CN110248648A

CN110248648A - 细胞膜结合信号因子的应用

Info

Publication number: CN110248648A
Application number: CN201780083512.0A
Authority: CN
Inventors: 加布里埃尔·尼斯托尔
Original assignee: Iveta Biomedical Co
Current assignee: Iveta Biomedical Co
Priority date: 2016-11-16
Filing date: 2017-11-16
Publication date: 2019-09-17
Anticipated expiration: 2037-11-16
Also published as: EP3541370A4; WO2018094100A1; JP2022184908A; CN110248648B; AU2017363131A1; US20190358145A1; JP2019535827A; EP3541370A1; AU2017363131B2; CA3043886A1; KR20190090387A

Abstract

本发明公开了包含环糊精和脂质修饰的干细胞蛋白质的复合物的组合物。还公开了包含所述复合物的局部用组合物。还公开了将该组合物用于治疗目的方法以及制备该组合物的方法。

Description

细胞膜结合信号因子的应用

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2016年11月16日提交的美国临时专利申请62/422,900的权利，其全部内容通过引用结合于此。

背景技术

包括Wingless(Wnt)和Hedgehog(Hh)家族蛋白质的膜结合信号因子，具有应用于多种疾病的潜力，但目前获取这些蛋白质的方法不能产生稳定有效的分子。

发明内容

本发明公开了一种组合物，所述组合物包含本发明公开的脂质修饰蛋白质和环糊精的复合物。

本发明还公开了局部用组合物，所述局部用组合物包含本发明公开的脂质修饰蛋白质和环糊精的复合物。

根据本发明的一些实施方式，环糊精为α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精或甲基-β-环糊精中的一种或多种。根据本发明的一些实施方式，环糊精为化学修饰的环糊精，其通过氢化、加氢甲酰化、甲基化、氧化、还原或碳-碳偶联反应进行修饰。根据本发明的一些实施方式，所述环糊精为甲基-β-环糊精。

根据本发明的一些实施方式，脂质修饰蛋白质包含与细胞膜脂质相关的一种或多种Wingless(Wnt)或Hedgehog(Hh)蛋白质。根据本发明的一些实施方式，Hh蛋白质为音猥因子(Shh)蛋白质、沙漠刺猬(Dhh)蛋白质或印度刺猬(Ihh)蛋白质中的一种或多种。根据本发明的一些实施方式，Wnt蛋白质为Wnt3a、Wnt7b或Wnt10b中的一种或多种。根据本发明的一些实施方式，脂质修饰蛋白质包含除了属于Wingless(Wnt)或Hedgehog(Hh)家族之外的其他蛋白质。

根据本发明的一些实施方式，脂质修饰蛋白质从干细胞群中获取。根据本发明的一些实施方式，干细胞为胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、成体干细胞、胎儿干细胞或诱导的多能干细胞。根据本发明的一些实施方式，干细胞为哺乳动物干细胞。根据本发明的一些实施方式，干细胞为人类干细胞。根据本发明的一些实施方式，对干细胞进行基因工程改造以过表达Wnt或Hh蛋白质。根据本发明的一些实施方式，干细胞经过基因工程改造成永生的(immortal)。根据本发明的一些实施方式，干细胞经基因工程改造以表达端粒酶逆转录酶(hTERT)。

根据本发明的一些实施方式，所述组合物还包含至少一种秩序制造物(kosmotrope)。根据本发明的一些实施方式，kosmotrope为丙二醇、脯氨酸、海藻糖、四氢嘧啶或三甲胺N-氧化物中的至少一种。

根据本发明的一些实施方式，局部用组合物为含水制剂。根据本发明的一些实施方式，局部用组合物还包含至少一种kosmotrope和抗微生物剂。根据本发明的一些实施方式，至少一种kosmotrope为海藻糖。根据本发明的一些实施方式，抗微生物剂包含银颗粒。根据本发明的一些实施方式，银颗粒是纳米银颗粒或微米银颗粒。根据本发明的一些实施方式，局部用组合物的pH为约4.5至约8.0。

本发明还公开了促进有需要的组织中组织再生的方法，包括将组织暴露于本发明公开的组合物或局部用组合物中。

本发明还公开了促进有需要的组织中的组织更新的方法，包括将组织暴露于本发明公开的组合物或局部用组合物中。

本发明还公开了在有需要的组织中恢复感觉神经功能的方法，包括将组织暴露于本发明公开的组合物或局部用组合物中。

根据本发明的一些实施方式，所述组织为皮肤。根据本发明的一些实施方式，所述组织为瘢痕组织。

本发明还公开了促进毛发生长的方法，包括将毛囊暴露于本发明公开的组合物或局部用组合物中。本发明还公开了改善毛发外观的方法，包括将毛囊暴露于本发明公开的组合物或局部用组合物中。根据本发明的一些实施方式，在患有衰老性秃发、秃头症、特洛伊根和毛发生长疣或斑秃的受试者中促进毛发生长。根据本发明的一些实施方式，毛囊位于受试者的头皮上。根据本发明的一些实施方式，毛囊为受试者的睫毛。根据本发明的一些实施方式，毛囊为受试者的眉毛。根据本发明的一些实施方式，毛囊位于受试者的面部。根据本发明的一些实施方式，毛囊位于受试者的胸部。根据本发明的一些实施方式，毛囊位于受试者的手臂上。根据本发明的一些实施方式，毛囊位于受试者的腿上。

本发明还公开了改善皮肤外观的方法，包括将皮肤暴露于本发明公开的组合物或局部用组合物中。根据本发明的一些实施方式，改善的外观为皮肤纹理，皱纹、变色和老年斑中的一种或多种。

本发明还公开了制备本发明公开的组合物或局部用组合物的方法，包括：在培养基中培养能够产生Wnt和Hh蛋白质的干细胞；将上述细胞在包含环糊精的收获溶液中培养，以获得脂质修饰蛋白质的环糊精复合物；将环糊精/脂质修饰蛋白质复合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合以形成局部制剂。

根据本发明的一些实施方式，收获溶液还包含至少一种kosmotrope。根据本发明的一些实施方式，收获溶液包含稳定剂。根据本发明的一些实施方式，稳定剂为kosmotrope。根据本发明的一些实施方式，kosmotrope是海藻糖。根据本发明的一些实施方式，收获溶液中的kosmotrope浓度为约5％至30％。根据本发明的一些实施方式，kosmotrope的浓度为20％。

根据本发明的一些实施方式，收获溶液包含环糊精的水溶液。根据本发明的一些实施方式，环糊精为甲基-β-环糊精。根据本发明的一些实施方式，收获溶液中环糊精的浓度约为1mM至20mM。根据本发明的一些实施方式，收获溶液中环糊精的浓度约为10mM。

根据本发明的一些实施方式，环糊精/脂质修饰蛋白质复合物溶液储存在4℃或更低温度下。根据本发明的一些实施方式，将环糊精/脂质修饰蛋白质复合物溶液进行冻干。根据本发明的一些实施方式，一种或多种药学上可接受的赋形剂包含一种或多种防腐剂。根据本发明的一些实施方式，一种或多种药学上可接受的赋形剂包含一种或多种抗微生物剂。

附图说明

图1描绘了环糊精的化学和物理结构。

图2描绘了海藻糖在脱水过程中对稳定脂质膜的作用。

图3描绘了形态发生和组织生长中局部和区域因素之间的相互作用。

图4A-B描绘了利用环糊精捕获膜结合的脂质修饰蛋白质的示意性机制。图4A描绘了溶液中的环糊精可以捕获附着于细胞膜的脂质修饰蛋白质。图4B描绘了通过添加海藻糖可以进一步增强环糊精捕获的复合物，所述海藻糖通过置换蛋白质分子周围的水并允许冻干储存方法具有kosmotrope效应。

图5A描绘了暴露前的细胞培养物，其为光滑的、致密的和多层的。图5B描绘了与环糊精温育后的培养物，其中培养物被破坏，大部分细胞失去粘附。

图6A-D描绘了治疗组1(图6A)，2(图6B)，3(图6C)和4(图6D)中的小鼠通过出现新的生长期斑块“生长期波”，证明了早期向生长期的过渡。

图7A描绘了无论活性成分的浓度如何，所有的治疗组的动物都显示出毛发生长反应。图7B显示，经过处理的动物显示出更多的生长期毛发斑块。图7C描绘了治疗组皮肤的暗沉增加，证实了治疗的效果。

图8A-C描绘了处理小鼠中毛囊的休止期状态。在研究的第一天(D1)获得样品以确认小鼠处于第一个休止期。对照组(第1组，图8A)中的小鼠在研究结束时维持毛囊的休止期(T)状态(D20)(图8B和C)。

图9A-C描绘了处理小鼠中毛囊的休止期状态。治疗组中的小鼠(第2、3和4组；分别为图9A、9B和9C)显示出休止期和早期毛发生长初期(EA)毛囊的混合物，该区域不包含新的生长期斑块。

图10A-C描绘了经处理的小鼠中的毛发生长。所有治疗组中的小鼠(组2、3和4；分别为图10A、10B和10C)显示具有典型毛发生长初期毛囊形态的新的生长期斑块。

图11A-B描绘了两只未治疗小鼠的毛发生长。在对照动物中，极少数LRG5阳性细胞证实休止期阶段持续存在极少或没有Wnt活化。

图12A-C描绘了治疗小鼠中的毛囊。图12A描绘了治疗组2，是新的毛发生长初期毛囊的显微照片。扩张的LGR5阳性突起细胞(B)向下迁移并填充新的球泡基质(MX)。图12B描绘了治疗组3，是新的毛发生长初期毛囊的显微照片。扩张的LGR5阳性细胞向下迁移，并在休止期(T)靠近毛囊的早期生长期球茎(EA)中繁殖。图12C描绘了治疗组4，是新的毛发生长初期毛囊的显微照片。新的毛囊(EA)位于旧的休止期毛囊(T)之下。LGR5阳性细胞扩大隆突面积(B)并向下填充新的球泡基质(MX)。

图13A-B描绘了经处理的动物中的毛发生长。处理后的动物显示出Sox9阳性激活毛发干细胞。图13A描绘了早期生长期阶段，图13B描绘了生长期阶段。

图14A-G描绘了在不存在其它生长因子的情况下，甲基-β-环糊精(MBCD)在不同浓度下对毛囊的体外生长的影响，图14A-C为培养2天后和图14D-G为培养5天后。

图15A描绘了生长在0.25mM MBCD复合物中的毛囊，显示毛囊的长度增加。图15B描绘了生长在0.25mM和0.5mM MBCD复合物中的毛囊，显示毛囊厚度显著增加(0.25mM组p<0.01,0.5mM组p<0.05)。

图16A-D为载有胚胎干细胞膜成分和海藻糖的MBCD复合物在人体皮肤上的试验。图16A和16C描述了未经处理的区域。图16B和16D描绘了处理后的对侧区域，可见修复的绒毛、较长的绒毛和减少的老年斑。

详细说明

尽管Wingless(Wnt)和Hedgehog(Hh)蛋白质已经被分离和表征，但这些因子的应用却十分有限。这些蛋白质的来源通常是经过基因工程改造以过表达特定蛋白质的细胞，所述蛋白质用温和的洗涤剂从细胞表面除去。

本发明公开了取自干细胞的脂质修饰蛋白质和环糊精的复合物。如本发明所述，术语“脂质修饰”是指与脂质共价结合的蛋白质。所述Wnt和Hh蛋白质用脂肪酸棕榈酸酯修饰，尽管用其他脂质(包括胆固醇)进行修饰也在本发明公开的组合物和方法的范围内。

从多能性到胚层阶段的过渡态的干细胞表达有显著量的Wnt和Hh蛋白质。然而，尽管培养上清液中含有许多可溶性生长因子，但在细胞培养上清液中却不能鉴定出Wnt和Hh蛋白质。Wnt和Hh的生理表达引起脂质修饰，使其与表达细胞的表面膜结合，而不是分泌到细胞外液中。通过将干细胞暴露于环糊精溶液，可以成功地提取与含胆固醇的细胞膜结合的脂质修饰的Wnt和Hh蛋白质，从而形成与环糊精结合的脂质修饰蛋白质的可溶性复合物。向可溶性脂质修饰蛋白质/环糊精复合物中添加海藻糖促使复合物的稳定化，使冻干复合物长期保存。

Wnt和Hh蛋白质在体内外对细胞增殖、毛发生长和组织再生均有明显作用。使用从特性正常的干细胞培养物获得的异质Wnt(例如Wnt3a，Wnt 7b，Wnt 10b等)和Hh混合物优于从经过基因工程改造以表达特定蛋白质的修饰细胞获得的单一因子，因为多种组合因素因子的组合对于适当的干细胞功能和治疗功效所必需的。

因此，本发明公开了从干细胞获取膜结合的脂质修饰蛋白质的方法，所述干细胞包括胚胎干细胞、诱导的多能干细胞和成体干细胞。脂质修饰蛋白质结构的实例包括但不限于Wnt和Hh家族中的蛋白质(配体)。操纵细胞以使这些蛋白质的表达最大化，然后将其暴露于具有捕获疏水性分子能力的环糊精中。环糊精复合物进一步用海藻糖包被保护，以防止脱水和蛋白质变性。

在本申请之前，这些脂质修饰蛋白质通过有机溶剂或洗涤剂从细胞中提取。这些方法的缺点是提取的蛋白质稳定性和功能性有限。有机溶剂可使蛋白质组分变性并会去除对蛋白质活性必不可少的脂质修饰。洗涤剂提取会产生脂蛋白质胶束，其可以进一步包含在脂质体中。虽然洗涤剂提取方法优于溶剂提取，但胶束和脂质体的结构不稳定，保质期有限。

本发明描述的方法能够确保捕获脂质修饰蛋白质，并且通过冻干(冷冻干燥)可长期保存。使用海藻糖可进一步保存环糊精/脂质修饰蛋白质复合物，海藻糖是一种取代蛋白质和脂质周围的水并保证结构保存的亲液剂(kosmotropicagent)。

从干细胞培养物中分离的脂质修饰蛋白质/环糊精复合物可用于组织修复、伤口修复和再生、皮肤再生、毛发生长和化妆品。

环糊精

有三种天然存在的环糊精，-α，-β和-γ。环糊精能够与许多其他化学物质形成稳定的含水复合物。典型的环糊精包含6-8个吡喃葡萄糖苷单元，并且可拓扑表示为环状，其中环状的较大和较小的开口分别暴露于溶剂仲羟基和伯羟基。由于这种结构，环形的内部不是疏水的，但其相比于水性环境亲水性小得多，因此能够容纳其他疏水性分子。相反，环形的外部足够亲水以使得环糊精(或其复合物)具有水溶性(图1)。

包合物的形成极大地改变了客体分子的物理和化学性质，尤其是在水溶性方面，因此环糊精与疏水分子的包合物能够穿透身体组织，并在特定条件下释放生物活性疏水化合物，特定条件下包括但不限于pH改变，加热，使葡萄糖单体之间的α-1,4键断裂的酶，或被其他疏水分子(例如胆固醇)置换的酶。

根据分子中葡萄糖环的数量，环糊精被分类为α(alpha)-环糊精(6元糖环分子)，β(beta)-环糊精(7元糖环分子)，或γ(gamm)-环糊精(8元糖环分子)。由于环糊精内部是疏水的、外部是亲水的，可以与疏水化合物形成络合物。因此可以增强这些化合物的溶解度和生物利用度。这对于递送疏水性化合物的药物以及膳食补充剂的应用十分有利。α-，β-和γ-环糊精通常被FDA认为是安全的。

通过对自然生成的环糊精进行化学修饰，可以提高其溶解度，容纳特定的疏水分子，提供可用于附着于其他分子的终止物，提供特定的功能，如附着于特定的细胞组分，以及在大分子结构中的自组装。常见的修饰包括随机甲基化和羟丙基化。

β-环糊精和甲基-β-环糊精(MBCD)均可从培养的细胞中除去胆固醇。在从培养细胞中除去胆固醇方面，甲基化β-环糊精(MBCD)比β-环糊精更有效。水溶性MBCD与胆固醇形成可溶性包合配合物，从而增强其在水溶液中的溶解度。MBCD用于制备无胆固醇产品；庞大而疏水的胆固醇分子很容易滞留在环糊精环内，然后被去除。MBCD还用于通过去除细胞膜上的胆固醇来破坏脂筏的研究中。

秩序制造物(Kosmotropes)

秩序制造物使水分子之间发生良好的相互作用，这也(实际上)稳定了蛋白质等大分子的分子内相互作用.示例性的秩序制造物包括但不限于丙二醇、脯氨酸，海藻糖、四氢嘧啶和三甲胺N-氧化物。海藻糖(蕈糖，tremalose)是由两个葡萄糖分子组成的二糖。

海藻糖在蘑菇和细菌中的主要生物学作用是调节水分，因为它在细胞脱水过程中形成凝胶相，在此期间保护细胞器，然后在重新引入适当的环境时，海藻糖可以快速补液。它在人体中具有水合功能，并具有一般的抗氧化特性，但其主要作用是细胞分子伴侣，调节细胞内功能，如蛋白质折叠和解折叠。

海藻糖的化学结构

海藻糖被归类为秩序制造物或水结构制造者；即海藻糖与水之间的相互作用比水与水相互作用强得多，并且可参与其生物保护作用。

海藻糖可以抑制蛋白质聚集，充当稳定剂以改善治疗性蛋白质的保质期。对模型蛋白质的研究表明，海藻糖能够通过干扰分子间二硫键的形成来消除水分诱导的牛血清白蛋白质聚集。海藻糖可有效稳定脂质膜和防止脱水。脂质双分子层在脱水过程中会经历液晶到凝胶的转变，会永久地损害双分子层结构。海藻糖通过取代水占据脂质之间的空间，并在再水化时保持液晶组织结构(图2)。

Hedgehog(Hh)和Wingless(Wnt)家族

哺乳动物有三种刺猬同源物，Desert(Dhh)、Indian(Ihh)和Sonic(Shh)，其中Sonic是研究得最好的。在敲除小鼠中对信号传导途径进行了研究，并证实了对脑、骨骼、肌肉组织、胃肠道、肺和心脏的细胞特异性。最近的研究表明，Hedgehog信号传导在调节成体干细胞方面发挥着重要作用，所述成体干细胞参与成体组织的维持和再生。该途径还影响一些癌症的发展。针对Hedgehog信号传导的抗癌症药物正在积极研发中。

亲脂性基团的附着是在近1000种具有不同结构和功能的蛋白质上发生的广泛修饰(表1)。至少五种不同类型的脂质可以共价连接到蛋白质上，包括但不限于脂肪酸、类异戊二烯、甾醇、磷脂和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚。蛋白质可含有一种以上的脂质，例如肉豆蔻酸酯(Myristate)+棕榈酸酯(Palmitate)、棕榈酸酯+胆固醇或法尼基(farnesyl)+棕榈酸酯。脂质修饰的最常见结果是增加对膜的亲和力。

表1.典型的脂质修饰蛋白质

Hh蛋白质作为前体分子，由C端蛋白质酶结构域和N端信号传导单元组成，并且在其合成过程中经历许多不寻常的修饰。Hh的N端被脂肪酸棕榈酸酯修饰，保守的半胱氨酸残基在其信号序列被除去后暴露于蛋白质的N端。棕榈酰基通过酰胺与半胱氨酸的NH2基团连接。

Wnt分子是棕榈酰化的，因此比从它们的一级氨基酸序列预测的疏水性更强。似乎被修饰的Wnt蛋白质的氨基酸是第一个保守的半胱氨酸(C77)，这是一种存在于所有Wnt中的残基，并且对于Wnt功能是必需的，如突变分析所揭示的。

由于脂质修饰具有疏水性，Hh和Wnt不能全身分布；这些蛋白质是膜结合的，只能在直接接触的细胞中从细胞传递到细胞。而可溶性因子(如FGF，EGF等)是全身分布的，可以对区域或远端细胞产生影响。

表达Engrailed(En)转录因子的起源细胞(干细胞)分泌Hh。在Hh与受体蛋白质Patched(Ptc)相互作用后，只有与表达En的细胞相邻的细胞才能够响应Hedgehog。

具有Hh活化Ptc的细胞合成Wnt蛋白质。Wnt脂质修饰蛋白质充当细胞间信号，并通过激活其细胞表面受体Frizzled来模拟相邻的细胞行。因此，Wnt和Hh对相邻细胞的影响建立了解释了不同的解剖特征的位置代码，而可溶性因子建立了细胞增殖和组织生长的临时代码(图3)。

毛囊被认为是由神经外胚层-中胚层相互作用形成的小器官。通过将表皮基板内陷到周围的真皮中，在胚胎中发生毛囊新生。产后毛囊经历3个阶段的更新周期：毛发生长初期(生长期)，退化期(退化期)和休止期(休息期)。第一次完整的产后毛囊周期(第一次毛发生长初期，第一次退化期，第一次休止期)在出生后的前3.5周内完成，然后是第二次毛发周期(第二次毛发生长期，第二次退化期，第二次休止期)。

在皮肤中，从表皮发育而来的毛囊的形成需要来自真皮下层的成纤维细胞的信号。毛囊形态发生在胚胎晚期和早期新生儿期。成年皮肤通常不会产生新的毛囊。

响应于转基因或伤口诱导的Wnt/β-连环蛋白质的表皮活化，可以在成年小鼠皮肤中诱导毛囊新生。DKK1(Dickkopf相关蛋白质1)对Wnt信号传导的抑制证明了Wnt信号传导在毛囊发育中的功能重要性。几种Wnt分子在毛囊中表达并且可以起到这种功能。Wnt3a和Wnt7a在滤泡基质细胞中表达并在毛发生长初期维持真皮***细胞。这些细胞可能能够响应Wnt，因为它们表达Wnt信号转导级联的组分，包括frizzled7、disheveled2、GSK3β、β-catenin和Lef1。因此，Wnt通路被认为是毛囊形态发生过程中的主要调节因子。Wnt信号传导通过EDA/EDAR/NF-κB(外异蛋白质A/外异蛋白质A受体/核因子活化B细胞κ-轻链增强子)信号转导进行。NF-κB调节Wnt通路并通过上调Shh的表达而充当信号介质。皮肤Shh和血小板衍生生长因子(PDGF)信号上调皮肤头蛋白质表达；头蛋白质是一种有效的骨形态发生蛋白质(BMP)信号抑制剂，有助于抵抗BMP介导的β-连环蛋白质抑制。上皮和真皮谱系之间的信号传导的相互作用有助于上皮Shh信号放大。

Shh对毛发发育的相关性已经通过胚胎发生过程中的Shh表达模式以及在整个胚胎发育过程中操纵Shh表达来证实。在正常毛囊发育期间，Shh在表皮基板的毛囊中表达，并且其受体Ptc在胚胎早期的基础间充质凝结中被检测到。

体内实验表明Shh可能与其他局部因素协同刺激从休止期向生长期的转化。Shh的瞬时表达可以在疾病状况下重新激活毛发生长周期。

在哺乳动物中，尽管具有相当大的组织再生能力，但大的伤口导致瘢痕组织的形成，而不是组织形态和功能的完全恢复。这种有限的再生能力部分是由于纤维化组织的快速***，这阻止了随后的组织再生，但在预防有害微生物方面可能是一种防御优势。如果受伤的话，只有骨头、肝脏和婴儿指尖可以再生。衰老是组织恢复的另一个决定因素，因为随着年龄的增长，动物逐渐失去再生能力。

与未受伤的皮肤相比，修复后的皮肤通常作为疤痕愈合，比完好的皮肤弱，并且含有紊乱的细胞外基质(ECM)。皮肤伤口通常不会再生毛囊。因此，哺乳动物产后皮肤修复与早期妊娠胎儿伤口的再生过程不同，在早期妊娠胎儿伤口中，再生组织与未受伤组织几乎无法区分。

尽管在皮肤愈合的增殖期期间Wnt信号传导对于维持升高的β-连环蛋白质水平并不重要，但Wnt蛋白质可在伤口修复期间参与刺激真皮β-连环蛋白质。类似于其在皮肤发育中的功能，Wnt和/或β-连环蛋白质信号传导在皮肤伤口修复的各个方面中起重要作用，涉及上皮结构的构建和真皮隔室的重建。

β-连环蛋白质的相对水平和活性有助于皮肤伤口表型，高的β-连环蛋白质水平和活性导致扩大的细胞外真皮隔室，从而有助于增生性瘢痕形成。β-连环蛋白质水平是Wnt非依赖性的，可能受转化生长因子β(TGFβ)水平的影响。

Wnt信号调节成年表皮细胞增殖，直接影响皮肤伤口愈合的速度和程度。Wnts还作为至少两种类型的皮肤干细胞的生态位信号，即毛囊的凸起区域和滤泡间表皮的基底层中的干细胞，这些干细胞有助于皮肤伤口修复。将脂质体Wnt3a局部应用于非愈合伤口补充内源性Wnt信号传导，可以更好的促使皮肤伤口愈合。

Hedgehog信号传导被证明直接有助于小鼠伤口的正常和加速愈合。当Hh信号被抑制时，伤口愈合(伤口闭合、上皮形成、肉芽形成、血管分布和增殖)的所有方面都严重受损。

在皮肤中，触觉穹顶(touchdome)与初级毛囊协同发育，并含有感官默克尔(Merkel)细胞。皮肤Wnt信号传导和随后的表皮Eda/Edar(外异蛋白质/外异蛋白质受体)信号传导通过在早期毛囊中诱导Shh表达来促进默克尔细胞形态发生。虽然发育上与毛囊有关，但原基分布图(fatemapping)显示默克尔细胞主要起源于毛囊谱系之外。这些研究表明触觉穹顶发育需要Wnt依赖的间充质信号和发育中的外胚层Shh信号从初级毛囊到毛囊外的默克尔细胞祖细胞中建立相互信号传导。在发育中的外胚层Shh信号作为形态发生素的局部产生的Shh对于发育期间和产后触觉穹顶干细胞维持中的谱系规范是必不可少的。

在两栖动物中，Hh信号传导及其与Wnt信号传导的层次关联控制肢体再生。Wnt信号传导已经证实可以促进肠上皮细胞和造血干细胞(HSC)中的自我更新。许多组织中的干细胞对Wnt有应答(表2)。

表2.利用谱系示踪鉴定的Wnt响应性组织干细胞的实例.

组织	干细胞
		肠	地穴基柱状细胞
乳腺	基底细胞
		胃	基底幽门细胞
滤泡间表皮	基底细胞
		中枢神经***	桡神经胶质细胞
毛囊	外凸起细胞
		肾	Nephron片段特异性干细胞
耳蜗	鼓膜边界
		卵巢	Hilum卵巢表面上皮细胞
味蕾	后舌周围*状*干细胞
		视网膜	视网膜祖细胞

随着脂质修饰蛋白质与细胞膜结合，脂质也参与细胞信号传导，其包括但不限于基于鞘脂的脂质(如神经酰胺、鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇、神经酰胺、神经酰胺-1-磷酸盐，磷脂酰肌醇二磷酸盐(PIP2)脂质激动剂；基于磷脂酰肌醇的脂质(如磷脂酰肌醇二磷酸盐(PIP2))；G蛋白偶联受体激活剂(如溶血磷脂酸(LPA)，鞘氨醇-1-磷酸(S1P)、血小板)激活因子(PAF)、内源性***素、***素、FAHFA、视黄醇衍生物)；和核受体的激活剂(例如类固醇激素、视黄酸、***素)。

组合物

因此，本发明公开了包含脂质修饰的Hedgehog(Hh)和/或Wingless(Wnt)蛋白质和至少一种环糊精的组合物。如本发明所述，从人干细胞分离脂质修饰的Hh和/或Wnt蛋白质。在某些实施方案中，干细胞为亚全能性干细胞、多能干细胞、单谱系***祖细胞或永生化细胞系。

根据本发明的某些实施方式，Wnt和Hh蛋白质的源细胞为人胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞或诱导的多能干细胞。其他有益的细胞包括已被鉴定为胎儿或成体干细胞或源自胎儿附件的任何体外增殖细胞。其他细胞可以通过基因操作进行修饰，所述基因操作通过细胞周期失调(例如端粒酶表达)赋予永生。根据本发明的某些实施方式，通过端粒酶逆转录酶(hTERT)的基因工程化表达使干细胞永生化。可以使用本领域普通技术人员已知的已建立的方法和细胞培养基培养源细胞。

根据本发明的一些实施方式，通过以下方式收获Hh或Wnt蛋白质：首先去除培养基，用等渗缓冲液(例如盐水、Hanks、平衡盐溶液等)冲洗培养物，然后将细胞与收获溶液混合，缓慢，连续或间歇搅拌约1小时至约5小时。一些细胞可能失去与基质的附着。将含有可溶性脂质修饰蛋白质/环糊精复合物的收获溶液进一步过滤以除去碎片(例如通过0.1-0.5μm过滤器)并在4℃下储存。

适合于从干细胞获得脂质修饰的Wnt和Hh蛋白质的收获溶液包含含有约1-20mM环糊精的等渗溶液。根据本发明的一些实施方式，环糊精的浓度为约1-5mM，约5-10mM，约10-15mM，约15-20mM，约2-10mM，约5-20mM，约8-20mM，约12-20mM，约8-12mM，约5mM，约7mM，约9mM，约10mM，约11mM，约13mM或约15mM。收获溶液的体积约为培养皿或***0.1-1.0mL/cm²。根据本发明的一些实施方式，收获溶液的体积为约为培养皿或***0.25mL/cm²。

缓慢、连续或间歇搅拌下，将收获溶液与源细胞一起温育约1小时至约5小时。根据本发明的一些实施方式，将收获溶液与细胞一起温育约1小时，约1.5小时，约2小时，约2.5小时，约3小时，约3.5小时，约4小时，约4.5小时或约5小时。

根据本发明的一些实施方式，环糊精是α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精中的一种或多种。根据本发明的一些实施方式，天然环糊精通过氢化、加氢甲酰化、氧化、还原和碳-碳偶联反应进行化学改性。这些众所周知的修饰包括2-羟丙基β-环糊精和甲基-β-环糊精。根据本发明的一些实施方式，环糊精是甲基-β-环糊精(MBCD)。

根据本发明的某些实施方式，收获溶液还包含kospmotrope。制备收获溶液的示例性方法包括添加kosmotropic制剂以置换蛋白质分子周围的水。示例性的kosmotropic制剂是海藻糖，其加入环糊精复合物溶液中，最终浓度为约5％至约30％。根据本发明的其他实施方式，kosmotrope浓度为约5％至约10％，约10％至约15％，约15％至约20％，约15％至约25％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％或约30％或上述值之间的任何浓度。根据本发明的一个实施方式，收获后立即加入海藻糖浓度为20％w/v。

根据本发明的一些实施方式，收获溶液包含10mM环糊精和20％海藻糖的水溶液。

环糊精复合物可通过低温冻干(如冷冻干燥)进一步冻干保存。

可以使用市售的定量ELISA检测试剂盒来检测所公开组合物中的Wnt和Hh蛋白质。

本发明公开的脂质修饰蛋白质/环糊精复合物的一个实施方式如图4A和4B所示。

环糊精Wnt/Hh复合物的体内应用可遵循以下原则：(1)制备和储存温度应保持在40℃以下；(2)最终产品不应含有可取代环糊精有效负载(即脂质修饰蛋白质)的疏水分子；(3)可包括抗微生物稳定剂或防腐剂，例如但不限于局部应用的银(Ag)纳米或微米颗粒、苯氧基乙醇、辛二醇、戊二醇或用于其它试剂。

在一个示例性实施方案中，包含Wnt/Hh-环糊精复合物的组合物是水溶液，其任选地还包含银颗粒。该组合物可进一步包括氨基酸、肽、蛋白质、水溶性维生素和微量元素中的一种或多种。组合物的示例性组分包括但不限于水溶性生长因子和类固醇激素及其类似物。示例性的水溶性生长因子包括但不限于成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGF)等。

银颗粒(纳米颗粒或微米颗粒)浓度可以为0.01-1.0％w/v。根据本发明的一些实施方式，银颗粒的浓度为0.1-0.55w/v。

根据本发明的一些实施方式，本发明制备的局部用组合物或制剂可以采用液体、糊剂、乳膏、洗剂、粉末、软膏或凝胶的组合形式。

根据本发明的一些实施方式，组合物形式是糊剂，所述糊剂指含有一种或多种旨在局部施用的物质的半固体剂型。

根据本发明的一些实施方式，组合物形式是乳膏。本发明所用的术语“乳膏”是指水包油或油包水型的粘稠液体或半固体乳液。本发明所述“乳液”是指胶体***，其中分散相和分散介质都是不混溶的液体，其中分散相以小球状分布在整个分散介质液体中。稳定的基础乳液含有至少两种液体和乳化剂。常见的乳液类型是水包油，其中油是分散液体，水溶液如水是分散介质，和油包水相反，油包水的水溶液是分散相。还可以制备非水性乳液。水包油型乳霜包括护手霜和粉底霜。油包水乳膏包括冷霜和润肤霜。

根据本发明的一些实施方式，组合物形式是洗剂，所述洗剂指在合适的载体中含有一种或多种活性成分的液体或半液体制剂。洗剂可以是水性介质、乳液或溶液中的固体悬浮液。

“溶液”通常被认为是两种或更多种物质的均匀混合物。它经常(尽管不一定)是液体。在溶液中，溶质(或溶解的物质)的分子均匀地分布在溶剂分子中。可用于本发明的组合物中的溶剂包括水以及有机溶剂例如醇。

根据本发明的一些实施方式，组合物形式是软膏。软膏是一种半固体制剂，通常用于皮肤外用。软膏基质一般分为烃基(油质)，吸附基质(无水)；乳液基质(水和油型)和水溶性碱。由于它们的无水性质，软膏通常不需要任何防腐剂。软膏比乳霜更滋润，更闭塞，可以在皮肤上形成一层保护膜。闭塞效应倾向于延长并增强穿透力。

根据本发明的一些实施方式，本发明的组合物形式为凝胶。本发明所用的术语“凝胶”是指在水性或醇性基质中由高分子量聚合物制备的粘性果冻状半固体或固体。

其他的成分形式可以使用制剂领域中已知的技术来制备，例如The Science andPractice of Pharmacy,20th Ed.(Gennaro,A.R.et al.,eds)Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia(2000)，其通过引用并入本发明。

本发明公开的组合物中可以添加许多附加成分，用于功能性、审美性和市场营销目的，包括乳化剂、防腐剂、保湿剂、增稠剂、香料、染料、草本提取物和维生素，但所选附加成分在化学和物理上是相容的。术语“相容的”在本发明中用于表示组合物的组分能够以在正常使用条件下不存在会显着降低组合物功效的相互作用的方式彼此组合。

根据本发明的一些实施方式，组合物包含聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-80及其混合物。

本发明所用的术语“载体”是指药学上可接受的惰性剂或载体，用于将一种或多种活性剂递送至受试者，并且通常称为“赋形剂”。载体必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使之适合于对待治疗的受试者给药。载体还应保持本发明公开的脂质修饰蛋白质/环糊精复合物的稳定性和生物利用度。载体可以是液体或固体，并且当与活性剂和特定组合物的其它组分组合时，根据计划的给药方式，能够选择提供所需的体积，稠度等。

根据本发明的一些实施方式，所述组合物包含含水载体。根据与其他组分的相容性和产品的其他所需特性选择载体的水平和种类。含水载体在组合物中的含量例如为约30％至约98％，约50％至约95％或约70％至约95％。

示例性载体包括水和低级烷基醇的水溶液。示例性的低级烷基醇包括具有1至6个碳的一元醇，例如乙醇。根据本发明的一些实施方式，含水载体实质上是水。

所述组合物的pH例如为约4至约8。当组合物中包含皮肤有益剂时，可将pH调节至提供最佳功效的pH。可以包含缓冲剂和其他pH调节剂以实现所需的pH。本发明的示例性pH调节剂包括乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、三乙醇胺和碳酸盐。

所述组合物的粘度(流动阻力)可在很宽的范围内变化，并且可取决于增粘剂。例如，根据本发明的一些实施方式，所述组合物可包含增粘剂，增粘剂使组合物的粘度为约500mPas至约1000000Pas。根据本发明的一些实施方式，增粘剂使组合物的粘度为约1000mPas至约100000mPas。

提供微乳液的增粘剂的非限制性实例为羧酸/羧酸酯共聚物。该共聚物可以使组合物保持合适的粘度同时在使用时不发粘或油腻，并且这些组分可以分散和稳定组合物的水不溶性组分。示例性的市售羧酸/羧酸酯共聚物包括丙烯酸酯/C_10-30烷基丙烯酸酯交联聚合物，例如PEMULEN^TM TR-1，PEMULEN^TM TR-2，1342，1382和ETD 2020，均可从BF古德里奇公司购得。

可以包括中和剂，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二异丙醇胺、氨基甲基丙醇、氨丁三醇、四羟基丙基乙二胺以及它们的混合物，以中和羧酸/羧酸酯共聚物。

示例性纤维素衍生物聚合物包括但不限于甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硝酸纤维素、硫酸纤维素钠、羧甲基纤维素钠、结晶纤维素、纤维素粉末及其混合物。根据本发明的一些实施方式，纤维素衍生物聚合物为羟乙基纤维素、羧甲基纤维素及其混合物。可商购的在本发明中十分有用的化合物包括商品名为Natrosol Hydroxyethylcellulose的羟乙基纤维素和商品名为Aqualon CelluloseGum的羧甲基纤维素，两者均购自Aqualon。

其他示例性增粘剂包括支链淀粉、甘露聚糖、硬葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、瓜尔胶、羟丙基瓜尔胶、黄原胶、***胶、***胶、黄蓍胶、半乳聚糖、角豆胶、刺槐豆胶、角叉菜胶、果胶、支链淀粉、琼脂、昆氏种子(Cydonia oblonga Mill)、淀粉(大米、玉米、马铃薯、小麦)和藻类胶体(藻类提取物)。示例性微生物聚合物包括但不限于葡聚糖、琥珀葡聚糖、淀粉基聚合物如羧甲基淀粉和甲基羟丙基淀粉。示例性的基于藻酸的聚合物包括但不限于藻酸钠和藻酸丙二醇酯。示例性的丙烯酸酯聚合物包括但不限于聚丙烯酸钠、聚丙烯酰胺和聚乙烯亚胺。示例性的无机水溶性材料包括但不限于膨润土、硅酸铝镁、锂皂石、白云石和无水硅酸。

示例性的增粘剂还包括分子量大于约1000的聚亚烷基二醇。示例性化合物包括聚环氧乙烷、聚氧乙烯、聚乙二醇、聚环氧丙烷、聚氧丙烯、聚丙二醇、聚丙二醇和混合的聚乙二醇-聚丙二醇，或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。示例性的聚乙二醇聚合物包括但不限于PEG-2M，也称为N-10，从Union Carbide购得，型号为PEG-2000；PEG-5M，也称为N-35和N-80，均从Union Carbide购得，型号为PEG-5000和聚乙二醇300000)；PEG-7M，也称为N-750(从Union Carbide购得)；PEG-9M，也称为N-3333(从Union Carbide购得)和PEG-14M，也称为N-30(从Union Carbide购得)。

示例性的其他市售水溶性聚合物包括但不限于黄原胶(KELTROL^TM，可从Kelco购得)、卡波姆(CARBOPOL^TM 934、CARBOPOL^TM 940、CARBOPOL^TM 950、CARBOPOL ^TM 980和CARBOPOL^TM 981(均可从B.F.Goodrich Company购得)，丙烯酸酯/硬脂醇聚醚-20甲基丙烯酸酯共聚物(ACRYSOL^TM 22，可从Rohm and Hass购得)、聚丙烯酰胺(SEPIGEL^TM 305，可从Seppic购得)、聚甲基丙烯酸甘油酯(LUBRAGEL^TM NP)以及聚甲基丙烯酸甘油酯的混合物)丙二醇和PVM/MA共聚物(LUBRAGEL^TM OIL)(均可从ISP购得)，硬葡聚糖(CLEAROGEL^TM SCI I，购自Michel Mercier Products Inc.(NJ，USA))、环氧乙烷和/或环氧丙烷基聚合物(CARBOWAX^TM PEGs，POLYOX^TM WASR和UCON^TM FLUIDS(均由Amerchol提供)。

其他示例性试剂包括市售的两性聚合物，例如Polyquaternium 22(MERQUAT^TM280，MERQUAT^TM 295)、Polyquaternium 39(MERQUAT^TM PLUS 3330，MERQUAT^TM PLUS3331)和Polyquaternium 47(MERQUAT^TM 2001，MERQUAT^TM 200IN)，均可从Calgon Corporation购得。

本发明所用的术语“保湿剂”是指利用其吸湿性而促进保水性的物质。所述保湿剂的作用是被皮肤吸收并从大气中吸收水分。吸收的水用作角质层的储库。

示例性的水溶性保湿剂包括但不限于多元醇，例如丁二醇(1,3丁二醇)、戊二醇(1,2-戊二醇)、甘油、山梨糖醇、丙二醇、己二醇、乙氧基化葡萄糖、1,2-己二醇、1,2-戊二醇、己三醇、二丙二醇、赤藓糖醇、海藻糖、双甘油、木糖醇、麦芽糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖和其它水溶性化合物，如尿素、硫酸软骨素钠、透明质酸钠、磷酸腺苷钠、乳酸钠、碳酸吡咯烷酮、葡糖胺、环糊精及其混合物。其他实例包括水溶性烷氧基化非离子聚合物，例如分子量高达1000左右的聚乙二醇和聚丙二醇(例如PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-1000)以及它们的混合物。

可商购的保湿剂包括但不限于：丁二醇(1,3-丁二醇，可从Celanese购得)，戊二醇(HYDROLITE^TM-5，可从Dragoco购得)，甘油(STAR^TM和SUPEROL^TM，可从The Procter&GambleCompany购得，CRODEROL^TM GA7000，可从Croda Universal Ltd.购得，PRECERIN^TM系列，可从Unichema购得以及可从NOF购得的甘油，商品名与化学名称相同)；丙二醇(LEXOL^TM PG-865/855，可从Inolex购得，1,2-PROPYLENE GLYCOL USP，可从BASF购得)；山梨糖醇(LIPONIC^TM系列，可从Lipo购得，SORBO^TM，ALEX^TM，A-625^TM和A-641^TM，均可从ICI购得和UNISWEET^TM70，UNISWEET^TM CONC，可从UPI购得)；二丙二醇，商品名也为二丙二醇，可从BASF购得；双甘油(DIGLYCEROL^TM，可从Solvay GmbH购得)；木糖醇，商品名也为木糖醇，可从Kyowa和Eizai购得；麦芽糖醇(MALBIT^TM，可从Hayashibara购得)；硫酸软骨素(商品名也为硫酸软骨素，购自Freeman和Bioiberica，商品名为ATOMERGIC SODIUM CHONDROITIN SULFATE，购自AtomergicChemetals)；透明质酸钠(商品名也为透明质酸钠，购自Chisso Corp.，商品名为ACTIMOIST^TM，购自Active Organics，AVIAN SODIUM HYALURONATE系列，购自Intergen，HYALURONIC ACID Na，购自Ichimaru Pharcos)；可从Asahikasei，Kyowa和DaiichiSeiyaku购得的具有相同商品名的腺苷磷酸钠；可购自Merck，Wako和Showa Kako的相同商品名的乳酸钠，环糊精(CAVITRON^TM，可从American Maize购得，RHODOCAP ^TM系列，可从Rhone-Poulenc购得和DEXPEARL^TM，可从Tomen购得)；聚乙二醇(CARBOWAX^TM系列，购自UnionCarbide，)，和聚甲基丙烯酸甘油酯，丙二醇和PVM/MA共聚物的混合物(LUBRAJEL^TMOil，可从Guardian Lab购得)。

本发明使用的术语“防腐剂”是指防止或抑制含水产品中不希望的微生物生长的物质。能够用于药物的防腐剂，例如局部制剂，可在“联邦法规”第21卷中公布的现行联邦法规中确定，该法通过引用并入本发明。示例性防腐剂包括但不限于：抗坏血酸，抗坏血酸棕榈酸酯，生物素，BHT(丁基化羟基-甲苯)，丁基化羟基苯甲醚，丁基化羟基甲苯，对羟基苯甲酸丁酯，抗坏血酸钙，山梨酸钙，柠檬酸，肉桂肉桂，氯甲酚，二唑烷基脲，二月桂基硫代二丙酸酯，EDTA(乙二胺四乙酸四钠盐)，异抗坏血酸，葡萄柚种子提取物，羟基苯甲酸盐，对羟基苯甲酸甲酯，新戊酸，苯丙酸，苯氧乙醇，亚硫酸氢钾，偏亚硫酸氢钾，山梨酸钾，对羟基苯甲酸丙酯，迷迭香油提取物，抗坏血酸钠，苯甲酸钠，亚硫酸氢钠，钠偏亚硫酸氢盐，山梨酸钠，亚硫酸钠，山梨酸，二氧化硫，Suprarein，硫代二丙酸，银颗粒和/或生育酚。另外还可以储存于低温(例如，低于4℃，或冷冻)下来保存。

根据本发明的一些实施方式，组合物局部施用每日一次，每日施用两次，每日施用三次，每隔一天试用一次，每周施用一次，或施用达到所需结果所需的任何时间。通常将组合物局部施用于所需的治疗区域并使其吸收到皮肤中。

治疗用途

含有环糊精/脂质修饰蛋白质复合物的组合物的治疗用途包括但不限于毛发生长或再生、毛囊干细胞的体外扩增，用于产生可以移植到自体受体中的毛囊、伤口愈合、触觉恢复、皮肤外观改善和组织年轻化。

环糊精复合物靶向的组织应含有有效负载蛋白质的受体(例如卷曲蛋白质，贴片等)和交换疏水分子，例如来自细胞膜的胆固醇或脂质分泌物，例如皮脂。

本发明公开的组合物和制剂可以局部给药。含有环糊精复合物的组合物可以以含有约0.1％至约100％收获溶液的剂量局部给药。根据本发明的一些实施方式，组合物以约5％至约25％(v/w，v/v或w/v)，约10％至约25％，约15％至约25％，约20％至约25％，约5％至约20％，约5％至约15％，约5％至约10％，约5％，约7.5％，约10％，约12.5％，约15％％，约17.5％，约20％，约22.5％，或约25％或由上述值限定的任何范围的剂量局部给药。

本发明公开的组合物的剂量和所需药物浓度可根据设想的特定用途而改变。适当剂量的确定完全在普通医师的能力范围内。动物实验为人类治疗的有效剂量的确定提供了可靠的指导。有效剂量的种间缩放可以遵循Mardenti，J.和Chappell，W.制定的原则进行，“The use of interspecies scaling in toxicokinetics”In Toxicokinetics and NewDrug Development,Yacobi et al,Eds.,Pergamon Press,New York 1989,pp.42-96.。本发明所用的术语“治疗有效”量是指进行特定治疗(例如毛发生长)所需的量。“治疗”是指治疗性治疗和预防性或预防性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)靶向病症或病症。需要治疗的患者包括已患有该疾病的患者以及易患该疾病的患者或需要预防该疾病的患者。根据本发明的一些实施方式，病症已经存在。

为了用于毛发生长或再生，可将本发明公开的组合物施用于健康头皮上以维持延长的毛发生长初期或施用在各种形式的脱发中，将休止期转化为生长期或诱导新生毛发生长。根据本发明的某些实施方式，将本发明公开的组合物局部施用于头皮的一部分以诱导毛发生长或毛发再生长。根据本发明的某些实施方式，将组合物施用于需要毛发生长或毛发再生的身体的其他区域，例如但不限于眉毛\睫毛、面部、胸部、手臂、腿部或生殖器区域。

根据本发明的某些实施方式，本发明公开的组合物局部施用用于伤口愈合，如用于加速无张力性伤口愈合或无瘢痕性伤口愈合。

根据本发明的其他实施方式，将本发明公开的组合物局部施用于伤口以帮助伤口愈合。

根据本发明的其他实施方式，将本发明公开的组合物局部施用于现有瘢痕以使瘢痕减小。

根据本发明的其他实施方式，将本发明公开的组合物局部施用于触觉降低的区域以改善触觉。

根据本发明的一些实施方式，本发明公开的组合物局部施用于皮肤以使皮肤外观年轻化，减少皱纹，改善皮肤弹性，抵消皮肤老化和环境压力的显著影响，减少色素过度沉着或色素减退，改善老年斑的外观，改善皮肤纹理和/或改善皮肤色素沉着的均匀性。

具体实施方式

实施例1.从衍生自部分分化的胚胎干细胞培养物的细胞中捕获和检测Hh/Wnt。

根据现有的方法，在包括薄层的粘附基质上，使用添加bFGF(10ng/mL)和激活素A(5ng/mL)的无血清培养基进行胚胎干细胞的扩增。融合后，一半培养物用不含生长因子bFGF和激活素A的相同培养基培养。分析细胞培养上清液样品的卵泡抑素浓度。

将未分化或部分分化的单个培养物暴露于10mM的α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精或甲基-β-环糊精(MBCD)溶液中60至180分钟。暴露前的细胞培养物是光滑的、致密的和多层的(图5A)。与环糊精一起温育后，培养物被破坏，大部分细胞失去粘附(图5B)。

检测与细胞一起温育的MBCD溶液中Shh、Wnt 3a和Wnt7a的浓度。结果列于表3中。

表3.细胞培养物暴露于环糊精之后的上清液中卵泡抑素的浓度以及暴露于细胞培养物3小时后甲基-β-环糊精捕获溶液中Wnt和Shh的浓度

α-或β-环糊精的添加表现出呈比例降低的效果。

实施例2.动物实验中毛发生长的比较研究

将部分分化的胚胎干细胞培养物暴露于含有10mM甲基-β-环糊精和20％海藻糖的注射用水的收获溶液中，在室温下以1mL/10⁶细胞的体积处理3小时获得随后称为“活性成分”的环糊精/脂质修饰蛋白质复合物。

对配制的活性成分(含有苯氧基乙醇和0.75％辛二醇作为防腐剂)进行针对毛发生长(或再生)的测试。将毛发生长的小鼠模型用于测试原型配方。将在第一个休止期中6周龄的雄性和雌性小鼠随机分为3个不同浓度的治疗组和一个阴性对照组。

在第-1天，用异氟烷麻醉所有动物，并且用剪毛器将整个背部(从肩部到臀部)的毛发除去。从第0天开始，连续14天局部施用试验品；每天将试验品轻轻擦拭到每只小鼠的背部皮肤上。每种类型的治疗都戴有新手套。在治疗期间将动物单独饲养以避免笼养舔试验品。

每周测量体重和进行临床观察。在第2、7、10、14和21天拍摄宏观数码照片。在第21天，收集来自所有小鼠的皮肤样品并固定在***中用于组织学分析。

无论活性成分的浓度如何，所有的治疗组都通过新的生长期贴片响应。皮肤暗沉度增加和剃毛区域新毛发生长初期斑块的数量证实了这一响应(图6、7A-C)。

苏木精和伊红染色显示对照组在第1天出现休止期，并一直持续到研究结束(图8)。治疗组在未显示明显毛发生长的区域显示休止期到生长期的转变(图9)，在新发斑中显示典型的生长期毛囊(图10)。

在休止期阶段，毛囊干细胞处于休眠状态，位于旧毛囊的凸起区域。在没有Wnt的情况下，LGR5表达最小或不存在。CK14是一种皮肤基底细胞标记物，存在于毛囊的外根鞘中(图11)。在转变为生长期期间，Wnt信号传导稳定β-连环蛋白质并诱导Lgr5，Lgr5是一种假定的毛囊干细胞标记物。Lgr5+细胞在迁移到真皮***后为实际的毛囊轴提供燃料(图12)。

SOX9是控制毛囊干细胞命运和可塑性的先导因素，对于外根鞘(ORS)分化和凸起中毛发干细胞区室的形成至关重要。Sox9表达依赖于索尼克刺猬(Shh)信号传导。处理后的动物显示出Sox9阳性激活毛发干细胞(图13)。

实施例3.人毛囊体外培养物

在细胞生长培养基中收集后立即浸入具有明显球茎区域的拔毛的人发。将部分毛发样本暴露于样本2(称为活性成分)所述的胚胎干细胞培养的脂质修饰蛋白质/MBCD复合物(负载的MBCD)中，将未负载的MBCD作为对照，浓度相同，为0.25mM的环糊精组分。在毛囊培养物中不使用其他生长因子(例如EGF，KGF等)。培养2天后(图14A-C)，在含有MBCD的毛囊培养物和对照毛囊培养物中均观察到细胞的附着和少量的生长，在含有MBCD的毛囊培养物中细胞的生长更多。暴露5天后(图14D-G)，对照毛囊经历衰老并从基质上脱离，而暴露于MBCD的毛囊培养物直径和附着细胞继续生长。

从一名没有秃顶的男子的头皮样本中分离出人类毛囊。将每组总共15个毛囊转移到标准DMEM：F12和5％胎牛血清培养基中，并暴露于对照或活性成分浓度为0.1mM、0.25mM或0.5mM的环糊精组分中。在第0天和第7天测量毛发长度和毛囊厚度。

在7天内，大多数毛囊长度增加，长度从0增加到63％。0.25mM活性成分处理后毛囊生长42％+/-13，而其他组毛囊生长33％-34％。相同的试验条件对毛囊厚度的生长具有统计学意义(p<0.01)(图15A-B)。

实施例4.含细胞膜结合脂质修饰信号因子制剂的临床试验

通过将部分分化的人胚胎干细胞培养物暴露于含有10mM甲基-β-环糊精和20％海藻糖的注射用水的收获溶液中来制备由环糊精/脂质修饰蛋白质复合物组成的活性成分，1mL/10⁶细胞，室温下3小时。将该组合物外部施用于一只手腕关节的背部区域，而另一只手未经处理。手的这部分被末端臂毛覆盖，其左右形态和密度相同，但由于机械磨损有明显的休止期迹象。该应用包括约1滴(30μL)分散在皮肤上，使其干燥直至发粘，然后摩擦直至粘性消失。该区域连续治疗5天，2周后进行评估。在治疗区域，末端臂毛的生长明显加强(图16C-D)。此外，与年龄相关的皱纹和斑点明显减少，皮肤纹理得到改善。通过增加2点辨别能力，受试者报告了触觉的改善。观察结果表明，这对皮肤有恢复活力的作用(图16A-B)。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求中所有表示成分数量、性质(如分子量、反应条件)的数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。本发明使用的术语“约”和“大约”意指10至15％，优选5至10％。因此，除非有相反的指示，否则说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据本发明寻求获得的所需性质而变化。至少，并不是试图将等同原则的应用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的数量并通过应用一般四舍五入技术来解释。尽管阐述本发明广泛范围的数值范围和参数是近似值，但具体实施例中列出的数值尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地包含必然由其各自的测试测量中发现的标准偏差引起的某些误差。

在描述本发明的上下文中使用的术语“一”，“一个”，“该”和类似的指示物(特别是在以下权利要求的上下文中)应被解释为涵盖单数和复数，除非本发明另有说明或明确与上下文相矛盾。本发明中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本发明另有说明，否则每个单独的值被并入说明书中，如同其在本发明中单独引用一样。除非本发明另有说明或上下文明显矛盾，否则本发明所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。本发明提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对于本发明的实践必不可少的任何未要求保护的特征。

本发明公开的本发明的替代要素或实施方案的分组不应解释为限制。每个组成员可以单独引用和声明，也可以与组的其他成员或本发明中找到的其他元素以任何组合的形式进行引用和声明。出于方便和/或可专利性的原因，预期组中的一个或多个成员可以被包括在组中或从组中删除。当发生任何这样的包含或删除时，该说明书被认为包含经修改的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。

本发明描述了本发明的某些实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。当然，在阅读前面的描述后，对这些描述的实施例的变化对于本领域普通技术人员将变得显而易见。发明人期望熟练技术人员适当地采用这些变化，并且发明人希望本发明以不同于本发明具体描述的方式实施。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此外，除非本发明另有说明或上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素的所有可能变型的任何组合。

本发明公开的具体实施方案可以使用由......组成或基本上由语言组成的权利要求进一步限制。当在权利要求中使用时，无论是提交还是按修改添加，过渡术语“由...组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡术语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制在指定的材料或步骤以及不会对基本和新颖特征产生实质性影响的那些。所述发明的实施例在本发明中固有地或明确地描述和实现。

此外，在整个说明书中对专利和印刷出版物进行了许多参考。以上引用的每篇参考文献和印刷出版物均通过引用整体并入本发明。

最后，应理解，本发明公开的本发明的实施方案是对本发明原理的说明。可以采用的其他修改在本发明的范围内。因此，作为示例而非限制，可以根据本发明的教导使用本发明的替代配置。因此，本发明不限于精确地如所示和所述的那些。

Claims

1.一种组合物，其包含脂质修饰蛋白质和环糊精的复合物。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精、-环糊精或甲基-β-环糊精中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述环糊精是化学改性的环糊精，通过氢化、加氢甲酰化、甲基化、氧化、还原或碳-碳偶联反应进行改性。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的组合物，其特征在于，所述环糊精是甲基-β-环糊精。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的组合物，其特征在于，所述脂质修饰蛋白质包含与细胞膜脂质相关的一种或多种Wingless(Wnt)或Hedgehog(Hh)蛋白质。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述Hh蛋白质是索尼克刺猬(Shh)蛋白质、沙漠刺猬(Dhh)蛋白质或印度刺猬(Ihh)蛋白质中的一种或多种。

7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述Wnt蛋白质是Wnt3a、Wnt7b或Wnt10b中的一种或多种。

8.根据权利要求1-4中任意一项所述的组合物，其特征在于，所述脂质修饰蛋白质包含除了属于Wingless(Wnt)或Hedgehog(Hh)家族的蛋白质之外的其他蛋白质。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的组合物，其特征在于，脂质修饰蛋白质从干细胞群中收获。

10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述干细胞为胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、成体干细胞、胎儿干细胞或诱导的多能干细胞。

11.根据权利要求9或10所述的组合物，其特征在于，所述干细胞为哺乳动物干细胞。

12.根据权利要求9或11所述的组合物，其特征在于，所述干细胞为人干细胞。

13.根据权利要求9-12中任意一项所述的组合物，其特征在于，所述干细胞经基因工程改造以过表达Wnt或Hh蛋白质。

14.根据权利要求9-13中任意一项所述的组合物，其特征在于，所述干细胞基因工程改造为永生的。

15.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述干细胞经基因工程改造以表达端粒酶逆转录酶(hTERT)。

16.根据权利要求1-15中任意一项所述的组合物，其特征在于，还包含至少一种秩序制造物。

17.根据权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述至少一种秩序制造物为丙二醇、脯氨酸、海藻糖、四氢嘧啶或三甲胺N-氧化物。

18.根据权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述至少一种秩序制造物是海藻糖。

19.一种局部用组合物，其包含根据权利要求1-18中任意一项所述的脂质修饰蛋白质和环糊精的复合物。

20.根据权利要求19或20的所述的局部用组合物，其特征在于，所述组合物是含水制剂。

21.根据权利要求19所述的局部用组合物，其特征在于，还包含至少一种秩序制造物和抗微生物剂。

22.根据权利要求21的局部用组合物，其特征在于，所述至少一种秩序制造物为海藻糖。

23.根据权利要求21所述的局部用组合物，其特征在于，所述抗微生物剂包括银粒子。

24.根据权利要求21所述的局部用组合物，其特征在于，所述银颗粒是纳米银颗粒或微米银颗粒。

25.根据权利要求19-24中任意一项所述的局部用组合物，其特征在于，pH为约4.5至约8.0。

26.一种促进有需要的组织中组织再生的方法，包括将组织暴露于权利要求1-25中任意一项所述的组合物。

27.一种促进有需要的组织中的组织更新的方法，包括将组织暴露于权利要求1-25中任意一项所述的组合物。

28.一种恢复组织中感觉神经功能的方法，包括将组织暴露于权利要求1-25中任意一项所述的组合物中。

29.根据权利要求26-28中任意一项所述的方法，其特征在于，所述组织为皮肤。

30.根据权利要求26-28中任意一项所述的方法，其特征在于，所述组织为瘢痕组织。

31.一种促进毛发生长的方法，包括将毛囊暴露于权利要求1-25中任意一项所述的组合物中。

32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述毛发生长在患有衰老性秃头症、秃头症、特洛伊根和毛发生长疣，或斑秃的受试者中得到促进。

33.根据权利要求31或32所述的方法，其特征在于，所述毛囊位于受试者的头皮上。

34.根据权利要求31或32所述的方法，其特征在于，所述毛囊为受试者的睫毛。

35.根据权利要求31或32所述的方法，其特征在于，所述毛囊为受试者的眉毛。

36.根据权利要求31或32所述的方法，其特征在于，所述毛囊位于受试者的面部。

37.根据权利要求31或32所述的方法，其特征在于，所述毛囊位于受试者的胸部。

38.根据权利要求31或32所述的方法，其特征在于，所述毛囊位于受试者的手臂上。

39.根据权利要求31或32所述的方法，其特征在于，所述毛囊位于受试者的腿上。

40.一种改善皮肤外观的方法，包括将皮肤暴露于权利要求1-24中任意一项所述的组合物中。

41.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，所述改善的外观为皮肤纹理、皱纹、变色和老年斑中的一种或多种。

42.一种改善毛发外观的方法，包括将毛囊暴露于权利要求1-24中任意一项所述的组合物中。

43.一种制备权利要求1-22中任意一项所述的组合物的方法，包括：

在培养基中培养能够中产生Wnt和Hh蛋白质的干细胞；

将细胞在含有环糊精的收获液中培养，得到脂质修饰蛋白质和环糊精的复合物；和

将环糊精/脂质修饰蛋白质复合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合以形成局部制剂。

44.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述收获溶液还包含至少一种秩序制造物。

45.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述收获溶液包含稳定剂。

46.根据权利要求45所述的方法，其特征在于，所述稳定剂为秩序制造物。

47.根据权利要求44或46的方法，其特征在于，所述秩序制造物为海藻糖。

48.根据权利要求44、46或47中任意一项所述的方法，其特征在于，所述收获溶液中的秩序制造物浓度为约5％至约30％。

49.根据权利要求44或46-48中任意一项所述的方法，其特征在于，所述秩序制造物的浓度为20％。

50.根据权利要求43-49中任意一项所述的方法，其特征在于，所述收获溶液包含环糊精的水溶液。

51.根据权利要求43-50中任意一项所述的方法，其特征在于，所述环糊精为甲基-β-环糊精。

52.根据权利要求43-51中任意一项所述的方法，其特征在于，所述收获溶液中环糊精的浓度为约1mM至约20mM。

53.根据权利要求43-52中任意一项所述的方法，其特征在于，所述收获溶液中环糊精的浓度为约10mM。

54.根据权利要求43-53中任意一项所述的方法，其特征在于，所述环糊精/脂质修饰蛋白质复合物溶液在4℃或更低温度下储存。

55.根据权利要求43-53中任意一项所述的方法，其特征在于，将所述环糊精/脂质修饰蛋白质复合物溶液冻干。

56.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述一种或多种药学上可接受的赋形剂包含一种或多种防腐剂。

57.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述一种或多种药学上可接受的赋形剂包含一种或多种抗微生物剂。