CN110261206A - 一种大叶金腰染色体核型分析的制片方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大叶金腰染色体核型分析的制片方法,大叶金腰Chrysosplenium macrophyllum Oliv.是一种低矮的常绿草本，因含有黄酮类而具有重要药用开发价值。本发明公开一种适合大叶金腰染色体核型分析的制片方法，包括从大叶金腰新鲜植株获取根尖、预处理、固定、前低渗、酶解去壁、后低渗、涂片和染色、镜检和观察的过程。本发明提供一种简单适用的大叶金腰染色体核型分析制片方法，为大叶金腰的后续科学研究提供帮助，为金腰属植物的分类及开发应用研究奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于细胞遗传学和细胞生物学领域，具体涉及一种金腰的染色体制片方法。
背景技术
大叶金腰(Chrysosplenium macrophyllum Oliv.)为虎耳草科(Saxifragaceae)金腰属(Chrysosplenium)多年生草本植物，其叶互生，具柄，叶片近圆形至阔卵形，边缘具11-13圆齿，腹面疏生褐色柔毛，背面无毛，叶柄具褐色柔毛。花茎疏生褐色长柔毛。基生叶数枚，具柄，叶片革质，倒卵形，先端钝圆，全缘或具不明显之微波状小圆齿，基部楔形，腹面疏生褐色柔毛，背面无毛；茎生叶通常1枚，叶片狭椭圆形，边缘通常具13圆齿，背面无毛，腹面和边缘疏生褐色柔毛。多歧聚伞花序；花序分枝疏生褐色柔毛或近无毛；苞叶卵形至阔卵形，先端钝状急尖，边缘通常具9-15圆齿(有时不明显)，基部楔形；萼片近卵形至阔卵形，先端微凹，无毛；雄蕊高出萼片；子房半下位，花柱长约5mm，近直上；无花盘。蒴果；种子黑褐色，近卵球形，密被微***突起。花果期4-6月。
金腰属植物全球约70种，亚、欧、非、美四洲均有分布，以亚洲温带分布为主。中国目前发现金腰属植物约36种，广泛分布于云南、西藏、四川、贵州、湖北、湖南、东北等二十多个省份。
金腰属植物因富含黄酮类化合物而具较高药用价值，《中国植物志》、《中国药植图鉴》以及《全国中草药汇编》均有关于本属植物的药效记载，用于清热解毒、治疗肝胆病等。金腰的药用历史在中国传统医药中有广泛应用和记载，如藏药中称其为亚吉玛，藏医学者帝玛尔·丹增平措著作《晶珠本草》中载有“亚吉玛生于高山石隙，味苦性凉，缓吐泻，治胆疾。”此外金腰属植物还被收录于蒙医学著作《无误蒙药鉴》中。近年来有研究表明，金腰属植物普遍含有较高的黄酮类及三萜类化合物具良好抗肿瘤和抗病毒活性，从裸茎金腰C.nudicale中分离到的五环三萜对恶性褐色瘤(A375)、4种胃癌(ST-KM,KaTo-III,NKPS,KKLS)和膀胱癌(KK-47)都具较强抑制作用，且该属植物中特有且普遍存在的金腰酮B和金腰酮C(Chrysosplenol B,Chrysosplenol C)都有显著的抗病毒活性。以上生理活性表明金腰属植物值得进一步研究和开发。
染色体是生物体内在的遗传物质基础，是遗传物质的主要载体。染色体大小、数目和形态(即核型特征)在植物的生长发育和世代繁衍过程中相对稳定，不易受环境条件变化的影响产生变异，能在很大程度上反映了物种的特性及其遗传差异。因此，不同物种的染色体核型特征甚至染色体数目可为本属植物分类、***发育和亲缘关系鉴定提供细胞学依据。金腰属植物众多，不同种类黄酮类成分差异较大，因此鉴定清楚并筛选药用价值高的金腰种类是该属植物开发应用的首要任务。当对特定类群细胞内染色体数目、形态和核型等进行比较研究时，供核型分析的的染色体标本必须核型特征完整、清晰。
查阅资料发现目前没有金腰属植物染色体制备的方法，而常规的染色体制片方法，即压片法和去壁低渗法对于大叶金腰染色体制片来说具有许多问题，如染色体难以分散、伸展不充分，细胞质残留较多，染色不够明显，制片结果不稳定等。因此，获得一种适用于大叶金腰染色体核型分析制片的方法是目前急需解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明旨在于提供一种适用于大叶金腰染色体核型分析制片的方法，为大叶金腰的后续科学研究提供帮助，为金腰属植物的分类和开发应用研究奠定基础。
在一个实施方式中，本发明提供了一种简单适用的大叶金腰染色体核型制备的方法。具体步骤为:
(1)获取根尖：取生长茂盛的金腰植株的根尖；
(2)预处理：将根尖置于4℃冰箱中进行预处理2-3h；
(3)固定：将预处理后的根尖投入盛有固定液中进行固定保存；
(4)前低渗：取出根尖，置于重蒸水中处理40min；
(5)酶解去壁：加入2％混合酶0.2mL，然后放入28℃水浴锅中水浴4.5h，所述混合酶为4％纤维素酶与4％果胶酶等体积混合。
(6)后低渗：吸去酶液，用重蒸水清洗根尖，置于重蒸水中进行低渗水浴28℃，40min左右；
(7)敲片和染色：取低渗后的根尖进行敲片处理，并放入有改良吉姆萨染液的染缸中染色40min，所述改良吉姆萨染液的配方为：先由吉姆萨粉末与甘油按照质量体积比2:1研磨混合制成母液，实验取用时将吉姆萨母液与磷酸盐缓冲液按体积比1：20进行；
(8)镜检观察。
在一个实施方式中，所述金腰为大叶金腰。
在一个实施方式中，所述步骤1)的步骤为晴天的上午9点左右，选取盆栽里的生长茂盛的大叶金腰植株，取其根尖部位3cm左右，然后用蒸馏水清洗干净根表面附着的泥土。
在一个实施方式中，所述步骤3)为将预处理后的根尖吸去水分，投入盛有固定液的小瓶子中，进行固定保存，或者固定24h后转入75％乙醇溶液中长期保存，保存在4℃冰箱中。
在一个实施方式中，所述步骤4)为用镊子取出根尖，然后重蒸水洗净，在培养皿中切取尖端白色部分1mm左右，置于盛有低渗液(双蒸水)的EP管中浸泡处理40min，期间可更换低渗液3次。
在一个实施方式中，所述步骤6)为吸去酶液，用重蒸水清洗根尖2-3次，然后置于重蒸水中进行低渗，水浴28℃，40min左右。
在一个实施方式中，所述步骤7)为。取低渗后的根尖2-3个于滴有固定液(乙醇：冰醋酸＝3:1)的载玻片上，并用玻璃棒尽量压碎根尖，分散细胞，压碎后使破碎的组织细胞在载玻片上尽量铺散均匀，压碎根尖期间加入固定液保持水环境，根尖组织均匀分散在载玻片后用酒精灯内焰干燥。干燥后的载玻片直接放入有改良吉姆萨染液的染缸中浸没染色40min，染色完成后，载玻片用重蒸水冲洗干净，备用，所述改良吉姆萨染液的配方为：先由吉姆萨粉末与甘油按照质量体积比2:1研磨混合制成母液，实验取用时将吉姆萨母液与磷酸盐缓冲液按体积比1：20进行。
优选的，所述固定液的配方为：乙醇与冰醋酸体积比为3：1；
优选的，所述混合酶的成分为：所用纤维素酶为Cellulase R-10，果胶酶为PECTOLYASE Y-23；
优选的，所述改良吉姆萨染液的成分为：Giemsa粉末、甘油、甲醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，重蒸水，所述染液先由吉姆萨粉末与甘油研磨混合制成母液，实验取用时将吉姆萨母液与磷酸盐缓冲液按体积比1：20进行稀释。
在一个实施方式中，本发明提供一种通过参数调整，最适于大叶金腰染色体核型制备的方法，具体步骤如下：
(1)获取根尖：在晴天的上午9点左右，选取盆栽里的生长茂盛的大叶金腰植株，取其根尖部位3cm左右，然后用蒸馏水清洗干净根表面附着的泥土；
(2)预处理：将洗干净的根尖放入盛有重蒸水的小瓶中，置于4℃冰箱中，进行预处理2.5h；
(3)固定：将预处理后的根尖吸去水分，投入盛有固定液(乙醇：冰醋酸＝3:1)的小瓶子中，进行固定保存，或者固定24h后转入75％乙醇溶液中长期保存，保存在4℃冰箱中；
(4)前低渗：用镊子取出根尖，然后重蒸水洗净，在培养皿中切取尖端白色部分1mm左右，置于盛有低渗液(双蒸水)的EP管中浸泡处理40min，期间可更换低渗液3次；
(5)酶解去壁：低渗后，用移液器吸去低渗液，用移液器吸去低渗液，加入2％混合酶(4％的Cellulase R-10，4％的PECTOLYASE Y-23按照1:1制备成混合酶)0.2mL左右，然后放入28℃水浴锅中水浴4.5h，酶解过程中轻摇EP管3次左右，使酶液充分作用于材料。
(6)后低渗：吸去酶液，用重蒸水清洗根尖2-3次，然后置于重蒸水中进行低渗，水浴28℃，40min左右；
(7)敲片和染色：取低渗后的根尖2-3个于滴有固定液(乙醇：冰醋酸＝3:1)的载玻片上，并用玻璃棒尽量压碎根尖，分散细胞，压碎后使破碎的组织细胞在载玻片上尽量铺散均匀，压碎根尖期间加入固定液保持水环境，根尖组织均匀分散在载玻片后用酒精灯内焰干燥。干燥后的载玻片直接放入有改良吉姆萨染液的染缸中浸没染色40min，染色完成后，载玻片用重蒸水冲洗干净，备用，所述改良吉姆萨染液的配方为：先由吉姆萨粉末与甘油按照质量体积比2:1研磨混合制成母液，实验取用时将吉姆萨母液与磷酸盐缓冲液按体积比1：20进行；
(8)镜检观察：使用OLYMPUS BX51显微镜，10x目镜、100x油镜下观察，找到理想分散且清晰的染色体，然后用OLYMPUS DP73摄像头拍照，保存照片。
在一个实施方式中，本发明提供一种所述金腰染色体制片方法制备的含有金腰染色体吉姆萨染色核型的载玻片产品。
在一个实施方式中，本发明提供一种所述金腰染色体制片方法在制备金腰染色体核型中的用途。
与现有技术中常规的，适用于其他的植物染色体核型制备方法相应，本发明的适用于金腰染色体核型分析制备的方法，具有以下优点：
在预处理步骤中，低温处理比用秋水仙素，8-羟基喹啉更能使大叶金腰染色体分散，得到较清晰的***相，便于观察。
在酶解步骤中，通过实验对比发现由4％纤维素酶与4％果胶酶按等体积混合后的2％混合酶解效果最佳，可以得到分散良好且清晰的染色体图。试验比较了等体积纤维素酶与果胶酶混合后的1％、2％、2.5％的混合酶处理结果；通过实验对比发现酶解时间在4.5h时可以较好的破除大叶金腰的细胞壁，实验比较了4h、4.5h、5h的处理时间。
在制片步骤中，用玻璃棒直接敲碎根尖的方法比用盖玻片压片方法更简洁，且细胞分散效果更好，便于镜检。
在染色步骤中，改良的吉姆萨染液与苯酚品红，龙胆紫染液相比，可以得到更好的染色效果，大叶金腰染色体带型更加清晰。
在低渗步骤中，找到适宜的低渗时间可以使染色体分散开，便于观察。
相应的，本发明可以达到以下有益效果：
1、本发明材料获取方便，操作简易。
2、本发明可以达到染色体分散良好、清晰且染色佳的效果。
3、本发明为后续大叶金腰基于染色体方面的研究打下基础。
4、本发明为后续金腰属其他物种染色体方面的研究提供帮助。
附图说明
图1是本发明方法的流程图；
图2是低温预处理的大叶金腰染色体核型效果图；
图3是用秋水仙素，8-羟基喹啉预处理的效果图；
图4是不同混合酶浓度处理的效果图，图a为1％混合酶处理组；图b为2％混合酶处理组；图c为2.5％混合酶处理组；
图5是大叶金腰染色体核型效果图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例详细描述本发明提供的技术方案。
实施例1大叶金腰染色体核型制备的方法
一种大叶金腰染色体核型制备的方法，具体的实验步骤如下：
(1)获取根尖：在晴天的上午9点左右，选取盆栽里的生长茂盛的大叶金腰植株，取其根尖部位3cm左右，然后用蒸馏水清洗干净根表面附着的泥土；
(2)预处理：将洗干净的根尖放入盛有重蒸水的小瓶中，置于4℃冰箱中，进行预处理2-3h，或采用0.02％的秋水仙素和2mmol的8-羟基喹啉混合液进行预处理；
(3)固定：将预处理后的根尖吸去水分，投入盛有固定液(乙醇：冰醋酸＝3:1)的小瓶子中，进行固定保存，或者固定24h后转入75％乙醇溶液中长期保存，保存在4℃冰箱中；
(4)前低渗：用镊子取出根尖，然后重蒸水洗净，在培养皿中切取尖端白色部分1mm左右，置于盛有低渗液(双蒸水)的EP管中浸泡处理40min，期间可更换低渗液1-3次；
(5)酶解去壁：低渗后，用移液器吸去低渗液，加入1％-2.5％混合酶(纤维素酶、果胶酶，所用纤维素酶为Cellulase R-10，果胶酶为PECTOLYASE Y-23)0.2mL左右，然后放入28℃水浴锅中水浴4-4.5h，酶解过程中轻摇EP管3次左右，使酶液充分作用于材料。
(6)后低渗：吸去酶液，用重蒸水清洗根尖2-3次，然后置于重蒸水中进行低渗，水浴28℃，40min左右；
(7)敲片和染色：取低渗后的根尖2-3个于滴有固定液(乙醇：冰醋酸＝3:1)的载玻片上，并用玻璃棒尽量压碎根尖，分散细胞，压碎后使破碎的组织细胞在载玻片上尽量铺散均匀，压碎根尖期间加入固定液保持水环境，根尖组织均匀分散在载玻片后用酒精灯内焰干燥。干燥后的载玻片直接放入有改良吉姆萨染液的染缸中浸没染色40min，染色完成后，载玻片用重蒸水冲洗干净，备用，所述改良吉姆萨染液的配方为：先由吉姆萨粉末与甘油按照质量体积比2:1-1:2研磨混合制成母液，实验取用时将吉姆萨母液与磷酸盐缓冲液按体积比1：20进行；
(8)镜检观察：使用OLYMPUS BX51显微镜，10倍目镜、100倍油镜下观察，找到理想分散且清晰的染色体，然后用OLYMPUS DP73摄像头拍照，保存照片。
实施例2不同预处理方式对大叶金腰染色体核型的影响
为了探究不同处理方式对大叶金腰染色体核型的影响，力求寻找到最合适大叶金腰染色体核型制备的预处理方式，本实施采用如下实验设计：
比较4℃低温处理组和秋水仙素和8-羟基喹啉混合液处理组，对于叶金腰染色体核型的影响，每组设置3个平行实验，具体步骤如下：
1.实验方法
(1)获取根尖：在晴天的上午9点左右，选取盆栽里的生长茂盛的大叶金腰植株，取其根尖部位3cm左右，然后用蒸馏水清洗干净根表面附着的泥土；
(2)预处理：将洗干净的根尖放入盛有重蒸水的小瓶中，置于4℃冰箱中，进行预处理2.5h(低温处理组)，或采用0.02％的秋水仙素和2mmol的8-羟基喹啉1:1的混合液进行预处理(混合液处理组)；
(3)固定：将预处理后的根尖吸去水分，投入盛有固定液(乙醇：冰醋酸＝3:1)的小瓶子中，进行固定保存，或者固定24h后转入75％乙醇溶液中长期保存，保存在4℃冰箱中；
(4)前低渗：用镊子取出根尖，然后重蒸水洗净，在培养皿中切取尖端白色部分1mm左右，置于盛有低渗液(双蒸水)的EP管中浸泡处理40min，期间可更换低渗液3次；
(5)酶解去壁：低渗后，用移液器吸去低渗液，加入1％-2.5％混合酶(纤维素酶、果胶酶，所用纤维素酶为Cellulase R-10，果胶酶为PECTOLYASE Y-23)0.2mL左右，然后放入28℃水浴锅中水浴4-4.5h，酶解过程中轻摇EP管3次左右，使酶液充分作用于材料。
(6)后低渗：吸去酶液，用重蒸水清洗根尖2-3次，然后置于重蒸水中进行低渗，水浴28℃，40min左右；
(7)敲片和染色：取低渗后的根尖2-3个于滴有固定液(乙醇：冰醋酸＝3:1)的载玻片上，并用玻璃棒尽量压碎根尖，分散细胞，压碎后使破碎的组织细胞在载玻片上尽量铺散均匀，压碎根尖期间加入固定液保持水环境，根尖组织均匀分散在载玻片后用酒精灯内焰干燥。干燥后的载玻片直接放入有改良吉姆萨染液的染缸中浸没染色40min，染色完成后，载玻片用重蒸水冲洗干净，备用，所述改良吉姆萨染液的配方为：先由吉姆萨粉末与甘油按照质量体积比2:1-1:2研磨混合制成母液，实验取用时将吉姆萨母液与磷酸盐缓冲液按体积比1：20进行；
(8)镜检观察：使用OLYMPUS BX51显微镜，10倍目镜、100倍油镜下观察，找到理想分散且清晰的染色体，然后用OLYMPUS DP73摄像头拍照，保存照片。
2.实验结果
从镜检结果可以看出，采用4℃冰箱中，进行预处理2.5h获得的大叶金腰染色体中期核型数量明显多于采用0.02％的秋水仙素和2mmol的8-羟基喹啉1:1的混合液进行预处理2.5h。从图2-3的结果可以看出，低温处理的染色体收缩的长短，大小合适，而采用0.02％的秋水仙素和2mmol的8-羟基喹啉1:1的混合液进行预处理的大叶金腰染色体收缩过度，长度较短，染色体的形态较为模糊，不适于后期的核型分析和染色杂交等试验操作。可见，采用4℃冰箱中，进行预处理2.5h，是大叶金腰染色体核型制备的最佳预处理步骤。
实施例3不同酶解参数对大叶金腰染色体核型的影响
为了探究不同酶解参数对大叶金腰染色体核型的影响，力求寻找到最合适大叶金腰染色体核型制备的酶解参数方式，本实施采用如下实验设计：
1％混合酶处理组：4％的Cellulase R-10，4％的PECTOLYASE Y-23按照1:1制备成混合酶，酶解时加入1％上述混合酶；
2％混合酶处理组：4％的Cellulase R-10，4％的PECTOLYASE Y-23按照1:1制备成混合酶，酶解时加入2％上述混合酶；
2.5％混合酶处理组：4％的Cellulase R-10，4％的PECTOLYASE Y-23按照1:1制备成混合酶，酶解时加入2.5％上述混合酶；
每组设置3个平行实验，具体步骤如下：
1.实验方法
(1)获取根尖：在晴天的上午9点左右，选取盆栽里的生长茂盛的大叶金腰植株，取其根尖部位3cm左右，然后用蒸馏水清洗干净根表面附着的泥土；
(2)预处理：将洗干净的根尖放入盛有重蒸水的小瓶中，置于4℃冰箱中，进行预处理2.5h；
(3)固定：将预处理后的根尖吸去水分，投入盛有固定液(乙醇：冰醋酸＝3:1)的小瓶子中，进行固定保存，或者固定24h后转入75％乙醇溶液中长期保存，保存在4℃冰箱中；
(4)前低渗：用镊子取出根尖，然后重蒸水洗净，在培养皿中切取尖端白色部分1mm左右，置于盛有低渗液(双蒸水)的EP管中浸泡处理40min，期间可更换低渗液3次；
(5)酶解去壁：低渗后，用移液器吸去低渗液，按照前述1％混合酶处理组、2％混合酶处理组、2.5％混合酶处理组的步骤加入相应的混合酶，然后放入28℃水浴锅中水浴4.5h，酶解过程中轻摇EP管3次左右，使酶液充分作用于材料。
(6)后低渗：吸去酶液，用重蒸水清洗根尖2-3次，然后置于重蒸水中进行低渗，水浴28℃，40min左右；
(7)敲片和染色：取低渗后的根尖2-3个于滴有固定液(乙醇：冰醋酸＝3:1)的载玻片上，并用玻璃棒尽量压碎根尖，分散细胞，压碎后使破碎的组织细胞在载玻片上尽量铺散均匀，压碎根尖期间加入固定液保持水环境，根尖组织均匀分散在载玻片后用酒精灯内焰干燥。干燥后的载玻片直接放入有改良吉姆萨染液的染缸中浸没染色40min，染色完成后，载玻片用重蒸水冲洗干净，备用，所述改良吉姆萨染液的配方为：先由吉姆萨粉末与甘油按照质量体积比2:1-1:2研磨混合制成母液，实验取用时将吉姆萨母液与磷酸盐缓冲液按体积比1：20进行；
(8)镜检观察：使用OLYMPUS BX51显微镜，10x目镜、100x油镜下观察，找到理想分散且清晰的染色体，然后用OLYMPUS DP73摄像头拍照，保存照片。
2.实验结果
从图4中可以看出，不同混合酶浓度对于染色体核型清晰程度影响较大，采用1％的混合酶，酶解效力太弱，细胞壁未完全去除，染色体核型包裹在一层厚厚的膜中，无法进行核型分析，而2.5％的混合酶，酶解效力太大，染色体的核型变得模糊不清，而2％的混合酶可以获得清晰的染色体核型，可见，4％的Cellulase R-10，4％的PECTOLYASE Y-23按照1:1制备成混合酶，酶解时加入2％上述混合酶是大叶金腰染色体核型制备的最佳酶解浓度。
进一步，为了探究不同酶解时间对大叶金腰染色体核型的影响，力求寻找到最合适大叶金腰染色体核型制备的酶解时间，进一步设计如下实验：
4h组：采用上述2％混合酶放入28℃水浴锅中水浴4h；
4.5h组：采用上述2％混合酶放入28℃水浴锅中水浴4.5h；
5h组：采用上述2％混合酶放入28℃水浴锅中水浴5h；
每组设置3个平行实验，具体步骤如下：
1.实验方法
采用前述相同的实验步骤，其中，在步骤(5)酶解去壁中，分别进行4h组、4.5h组、5h组的比较实验。
2.实验结果
从最终的镜检结果中可知，与其他酶解时间相比，酶解4.5h可以获得清晰的染色体核型，可见，酶解4.5h是大叶金腰染色体核型制备的最佳酶解时间。
实施例4不同的染色方式对大叶金腰染色体核型制备的影响
为了探究不同的染色方式对大叶金腰染色体核型的影响，力求寻找到最合适大叶金腰染色体核型制备的不同的染色方式，本实施采用如下实验设计：
吉姆萨染色组：采用常规吉姆萨溶液染色
改良吉姆萨染色组1：由吉姆萨粉末与甘油按照质量体积比2:1研磨混合制成母液，实验取用时将吉姆萨母液与磷酸盐缓冲液按体积比1：20进行
改良吉姆萨染色组2：由吉姆萨粉末与甘油按照质量体积比1:2研磨混合制成母液，实验取用时将吉姆萨母液与磷酸盐缓冲液按体积比1：20进行；
苯酚品红染色组：采用苯酚品红进行染色；
龙胆紫染色组：采用龙胆紫进行染色；
每组设置3个平行实验，具体步骤如下：
1.实验方法
(1)获取根尖：在晴天的上午9点左右，选取盆栽里的生长茂盛的大叶金腰植株，取其根尖部位3cm左右，然后用蒸馏水清洗干净根表面附着的泥土；
(2)预处理：将洗干净的根尖放入盛有重蒸水的小瓶中，置于4℃冰箱中，进行预处理2.5h；
(3)固定：将预处理后的根尖吸去水分，投入盛有固定液(乙醇：冰醋酸＝3:1)的小瓶子中，进行固定保存，或者固定24h后转入75％乙醇溶液中长期保存，保存在4℃冰箱中；
(4)前低渗：用镊子取出根尖，然后重蒸水洗净，在培养皿中切取尖端白色部分1mm左右，置于盛有低渗液(双蒸水)的EP管中浸泡处理40min，期间可更换低渗液3次；
(5)酶解去壁：低渗后，用移液器吸去低渗液，加入2％混合酶(纤维素酶、果胶酶，所用纤维素酶为4％Cellulase R-10，果胶酶为4％PECTOLYASE Y-23)0.2mL左右，然后放入28℃水浴锅中水浴4.5h，酶解过程中轻摇EP管3次左右，使酶液充分作用于材料。
(6)后低渗：吸去酶液，用重蒸水清洗根尖2-3次，然后置于重蒸水中进行低渗，水浴28℃，40min左右；
(7)敲片和染色：取低渗后的根尖2-3个于滴有固定液(乙醇：冰醋酸＝3:1)的载玻片上，并用玻璃棒尽量压碎根尖，分散细胞，压碎后使破碎的组织细胞在载玻片上尽量铺散均匀，压碎根尖期间加入固定液保持水环境，根尖组织均匀分散在载玻片后用酒精灯内焰干燥。干燥后的载玻片分别采用前述吉姆萨染色组、改良吉姆萨染色组1、改良吉姆萨染色组2、苯酚品红染色组、龙胆紫染色组的方式进行染色
(8)镜检观察：使用OLYMPUS BX51显微镜，10倍目镜、100倍油镜下观察，找到理想分散且清晰的染色体，然后用OLYMPUS DP73摄像头拍照，保存照片。
2.实验结果
从镜检结果可以看出，改良吉姆萨染色组1获得的染色体核型最为清晰，染色体中出现了清晰的带型，便于染色体的识别和后续的核型分析实验。可见，由吉姆萨粉末与甘油按照质量体积比2:1研磨混合制成母液，实验取用时将吉姆萨母液与磷酸盐缓冲液按体积比1：20进行是大叶金腰染色体核型制备的最佳染色方式。
实施例5综合实施例2-3的最佳参数获得的大叶金腰染色体核型制备
一种通过参数调整，最适于大叶金腰染色体核型制备的方法，具体步骤如下：
(1)获取根尖：在晴天的上午9点左右，选取盆栽里的生长茂盛的大叶金腰植株，取其根尖部位3cm左右，然后用蒸馏水清洗干净根表面附着的泥土；
(2)预处理：将洗干净的根尖放入盛有重蒸水的小瓶中，置于4℃冰箱中，进行预处理2.5h；
(3)固定：将预处理后的根尖吸去水分，投入盛有固定液(乙醇：冰醋酸＝3:1)的小瓶子中，进行固定保存，或者固定24h后转入75％乙醇溶液中长期保存，保存在4℃冰箱中；
(4)前低渗：用镊子取出根尖，然后重蒸水洗净，在培养皿中切取尖端白色部分1mm左右，置于盛有低渗液(双蒸水)的EP管中浸泡处理40min，期间可更换低渗液3次；
(5)酶解去壁：低渗后，用移液器吸去低渗液，用移液器吸去低渗液，加入2％混合酶(4％的Cellulase R-10，4％的PECTOLYASE Y-23按照1:1制备成混合酶)0.2mL左右，然后放入28℃水浴锅中水浴4.5h，酶解过程中轻摇EP管3次左右，使酶液充分作用于材料。
(6)后低渗：吸去酶液，用重蒸水清洗根尖2-3次，然后置于重蒸水中进行低渗，水浴28℃，40min左右；
(7)敲片和染色：取低渗后的根尖2-3个于滴有固定液(乙醇：冰醋酸＝3:1)的载玻片上，并用玻璃棒尽量压碎根尖，分散细胞，压碎后使破碎的组织细胞在载玻片上尽量铺散均匀，压碎根尖期间加入固定液保持水环境，根尖组织均匀分散在载玻片后用酒精灯内焰干燥。干燥后的载玻片直接放入有改良吉姆萨染液的染缸中浸没染色40min，染色完成后，载玻片用重蒸水冲洗干净，备用，所述改良吉姆萨染液的配方为：先由吉姆萨粉末与甘油按照质量体积比2:1研磨混合制成母液，实验取用时将吉姆萨母液与磷酸盐缓冲液按体积比1：20进行；
(8)镜检观察：使用OLYMPUS BX51显微镜，10倍目镜、100倍油镜下观察，找到理想分散且清晰的染色体，然后用OLYMPUS DP73摄像头拍照，保存照片。
从图5的效果可以看出，实施例5的方法可以获得分散度良好，染色体长短合适，带型清晰的大叶金腰染色体核型
上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种金腰染色体制片方法，具体步骤为:
(1)获取根尖：取生长茂盛的金腰植株的根尖；
(2)预处理：将根尖置于4℃冰箱中进行预处理2-3h；
(3)固定：将预处理后的根尖投入盛有固定液中进行固定保存；
(4)前低渗：取出根尖，置于重蒸水中处理40min；
(5)酶解去壁：加入2％混合酶0.2mL，然后放入28℃水浴锅中水浴4.5h，所述混合酶为4％纤维素酶与4％果胶酶等体积混合。
(6)后低渗：吸去酶液，用重蒸水清洗根尖，置于重蒸水中进行低渗水浴28℃，40min左右；
(7)敲片和染色：取低渗后的根尖进行敲片处理，并放入有改良吉姆萨染液的染缸中染色40min，所述改良吉姆萨染液的配方为：先由吉姆萨粉末与甘油按照质量体积比2:1研磨混合制成母液，实验取用时将吉姆萨母液与磷酸盐缓冲液按体积比1：20进行；
(8)镜检观察。
2.权利要求1所述的金腰染色体制片方法，其特征在于，所述金腰为大叶金腰。
3.权利要求1金腰染色体制片方法，其特征在于，所述步骤1)的步骤为晴天的上午9点左右，选取生长茂盛的大叶金腰植株，取其根尖部位3cm左右，然后用蒸馏水清洗干净根表面附着的泥土。
4.权利要求1金腰染色体制片方法，其特征在于，所述步骤3)为将预处理后的根尖吸去水分，投入盛有固定液的小瓶子中，进行固定保存，或者固定24h后转入75％乙醇溶液中长期保存，保存在4℃冰箱中。
5.权利要求1所述的金腰染色体制片方法，其特征在于，所述步骤4)为用镊子取出根尖，然后重蒸水洗净，在培养皿中切取尖端白色部分1mm左右，置于盛有低渗液(双蒸水)的EP管中浸泡处理40min，期间需更换低渗液3次。
6.权利要求1所述的金腰染色体制片方法，其特征在于，所述步骤6)为吸去酶液，用重蒸水清洗根尖2-3次，然后置于重蒸水中进行低渗，水浴28℃，40min左右。
7.权利要求1所述的金腰染色体制片方法，其特征在于，所述步骤7)为。取低渗后的根尖2-3个于滴有固定液(乙醇：冰醋酸＝3:1)的载玻片上，并用玻璃棒尽量压碎根尖，分散细胞，压碎后使破碎的组织细胞在载玻片上尽量铺散均匀，压碎根尖期间加入固定液保持水环境，根尖组织均匀分散在载玻片后用酒精灯内焰干燥。干燥后的载玻片直接放入有改良吉姆萨染液的染缸中浸染40min，染色完成后，载玻片用重蒸水冲洗干净，备用，所述改良吉姆萨染液的配方为：先由吉姆萨粉末与甘油按照质量体积比2:1研磨混合制成母液，实验取用时将吉姆萨母液与磷酸盐缓冲液按体积比1：20进行。
8.权利要求1所述的金腰染色体制片方法，其特征在于，所述方法的步骤为：
(1)获取根尖：在晴天的上午9点左右，选取盆栽里的生长茂盛的大叶金腰植株，取其根尖部位3cm左右，然后用蒸馏水清洗干净根表面附着的泥土；
(2)预处理：将洗干净的根尖放入盛有重蒸水的小瓶中，置于4℃冰箱中，进行预处理2.5h；
(3)固定：将预处理后的根尖吸去水分，投入盛有固定液(乙醇：冰醋酸＝3:1)的小瓶子中，进行固定保存，或者固定24h后转入75％乙醇溶液中长期保存，保存在4℃冰箱中；
(4)前低渗：用镊子取出根尖，然后重蒸水洗净，在培养皿中切取尖端白色部分1mm左右，置于盛有低渗液(双蒸水)的EP管中浸泡处理40min，期间可更换低渗液3次；
(5)酶解去壁：低渗后，用移液器吸去低渗液，用移液器吸去低渗液，加入2％混合酶(4％的Cellulase R-10，4％的PECTOLYASE Y-23按照1:1制备成混合酶)0.2mL左右，然后放入28℃水浴锅中水浴4.5h，酶解过程中轻摇EP管3次左右，使酶液充分作用于材料。
(6)后低渗：吸去酶液，用重蒸水清洗根尖2-3次，然后置于重蒸水中进行低渗，水浴28℃，40min左右；
(7)敲片和染色：取低渗后的根尖2-3个于滴有固定液(乙醇：冰醋酸＝3:1)的载玻片上，并用玻璃棒尽量压碎根尖，分散细胞，压碎后使破碎的组织细胞在载玻片上尽量铺散均匀，压碎根尖期间加入固定液保持水环境，根尖组织均匀分散在载玻片后用酒精灯内焰干燥。干燥后的载玻片直接放入有改良吉姆萨染液的染缸中浸没染色40min，染色完成后，载玻片用重蒸水冲洗干净，备用，所述改良吉姆萨染液的配方为：先由吉姆萨粉末与甘油按照质量体积比2:1研磨混合制成母液，实验取用时将吉姆萨母液与磷酸盐缓冲液按体积比1：20进行；
(8)镜检观察：使用OLYMPUS BX51明视野显微镜，10倍目镜、100倍油镜观察，找到理想分散且清晰的染色体，然后用OLYMPUS DP73摄像头拍照，保存照片。
9.权利要求1-8所述金腰染色体制片方法制备的含有金腰染色体吉姆萨染色核型的载玻片产品。
10.权利要求1-8所述金腰染色体制片方法在制备金腰染色体核型中的用途。
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| CN108731994A (zh) * | 2018-05-21 | 2018-11-02 | 遵义医学院 | 一种千里光根尖染色体标本片的制作方法 |
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 王超 等: "木薯根尖染色体制片方法的优化", 《热带作物学报》 * |
Cited By (1)
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| CN110672389A (zh) * | 2019-10-12 | 2020-01-10 | 广州甘蔗糖业研究所湛江甘蔗研究中心 | 一种基于幼叶的圆叶牛樟染色体核型分析方法 |
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