CN110243988A - 壮药白花九里明hplc指纹图谱的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药材指纹图谱领域，具体涉及一种壮药白花九里明HPLC指纹图谱的建立方法。所述壮药白花九里明HPLC指纹图谱的建立方法，以白花九里明主要成分咖啡酸为参照物，据此获得壮药白花九里明共有模式指纹图谱。指纹图谱共有色谱峰10个，能够充分反应白花九里明药材中化学成分，信息量较丰富，方法重现性良好，对控制药材质量和鉴别药材优劣提供了更有力的理论依据，提高了壮药白花九里明的质量控制和真伪鉴别水平，实现了快速，准确地鉴别白花九里明的真伪优劣。

Description

壮药白花九里明HPLC指纹图谱的建立方法
【技术领域】
本发明涉及中药材指纹图谱领域，具体涉及一种壮药白花九里明HPLC指纹图谱的建立方法。
【背景技术】
白花九里明为菊科艾纳香属植物Blumea megacephala(Randeria)Chang etTseng的地上部分，产于云南、四川、贵州、广西、广东、湖南南部、江西南部、福建及台湾等省区。白花九里明在广西壮族民间常用水煎服治疗产后流血过多。
中药指纹图谱(fingerprinting)是借用DNA指纹图谱发展而来。最先发展起来的是中药化学成分色谱指纹图谱，特别是高效液相色谱(HPLC)指纹图谱。HPLC具有很高的分离度，可把复杂的化学成分进行分离而形成高低不同的峰组成一张色谱图，这些色谱峰的高度和峰面积分别代表了各种不同化学成分和其含量。中药指纹图谱的研究和建立，对于提高中药质量，促进中药现代化具有重要意义。
目前壮药白花九里明主要进行了性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别和含量测定等，这些方法存在信息量小、样品化学成分体现不全面、鉴别成分数量不足等问题，因此无法表现壮药白花九里明整体质量。如宁小清等(宁小清,卢汝梅,黄丽贞等.壮药白花九里明化学成分研究[J].中药材,2016,39(11):2536-2538.)对白花九里明有效成分进行研究，对儿茶酸、绿原酸和咖啡酸含量进行了测定。其仅以其中几种成分的含量为指标确定药材的质量优劣。然而，壮药(中药)具有复杂的化学成分，有效成分多，未知成分多，不同成分或功效之间相互影响，任何一种活性成分都无法全面的反映该药的总体质量与疗效，所以很难仅依靠一种或几种成分来评价中药的有效性和专属性。
美国食品与药品管理局(FDA)在有关植物药物质和植物药产品部分，已将指纹图谱引入质量控制中；世界卫生组织(WHO)在其草药评价指南中指出，不能鉴别的植物药质谱和最终产品的有效成分，可采用色谱指纹图谱鉴别特征成分或混合成分，保证产品质量的一致性。
目前国内外对壮药白花九里明指纹图谱的研究尚未见任何报道，本发明对壮药白花九里进行高效液相指纹图谱研究，弥补了白花九里明质量标准项下的空白，为白花九里明药材的质量评价提供了依据，并为更加科学、合理、规范地使用白花九里明，提高其临床用药的安全性提供了参考。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种壮药白花九里明HPLC指纹图谱的建立方法。所述方法能够为白花九里明的鉴别和质量控制提供可靠依据。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种壮药白花九里明HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取咖啡酸对照品，加甲醇溶解制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密称取壮药白花九里明药材粗粉，加水，超声提取，放冷至室温，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)高效液相色谱测定：分别精密吸取步骤(1)的对照品溶液与步骤(2)的供试品溶液各10-20μl注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，以咖啡酸色谱峰为参照峰，通过分析比较确定特征共有峰，即得所述白花九里明HPLC指纹图谱；
其中，色谱条件为：以C18烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以磷酸溶液为流动相B组成的梯度洗脱液进行梯度洗脱；检测波长为300-350nm。
进一步地，所述步骤(1)按以下操作进行：取咖啡酸对照品，加甲醇溶解制成每1ml含咖啡酸20μg的对照品溶液。
进一步地，所述步骤(2)按以下操作进行：精密称取白花九里明药材粗粉1g，加水20-40ml，密塞，称定重量，超声提取20-40min，放冷至室温，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
优选地，所述步骤(2)按以下操作进行：精密称取白花九里明药材粗粉1g，加水20ml，密塞，称定重量，超声提取30min，放冷至室温，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
进一步地，所述步骤(3)的色谱条件为：以C18烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B组成的梯度洗脱液进行梯度洗脱；柱温为25℃；检测波长为300-350nm；流速为1.0ml/min；分析时间为60min，进样量为10-20μl。
进一步地，采用以下梯度洗脱方式洗脱：
表1梯度洗脱程序表
本发明建立白花九里明药材指纹图谱，由10个共有指纹峰构成，所述指纹图谱10个共有指纹峰的相对保留时间及标准偏差如下表2。
表2指纹图谱10个共有指纹峰的保留时间及相对标准偏差
为提高白花九里明药材质量控制水平，发明人采用高效液相色谱，以白花九里明中主要有效成分咖啡酸为参照物，研发白花九里明HPLC指纹图谱建立方法，据此得到壮药白花九里明共有模式的指纹图谱，指纹图谱共有色谱峰10个，能充分反应白花九里明药材共有模式指纹图谱，指纹图谱共有色谱峰10个，能充分反应白花九里明中化学成分，信息丰富，方法重现性良好，对控制药材质量和鉴别药材优劣提供理论依据。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
(1)本发明白花九里明药材指纹图谱方法对供试品处理方法简单，特征性成分保留完整，供试品溶液稳定。
(2)本发明高效液相色谱法精密度较高，重现性良好，专属性强。
(3)本发明建立标准指纹图谱有10个共有峰，信息量较大，较完整保留供试液中化学成分。
(4)经过相似度评价，所选择的广西不同县市白花九里明指纹图谱相似度都大于0.90，具有良好的相关性。
(5)本发明确立白花九里明药材指纹图谱方法，通过该方法可获得白花九里明药材标准指纹图谱，比较共有峰有无，能有效控制白花九里明质量，完善白花九里明药材质量评价体系，为白花九里明药材质量全面、有效控制提供理论和时间基础。
【附图说明】
图1为对照品溶液的HPLC指纹图谱，图中：6为咖啡酸；
图2为白花九里明药材的HPLC指纹图谱；
图3为各批壮药白花九里明药材HPLC指纹图谱整合叠加图；
图4为白花九里明供试品HPLC指纹图谱精密度考察叠加图；
图5为白花九里明供试品HPLC指纹图谱稳定性考察叠加图；
图6为白花九里明供试品HPLC指纹图谱重复性考察叠加图。
【具体实施方式】
发明人将13批不同来源白花九里明药材在同指纹图谱条件下分别建立指纹图谱，然后将指纹图谱融合，确定共用指纹特征图，增加指纹图谱信息量，从而提高指纹鉴定能力，实现指纹图谱全面整体评价。下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明范围。
实施例1
1实验材料和仪器
1.1药材：产地及采收时间如表3。
表3白花九里明药材产地及采收时间
药材编号 药材来源(产地) 采收时间
1 蒙山 2014.11
2 南宁高峰 2014.11
3 巴马 2014.11
4 南宁高峰 2014.03
5 天等 2015.11
6 巴马 2015.11
7 北流 2015.11
8 那坡 2013.06
9 崇左 2013.11
10 南宁老虎岭 2015.11
11 北流 2016.10
12 防城 2015.11
13 陆川 2016.10
1.2仪器：Agilent1260高效液相色谱仪(包括G1311C四元泵,G1329B自动进样器，G1316A柱温箱，G1315D DAD检测器，Agilengt1260色谱工作站(美国安捷伦科技公司))；中型超声波清洗器(Elma Schmidbauer GmbH，P300H)；电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，SQP)；《中药色谱指纹图谱相似度评价***2004年A版(国家药典委员会)》。
1.3试剂：咖啡酸对照品(购于中国食品药品检定研究院)批号：5WZE-RZUW；流动相乙腈(购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司)批号：A998-4；磷酸(购于天津市光复精细化工研究所)批号：25447-33-0。
2高效液相色谱
2.1色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent色谱柱(4.6mm×150mm，5μm))；采用梯度洗脱，洗脱程序如表4
表4流动相洗脱程序
流动相A：乙腈；流动相B：0.1％磷酸；检测波长325nm，流速1ml/min；柱温25℃；进样量10μl；检测时间为60min，理论塔板数以咖啡酸计不低于3000。
2.2对照品溶液制备：精密称取咖啡酸0.2mg，至10ml容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，超声5min，即得。
2.3供试品溶液制备：精密称取各产地壮药白花九里明粗粉1g，分别置具塞锥形瓶中，精密加水20ml，密塞，称定重量，超声提取30min，放冷至室温，称定重量，用水补重后，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.4测定：分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录60分钟色谱图(图1、图2)。
实施例2
取白花九里明药材13批次(药材编号1-13)，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件和“2.4”项下测定方法进行测定，得到13批样品HPLC指纹图谱叠加图，如图3所示。通过这13批HPLC图谱比较，进行相似度评价，确定特征共有峰：指纹图谱有10个特征共有峰，保留时间、峰面积的平均值及占总峰面积比例汇总如下：
1号峰，保留时间为2.726min，RSD％0.66％，峰面积156.555，RSD％47.01％；占总峰面积的1.520％；
2号峰，保留时间为3.483min，RSD％0.17％，峰面积674.258，RSD％90.55％；占总峰面积的6.544％；
3号峰，保留时间为4.599min，RSD％0.29％，峰面积376.808，RSD％84.76％；占总峰面积的3.657％；
4号峰，保留时间为10.375min，RSD％0.31％，峰面积1340.542，RSD％36.52％；占总峰面积的13.011％；
5号峰，保留时间为17.489min，RSD％0.33％，峰面积2192.841，RSD％46.25％；占总峰面积的21.284％；
6号峰，保留时间为19.26min，RSD％0.28％，峰面积3517.345，RSD％52.59％；占总峰面积的34.139％；
7号峰，保留时间为25.687min，RSD％0.22％，峰面积163.423，RSD％48.73％；占总峰面积的1.586％；
8号峰，保留时间为34.223min，RSD％0.31％，峰面积319.89，RSD％129.86％；占总峰面积的3.105％；
9号峰，保留时间为36.628min，RSD％0.3％，峰面积376.507，RSD％83.26％；占总峰面积的3.654％；
10号峰，保留时间为37.756min，RSD％0.3％，峰面积148.143，RSD％61.28％；占总峰面积的1.438％；
可见，壮药白花九里明药材指纹图谱中10个特征峰，6号为咖啡酸对照峰，图谱总长度60min。其中，单峰面积超总峰面积1％有10个，它们是1-13号峰；单峰面积超总峰面积5％的峰有4个，它们是2号峰、4号峰、5号峰、6号峰；单峰面积超总峰面积10％的峰有3个，它们是4号峰、5号峰、6号峰。
相似度评价：采用中国药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价***软件2004A版，对HPLC图谱进行综合评价，相似度评价结果见图3和表5。
表5HPLC指纹图谱相似度评价
备注：S1-S13分别代表13批壮药白花九里明药材供试品序号。
结果：13批壮药白花九里明药材HPLC指纹图谱相似度均大于0.90。
实施例3
3方法学考察
3.1精密度实验
精密吸取同一份供试品溶液(由编号为1号的白花九里明药材粉末按“2.3”项下方法制备得到)，按“2.1”项下色谱条件和“2.4”项下测定方法进样6次，记录指纹图谱，见图4。以6号峰(咖啡酸)为参照峰，计算得到各峰的相对保留时间RSD值为0.01％-0.48％，各峰相对峰面积RSD值在0.3％-2.04％。相关系数见表6。
表6精密度实验相似度结果
由表6可看出，精密度实验相关系数均大于0.95，相似度计数结果显示该仪器精密度良好，符合指纹图谱检测要求。
3.2稳定性实验
精密吸取同一份供试品溶液(由编号为1号的白花九里明药材粉末按“2.3”项下方法制备得到)，分别于制备后的0、4、6、8、12、16、24h，按“2.1”项下色谱条件和“2.4”项下测定方法测定，考察实验方法的重复性，见图5。以6号峰(咖啡酸)为参照峰，计算得到各色谱峰相对保留时间RSD在0.01％-0.19％，各峰相对峰面积RSD值在0.05％-1.96％。相关系数见表7。
表7稳定性试验相似度结果
由表7可以看出，各指纹图谱相关系数均大于0.95，结果表明24h内样品溶液成分稳定，符合指纹图谱检测要求。
3.3重复性实验
取编号为1号的白花九里明药材粉末，按“2.3”项下方法制备6份，按“2.1”项下色谱条件和“2.4”项下测定方法测定，考察实验方法重复性，见图6。以6号峰(咖啡酸)为参照峰，计算得到各色谱峰相对保留时间RSD在0.04％-0.21％，各峰相对峰面积RSD值在0.66％-1.74％。相关系数见表8。
表8重复性试验相似度结果
由表8可看出，重复性试验相关系数均大于0.95，相似度计算结果显示该方法重复性很好，符合指纹图谱检测要求。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (7)

1.壮药白花九里明HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取咖啡酸对照品，加甲醇溶解制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密称取壮药白花九里明药材粗粉，加水，超声提取，放冷至室温，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)高效液相色谱测定：分别精密吸取步骤(1)的对照品溶液与步骤(2)的供试品溶液各10-20μl注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，以咖啡酸色谱峰为参照峰，通过分析比较确定特征共有峰，即得所述白花九里明HPLC指纹图谱；
其中，色谱条件为：以C18烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以磷酸溶液为流动相B组成的梯度洗脱液进行梯度洗脱；检测波长为300-350nm。
2.根据权利要求1所述的壮药白花九里明HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)按以下操作进行：取咖啡酸对照品，加甲醇溶解制成每1ml含咖啡酸20μg的对照品溶液。
3.根据权利要求1所述的壮药白花九里明HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)按以下操作进行：精密称取白花九里明药材粗粉1g，加水20-40ml，密塞，称定重量，超声提取20-40min，放冷至室温，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.根据权利要求1所述的壮药白花九里明HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)按以下操作进行：精密称取白花九里明药材粗粉1g，加水20ml，密塞，称定重量，超声提取30min，放冷至室温，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
5.根据权利要求1所述的壮药白花九里明HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)的色谱条件为：以C18烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B组成的梯度洗脱液进行梯度洗脱；柱温为25℃；检测波长为300-350nm；流速为1.0ml/min；分析时间为60min，进样量为10-20μl。
6.根据权利要求1所述的壮药白花九里明HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序设为时间梯度0min→5min→10min→25min→40min→60min；对应梯度洗脱液按以下体积比由流动相A乙腈和流动相B0.1％磷酸溶液组成，流动相A的体积百分数梯度8％→11％→10％→21％→24％→30％，流动相B体积百分数梯度92％→89％→90％→79％→76％→70％。
7.根据权利要求1所述的壮药白花九里明HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述指纹图谱包括10个共有峰，保留时间分别为2.726min、3.483min、4.599min、10.375min、17.489min、19.26min、25.687min、34.223min、36.628min、37.756min。
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