人员已知的体外测定诱导细胞凋亡的能力来评估。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤大小，或以其他方式改善受试者的症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的大小、受试者症状的严重性和所选择的特定组合物或给药途径等因素来确定这样的量。
调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。肠胃外组合物可以以剂量单位形式配制，以便于施用和剂量均匀。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的活性化合物，其经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果。
本发明的剂量单位形式的规格决定于和直接取决于(a)活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果和(b)用于治疗个体敏感性的这种活性化合物的配制领域中固有的局限性。
用于本发明的双特异性抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症，并且可由本领域技术人员确定。
用于本发明的治疗有效量的双特异性抗体的示例性非限制性范围是约0.1-100mg/kg。
所有引用的参考文献均通过引用整体并入本文。
尽管以上为了说明的目的描述了本发明的特定实施方案，但是本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求中描述的本发明的情况下，可以进行细节的许多变化。
XIII.实施例
以下提供实施例以说明本发明。这些实施例并不意味着将本发明限制于任何特定的应用或操作理论。对于本发明中讨论的所有恒定区位置，编号是根据Kabat中的EU索引(Kabat等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.，UnitedStates Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，通过引用完整并入)。抗体领域的技术人员将理解，该惯例由免疫球蛋白序列的特定区域中的非顺序编号组成，使得能够标准化地参考免疫球蛋白家族中的保守位置。因此，由EU索引定义的任何给定免疫球蛋白的位置不一定对应于其顺序序列。
在美国公开2015/0307629、2014/0288275和WO2014/145806中概述了一般和具体的科学技术，所有这些技术都通过引用明确地并入本文，特别是其中概述的技术。
A.实施例1：来自多种癌症类型的TIL共表达PD-1和T细胞共刺激受体
为了研究PD-1与各种T细胞共刺激受体之间的潜在关联，使用来自癌症基因组图谱项目(TCGA)的RNA测序数据进行分析。V2 RSEM数据从FireBrowse(http://firebrowse.org/)下载。使用R和惯常例程进行分析。图1中描绘了PD-1的表达与八种共刺激受体之间的相关性，以及计算的R2值(Pearson相关系数的平方)。数据显示PD-1和几种共刺激受体在癌症中共表达，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺腺癌、肺鳞癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌和黑素瘤癌。值得注意的是，与其他几个共刺激分子(costim)相比，ICOS在TIL上的表达与PD-1的表达相关性更好。
B.实施例2：免疫检查点抗原结合结构域
1. 2A：抗PD-1ABD
以二价IgG1形式生成结合PD-1的抗体的实例，具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代，示例性的序列在图10中描绘。通过基因合成产生编码可变区的DNA，并通过Gibson组装方法将其***哺乳动物表达载体pTT5中。通过Gibson组装将重链VH基因***编码具有上述取代的人IgG1恒定区的pTT5中。将轻链VL基因***编码人Cκ恒定区域的pTT5中。将DNA转染到HEK293E细胞中用于表达。将另外的PD-1ABD(包括衍生自上述抗体的那些)格式化为用于共刺激/检查点双特异性抗体的Fab和scFv，其说明性序列分别在图11和序列表中描述。
2. 2B：抗-CTLA-4ABD
结合CTLA-4的抗体以二价IgG1形式产生，具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代。通过基因合成产生编码可变区的DNA，并通过Gibson组装方法将其***哺乳动物表达载体pTT5中。通过Gibson组装将重链VH基因***编码具有上述取代的人IgG1恒定区的pTT5中。将轻链VL基因***编码人Cκ恒定区域的pTT5中。将DNA转染到HEK293E细胞中用于表达。将另外的CTLA-4ABD(包括衍生自上述抗体的那些)格式化为用于共刺激/检查点双特异性抗体的scFv，其说明性序列在图12和序列表中描述。
3. 2C：抗LAG-3ABD
结合LAG-3的抗体的实例以二价IgG1形式产生，具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代。通过基因合成产生编码可变区的DNA，并通过Gibson组装方法将其***哺乳动物表达载体pTT5中。通过Gibson组装将重链VH基因***编码具有上述取代的人IgG1恒定区的pTT5中。将轻链VL基因***编码人Cκ恒定区域的pTT5中。将DNA转染到HEK293E细胞中用于表达。将另外的LAG-3ABD(包括衍生自上述抗体的那些)格式化为用于共刺激/检查点双特异性抗体的Fab，其说明性序列在图13和序列表中描述。
4. 2D：抗TIM-3ABD
结合TIM-3的抗体的实例以二价IgG1形式产生，具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代，其示例性序列示于图14中。通过基因合成产生编码可变区的DNA，并通过Gibson组装方法将其***哺乳动物表达载体pTT5中。通过Gibson组装将重链VH基因***编码具有上述取代的人IgG1恒定区的pTT5中。将轻链VL基因***编码人Cκ恒定区域的pTT5中。将DNA转染到HEK293E细胞中用于表达。将上述抗体格式化为Fab，用于共刺激/检查点双特异性抗体。
5. 2E：抗PD-L1 ABD
结合PD-L1的原型抗体以二价IgG1形式产生，具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代，其示例性序列示于图15中。通过基因合成产生编码可变区的DNA，并通过Gibson组装方法将其***哺乳动物表达载体pTT5中。通过Gibson组装将重链VH基因***编码具有上述取代的人IgG1恒定区的pTT5中。将轻链VL基因***编码人Cκ恒定区域的pTT5中。将DNA转染到HEK293E细胞中用于表达。将上述抗体格式化为Fabs和scFv，用于共刺激/检查点双特异性抗体。
C.实施例3：共刺激受体抗原结合结构域
结合ICOS、GITR、OX40和4-1BB的原型共刺激受体抗体以二价IgG1形式产生，具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代，其序列示于图16-19中。通过基因合成产生编码可变区的DNA，并通过Gibson组装方法将其***哺乳动物表达载体pTT5中。通过Gibson组装将重链VH基因***编码具有上述取代的人IgG1恒定区的pTT5中。将轻链VL基因***编码人Cκ恒定区域的pTT5中。将DNA转染到HEK293E细胞中用于表达。将上述抗体格式化为Fabs或scFv，用于共刺激/检查点双特异性抗体。
D.实施例4：设计抗-ICOS ABD以获得稳定性和亲和力
将抗-ICOS抗体(XENP16435；图19中所描绘)的亲本可变区工程化以用作ICOS x检查点双特异性抗体中的组分。通过定点诱变(QuikChange，Stratagene，Cedar Creek，Tx.)或其他基因合成和Fab-His和scFv-His形式的亚克隆构建工程化以具有最佳亲和力和稳定性的Fv变体文库，并如下所述产生。
1. 4A：抗ICOS Fab
变体抗-ICOS Fab的氨基酸序列列于图20A-20G中(多组氨酸(His6)标签已从Fab重链的C-末端除去)。通过基因合成产生编码Fab表达所需的两条链的DNA，并使用标准分子生物学技术将其亚克隆到表达载体pTT5中。Fab重链包括C末端多组氨酸标签。将DNA转染到HEK293E细胞中进行表达，并使用Ni-NTA层析从上清液中纯化得到的蛋白质。得到的抗-ICOS Fab的特征在于稳定性和亲和力。
使用Bio-Rad CFX Connect实时PCR检测***进行差示扫描荧光测定(DSF)实验。将蛋白质与SYPRO Orange荧光染料混合并在PBS中稀释至0.2mg/mL。SYPRO Orange的最终浓度为10X。在25℃下孵育10分钟后，使用1℃/min的加热速率将蛋白质从25℃加热至95℃。每30秒进行一次荧光测量。使用仪器软件计算熔化温度(Tm)。结果如图21所示。
使用Octet(基于BioLayer干涉测定法(BLI)的方法)进行抗ICOS Fab对人ICOS的一系列亲和筛选。Octet的实验步骤通常包括以下内容：固定化(将配体或测试物捕获到生物传感器上)；缔合(将配体或测试物涂覆的生物传感器浸入含有相应测试物品或配体的连续稀释液的孔中)；和解离(将生物传感器返回到含有缓冲液的孔中)以确定测试物品的单价亲和力。具体地，使用抗小鼠Fc(AMC)生物传感器捕获ICOS的小鼠IgG2a Fc融合物并浸入多种浓度的测试物品中。得到的平衡解离常数(KD)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)显示在图22-23中。通过使用ForteBio Octet数据分析软件(ForteBio)使用1：1结合模型分析处理的数据来获得结合亲和力和动力学速率常数。来自两个单独实验的数据描绘于图22A-22C中。在进一步的实验中，使用链霉抗生物素蛋白(SA)生物传感器捕获ICOS-TEV-Fc-Avi并浸入测试物品中。数据如图23描绘。包括XENP22780、XENP22782、XENP22783和XENP22784的许多变体抗-ICOS Fab具有改善的稳定性，同时保持与包含亲本可变区(XENP22050)的Fab类似的亲和特征。
2. 4B：抗ICOS scFv
抗ICOS scFv的氨基酸序列列于图24中(多组氨酸(His6)标签已从scFv的C末端除去)。通过基因合成产生编码scFv的DNA，并使用标准分子生物学技术将其亚克隆到表达载体pTT5中。scFv包括C末端多组氨酸标签。将DNA转染到HEK293E细胞中进行表达，并使用Ni-NTA层析从上清液中纯化得到的蛋白质。如上所述，在DSF实验中表征所得的抗-ICOS scFv的稳定性。数据如图25描绘。
E.实施例5：抗-ICOS x抗-PD-1双特异性抗体
1. 5A：原型共刺激/检查点开瓶器
开瓶器形式的共刺激/检查点双特异性抗体的示意图如图2A描绘。产生了基于原型抗GITR mAb(XENP16438)、抗OX40 mAb(XENP16437)、抗-4-1BB mAb(XENP14410)和抗ICOSmAb(XENP16435)和示例性抗-PD-1scFv(XENP19692)臂的具有共刺激受体结合Fab臂的原型开瓶器以研究它们在SEB刺激的PBMC测定中对细胞因子分泌的影响。序列如图26A-26D描绘。通过基因合成产生编码开瓶器表达所需的三条链的DNA，并使用标准分子生物学技术将其亚克隆到表达载体pTT5中。使用标准技术纯化转染到HEK293E细胞中用于表达的DNA和得到的蛋白质。
a.5A(a)：原型抗-ICOS x抗-PD-1开瓶器增强细胞因子分泌
葡萄球菌肠毒素B(SEB)是一种超抗原，以类似于通过T细胞受体(TCR)激活所获得的方式引起T细胞活化和增殖。用SEB刺激人PBMC是测定T细胞活化和增殖的常用方法。用100ng/mL SEB模拟PBMC 2天。将细胞洗涤两次并用100ng/mL SEB与20μg/mL指定的测试物组合再刺激。使用基于纳武单抗的第一种二价抗PD-1抗体(XENP16432)、第二种二价抗PD-1mAb(XENP19686)和二价抗RSVmAb(XENP15074)作为对照。处理后24小时，测定上清液的IL-2。图27中描绘的数据显示，与二价抗RSV抗体相比，每个共刺激/检查点开瓶器增强了细胞因子分泌。令人惊讶的是，XENP22730对细胞因子分泌的诱导远远优于单独的二价抗PD-1抗体以及其他原型共刺激/检查点开瓶器的细胞因子分泌，表明ICOS结合的加入增强了细胞因子的产生，并且对于双特异性抗体，ICOS是比其他共刺激受体更好的PD-1伴侣。
在另一个实验中，用20μg/mL指定的测试物品以0.01μg/mL SEB刺激PBMC 3天。作为对照，还将测试物品与天然(非SEB刺激的)PBMC一起温育。处理后3天，评估上清液的IL-2分泌，作为T细胞活化的指标(如图28所示)。数据显示抗PD-1二价抗体和抗ICOS x抗PD-1开瓶器都不刺激天然细胞中的IL-2分泌。此外，数据再次显示XENP20896比单独的二价抗PD-1抗体更能增强IL-2分泌，并且XENP20896比二价组合物(XENP16432和XENP16435)以及单臂物组合(XENP20111和XENP20266)更能增强IL-2分泌。
先前已发现共刺激受体如ICOS仅在通过二价抗体或多聚化配体交联后诱导细胞因子产生(Viera等人，2004；Sanmamed等人2015)。鉴于交联机制，令人惊讶的是，在共刺激x检查点阻断双特异性抗体中单臂的单价ICOS结合能够增强细胞因子的产生。此外，值得注意的是，与二价抗-ICOS mAb(XENP16432+XENP16435)组合，双特异性抗体能够比二价抗PD-1mAb更能增强细胞因子分泌。
b.5A(b)：PD-1和ICOS双阳性细胞被原型抗ICOS x抗PD-1
开瓶器选择性占据
相对于仅表达免疫检查点受体或共刺激受体的非肿瘤反应性T细胞，选择性靶向共表达如实施例1所示的免疫检查点受体(例如PD-1)和共刺激受体的肿瘤反应性TIL，可以增强抗肿瘤活性，同时避免外周毒性(如图29所示)。
SEB刺激的PBMC测定用于研究抗ICOS x抗PD-1开瓶器与T细胞的结合。用100ng/mLSEB(葡萄球菌肠毒素B)刺激PBMC 3天，然后用指定的测试物在4℃下处理PBMC 30分钟。然后将PBMC与APC标记的单臂抗ICOS抗体和FITC标记的单臂抗PD-1抗体在4℃下孵育30分钟。图30和31显示了原型抗ICOS x抗PD-1开瓶器(XENP20896)、单臂抗ICOS抗体(XENP20266)和单臂抗PD-1抗体(XENP20111)的受体占据。
数据显示，双阳性细胞(表达PD-1和ICOS)被抗ICOS x抗PD-1开瓶器(XENP20896)选择性占据，如图30所示，表明单价ICOS和PD-1结合对选择性靶向有用。此外，如图31A所示，抗-ICOS x抗-PD-1开瓶器(例如XENP20896)比单价、单特异性单臂抗-PD-1和抗-ICOS更有效地结合双阳性细胞。
c.5A(c)：原型抗-ICOS x抗-PD-1开瓶器在GVHD小鼠研究中增强植入
在NSG(NOD-SCID-γ)免疫缺陷小鼠中进行的移植物抗宿主病(GVHD)模型中评估原型抗ICOS x抗PD-1开瓶器。用人PBMC植入小鼠。当向NSG小鼠注射人PBMC时，它们发展出针对人PBMC的自身免疫应答。注射具有免疫检查点抗体(例如抗PD-1)的人PBMC的NSG小鼠的治疗增强了植入。因此，增加的植入显示抗体的功效。
在第0天通过IV-OSP将1000万个人PBMC植入NSG小鼠中，然后在第1天、第8天、第15天和第22天用指定的测试物品给药。在第14天测量人CD45+细胞计数作为疾病的指标。
图41A-41B中描绘的数据显示，与对照(PBS和PBS+PBMC)相比，抗ICOS x抗PD-1开瓶器增强人PBMC移植的NSG小鼠中CD45+细胞的增殖。此外，使用本发明的抗体比用二价抗PD-1抗体观察到的增强更强。
2. 5B：具有优化的抗-ICOS Fab臂的变体抗-ICOS x抗-PD-1开瓶器的生产
如上文一般性描述制备包含如实施例4A中所述工程化的抗ICOS Fab的变体抗ICOS x抗PD-1开瓶器。图32中列出了变体抗ICOS x抗PD-1开瓶器的氨基酸序列。具有FcRnpH 6.0亲和力增强取代的变体抗-ICOS x抗-PD-1的氨基酸序列列于图33中。
使用如上一般描述的Octet表征所得的抗-ICOS x抗-PD-1双特异性抗体对人和食蟹猴ICOS的亲和力。在第一组实验中，AMC生物传感器用于捕获ICOS的小鼠IgG2a Fc融合物并浸入多种浓度的测试物品中(图34A-34C中描绘的数据)。在进一步的实验中，链霉抗生物素蛋白(SA或SAX)生物传感器用于捕获人和食蟹猴ICOS的生物素化的人和食蟹猴IgG1 Fc融合物，并浸入多种浓度的测试物品中(图35中描绘的数据)。
3. 5C：变体抗ICOS x抗PD-1开瓶器的T细胞表面结合
在SEB刺激的PBMC测定中测量抗ICOS x抗PD-1双特异性抗体与T细胞的结合。用100ng/mL SEB刺激人PBMC 3天。然后用指定的测试物处理PBMC，并在4℃下孵育30分钟。处理后，将细胞与FITC标记的抗CD3抗体和APC标记的抗人IgG Fc二抗一起温育。CD3+细胞上的MFI如图36A-36B所描绘。
4. 5D：T细胞上变体抗ICOS x抗PD-1开瓶剂的受体占据
在SEB刺激的PBMC测定中测量T细胞上变体抗ICOS x抗PD-1开瓶器的受体占据。用100ng/mL SEB(葡萄球菌肠毒素B)刺激PBMC 3天，然后用指定的测试物在4℃下处理PBMC30分钟。然后将PBMC与APC标记的单臂抗ICOS抗体和FITC标记的单臂抗PD-1抗体在4℃下孵育30分钟。图37描绘变体抗-ICOS x抗PD-1双特异性抗体、相应的单臂抗-ICOS抗体和单臂抗-PD-1抗体(XENP20111)在PD-1和ICOS双阳性T细胞上的受体占据。与实施例1A中研究的原型抗体一致，每个开瓶器比单价单特异性单臂抗PD-1和单臂抗ICOS抗体更有效地结合双阳性细胞。
5. 5E：变体抗-ICOS x抗-PD-1开瓶器在细胞因子释放测定中的体外活性
用100ng/mL SEB刺激人PBMC 2天。洗涤细胞并再次用100ng/mL SEB与20μg/mL指定的测试制品组合刺激。处理后24小时，测定细胞的IL-2(图38A)和IFNγ(图38B)。数据显示抗ICOS x抗PD-1开瓶器比单独的二价抗PD-1抗体(XENP16432)、单独的二价抗-ICOS抗体(XENP16435)或二价抗-PD-1抗体加上二价抗-ICOS抗体的组合刺激显著更多的细胞因子释放。
在进一步的实验中，用100ng/mL SEB刺激人PBMC 2天。洗涤细胞并再次用100ng/mL SEB与20μg/mL指定的测试制品组合刺激。处理后24小时，测定细胞的IL-2(图39A)和IFNγ(图39B)。
6. 5F：变体抗ICOS x抗PD-1开瓶器在GVHD小鼠研究中的体内活性
在第一项研究中，在第0天通过IV-OSP将1000万个人PBMC植入NSG小鼠中，然后在第1天用指定的测试物品给药。在第7、11和14天测量IFNγ水平和人CD45+、CD8+T细胞和CD4+T细胞计数。图40A-40B分别描绘了第7天和第11天的IFNγ水平。图41A-B分别描绘了第11天和第14天的CD45+细胞计数。图42A-42B分别描绘了第14天的CD8+T细胞和CD4+T细胞计数。图43描述了由于T细胞扩增和IFNγ生产的GVHD恶化导致的第14天小鼠体重的变化。
在使用另外的变体抗-ICOS x抗-PD-1开瓶器的进一步研究中，在第0天通过IV-OSP将1000万个人PBMC植入NSG小鼠中，然后在第1天以指定浓度给予指定的测试物品。在第7天和第14天测量IFNγ水平和人CD45+、CD8+T细胞和CD4+T细胞计数。图44A-44B分别描绘了IFNγ在第7天和第14天的水平。图45描绘了第14天的CD45+细胞计数。图46A-46C分别描绘了第14天的CD8+T细胞计数、CD4+T细胞计数和CD8+/CD4+比率。还在第12天和第15天测量小鼠的体重，并分别在图47A-47B中描绘为初始体重的百分比。
附图显示抗ICOS x抗PD-1开瓶器增强了植入(如CD45+细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞的增殖以及小鼠体重的减少所示)。观察到的活性与每种变体的体外效力相关。此外，包括XENP20896、XENP22744、XENP23092、XENP22730、XENP23104、XENP22974和XENP23411在内的许多开瓶器比对照二价抗PD-1抗体(XENP16432)更能增强植入。
7. 5G：额外的抗ICOS ABD在抗ICOS x抗PD-1开瓶器中起作用
制备另外的抗-ICOS x抗-PD-1开瓶器，其包含基于如上文一般描述的实施例3中所述的其他抗-ICOS ABD的抗-ICOS Fab。另外的开瓶器的序列如图48A-48D所示。
在第一个实验中，用100ng/mL SEB刺激PBMC 2天。将细胞洗涤两次并用100ng/mLSEB与20μg/mL指定的测试物组合再刺激(PBS作为对照)。处理后24小时，测定上清液的IL-2浓度，如图49所示。在第二个实验中，用10ng/mL SEB刺激PBMC，并用20μg/mL指定的测试物处理3天(二价抗PD-1XENP16432作为对照)。收集上清液并测定IL-2。图50描绘了IL-2相对于二价抗RSVmAb的倍数诱导。
与实施例5A(a)中的数据一致，XENP20896刺激IL-2的分泌。值得注意的是，包含替代抗ICOS ABD的额外开瓶器也能够刺激IL-2的分泌，这表明抗ICOS x抗PD-1开瓶器增强细胞因子的分泌并非源自实施例4中描述的亲本抗-ICOS ABD的ABD独有的。
8. 5H：抗ICOS x抗PD-1开瓶器显示清晰的ICOS标志
a.5H(a)：抗-ICOS x抗-PD-1双特异性抗体诱导AKT磷酸化
ICOS连接诱导活化T细胞中的AKT磷酸化(Fos，C等2008)，因此，AKT磷酸化将是本发明的抗-ICOS x抗-PD-1双特异性抗体对ICOS激动作用的指示。
用100ng/mL SEB刺激人PBMC 2天。刺激后，使用EasySepTM人T细胞富集试剂盒(加拿大Vancouver的STEMCELL Technologies)通过阴性选择分离CD3+细胞，然后用指定的测试物与板结合的抗CD3抗体(OKT3；500ng/mL)组合处理。处理后30分钟裂解细胞，并通过MULTI-SPOT 384-孔斑板(Meso Scale Discovery，Rockville，MD)上的多重磷蛋白测定法测定总AKT和磷酸化AKT(Ser473)。数据在图51中描绘为处理后磷酸化的AKT的百分比。
数据显示用阴性对照二价抗PD-1mAb(XENP16432)处理后AKT磷酸化没有增加。单独的二价抗ICOS mAb(XENP16435)和XENP16435与XENP16432组合增加AKT磷酸化，证明XENP16435的ICOS连接和激动作用。令人惊讶的是，尽管仅ICOS单价结合，但与单独使用XENP16435和XENP16435联合XENP16432处理相比，用抗ICOS x抗PD-1双特异性抗体处理诱导更多的AKT磷酸化。尽管ICOS的单价结合，AKT阳性磷酸化数据证明了ICOS活性与双特异性抗体的明显特征。
b.5H(b)：由抗ICOS x抗PD-1开瓶器上调的活化T辅助细胞相关基因
Guedan等人(2014)描述了激活基于ICOS信号域的CAR-T后活化的T辅助细胞(即Th1、Th2和Th17)和调节性T细胞(Tregs)的基因表达谱。他们发现与活化的T辅助细胞相关的基因如IL-17A、IL22、IFNγ、TNF和IL-13被上调，而Treg相关基因如TGFβ1、SMAD3和FOXP3则没有变化或下调。
为了研究T细胞与本发明的抗-ICOS x抗PD-1双特异性抗体的结合是否导致类似的特征，我们使用Nanostring技术。用100ng/mL SEB刺激PBMC 2天。将细胞洗涤2次并用100ng/mL SEB再刺激，并用指定的测试品处理24小时。从细胞中提取RNA并通过PanCancer免疫分析组(NanoStringTechnologies，Seattle，WA)测定，其测定770个靶基因以覆盖免疫应答。图52描绘了与二价抗RSV抗体相比，许多Th相关和Treg相关基因表达的平均倍数诱导。图53A-53F分别描述了与通过二价抗RSV mAb诱导相比，所示测试物的IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-10、IL-9和IFNγ基因表达的倍数诱导。
如图52-53所示并与Gueden等人的观察一致，与ICOS信号传导相关的Th相关基因如IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-9和IFNγ在用二价抗-ICOS mAb和抗-ICOS和抗-PD-1mAb的组合处理后被上调。值得注意的是，在用抗ICOS x抗PD-1抗体处理后，与ICOS信号传导相关的Th相关基因的表达进一步上调，再次表明ICOS共刺激特征明显，以及双特异性抗体的抗ICOS和抗PD-1的显著协同作用参与。
9. 5I：替代形式抗ICOS x抗PD-1双特异性抗体
制备了替代形式的共刺激/检查点双特异性抗体，以研究抗ICOS x抗PD-1开瓶器的作用对开瓶器形式是否是独特的或是否广泛适用于抗ICOS x抗PD-1双特异性抗体。
a.5I(a)：抗PD-1 x抗ICOS开瓶器
使用如实施例2A中所述的编码抗-PD-1mAb(例如XENP16432和XENP29120)的DNA和如实施例4B中所述的抗-ICOS scFv产生具有抗-PD-1 Fab的抗-PD-1x抗-ICOS开瓶器。如实施例5A中一般描述的生产开瓶器。图56中描绘了示例性抗PD-1 x抗ICOS开瓶器的序列。
b.5I(b)：中心-scFv
中心-scFv形式的示意图如图55A-B所示。使用编码实施例4A中所述的抗-ICOSFab的DNA，通过标准亚克隆到表达载体pTT5中，产生编码抗-ICOSFab-Fc重链的DNA。使用编码实施例4A中描述的抗-ICOS Fab的DNA和实施例2A中描述的抗-PD-1 scFv通过基因合成和标准的亚克隆到表达载体pTT5中的组合产生编码抗-ICOS-抗PD-1 Fab-scFv-Fc重链的DNA。将DNA转染到HEK293E细胞中用于表达。图57A-57C中描绘了示例性抗-ICOS x抗-PD-1中心-scFv抗体的序列。
c.5I(c)：中心-scFv2
中心-scFv2形式的示意图如图55C所示。使用编码实施例4A中描述的抗-ICOS Fab的DNA和实施例2A中描述的抗-PD-1 scFv通过基因合成和标准的亚克隆到表达载体pTT5中的组合产生编码抗-ICOS-抗PD-1 Fab-scFv-Fc重链的DNA。将DNA转染到HEK293E细胞中用于表达。图58中描绘了示例性抗-ICOS x抗-PD-1中心-scFv2抗体的序列。
d.5I(d)：双特异性mAb
用于双特异性mAb形式的示意图描绘为图2K。基于编码实施例中描述的抗-ICOSFab的DNA产生编码抗-ICOS重链和轻链的DNA，并且基于编码实施例2A中描述的抗-PD mAb的DNA产生编码抗-PD-1重链和轻链的DNA。通过Gibson组装将重链VH基因***编码具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代的人IgG1恒定区的pTT5中。将轻链VL基因***编码人Cκ恒定区的pTT5中。
将DNA转染到HEK293E细胞中以表达为2种单独的抗体，其分别通过蛋白A亲和力(GE Healthcare)表达和纯化。这些抗体在CH3：CH3界面中含有异二聚化-偏斜取代。使用2-巯基乙胺-HCl(2-MEA)诱导两个亲本IgG中链间二硫键的受控还原。然后除去2-MEA，使链间二硫键发生再氧化，从而能够重组HC-LC对(由异二聚化突变驱动)。最后，通过阳离子交换层析纯化三特异性抗体。这些方法在本领域中是常见的(参见，例如，Labrijn(2013)PNAS110(13)：5145-50或Strop等人(2012)J Mol Biol 420(3)：204-19)。可以使用本领域已知的其他设计和纯化方法促进双特异性mAb产生，例如，常见的轻链抗体(Merchant(1998)Nat Biotechnol 16(7)：677-81)或异二聚体Fab结构域(Lewis等人(2014)NatBiotechnol 32(2)：191-8)。示例性抗-PD-1x抗-ICOS双特异性mAb的序列描绘于图59中。
e.5I(e)：DVD-IgG
DVD-IgG形式的示意图如图55A-55D描绘。使用编码实施例4A中描述的抗-ICOSFab的DNA和实施例2A中描述的抗-PD-1scFv通过基因合成和标准的亚克隆到表达载体pTT5中的组合产生编码抗-PD-1-抗-ICOS VH-VH-CH1-Fc重链和VL-VL-Cκ轻链的DNA。将DNA转染到HEK293E细胞中用于表达。图60中描绘了示例性抗-ICOS x抗-PD-1DVD-IgG的序列。
f.5I(f)：三齿形
三齿形形式的示意图如图55A-55D描绘。使用编码实施例4A中描述的抗-ICOS Fab的DNA和实施例2A中描述的抗-PD-1scFv通过基因合成和标准的亚克隆到表达载体pTT5中的组合产生编码抗-PD-1VL-VH-Fc重链和VL-VH轻链的DNA。将DNA转染到HEK293E细胞中用于表达。图61A-61B中描绘了示例性抗-ICOS x抗-PD-1三齿形的序列。
g.5I(g)：替代形式抗-ICOS x抗-PD-1双特异性抗体增强细胞因子分泌
用200ng/mL SEB刺激人PBMC 2天。将细胞洗涤两次，然后用100ng/mL SEB再刺激，并用指定浓度的所示测试品处理。处理后24小时，测定上清液的IL-2。数据描绘于图62中，并显示与二价抗RSV(XENP15074)对照相比，每种替代形式双特异性抗体增强IL-2分泌。值得注意的是，与二价抗PD-1抗体相比，大多数这些替代形式抗体增强IL-2分泌。
F.实施例6：靶向不同免疫检查点抗原的共刺激/检查点双特异性抗体
1. 6A：抗-CTLA-4x抗-ICOS
用衍生自XENP16435的抗-ICOS Fab和衍生自实施例2B中所述的ABD的抗-CTLA-4scFv产生抗-CTLA-4x抗-ICOS开瓶器。图63中描绘了示例性抗ICOS x抗CTLA-4开瓶器的序列。如实施例5I(c)中一般描述的制备双特异性mAb。
2. 6B：抗LAG-3x抗ICOS
用衍生自实施例2C中描述的ABD的抗LAG-3Fab和衍生自XENP16435的抗ICOS Fab产生抗LAG-3x抗ICOS双特异性抗体。图64A-64B中描绘了示例性抗LAG-3x抗ICOS双特异性抗体的序列。如实施例5I(c)中一般描述的制备双特异性mAb。
3. 6C：抗TIM-3x抗ICOS
用衍生自实施例2D中描述的ABD的抗TIM-3Fab和衍生自XENP16435的抗ICOS Fab产生抗TIM-3x抗ICOS双特异性抗体。图65中描绘了示例性抗TIM-3x抗ICOS双特异性抗体的序列。如实施例5I(c)中一般描述的制备双特异性mAb。
4. 6D：抗PD-L1 x抗ICOS
用衍生自实施例2E中描述的ABD的抗PD-L1 Fab和如实施例4B中所述的抗ICOSscFv产生抗PD-L1 x抗ICOS开瓶器。图66A-66C中描绘了示例性抗PD-L1 x抗ICOS双特异性抗体的序列。如实施例5A中一般描述的生产开瓶器。
5. 6E：额外的共刺激x检查点阻断双特异性抗体起到增强细胞因子分泌的作用
用200ng/mL SEB刺激人PBMC 2天。将细胞洗涤两次，然后用100ng/mL SEB再刺激，并用指定浓度的所示测试品处理(如上所述)。处理后24小时，测定上清液的IL-2。数据描绘于图67中，并显示与二价抗RSV(XENP15074)对照相比，每种额外的共刺激x检查点阻断双特异性抗体增强IL-2分泌。值得注意的是，与二价抗PD-1抗体(XENP16432)相比，这些替代检查点阻断抗体中的大多数(但不是全部，例如TIM-3阻断)增强IL-2分泌。
G.实施例7：ICOS的单价连接优于二价交联
在实施例5A(a)中，令人惊讶地发现尽管ICOS的单价结合，抗-ICOS x抗-PD-1抗体也起到增强细胞因子分泌的作用，这与诸如ICOS的共刺激受体的交联相反，这被认为对于刺激细胞因子的产生是必要的。在实施例5H(a)中，令人惊讶地发现抗-ICOS x抗-PD-1抗体比二价抗-ICOS mAb增强AKT磷酸化(ICOS激动作用的特征)。在本节中，我们进一步研究了这种趋势，其中ICOS的单价结合似乎优于ICOS的二价结合。
1. 7A：单臂抗ICOS Fab-Fc抗体的产生
说明性单臂抗ICOS Fab-Fc抗体的氨基酸序列在图68A-68G中列出。通过基因合成产生编码抗体表达所需的三条链的DNA，并使用标准分子生物学技术将其亚克隆到表达载体pTT5中。将DNA转染到HEK293E细胞中用于表达和使用标准技术纯化得到的蛋白质。
使用Octet表征所得的单臂抗ICOS Fab-Fc抗体对人ICOS的亲和力。使用抗小鼠Fc(AMC)生物传感器捕获ICOS的小鼠IgG2a Fc融合物并浸入多种浓度的测试物品中。得到的平衡解离常数(KD)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)显示在图69中。通过使用ForteBioOctet数据分析软件(ForteBio)使用1：1结合模型分析处理的数据来获得结合亲和力和动力学速率常数。
2. 7B：单价单臂抗-ICOS Fab-Fc抗体比二价抗-ICOS抗体促进PBMC中更大的AKT活化
用100ng/mL SEB刺激PBMC 2天。刺激后，使用EasySepTM人T细胞富集试剂盒(加拿大Vancouver的STEMCELL Technologies)通过阴性选择分离CD3+T细胞，然后用指定的测试物与板结合的抗CD3抗体(OKT3；500ng/mL)组合处理。处理后30分钟裂解细胞，并通过MULTI-SPOT 384-孔斑板(Meso Scale Discovery，Rockville，MD)上的多重磷蛋白测定法测定总AKT和磷酸化AKT(Ser473)。数据在图70中描绘为处理后磷酸化的AKT的百分比。
与实施例X一致，抗-ICOS x抗-PD-1双特异性抗体比二价抗-ICOS抗体促进显著更大的AKT活化。令人惊讶的是，增强的单价单臂抗-ICOS Fab-Fc抗体也比二价抗-ICOS抗体促进显著更大的AKT活化，达到与双特异性抗体相当的水平。
3. 7C：ICOS的单价激动作用与多种抗ICOS ABD一起起作用
使用EasySepTM人T细胞富集试剂盒(加拿大Vancouver的STEMCELL Technologies)通过阴性选择分离CD3+T细胞，然后用指定的测试物与板结合的抗CD3抗体(OKT3；500ng/mL)组合处理。处理后30分钟裂解细胞，并通过MULTI-SPOT 384-孔斑板(Meso ScaleDiscovery，Rockville，MD)上的多重磷蛋白测定法测定总AKT和磷酸化AKT(Ser473)。数据描绘于图74中，并显示包含各种抗-ICOS ABD的单价抗-ICOS Fab-Fc抗体能够诱导AKT磷酸化。

Claims (8)

1.一种异二聚体抗-PD1 x抗-ICOS抗体，其包括：
a)第一单体，其由氨基酸序列为SEQ ID NO:26367的scFv-接头-CH2-CH3组成；
b)第二单体，其由氨基酸序列为SEQ ID NO:26362的VH-CH1-铰链-CH2-CH3组成；和
c)轻链，其由氨基酸序列为SEQ ID NO:26377的VL-CL组成，
其中scFv是抗-PD1 scFv以及VH和VL形成抗-ICOS结合结构域。
2.一种核酸组合物，其包含：
a)编码权利要求1所述的第一单体的第一核酸；
b)分别地编码权利要求1所述的第二单体的第二核酸；和
c)分别地编码权利要求1所述的轻链的第三核酸。
3.一种表达载体组合物，其包含：
a)包含权利要求2所述的第一核酸的第一表达载体；
b)包含权利要求2所述的第二核酸的第二表达载体；和
c)包含权利要求2所述的第三核酸的第三表达载体。
4.一种宿主细胞，其包含权利要求3所述的表达载体组合物。
5.一种制备异二聚体抗体的方法，包括在表达所述异二聚体抗体的条件下培养权利要求4所述的宿主细胞，并回收所述抗体。
6.权利要求1所述的异二聚体抗体在制备用于在患者中激活细胞毒性T细胞(CTL)的试剂中的用途。
7.权利要求1所述的异二聚体抗体在制备用于增加患者中IFNγ水平的试剂中的用途。
8.权利要求1所述的异二聚体抗体在制备用于增加患者中IL-2水平的试剂中的用途。
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