CN110257419A

CN110257419A - 一种提高氮素利用效率的基因串联超表达载体及其应用

Info

Publication number: CN110257419A
Application number: CN201910491238.1A
Authority: CN
Inventors: 杨顺瑛; 苏彦华
Original assignee: Institute of Soil Science of CAS
Current assignee: Institute of Soil Science of CAS
Priority date: 2019-06-06
Filing date: 2019-06-06
Publication date: 2019-09-20

Abstract

一种提高氮素利用效率的基因串联超表达载体及其应用，所述载体上串联的基因为铵转运体基因和铵代谢基因。本发明首次提出将铵转运体基因和铵代谢基因同时组装到植物中，明确提升植物对铵态氮素的吸收利用的效率需同时考虑根系吸收与植株体内铵同化利用途径的协同增效，以打破体内铵积累对吸收造成的抑制作用，进而有效提高植物氮素利用率。

Description

一种提高氮素利用效率的基因串联超表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种提高氮素利用效率的基因串联超表达载体及其应用。

背景技术

氮是植物生长发育所必需的三大矿质营养元素之一，氮肥施用对提高作物产量起着极其关键的作用。土壤中可供植物利用的无机态氮主要是铵态氮和硝态氮，在通气良好的土壤中，硝态氮是主要的氮素形式；而淹水环境或酸性土壤中，铵态氮是主要的氮素形式。通常，由于土壤类型、质地及氮肥施肥量、肥料种类及施肥方式的差异，促使土壤溶液中的硝酸根和铵离子浓度在0.1～10mM范围内变动。

在农业生产中，为了保证粮食产量，不得不施用大量氮肥。中国是目前世界上氮肥需求量最大的家，氮肥的大量投入是目前保障粮食产量的重要生产模式，而中国的主要作物氮素利用率偏低，远低于世界平均水平(严湘等2008)；盈余的氮素还会带来巨大的环境风险，因此，提高农作物的氮素利用效率在农业生产和环境优化上均具有重大意义。

植物的氮素利用包括吸收、同化等过程。水稻是重要的粮食作物，由于长期生长在淹水环境，其对土壤中占主导的氮素形态—铵态氮的吸收利用是保证水稻氮素营养的关键之一。水稻对铵的吸收主要是由根系定位的一家族铵转运体(Ammonium Transporter,AMT1)介导的，近年来的研究表明水稻AMT1的铵吸收功能受到底物铵在体内积累的自发抑制(Yang et al.,2015)，超表达AMT的转基因水稻仅在铵供应不足的情况下才能更好发挥促进铵吸收的效果,如超表达OsAMT1；1的水稻在0.3mM NH₄ ⁺条件下有较好的效果，当供铵达到3mM时, 其饱满粒减少、憋粒增多，总籽粒产量显著降低，因而氮素利用率显著降低(Ranathunge et al., 2014)。生产上为追求高产，往往不得不施用远超过水稻所需要的氮素化肥用量“堆砌”充足的氮素养分供应以发挥现有高产水稻品种如超级稻的增产潜力。这种高产高投的集约化生产模式不仅导致氮肥利用率持续走低，过量的氮也对环境造成更大的负面影响。如能在增强铵吸收环节的同时匹配上铵同化环节，及时同化掉吸收的铵以打破体内铵积累对吸收造成的抑制作用，促进植物体内铵吸收和同化利用途径的协同增效，在当今氮肥减量增效的国家迫切需求下将会具有重要的理论和现实意义。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种提高氮素利用效率的基因串联超表达载体及其应用，将铵转运体基因和铵代谢基因串联，以转化植物获得的超表达纯系植株，实现超表达纯系植株中铵的根系吸收与铵同化利用途径的协同增效，以打破植物体内铵积累对铵吸收造成的抑制作用。

技术方案：一种提高氮素利用效率的基因串联超表达载体，所述载体上串联的基因为铵转运体基因和铵代谢基因。

上述铵转运体基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述铵代谢基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述提高氮素利用效率的基因串联超表达载体在提高植物氮素利用效率中的应用。

上述应用步骤为：a.提取水稻根系总RNA并以其为模板，以Oligo(dT)18为引物反转录，得到反转录产物cDNA；以此cDNA为模板，以SEQ ID NO.3所示的特异引物 OsAMT1.1-KpnI-P₁和SEQ ID NO.4所示的OsAMT1.1-XbaI-P₂进行PCR扩增，得 OsAMT1；1基因克隆；b.将OsAMT1；1基因构建到pCambia2301-35s-nos上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，得pCambia2301-35s-OsAMT1；1-nos表达载体；c.以pCambia2301-35s-nos质粒为模板，以SEQID NO.5所示的特异引物35S-nos-HindIII-P1和SEQ ID NO.6所示的特异引物35S-nos-BstEII-P2进行PCR扩增得35S-NOS克隆；将35S-NOS克隆与 pEASY-Blunt-Zero Vector(pEASY)连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，得pEASY-35s-nos 的重组质粒；d.同步骤a，以SEQ ID NO.7所示的特异引物OsGS1；2-KpnI-P₁和SEQ ID NO.8所示的OsGS1；2-BamHI-P₂进行PCR扩增，得OsGS1；2基因克隆；将OSGS1；2基因经KpnI/BamHI酶切并构建到上述pEASY-35s-nos重组质粒中，转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α，得pEASY-35s-OsGS1；2-NOS阳性重组质粒；e.用HindIII/BstEII将上述 pEASY-35s-OsGS1；2-NOS阳性重组质粒的35s-OsGS1；2-NOS片段酶切并连接到 pCambia2301-35s-OsAMT1；1-nos表达载体中，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得 pCambia2301-35s-OsAMT1；1+OsGS1；2-nos重组载体；f.将 pCambia2301-35s-OsAMT1；1+OsGS1；2-nos重组载体侵染野生型拟南芥的花絮，在含50μg/mL 卡那霉素的1/2MS平板上筛选得抗性纯系苗。

有益效果：本发明首次提出将铵转运体基因和铵代谢基因同时组装到植物中，明确提升植物对铵态氮素的吸收利用的效率需同时考虑根系吸收与植株体内铵同化利用途径的协同增效，以打破体内铵积累对吸收造成的抑制作用，进而有效提高植物氮素利用率。

附图说明

图1为OsAMT1；1基因克隆图；其中A:泳道1为OsAMT1；1PCR产物(1497bp)；M 为250bpDNA ladder marker：从上至下依次为4500bp，3000bp，2250bp,1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp；B：M为250bpDNA ladder marker,泳道1-8为TA-OsAMT1；1的 PCR鉴定结果；C：pCambia2301-35s-OsAMT1；1-nos的双酶切图：M1为DL15000 DNA marker, 泳道1-4为pCambia2301-35s-OsAMT1；1-nos的双酶切结果，M2为250bp DNA ladder marker。

图2为35S-MCS-nos基因克隆图；其中A：1和2为35S-MCS-nos的PCR结果(箭头所示条带为目的产物大小)，M为250bp DNA ladder marker；B：泳道1-6为pEASY-35s-nos 双酶切结果，M为250bp DNA ladder marker。

图3为OsGS1；2基因克隆图；其中A：1和2为OsGS1；2的PCR结果，M为DL2000 DNAMarker；B:TA-OsGS1；2重组质粒酶切图，M为DL2000 DNA Marker，泳道1和2为TA-OsGS1；2重组质粒的酶切结果；C重组质粒pEASY-35s-OsGS1；2-nos双酶切(KpnI/BamHI)图:M1为1kb DNA ladder marker,泳道1-4为pEASY-35s-OsGS1；2-nos的双酶切(KpnI/BamHI)结果，M2为250bp DNA ladder marker。D重组质粒pEASY-35s-OsGS1；2-nos双酶切(HindIII/BstEII) 图:M1为1kb DNA ladder marker,泳道1-4为pEASY-35s-OsGS1；2-nos的双酶切(HindIII/BstEII)结果，M2为250bp DNA ladder marker。

图4为pCambia2301-35s-OsAMT1；1+OsGS1；2-nos双酶切HindIII/BstEII结果图。M1为 DL 15000 DNA marker,泳道1-12为pCambia2301-35s-OsAMT1；1+OsGS1；2-nos重组质粒双酶切(HindIII/BstEII)结果，M2为250bp DNA ladder marker。

图5为本发明所述的串联多基因超表达载体图谱。

图6是水培条件下，采用含有不同浓度NH₄Cl的处理营养液浓度处理一周后的，实验组、对照组1和对照组2的纯系转基因植株的生物量，其中，A采用的是NH₄Cl浓度为0.2mM处理营养液，B采用的是NH₄Cl浓度为2mM处理营养液。

图7是水培条件下，采用含有不同浓度NH₄Cl的处理营养液浓度处理一周后的，实验组、对照组1和对照组2的纯系转基因植株的氮素积累量，其中，A采用的是NH₄Cl浓度为0.2mM 处理营养液，B采用的是NH₄Cl浓度为2mM处理营养液。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“表达载体”意指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。比如：表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点(如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp)，其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷(DNA)、核糖核苷或核糖核苷酸(RNA)及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA (肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代 (Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608 (1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。其中，本发明中提到的二硫键异构酶基因的cDNA是由二硫键异构酶基因的DNA经转录后获得的RNA逆转录而来。

实施例1

如图1-4所示，提高氮素利用效率的基因串联超表达载体的构建方法如下：

1，pCambia2301-35S-nos-OsAMT1；1超表达载体的构建；

1)OsAMT1；1基因克隆：

提取水培生长10天的水稻根系总RNA并以其为模板，以Oligo(dT)18为引物反转录，得到反转录产物cDNA。以此cDNA为模板，以特异引物OsAMT1.1-KpnI-P₁和 OsAMT1.1-XbaI-P₂进行PCR扩增；

上游引物：OsAMT1.1-KpnI-P₁(对应序列表中多核苷酸序列SEQ ID NO.3) GTCGGTACCATGGCGACGTGCGCGGCGGACCTG

下游引物：OsAMT1.1-XbaI-P₂(对应序列表中多核苷酸序列SEQ ID NO.4)

GTC TCTAGATTACACTTGGTTGTTGCTGTTGG

基因全长PCR反应体系：

基因全长PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。电泳检测，结果得到约1.5kb的单一产物(图1A)。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，于紫外照射下，割下含有目的条带的凝胶块，用胶回收试剂盒(MACHEREY-NAGEL,T40609.250)回收目的片段。将此回收的目的条带与pMD19-TSimple Vector连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。随机挑取8个单克隆 TA-OsAMT1；1/DH5α(含重组质粒TA-OsAMT1；1的DH5α菌)进行PCR鉴定。

以TA-OsAMT1；1/DH5α菌液为模板，以引物OsAMT1.1-KpnI-P₁和OsAMT1.1-XbaI-P₂进行PCR扩增。

PCR反应体系如下：

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。电泳检测，结果得到1.5kb左右的单一产物(图1B)，选取扩增出目的条带的克隆送测序，目的基因测序结果大小为1497bp，与已经公布的OsAMT1；1序列完全一致。

2)重组质粒pCambia2301-35s-OsAMT1；1-nos表达载体的构建

将测序正确的OsAMT1；1基因构建到pCambia2301-35s-nos上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后，提取质粒并酶切(图1C)鉴定。

酶切体系如下：

结果表明已经成功获得重组质粒pCambia2301-35s-OsAMT1；1-nos。

2，35s-OsGS1；2-nos多组分核苷酸片段的构建

1)35S-NOS片段的克隆

设计引物(位点分别为HindIII/BstEII)将pCambia2301-35s-nos上的35s-nos部分片段克隆出来；克隆方法具体如下：

以购买的pCambia2301-35s-nos质粒为模板，以特异引物35S-nos-HindIII-P1和35S-nos-BstEII-P2进行PCR扩增。

上游引物35S-nos-HindIII-P1(对应序列表中多核苷酸序列SEQ ID NO.5)： GGCAAGCTTCCATGGAGTCAAAGATTCAAATAG

下游引物35S-nos-BstEII-P2(对应序列表中多核苷酸序列SEQ ID NO.6)： GGCGGTNACCGGCAATTCCCGATCTAGTAACATAG

基因全长PCR反应体系：

基因全长PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。电泳检测结果见图2A。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，于紫外照射下，割下含有目的条带约825bp的凝胶块 (图2016-3-21-35s-nos)，用胶回收试剂盒(MACHEREY-NAGEL,T40609.250)回收目的片段。将此回收的目的条带与pEASY-Blunt-Zero Vector(pEASY)连接转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α。随机挑取6个单克隆pEASY-35s-nos/DH5α(含重组质粒pEASY-35s-nos的DH5α菌)进行酶切鉴定。

酶切反应体系：

37℃水浴酶切1小时，电泳检测，结果见图2B.选取酶切出目的条带大小的阳性克隆进行测序，目的基因测序结果大小为825bp，与pCambia2301-35s-nos质粒上的35s-nos部分序列完全一致，表明已经获得pEASY-35s-nos的重组质粒。

2)OsGS1；2的克隆

OsGS1；2的具体克隆方法同OsAMT1；1片段的克隆方法，不同之处在于，OsGS1；2扩增特异性引物为：

上游引物OsGS1；2-KpnI-P₁(对应序列表中多核苷酸序列SEQ ID NO.7):GTCGGTACCATGGCCAACCTCACCGACCTCG

下游引物OsGS1；2-BamHI-P₂(对应序列表中多核苷酸序列SEQ ID NO.8): GTCGGATCCTTAGTTCTGCTTCCACAGCAGCGTGG

PCR反应结束后，电泳检测得到单一条带的PCR产物，大小约为1kb(图3A)。余下的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，于紫外照射下，割下含有目的条带的凝胶块，用DNA胶回收试剂盒(MACHEREY-NAGEL,T40609.250)回收目的片段。将此回收的目的条带与pMD19-TSimple Vector连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。随机挑取单克隆 TA-OsGS1；2/DH5α(含重组质粒TA-OsGS1；2的DH5α菌)培养，提取培养的重组菌的质粒，将得到的重组质粒用KpnI/BamHI进行双酶切鉴定，将双酶切得到有条带大小分别为1074bp 和2692bp的克隆进行测定(图3B)，经测序验证所得的OSGS；2基因序列100％正确。将 OSGS1；2基因经KpnI/BamHI酶切并构建到上述1)中的重组质粒pEASY-35s-nos中，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后，提取质粒并用KpnI/BamHI双酶切鉴定 pEASY-35s-OsGS1；2-nos阳性克隆(图3C)。

酶切体系1(KpnI/BamHI)如下：

同时用HindIII/BstEII酶切鉴定pEASY-35s-OsGS1；2-nos的阳性克隆图3D。

酶切体系2(HindIII/BstEII)如下：

图3C和图3D的结果表明，已经获得了pEASY-35s-OsGS1；2-NOS的阳性重组质粒。

3)OsAMT1；1+OsGS1；2多基因串联表达载体的构建

用HindIII/BstEII将上述2)中阳性重组质粒pEASY-35s-OsGS1；2-NOS的 35s-OsGS1；2-NOS片段酶切并连接到1)中的阳性重组质粒pCambia2301-35s-OsAMT1；1-nos 中，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后，提取质粒并HindIII/BstEII酶切(图4A)鉴定，表明已经获得了OsAMT1；1+OsGS1；2多基因串联表达载体即 pCambia2301-35s-OsAMT1；1+OsGS1；2-nos重组载体，图谱如4-B所示。

实施例2

2.1转拟南芥材料的制备：

将通过实施例1构建的单基因表达载体pCambia2301-35s-OsAMT1；1-nos侵染野生型拟南芥Col-0(购自美国ATCC)的花絮，通过筛选(在含50μg/mL卡那霉素的1/2MS平板上筛选)抗性纯系苗，鉴定获得超表达拟南芥纯系材料OsAMT1；1OE#1和OsAMT1；1OE#6(如图 6和图7所示)。

将通过实施例1构建的多基因超表达载体pCambia2301-35s-OsAMT1；1+OsGS1；2-nos侵染野生型拟南芥Col-0(购自美国ATCC)的花絮，通过筛选(在含50μg/mL卡那霉素的1/2MS 平板上筛选)抗性纯系苗，鉴定获得超表达拟南芥纯系材料OsAMT1；1+OsGS1；2OE#3、OsAMT1；1+OsGS1；2#6和OsAMT1；1+OsGS1；2#7(如图6和图7所示)。

2.2含N量测定

实验组：pCambia2301-35s-OsAMT1；1+OsGS1；2-nos转化筛选的纯系转基因植株OsAMT1；1+OsGS1；2OE#3、OsAMT1；1+OsGS1；2#6和OsAMT1；1+OsGS1；2#7；

对照组1：拟南芥野生型Col-0；

对照组2：pCambia2301-35s-OsAMT1；1-nos转化筛选的纯系转基因植株：OsAMT1；1OE#1 和OsAMT1；1OE#6。

对实验组及对照组的超表达纯系转基因植株进行不同N水平处理下的生理实验，具体如下：

1)分别萌发实验组、对照组1和对照组2的纯系种子及野生型Col-0材料，营养液(参考Lanquar等，2009，如下表1所示)培养3周至5片莲座叶大小；

2)配制处理营养液：用NH₄Cl代替营养液中的NH₄NO₃，其他营养成分不变，配制NH₄Cl 浓度分别为0.2mM及2mM的处理营养液；

3)取大小一致的苗，用含有0.2mM及2mM NH₄Cl的处理营养液分别处理实验组、对照组1和对照组2的苗一周，收样测定生物量及含N量，具体方法为：

分别收获转基因拟南芥及对照植株的根部和地上部样品，依次先后用1mM CaSO₄和去离子水洗净，称量鲜重，105℃杀青30min，65℃烘干至恒重；粉碎；称重；H₂SO₄-H₂O₂消化，用分光光度计分别测定和计算各样品的含N量，结果如图6和图7所示：

采用含有相同浓度NH₄Cl的处理营养液处理实验组、对照组1和对照组2的超表达纯系转基因植株后，实验组的生物量及氮素积累明显优于对照组1和对照组2；

采用含有0.2mM及2mM NH₄Cl的处理营养液处理实验组、对照组1和对照组2的超表达纯系转基因植株后，实验组的生物量及氮素积累也明显优于对照组1和对照组2；

尤其，采用含有0.2mM NH₄Cl的处理营养液处理实验组时，实验组的生物量及氮素积累更优于采用含有2mM NH₄Cl的处理营养液处理的实验组。

表1：营养液成分

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

序列表

<110> 中国科学院南京土壤研究所

<120> 一种提高氮素利用效率的基因串联超表达载体及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1497

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atggcgacgt gcgcggcgga cctggcgccg ctgctggggc cggtggcggc gaacgcgacg 60

gactacctgt gcaaccggtt cgccgacacg acgtcggcgg tggacgcgac gtacctgctc 120

ttctcggcgt acctcgtgtt cgccatgcag ctcgggttcg cgatgctctg cgccgggtcg 180

gtgcgggcca agaacacgat gaacatcatg ctcaccaacg tgctcgacgc cgcggccggg 240

gcgctcttct actacctctt cggcttcgcc ttcgccttcg gcacgccgtc caacggcttc 300

atcgggaagc agttcttcgg cctcaagcac atgccgcaga ccgggttcga ctacgacttc 360

ttcctcttcc agtgggcctt cgccatcgcc gccgccggga tcacgtcggg ctccatcgcc 420

gagaggacgc agttcgtcgc ctacctcatc tactccgcct tcctcaccgg gttcgtctac 480

ccggtggtgt cccactggat ctggtccgcc gatgggtggg cctctgcctc ccgcacgtcc 540

ggacctctgc tgttcggctc cggtgtcatc gacttcgccg gctccggcgt cgtccacatg 600

gtcggcggtg tcgccgggct ctggggcgcg ctcatcgagg gcccccgcat cgggaggttc 660

gaccacgccg gccgatcggt ggcgctcaag ggccacagcg cgtcgctcgt cgtgcttggc 720

accttcctgc tgtggttcgg ctggtacgga ttcaaccccg ggtcgttcac caccatcctc 780

aagacgtacg gcccggccgg cggcatcaac gggcagtggt ccggagtcgg ccgcaccgcc 840

gtgacgacga ccctggccgg cagcgtggcg gcgctcacca cgctgttcgg gaagcggctc 900

cagacggggc actggaacgt ggtcgacgtc tgcaacggcc tcctcggcgg gttcgccgcc 960

atcaccgccg ggtgcagcgt cgtcgacccg tgggccgcga tcatctgcgg gttcgtctcg 1020

gcgtgggtgc tcatcggcct caacgcgctc gccgcgcgcc tcaagttcga cgacccgctc 1080

gaggccgccc agctccacgg cgggtgcggc gcgtggggga tcctcttcac cgcgctcttc 1140

gcgaggcaga agtacgtcga ggagatctac ggcgccggcc ggccgtacgg cctgttcatg 1200

ggcggcggcg gcaagctgct cgccgcgcac gtcatccaga tcctggtcat cttcgggtgg 1260

gtcagctgca ccatgggacc tctcttctac gggctcaaga agctcggcct gctccgcatc 1320

tccgccgagg acgagacgtc cggcatggac ctgacacggc acggcgggtt cgcgtacgtc 1380

taccacgacg aggacgagca cgacaagtct ggggttggtg ggttcatgct ccggtccgcg 1440

cagacccgcg tcgagccggc ggcggcggct gcctccaaca gcaacaacca agtgtaa 1497

<210> 2

<211> 1074

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atggccaacc tcaccgacct cgttaacctc aacctcagcg actgcagcga caagatcatc 60

gccgagtaca tctgggttgg aggatcgggc atagacctca ggagcaaagc gaggactgtg 120

aaaggcccca tcaccgatgt gagccagctg ccgaagtgga actacgacgg ctccagcacc 180

gggcaggctc ccggcgagga cagcgaagtg atcctctacc ctcaagccat tttcaaggac 240

ccgttcagga ggggcgacaa catccttgtg atgtgcgact gctacacgcc acaaggtgag 300

ccaatcccca ctaacaagag gcacagtgcc gccaagatct tcagccaccc tgatgttgtt 360

gctgaggtgc catggtacgg tattgagcag gagtacacac tccttcaaaa ggatgtgaac 420

tggccccttg gctggccagt tggtggcttc cctggcccac agggaccata ctactgcgct 480

gccggtgccg aaaaggcgtt cggccgcgac atcgtggacg cccactacaa ggcctgcatc 540

tacgccggga tcaacatcag tggcatcaac ggggaagtca tgcccggcca gtgggagttc 600

caagttggcc cgtcagttgg catcgccgct gctgaccaag tgtgggttgc ccgctacatc 660

ctcgagaggg tcacagaggt ggccggagtc gtgctctccc ttgacccgaa gccgatcccg 720

ggtgactgga atggcgctgg tgcccacacc aacttcagca ccaagtcgat gagggagccg 780

ggaggctacg aggtgatcaa gaaggcgatc gacaagctcg cgctgaggca caaggagcac 840

atcgccgcct acggcgaggg caacgagcgc cgcctcaccg gccgccacga gaccgccgac 900

atcaacacct tcaaatgggg cgtggcgaac cgcggcgcgt ccatccgcgt ggggcgcgac 960

acggagaagg agggcaaggg gtacttcgag gacaggaggc cggcgtccaa catggaccca 1020

tacgtcgtca ccggcatgat cgccgagacc acgctgctgt ggaagcagaa ctaa 1074

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtcggtacca tggcgacgtg cgcggcggac ctg 33

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtctctagat tacacttggt tgttgctgtt gg 32

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcaagcttc catggagtca aagattcaaa tag 33

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggcggtnacc ggcaattccc gatctagtaa catag 35

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtcggtacca tggccaacct caccgacctc g 31

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtcggatcct tagttctgct tccacagcag cgtgg 35

Claims

1.一种提高氮素利用效率的基因串联超表达载体，其特征在于所述载体上串联的基因为铵转运体基因和铵代谢基因。

2.根据权利要求1所述提高氮素利用效率的基因串联超表达载体，其特征在于所述铵转运体基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述铵代谢基因的多核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

3.权利要求1或2所述提高氮素利用效率的基因串联超表达载体在提高植物氮素利用效率中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤为：

a.提取水稻根系总RNA并以其为模板，以Oligo(dT)18为引物反转录，得到反转录产物cDNA；以此cDNA为模板，以SEQ ID NO.3所示的特异引物OsAMT1.1-KpnI-P₁和SEQ ID NO.4所示的OsAMT1.1-XbaI-P₂进行PCR扩增，得OsAMT1；1基因克隆；

b.将OsAMT1；1基因构建到pCambia2301-35s-nos上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，得pCambia2301-35s-OsAMT1；1-nos表达载体；

c.以pCambia2301-35s-nos质粒为模板，以SEQ ID NO.5所示的特异引物35S-nos-HindIII-P1和SEQ ID NO.6所示的特异引物35S-nos-BstEII-P2进行PCR扩增得35S-NOS克隆；将35S-NOS克隆与pEASY-Blunt-Zero Vector(pEASY)连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，得pEASY-35s-nos的重组质粒；

d.同步骤a，以SEQ ID NO.7所示的特异引物OsGS1；2-KpnI-P₁和SEQ ID NO.8所示的OsGS1；2-BamHI-P₂进行PCR扩增，得OsGS1；2基因克隆；将OSGS1；2基因经KpnI/BamHI酶切并构建到上述pEASY-35s-nos重组质粒中，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，得pEASY-35s-OsGS1；2-NOS阳性重组质粒；

e.用HindIII/BstEII将上述pEASY-35s-OsGS1；2-NOS阳性重组质粒的35s-OsGS1；2-NOS片段酶切并连接到pCambia2301-35s-OsAMT1；1-nos表达载体中，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得pCambia2301-35s-OsAMT1；1+OsGS1；2-nos重组载体；

f.将pCambia2301-35s-OsAMT1；1+OsGS1；2-nos重组载体侵染野生型拟南芥的花絮，在含50μg/mL卡那霉素的1/2MS平板上筛选得抗性纯系苗。