CN110257502B

CN110257502B - 肠无神经节细胞症血浆外泌体诊断标志物及其应用

Info

Publication number: CN110257502B
Application number: CN201910574068.3A
Authority: CN
Inventors: 唐维兵; 吕修睿; 李红星; 李杨
Original assignee: Nanjing Childrens Hospital of Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Childrens Hospital of Nanjing Medical University
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2023-02-14
Anticipated expiration: 2039-06-28
Also published as: CN110257502A

Abstract

本发明属于基因工程及临床医学技术领域，涉及一种肠无神经节细胞症血浆外泌体诊断标志物、引物组和试剂盒，以及血浆外泌体诊断标志物或其引物在制备肠无神经节细胞症诊断制剂的应用。血浆外泌体诊断标志物包括hsa‑miR‑494‑3p，hsa‑miR‑668‑3p，hsa‑miR‑323a‑3p，hsa‑miR‑605‑3p和hsa‑miR‑5701。该诊断标志物对肠无神经节细胞症的诊断具有很好的特异性和敏感性，可用于制备肠管神经节细胞症的诊断制剂，避免侵入性、有创性诊断，并可在早期进行筛查和诊断。

Description

肠无神经节细胞症血浆外泌体诊断标志物及其应用

技术领域

本发明属于基因工程及临床医学技术领域，尤其涉及一种肠无神经节细胞症血浆外泌体诊断标志物及其应用。

背景技术

肠无神经节细胞症，以消化道远端肠管缺乏神经节细胞为病理特征，以胎粪性便秘、呕吐、腹胀等为主要临床表现，早期为不完全性功能性肠梗阻，可以发展为完全性肠梗阻，甚至出现小肠结肠炎、肠穿孔，危及患儿生命，是最常见的先天性消化***疾病之一。该病的发病率在活产婴儿中约为1：2000-5000，男女比例约1：4。根据其狭窄段的长短，肠无神经节细胞症主要分为短段型、常见型、长段型及全结肠型，其中常见型约占75％的病例，病变肠管从乙状结肠中远段延续到直肠末端。

肠无神经节细胞症绝大多数需要手术治疗，但该病的诊断比较复杂，除了临床表现和体格检查外，还需要进行钡剂灌肠造影检查，***直肠测压观察直肠***抑制反射和直肠活组织检查，而这些检查有辐射、有创伤，还要镇静和麻醉，直肠活组织检查还可能出现出血、肠穿孔等并发症，同时这些检查都有一定的滞后性，往往是临床表现出现一段时间后才进行，这样会延误诊断。而新生儿肠无神经节细胞症由于临床表现不典型，诊断更为困难和复杂。因此，临床亟需寻找一种简单、及时、准确、微创的肠无神经节细胞症早期诊断方法。

外泌体是机体产生的双层脂膜的多囊泡运输体，可将细胞分泌的蛋白、DNA、RNA等分子包裹在囊泡内，促进细胞之间的交流，广泛参与各种病理生理过程。大多数细胞均可分泌外泌体，而来自不同组织来源的外泌体在组成和功能上不同，这种差异受细胞外基质和微环境的影响及调控，因此，外泌体携带有大量生理病理的生物标志物信息。研究发现，为了达到调节远处组织或细胞功能的目的，一些细胞以分泌外泌体的形式包裹重要的信号分子或靶蛋白、核糖核酸，使它们通过体液到达远处的组织或细胞，从而发挥相应作用。其中微小核糖核酸(microRNA，即miRNA)是外泌体小分子RNA的主要组成部分。miRNA是主要参与转录后基因调控的一类非编码RNA分子，它们可以通过降解特定mRNA或抑制其翻译来抑制相应蛋白质的表达，目前miRNA已被证明广泛存在于各种类型的细胞中，并发挥重要的作用。也有很多研究表明循环血浆miRNA可作为一种生物标志物用于疾病的诊断，但血浆中总RNA暴露干扰较多，如RNA酶干扰及降解等影响，存在假阴性可能。

而外泌体中的miRNA受到外泌体膜结构的保护，可免于RNA酶的降解，可以在体液循环和微环境中稳定检测到，保证了获得方法的无创或较小创伤，疾病特异性敏感性更高，且含量丰富、性质稳定，相比于血浆中直接存在的miRNA更加适用于早期诊断。由此可见外泌体源性miRNA作为生物标志物用于诊断和预测预后具有很大的潜能。已有研究证实外泌体包裹的特异性miRNAs在多种疾病的诊断中具有重要价值。例如，在胃癌中血浆外泌体中的非编码RNA被认为是新型的癌症标志物，目前对于外泌体miRNA的功能研究多集中在肿瘤、中枢神经***病变等领域，在出生缺陷和先天性畸形的早期诊断，特别是在肠无神经节细胞症中的应用还未见报道。因此，寻找表达显著差异的HSCR相关血浆外泌体miRNA表达谱，开发其早期诊断功能十分必要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种肠无神经节细胞症血浆外泌体诊断标志物及其应用。

本发明采取以下技术方案实现：一种肠无神经节细胞症血浆外泌体诊断标志物，由外泌体hsa-miR-494-3p，hsa-miR-668-3p，hsa-miR-323a-3p，hsa-miR-605-3p和hsa-miR-5701组合构成。

优选的，所述hsa-miR-494-3p的核苷酸序列为：UGAAACAUACACGGGAAACCUC(如SEQID NO:1所示)；

所述hsa-miR-668-3p的核苷酸序列为UGUCACUCGGCUCGGCCCACUAC(如SEQ ID NO:2所示)；

所述hsa-miR-323a-3p的核苷酸序列为：CACAUUACACGGUCGACCUCU(如SEQ ID NO:3所示)；

所述hsa-miR-605-3p的核苷酸序列为：AGAAGGCACUAUGAGAUUUAGA(如SEQ ID NO:4所示)；

所述hsa-miR-5701的核苷酸序列为UUAUUGUCACGUUCUGAUU(如SEQ ID NO:5所示)。

优选的，所述hsa-miR-494-3p的上游引物的核苷酸序列为：ACACTCCAGCTGGGTGAAACATACACGGGA(如SEQ ID NO:6所示)，下游引物的核苷酸序列为：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAGGTTTC(如SEQ ID NO:7所示)；

所述hsa-miR-668-3p的上游引物的核苷酸序列为：ACACTCCAGCTGGGTGTCACTCGGCTCGGCC(如SEQ ID NO:8所示)，下游引物的核苷酸序列为：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGTAGTGGG(如SEQ ID NO:9所示)；

所述hsa-miR-323a-3p的上游引物的核苷酸序列为：ACACTCCAGCTGGGCACATTACACGGTCG(如SEQ ID NO:10所示)，下游引物的核苷酸序列为：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGAGGTCG(如SEQ ID NO:11所示)；

所述hsa-miR-605-3p的上游引物的核苷酸序列为：ACACTCCAGCTGGGAGAAGGCACTATGAGA(如SEQ ID NO:12所示)，下游引物的核苷酸序列为：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCTAAATC(如SEQ ID NO:13所示)；

所述hsa-miR-5701的上游引物的核苷酸序列为：ACACTCCAGCTGGGTTATTGTCACGTT(如SEQ ID NO:14所示)，下游引物的核苷酸序列为：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAATCAGAA(如SEQ ID NO:15所示)。

本发明的第二个目的在于，提供一种血浆外泌体诊断标志物(miRNA标志物)在制备肠无神经节细胞症诊断制剂的应用，所述诊断制剂能够测定血浆外泌体诊断标志物(miRNA标志物)在血浆中表达量。

本发明的第三个目的在于，提供一种肠无神经节细胞症诊断试剂盒，所述试剂盒内含有Taq酶、20×EVA GREEN、MgCl2、dNTP混合液、10×PCR缓冲液、纯水，还含有：所述hsa-miR-494-3p的上游引物和下游引物；所述hsa-miR-668-3p的上游引物和下游引物；所述hsa-miR-323a-3p的上游引物和下游引物；所述hsa-miR-605-3p的上游引物和下游引物；所述hsa-miR-5701的上游引物和下游引物。

优选的，所述试剂盒中还含有外参cel-miR-39的上游引物和下游引物，所述cel-miR-39的上游引物的核苷酸序列为：GGCCTCACCGGGTGTAAATCAG(如SEQ ID NO:16所示)，下游引物的核苷酸序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAGCT(如SEQID NO:17所示)。

本发明详细描述如下：

以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，***收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了芯片测序方法、外泌体提取方法、外泌体鉴定方法、RT-PCR方法的一种或几种进行检测。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

一、研究对象选择和分组依据

A组：健康对照组(n＝57，9人芯片筛选，16人一期验证，32人独立人群验证)：

1.年龄在0至6月间；

2.无消化***疾病；

3.无先天畸形；

4.无其他全身性重大疾病。

B组：肠无神经节细胞症组(n＝57，9人芯片筛选，16人一期验证，32人独立人群验证)：

1.年龄在0至6月间；

2.经钡剂灌肠、***直肠压力测定、术后病理证实为肠无神经节细胞症；

3.无其他伴随先天畸形；

4.无其它消化***疾病；

5.无其他全身性重大疾病。

二、血浆外泌体分离以及RNA提取

(1)新鲜血浆样本2ml于离心机3000g离心15分钟以除去细胞和细胞碎片，取上清每100μl分装至洁净1.5ml EP管中。

(2)向每个样品中加入4μl凝血酶/0.5ml血浆至最终浓度为5U/ml。然后将混合物在室温下温育5分钟，然后在标准微量离心机中以10000rpm离心5分钟。在管底部观察到可见的纤维蛋白沉淀，并将上清液转移到新的清洁管中。

(3)使用0.22-μm PVDF过滤器(Millipore)过滤上清液。随后，将适当体积的ExoQuick外泌体沉淀溶液(System Biosciences)加入到血清样上清液中，然后在4℃冷藏30分钟。

(4)将混合物以1500g离心30分钟，在容器底部可见白色或米色颗粒即为外泌体。

(5)将TRIzol试剂加入每个外泌体样品中以提取总RNA。孵育5分钟后，加入5μL200nM cel-miR-39(RiboBio，Guangzhou，China)作为外部对照。

(6)充分混匀后，12000rpm离心15min，立即取上清至一洁净1.5ml EP管中。

(7)向EP管中加入1.5倍上清水相体积的无水乙醇，充分混匀后转移至离心柱，10000rpm离心15秒，弃下层废液。

(8)在离心柱上加入700μl RWT缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层废液。

(9)在离心柱上加入500μl RPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层液。重复一遍。

(10)将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm离心1分钟，用于去除RPE缓冲液。

(11)将离心柱装在一个新的1.5ml的离心管中，并在柱子上加入50μl DEPC水，离心1分钟。

(12)-70℃保存处理后的样本。

本发明实验中使用的离心柱和配套试剂(RWT缓冲液、RPE缓冲液)均来自QiagenmiRNeasy Mini Kit(货号217004)这个试剂盒，下同。

三、电镜拍摄、纳米颗粒追踪分析以及Western Blot方法鉴定外泌体

(1)电镜拍摄：将上述步骤中分离的外泌体样本取部分重悬于1×PBS中，并施加到碳涂覆的200目铜栅格上20分钟。使用滤纸将边缘处的多余液体吸走。然后，加入2％磷钨酸溶液，在室温***性染色10分钟。再次用滤纸除去不需要的液体后，用白炽灯干燥铜栅格。使用扫描透射电子显微镜(Tecnai G2 Spirit Bio TWIN,FEI,USA)获得显微照片。

(2)纳米颗粒追踪分析：使用Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments,UK)及其相应的软件处理外泌体用于纳米颗粒追踪分析。首先，将上述步骤中分离的外泌体样本取部分重悬于1×PBS(Gibco，NY，USA)中。在1mL1x PBS中稀释，将样品加载到载具中，然后我们如下调节仪器采集前参数：温度为23℃；灵敏度为85；帧速率为每秒30帧(fps)；快门速度为100；并且激光脉冲持续时间等于快门持续时间。整个过程中在11个不同位置测量每个样品，每个位置有两个循环读数。将采集后参数调整为25以获得最小亮度，将最大尺寸调整为200像素，将最小尺寸调整为5像素。在测量之前，我们使用Thermo Fisher Scientific生产的直径为100nm的聚苯乙烯颗粒来对准仪器。在分析了所有11个位置并去除所有异常位置后，使用仪器软件计算测量参数。

(3)Western Blot：将上述步骤中分离的外泌体样本取部分用放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液提取外泌体蛋白。在10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离等量的提取的蛋白质，然后在300mA的条件下转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上1小时。我们购买的抗体如下：抗CD63(ab134045，Abcam，Cambridge，MA，USA)和抗CD9(ab92726，Abcam，Cambridge，MA，USA)。用1％TBST(TBS，0.1％吐温20)缓冲液中的5％脱脂牛奶封闭1小时后，孵育一抗(CD63，1：1000；CD9，1：1000)在4℃下过夜。用1×TBST洗涤4次，每次15分钟后，在室温下以1：10000的稀释度进行二抗孵育1小时。再次洗涤膜。使用ECL蛋白质印迹底物(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)在凝胶成像***上检测目标蛋白。

四、芯片测序筛选差异表达的外泌体miRNA

使用Illumina SBS技术对血浆样本中的外泌体miRNA进行测序。首先通过PAGE凝胶过滤小RNA(18-30bp)，在最佳反应条件下连接3'衔接子***和5'衔接子混合***后，我们用衔接子引物在17个循环中扩增小RNA分子。然后，用PAGE凝胶纯化PCR产物(大约90bp的片段)使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent DNA 1000 Reagents)确定平均分子长度，并通过Real-time PCR定量。合适的文库在cBot上扩增以在流动池上产生簇，按照制造商的说明用HiSeq 2000***对其进行单端测序。数字质量数据是通过处理序列器获得的图像文件生成的。在覆盖衔接子序列并丢弃污染的读数后，我们用硅片分析评估了读数，获得差异表达的外泌体miRNA。

五、Real-time PCR方法测量血浆外泌体miRNA表达量

(1)制备cDNA：通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV缓冲液、2μl 10mM dNTP混合液(Takara公司)、0.5μl RNA酶抑制剂(Takara公司)、1μl AMV(Takara公司)以及1.5μl单一miRNA对应的反向引物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟。

(2)Real-time PCR：取1μl cDNA，将cDNA倍比稀释，加入0.3μl Taq酶(Takara公司)，1μl 20×EVA GREEN，0.25μl 10μM上述单一miRNA对应的正向引物，0.25μl 10μM通用反向引物(URP)，1.2μl 25mM MgCl₂，1.6μl 2.5mM dNTP混合液(Takara公司)，2μl10×PCR缓冲液，12.4μl纯水，20μl体系进行荧光定量PCR。使用仪器ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，反应条件均为：95℃、5分钟，进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟，进行40个循环。检测并比较健康对照、肠无神经节细胞症患儿血浆样本中外泌体miRNA表达量的变化，各组样品血浆外泌体miRNA的表达量比值可用方程2^–△G表示，其中△G＝C_Tgroup1–C_Tgroup2。为保证各次实验间的可比性，我们在每板上都设置了cel-miR-39，以其表达量作为外参调整计算表达量。

检测到的存在差异表达的健康对照和肠无神经节细胞症患者血浆外泌体诊断标志物(miRNAs)包括hsa-miR-494-3p(SEQ ID No：1)，hsa-miR-668-3p(SEQ ID No：2)，hsa-miR-323a-3p(SEQ ID No：3)，hsa-miR-605-3p(SEQ ID No：4)和hsa-miR-5701(SEQ ID No：5)。其中hsa-miR-494-3p(SEQ ID No：1)，hsa-miR-668-3p(SEQ ID No：2)，hsa-miR-323a-3p(SEQ ID No：3)，hsa-miR-605-3p(SEQ ID No：4)在肠无神经节细胞症患者中的拷贝数都显著高于健康对照组，hsa-miR-5701(SEQ ID No：5)的拷贝数显著低于健康对照组。

六、肠无神经节细胞症诊断试剂盒制备方法

根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于诊断肠无神经节细胞症的试剂盒，所述诊断试剂盒包含测定受试者血浆外泌体中稳定存在且可检测的成熟外泌体hsa-miR-494-3p，hsa-miR-668-3p，hsa-miR-323a-3p，hsa-miR-605-3p和hsa-miR-5701的引物和工具。诊断试剂盒包括一批血浆外泌体miRNAs引物，还可以包括Taq酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸等试剂。

本发明的优点和积极效果是：本发明通过分离和比较正常对照和肠无神经节细胞症患儿血浆外泌体中的诊断标志物(miRNAs)，发现了血浆外泌体中存在可用于评估是否患有肠无神经节细胞症的外泌体miRNA组合，提出了与肠无神经节细胞症相关的血浆外泌体诊断标志物(miRNA标志物)组合，以及该血浆外泌体诊断标志物或其引物在制备肠无神经节细胞症诊断制剂中的应用，研制出可便于临床应用的肠无神经节细胞症的早期、无创诊断试剂盒。

本发明采用血浆外泌体miRNA作为肠无神经节细胞症评价的诊断标志物的优越性在于：

(1)血浆外泌体miRNA是一种新型生物标志物，由于外泌体脂质膜结构具有对内源性RNA酶的防护作用，外泌体miRNA在血液中以稳定形式存在。区别于传统生物标志物，血浆外泌体miRNA不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高肠无神经节细胞症诊断的敏感性和特异性。而与血浆中直接存在的游离miRNA相比，外泌体miRNA表达更加稳定，受血浆环境影响较小，更利于长期监测。该类小分子RNA生物标志物的成功开发，将为出生缺陷的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)本发明提供的血浆外泌体miRNA标志物可用作肠无神经节细胞症的诊断标志物，在早期通过无创方式获得肠无神经节细胞症的患病风险，避免侵入性、有创性操作，为临床进一步深入检查提供依据，为早期、简便、快速、准确掌握患儿的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。

(3)本发明采用符合肠无神经节细胞症和健康对照人群的样本进行验证，证明这几种标志物表达量存在显著性差异并具有稳定性，以说明该标志物具有特异性，可作为标志物使用。

(4)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系，初期通过预实验筛选多种血浆外泌体miRNAs，应用Real-time PCR等方法进行二次验证，采用分层评分***对诊断结果进行标化，保证了该血浆外泌体miRNA生物标志物和诊断试剂盒的可靠性。

附图说明

图1直肠***抑制反射检查；

注：A图显示直肠内压力增加(直肠内人工气囊注气)后，肠无神经节细胞症患儿直肠压力未能反射性下降，提示直肠被动性扩张后内***松弛反射缺如；B图显示直肠内压力增加(直肠内人工气囊注气)后，正常儿直肠压力反射性下降到直肠舒张压水平，提示正常儿直肠被动性扩张后内***松弛反射正常。

图2灌肠造影检查：该图显示肠无神经节细胞症影像学表现为降结肠远端狭窄、痉挛，近端结肠扩张；

图3a.电镜下拍摄到清晰可见的外泌体膜性结构；

图3b.纳米颗粒追踪分析显示样本中所提取颗粒大小基本与外泌体大小一致；

图3c.Western Blot显示CD9、CD63两种外泌体标志蛋白均为阳性，提示所提颗粒为外泌体；

图4a.以外泌体hsa-miR-494-3p作为诊断标志物对健康对照和肠无神经节细胞症组进行区分，其在肠无神经节细胞症患者中的拷贝数显著高于健康对照组；

图4b.以外泌体hsa-miR-668-3p作为诊断标志物对健康对照和肠无神经节细胞症组进行区分，其在肠无神经节细胞症患者中的拷贝数显著高于健康对照组；

图4c.以外泌体hsa-miR-323a-3p作为诊断标志物对健康对照和肠无神经节细胞症组进行区分，其在肠无神经节细胞症患者中的拷贝数显著高于健康对照组；

图4d.以外泌体hsa-miR-605-3p作为诊断标志物对健康对照和肠无神经节细胞症组进行区分，其在肠无神经节细胞症患者中的拷贝数显著高于健康对照组；

图4e.以外泌体hsa-miR-5701作为诊断标志物对健康对照和肠无神经节细胞症组进行区分，其在肠无神经节细胞症患者中的拷贝数显著低于健康对照组；

图5应用hsa-miR-494-3p，hsa-miR-668-3p，hsa-miR-323a-3p，hsa-miR-605-3p和hsa-miR-5701联合诊断肠无神经节细胞症而绘制的ROC曲线。

具体实施方式

以下通过各实施例对本发明作进一步的阐述。

一、研究对象选择和分组依据

本发明人于2014年到2019年间从南京医科大学附属儿童医院等医院搜集符合要求的肠无神经节细胞症患儿及无疾病正常婴儿血浆样品(临床诊断标准见图1，图2)，通过对样品资料的整理，从中选择了符合要求的57例健康对照、57例肠无神经节细胞症患者作为Real-time PCR检测外泌体miRNA表达的实验对象。具体的样品归类标准如下：

1.年龄在0至6月间；

2.无消化***疾病；

3.无先天畸形；

4.无其他全身性重大疾病。

1.年龄在0至6月间；

3.无其他伴随先天畸形；

4.无其它消化***疾病；

5.无其他全身性重大疾病。

二、研究对象病理诊断

对既往有胎便排出延迟，反复排便困难、腹胀、低位肠梗阻的患儿使用肛管直肠测压检测直肠***抑制反射、钡剂灌肠造影影像学检查、直肠壁组织学检查诊断肠无神经节细胞症。直肠***抑制反射表现为***内***松弛反射缺如。影像学检查表现为：1.在病变段与扩张段之间有一明显移行分隔区，呈现“锥体”状；2.病变段自***开始向上延展至不同部位结肠；3.病变段肠管痉挛狭窄，其近端肠管扩张；4.钡剂潴留：超过24小时仍未排出。直肠壁组织学检查主要观察黏膜下及肌间神经丛有无神经节细胞。正常的神经节细胞核大、染色深、居正中、核仁明显、周围胞浆嗜碱性，而病变肠段即狭窄、痉挛肠管缺乏神经节细胞，神经丛增生。以上临床检查方法均存在其局限性，其中直肠肛管测压诊断准确性约80％，新生儿准确性更低，且需口服镇静剂。放射学方法对患儿有辐射损伤，对新生儿和全结肠型也有假阴性和假阳性的情况。直肠壁活检方法较为精确，但属于创伤性诊断方法，需接受麻醉，对患儿有明显创伤性，风险较大，有出血、肠穿孔等并发症。而诊断明确是手术治疗的依据。

三、外泌体提取与鉴定

(1)外泌体提取：

a)新鲜血浆样本2ml于离心机3000g离心15分钟以除去细胞和细胞碎片，取上清每100μl分装至洁净1.5ml EP管中；

b)向每个样品中加入4μl凝血酶/0.5ml血浆至最终浓度为5U/ml。然后将混合物在室温下温育5分钟，然后在标准微量离心机中以10000rpm离心5分钟。在管底部观察到可见的纤维蛋白沉淀，并将上清液转移到新的清洁管中；

c)使用0.22-μm PVDF过滤器(Millipore)过滤上清液。随后，将适当体积的ExoQuick外泌体沉淀溶液(System Biosciences)加入到血清样上清液中，然后在4℃冷藏30分钟；

d)将混合物以1500g离心30分钟，在容器底部可见白色或米色颗粒即为外泌体。

(2)电镜拍摄外泌体：

将上述步骤中分离的外泌体样本取部分重悬于1×PBS中，并施加到碳涂覆的200目铜栅格上20分钟。使用滤纸将边缘处的多余液体吸走。然后，加入2％磷钨酸溶液，在室温***性染色10分钟。再次用滤纸除去不需要的液体后，用白炽灯干燥铜栅格。使用扫描透射电子显微镜(Tecnai G2 Spirit Bio TWIN,FEI,USA)获得显微照片。

(3)纳米颗粒追踪分析：

使用Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments,UK)及其相应的软件处理外泌体用于纳米颗粒追踪分析。首先，将上述步骤中分离的外泌体样本取部分重悬于1×PBS(Gibco，NY，USA)中。在1mL1x PBS中稀释，将样品加载到载具中，然后我们如下调节仪器采集前参数：温度为23℃；灵敏度为85；帧速率为每秒30帧(fps)；快门速度为100；并且激光脉冲持续时间等于快门持续时间。我们在整个过程中在11个不同位置测量每个样品，每个位置有两个循环读数。将采集后参数调整为25以获得最小亮度，将最大尺寸调整为200像素，将最小尺寸调整为5像素。在测量之前，我们使用ThermoFisher Scientific生产的直径为100nm的聚苯乙烯颗粒来对准仪器。在分析了所有11个位置并去除所有异常位置后，使用仪器软件计算测量参数。

(4)Western Blot：

将上述步骤中分离的外泌体样本取部分用放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液提取外泌体蛋白。在10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离等量的提取的蛋白质，然后在300mA的条件下转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上1小时。我们购买的抗体如下：抗CD63(ab134045，Abcam，Cambridge，MA，USA)和抗CD9(ab92726，Abcam，Cambridge，MA，USA)。用1％TBST(TBS，0.1％吐温20)缓冲液中的5％脱脂牛奶封闭1小时后，孵育一抗(CD63，1：1000；CD9，1：1000)在4℃下过夜。用1×TBST洗涤4次，每次15分钟后，在室温下以1：10000的稀释度进行二抗孵育1小时。再次洗涤膜。使用ECL蛋白质印迹底物(ThermoFisher Scientific，MA，USA)在凝胶成像***上检测目标蛋白。

电镜下拍摄到清晰可见的外泌体膜性结构，纳米颗粒追踪分析显示样本中所提取颗粒大小基本与外泌体大小一致，Western Blot显示CD9、CD63两种外泌体标志蛋白均为阳性，结果均提示所提取颗粒为外泌体(如图3a、图3b、图3c所示)。

四、芯片测序筛选差异表达的外泌体miRNA

使用Illumina SBS技术对9例健康对照、9例肠无神经节细胞症患儿血浆样本中的外泌体miRNA进行测序。首先通过PAGE凝胶过滤小RNA(18-30bp)，在最佳反应条件下连接3'衔接子***和5'衔接子混合***后，我们用衔接子引物在17个循环中扩增小RNA分子。然后，用PAGE凝胶纯化PCR产物(大约90bp的片段)使用Agilent 2100生物分析仪(AgilentDNA 1000 Reagents)确定平均分子长度，并通过Real-time PCR定量。合适的文库在cBot上扩增以在流动池上产生簇，按照制造商的说明用HiSeq 2000***对其进行单端测序。数字质量数据是通过处理序列器获得的图像文件生成的。在覆盖衔接子序列并丢弃污染的读数后，我们用硅片分析评估了读数，获得差异表达的外泌体miRNA。

五、在小样本中进一步筛选外泌体miRNA

根据芯片结果筛选出在无神经节细胞症中有明显表达差异的外泌体miRNA，分别对16例健康对照、16例肠无神经节细胞症患儿的血浆进行各外泌体miRNA的定量Real-timePCR检测。

(1)制备cDNA样品：

a)将TRIzol试剂加入每个外泌体样品中以提取总RNA。孵育5分钟后，加入5μL200nM cel-miR-39作为外部对照；

b)充分混匀后，12000rpm离心15min，立即取上清至一洁净1.5ml EP管中；

c)向EP管中加入1.5倍上清水相体积的无水乙醇，充分混匀后转移至离心柱，10000rpm离心15秒，弃下层废液；

d)在离心柱上加入700μl RWT缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层废液；

e)在离心柱上加入500μl RPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层液。重复一遍；

f)将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm离心1分钟，用于去除RPE缓冲液；

g)将离心柱装在一个新的1.5ml的离心管中，并在柱子上加入50μl DEPC水，离心1分钟；收集RNA；

h)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV缓冲液、2μl 10mM dNTP混合液(Takara公司)、0.5μl RNA酶抑制剂(Takara公司)、1μl AMV(Takara公司)以及1.5μl单一miRNA对应的反向引物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟。

(2)Real-time PCR：

取1μl cDNA，将cDNA倍比稀释，加入0.3μl Taq酶(Takara公司)，1μl 20×EVAGREEN，0.25μl 10μM上述单一miRNA对应的正向引物，0.25μl 10μM通用反向引物(URP)，1.2μl25mM MgCl₂，1.6μl 2.5mM dNTP混合液(Takara公司)，2μl 10×PCR缓冲液，12.4μl纯水，20μl体系进行荧光定量PCR。使用仪器ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，反应条件均为：95℃、5分钟，进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟，进行40个循环。检测并比较健康对照、肠无神经节细胞症患儿血浆样本中外泌体miRNA表达量的变化，各组样品血浆外泌体miRNA的表达量比值可用方程2^–△G表示，其中△G＝C_Tgroup1–C_Tgroup2。为保证各次实验间的可比性，我们在每板上都设置了cel-miR-39，以其表达量作为外参调整计算表达量。

检测并比较健康对照、肠无神经节细胞症血浆样本中外泌体miRNAs表达谱的差异，筛选出有显著差异且倍数变化两倍以上的外泌体miRNAs进行进一步验证，选定了其中5条，其中4条显著上调，具体为：hsa-miR-494-3p，hsa-miR-668-3p，hsa-miR-323a-3p，hsa-miR-605-3p；此外还有1条显著下调，为hsa-miR-5701。

六、扩大样本验证筛选出的外泌体miRNAs

设计引物(表1)分别对其他32例健康对照、32例肠无神经节细胞症患儿的血浆进行各外泌体miRNAs的定量Real-time PCR检测。

(1)制备cDNA样品：a)新鲜血浆样本2ml于离心机3000g离心15分钟以除去细胞和细胞碎片，取上清每100μl分装至洁净1.5ml EP管中；b)向每个样品中加入4μl凝血酶/0.5ml血浆至最终浓度为5U/ml。然后将混合物在室温下温育5分钟，然后在标准微量离心机中以10000rpm离心5分钟。在管底部观察到可见的纤维蛋白沉淀，并将上清液转移到新的清洁管中；c)使用0.22-μm PVDF过滤器(Millipore)过滤上清液。随后，将适当体积的ExoQuick外泌体沉淀溶液(System Biosciences)加入到血清样上清液中，然后在4℃冷藏30分钟；d)将混合物以1500g离心30分钟，在容器底部可见白色或米色颗粒即为外泌体；e)将TRIzol试剂加入每个外泌体样品中以提取总RNA。孵育5分钟后，加入5μL 200nM cel-miR-39作为外部对照；f)充分混匀后，12000rpm离心15min，立即取上清至一洁净1.5ml EP管中；g)向EP管中加入1.5倍上清水相体积的无水乙醇，充分混匀后转移至离心柱，10000rpm离心15秒，弃下层废液；h)在离心柱上加入700μl RWT缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层废液；i)在离心柱上加入500μl RPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层液。重复一遍；j)将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm离心1分钟，用于去除RPE缓冲液；k)将离心柱装在一个新的1.5ml的离心管中，并在柱子上加入50μl DEPC水，离心1分钟；收集RNA。l)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV缓冲液、2μl 10mMdNTP混合液(Takara公司)、0.5μl RNA酶抑制剂(Takara公司)、1μl AMV(Takara公司)以及1.5μl单一miRNA对应的反向引物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟。

从结果分析得出，hsa-miR-494-3p，hsa-miR-668-3p，hsa-miR-323a-3p，hsa-miR-605-3p，hsa-miR-5701这五条miRNA在各组间均有显著差别(图4a、图4b、图4c、图4d、图4e)。非参数的趋势性检验也显示了相同的差异。

表1miRNAs的引物序列

七、外泌体miRNA组合对肠无神经节细胞症的诊断效率

根据上述Real-time PCR方法，本发明人通过对病例和对照组血浆样品的miRNAs表达水平的比较，对外泌体中hsa-miR-494-3p，hsa-miR-668-3p，hsa-miR-323a-3p，hsa-miR-605-3p，hsa-miR-5701进行回归分析评分，以此绘制联合诊断的ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这5个miRNAs低表达或高表达对肠无神经节细胞症的评估能力。ROC分析结果显示，hsa-miR-494-3p，hsa-miR-668-3p，hsa-miR-323a-3p，hsa-miR-605-3p，hsa-miR-5701联合诊断以90.4％的AUC(ROC曲线下面积)将正常对照组和肠无神经节细胞症组分开(图5)。

在上述一系列研究结果的基础上，本发明人证明了采用血浆外泌体中hsa-miR-494-3p，hsa-miR-668-3p，hsa-miR-323a-3p，hsa-miR-605-3p，hsa-miR-5701能够很好地将对照和肠无神经节细胞症患儿区分。

八、用于肠无神经节细胞症诊断的外泌体miRNA诊断试剂盒的制作

该血浆外泌体miRNA诊断试剂盒的制作工艺和操作流程主要基于Real-time PCR技术。

首先通过测序的方法和Real-time PCR方法确定正常人和肠无神经节细胞症患儿血浆中明显差异表达且倍数变化大于2的血浆外泌体miRNA。然后通过定量PCR等技术筛选与肠无神经节细胞症相关的一类血浆外泌体miRNA，作为预测是否患有肠无神经节细胞症的指标。最后验证筛选出的血浆外泌体miRNA的诊断效率，这是在预实验的基础上做出的最优化的精简。此试剂盒包括一批血浆外泌体miRNA引物，其中miRNA的引物包括hsa-miR-494-3p，hsa-miR-668-3p，hsa-miR-323a-3p，hsa-miR-605-3p，hsa-miR-5701的正反向引物(见表1)。还可以有相关外泌体提取技术以及PCR技术常用的试剂，如外泌体沉淀剂、Taq酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液、PCR缓冲液、MgCl₂、染料等试剂，这些试剂也可采用相应的市售产品。此试剂盒的价值在于只需要一次抽出少量(2ml)血液，即可检测血浆外泌体miRNA标志物的变化趋势，再通过该变化趋势预测肠无神经节细胞症发生可能性或诊断肠无神经节细胞症。

具体试剂盒组成如下：

引物可以是以下五对引物中的多对：SEQ ID No:6和SEQ ID No:7，SEQ ID No:8和SEQ ID No:9，SEQ ID No:10和SEQ ID No:11，SEQ ID No:12和SEQ ID No:13，SEQ ID No:14和SEQ ID No:15。

试剂盒中还可以含有0.3μl Taq酶，1μl 20×EVA GREEN，1.2μl 25mM MgCl₂，1.6μl2.5mM dNTP混合液，2μl 10×PCR缓冲液，12.4μl纯水。

试剂盒中还可以含有外参cel-miR-39的正反向引物一对(表1)。

试剂盒中除正向引物外还可以含有1μl 10μM通用反向引物。

试剂盒中的组分除引物外的试剂可以采用现有技术中用于miRNA含量检测的相应试剂。

本发明人通过分离和比较正常对照和肠无神经节细胞症患儿血浆外泌体中的miRNAs，发现了血浆外泌体中存在可用于评估是否患有肠无神经节细胞症(ROC曲线提示具有较好的灵敏度)的外泌体miRNA组合，提出了肠无神经节细胞症的血浆外泌体诊断标志物(miRNA标志物)组合，以及该血浆外泌体诊断标志物或其引物在制备肠无神经节细胞症诊断试剂中的应用，研制出可便于临床应用的肠无神经节细胞症的早期、无创诊断试剂盒。

综上所述：本发明提供了一种肠无神经节细胞症血浆外泌体诊断标志物、引物组和试剂盒，以及血浆外泌体诊断标志物或其引物在制备肠无神经节细胞症诊断制剂的应用。

序列表

<110> 南京市儿童医院

<120> 肠无神经节细胞症血浆外泌体诊断标志物及其应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ugaaacauac acgggaaacc uc 22

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ugucacucgg cucggcccac uac 23

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacauuacac ggucgaccuc u 21

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agaaggcacu augagauuua ga 22

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uuauugucac guucugauu 19

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acactccagc tgggtgaaac atacacggga 30

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgaggagg tttc 44

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acactccagc tgggtgtcac tcggctcggc c 31

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgaggtag tggg 44

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acactccagc tgggcacatt acacggtcg 29

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagagag gtcg 44

<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acactccagc tgggagaagg cactatgaga 30

<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagtcta aatc 44

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acactccagc tgggttattg tcacgtt 27

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagaatc agaa 44

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggcctcaccg ggtgtaaatc ag 22

<210> 17

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccaagct 50

Claims

1.一种肠无神经节细胞症血浆外泌体诊断标志物，其特征在于：由hsa-miR-494-3p,hsa-miR-668-3p, hsa-miR-323a-3p, hsa-miR-605-3p和hsa-miR-5701组合构成；

所述hsa-miR-494-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述hsa-miR-668-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述hsa-miR-323a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述hsa-miR-605-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述hsa-miR-5701的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

2.一种根据权利要求1所述的血浆外泌体诊断标志物在制备肠无神经节细胞症诊断制剂中的应用，其特征在于：所述诊断制剂能够测定血浆外泌体诊断标志物在血浆中的表达量。

3.一种含有如权利要求1所述的血浆外泌体诊断标志物的肠无神经节细胞症诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内含有Taq酶、20×EVA GREEN、MgCl₂、dNTP混合液、10×PCR 缓冲液、纯水；

所述hsa-miR-494-3p的上游引物和下游引物；

所述hsa-miR-668-3p的上游引物和下游引物；

所述hsa-miR-323a-3p的上游引物和下游引物；

所述hsa-miR-605-3p的上游引物和下游引物；

所述hsa-miR-5701的的上游引物和下游引物。

4.根据权利要求3所述的一种肠无神经节细胞症诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有外参cel-miR-39的上游引物和下游引物，所述cel-miR-39的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。