CN110241462A

CN110241462A - 一种二代测序文库靶向快速富集的方法和装置

Info

Publication number: CN110241462A
Application number: CN201910568971.9A
Authority: CN
Inventors: 许明炎; 林海久; 陈洁滢
Original assignee: Shenzhen Haplox Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Haplox Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-06-27
Filing date: 2019-06-27
Publication date: 2019-09-17

Abstract

本申请公开了一种二代测序文库靶向快速富集的方法和装置。本申请的二代测序文库靶向快速富集方法，包括引物杂交和延伸步骤，采用引物混合物对DNA样品进行退火、延伸；引物混合物由针对靶标基因设计的特异性引物组成，在靶标基因上每间隔50‑200bp设计一条特异性引物，特异性引物的5’端具有生物素修饰；磁珠分离和洗涤步骤，包括采用链霉亲和素修饰的磁珠对延伸产物进行捕获，获得靶标基因。本申请的方法，利用特异性引物对靶标基因进行延伸，替换长探针，成本低，效率高，缩短了富集反应时间。特异性引物在靶标基因上间隔设置，可采用相对较少数量的引物覆盖较长靶标基因区域，相比于探针杂交法，本申请方法更简单、易操作。

Description

一种二代测序文库靶向快速富集的方法和装置

技术领域

本申请涉及高通量测序技术领域，特别是涉及一种二代测序文库靶向快速富集的方法和装置。

背景技术

高通量测序技术又称二代测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)，与被认为是第一代测序技术的传统Sanger毛细管电泳测序方法相比，二代测序技术以更低的成本提供更高通量的数据，并实现大规模的基因组研究，单次运行数据量大，可以同时对数百万个DNA分子实施测序。随着当代科学技术的进步，二代测序平台已逐渐被引入包括肿瘤学在内的众多领域中，如临床诊断、农业基因组学和法医学等。

全基因组测序的成本很高，操作流程繁复耗时。具体在某一领域的应用中，技术人员通常需要对感兴趣的靶标基因选择性的富集，只对感兴趣的基因区域进行测序和分析，例如全外显子测序，以达到降低成本并且减少数据分析工作量的目的。

目前应用最广泛的二代测序靶向富集方法是探针杂交捕获，具体实施方式是对待测DNA进行文库构建，然后使用DNA探针或RNA探针进行杂交捕获。探针是杂交的关键成分，同时也是成本的主要部分。探针杂交法设计探针时，为了保障对目的基因的完整捕获，通常需要对目的基因进行全覆盖设计，所以探针往往数量繁多，且片段较长。数量繁多的长探针不仅合成成本高，而且降低了探针的特异性，导致捕获耗时甚长，通常需要12小时至超过70小时的时间来准备用于测序的样品，并需要更长时间来完成整个测序过程。

因此，亟需研发一种新的快速且节约成本的二代测序文库靶向富集技术，以满足日益发展的高通量测序需求。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的二代测序文库靶向快速富集的方法和装置。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种二代测序文库靶向快速富集的方法，包括以下步骤，引物杂交和延伸步骤，包括采用引物混合物对DNA样品进行退火、延伸；引物混合物由针对靶标基因设计的特异性引物组成，在靶标基因上每间隔50-200bp设计一条特异性引物，使得引物混合物能够覆盖整个靶标基因，并且特异性引物的5’端具有生物素修饰；磁珠分离和洗涤步骤，包括采用链霉亲和素修饰的磁珠，对引物杂交和延伸步骤的延伸产物进行捕获，并通过磁珠将生物素修饰的特异性引物以及相应的靶标基因分离，洗涤去除非靶标基因，即获得靶向富集的靶标基因。

需要说明的是，本申请的靶向富集方法，其原理还是利用预先设计的特异性引物，对靶标基因进行杂交捕获；但是，不同于现有的探针杂交捕获，本申请设计的是特异性引物。一方面，本申请的特异性引物是在靶标基因区域内间隔一定距离设计的，即间隔50-200bp，对于相同大小的靶标基因，本申请的方法所采用的特异性引物的数量大大小于探针杂交捕获方法的探针数量；另一方面，本申请利用特异性引物的延伸，可以采用较短的特异性引物捕获较长的靶标区域，而不需要设计长探针，大大降低了成本，例如本申请的一种实现方式中特异性引物的长度仅仅为15-25碱基，而一般杂交捕获的长探针的长度为60-120碱基；此外，本申请的方法通过特异性引物的退火、延伸实现靶标基因的特异性杂交捕获，单就杂交捕获来说，在本申请的一种实现方式中，仅仅需要8分钟即可完成，提高了杂交捕获的效率。

可以理解，本申请的引物混合物是由多条特异性引物组成的，这些特异性引物是间隔设计于靶标基因上的同一扩增方向的引物，例如，都是上游引物或者都是下游引物。本申请的方法中，引物杂交和延伸步骤的目的并非是对靶标基因进行指数倍的PCR扩增，其目的仅仅是能够更好更完整的杂交捕获靶标基因，因此，所有特异性引物的扩增方向相同，能够最大限度的保障各条特异性引物延伸后对靶标基因的覆盖度。本申请方法中的对DNA样品进行退火、延伸，实际上就是在退火温度下，保温一定时间，使特异性引物杂交到靶标基因上，然后在延伸温度下保温一定时间，使特异性引物沿靶标基因延伸即可；其中，所采用的试剂，例如酶、缓冲液，以及反应条件都可以参考常规PCR进行，例如延伸温度通常为72℃；所不同的是，本申请的引物杂交和延伸步骤中没有循环扩增的设计。

优选的，本申请的方法还包括测序文库扩增步骤，其中，测序文库扩增步骤包括采用文库构建引物对靶向富集的靶标基因进行PCR扩增，获得用于高通量测序的测序文库。

需要说明的是，测序文库扩增步骤是针对高通量测序而言的，实际上，本申请的方法中，经过引物杂交和延伸步骤和磁珠分离和洗涤步骤，即可完成对靶标基因的靶向富集；但是，如果需要继续进行后续的高通量测序，则通常需要测序文库扩增步骤。本申请的方法中，测序文库扩增步骤的最终目的是采用文库构建引物，对富集的靶标基因进行PCR扩增，获得可以直接用于高通量测序的文库。一般来说，如果引物杂交和延伸步骤处理的DNA样品是预文库样品，则测序文库扩增步骤，直接采用通用引物扩增富集产物即可；其中，预文库样品是指经过常规的片段处理、末端修复和加接头等处理的DNA样品。如果，引物杂交和延伸步骤处理的DNA样品不是预文库样品，则测序文库扩增步骤还需要包括对富集的靶标基因的DNA片段进行加接头等操作，然后再进行PCR扩增获得测序文库。至于DNA片段处理、末端修复、加接头等的具体方法可以参考现有的文库构建方法，在此不作具体限定。

优选的，特异性引物的长度不小于10碱基。

优选的，特异性引物的长度为15-25碱基。

需要说明的是，特异性引物的长度一方面需要考虑其特异性，另一方面需要考虑合成成本。可以理解，特异性引物的长度越长其特异性越好，但是，相应的合成成本高，难以体现与长探针的区别。因此，在保障特异性的情况下，本申请提出特异性引物的长度不小于10碱基，即特异性引物的长度可以做到最小10碱基，这样既能够保障特异性，又能够降低成本。

优选的，对DNA样品进行退火、延伸，具体条件为，98℃变性5分钟、65℃预杂交1分钟、58℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，反应结束后4℃待机。

需要说明的是，本申请的引物杂交和延伸步骤中，对DNA样品进行退火、延伸的反应体系可以参考常规的PCR扩增，只是反应条件有所不同。例如，变性后只进行一个步骤的退火和延伸，没有循环步骤；并且，在退火之前引入预杂交步骤，即65℃预杂交1分钟，使得所有的特异性引物都能够更好的结合到设计的靶标基因上。可以理解，以上反应条件只是最佳的参考，各步骤的温度和时间可以根据试验情况进行适应性的调整，例如变性温度通常在90℃以上，变性时间通常为30秒-10分钟；又例如预杂交的温度通常为60-70℃，时间为30秒-10分钟；退火的温度通常为50-60℃，时间为30秒-2分钟；延伸通常都是65-75℃延伸1-10分钟。反应结束后的待机温度只是为了更好的保存反应产物，通常是4℃，或者可以不用该待机温度，直接在反应结束后，立即取出存放于4℃左右的冰箱内备用。

本申请的另一面公开了一种二代测序文库靶向快速富集的装置，包括引物杂交和延伸模块和磁珠分离和洗涤模块；引物杂交和延伸模块，包括用于采用引物混合物对DNA样品进行退火、延伸；引物混合物由针对靶标基因设计的特异性引物组成，在靶标基因上每间隔50-200bp设计一条特异性引物，使得引物混合物能够覆盖整个靶标基因，并且特异性引物的5’端具有生物素修饰；磁珠分离和洗涤模块，包括用于采用链霉亲和素修饰的磁珠，对引物杂交和延伸模块的延伸产物进行捕获，并通过磁珠将生物素修饰的特异性引物以及相应的靶标基因分离，洗涤去除非靶标基因，即获得靶向富集的靶标基因。

优选的，本申请的装置还包括测序文库扩增模块，测序文库扩增模块包括用于采用文库构建引物对靶向富集的靶标基因进行PCR扩增，获得用于高通量测序的测序文库。

需要说明的是，本申请的装置，实际上就是通过各个模块实现本申请二代测序文库靶向快速富集方法中的各个步骤，以实现靶标基因的自动化富集。其中，引物杂交和延伸模块和测序文库扩增模块，其核心就在于通过温度控制实现引物杂交和延伸步骤的退火、延伸，以及测序文库扩增步骤的PCR扩增，其结构类似于恒温仪或PCR仪；磁珠分离和洗涤模块，其核心在于通过磁力架将磁珠吸附沉淀，使其分离，配套的还可以设置，例如振荡、搅拌混匀或超声波混匀等组件，用于自动实现磁珠的重悬等操作。至于样品或试剂的添加等操作可以参考现有的自动加样***，试管的移动可以采用常规的机械臂，在此不作具体限定。

可以理解，本申请二代测序文库靶向快速富集的方法，其全部或部分功能可以通过硬件的方式实现，也可以通过计算机程序的方式实现。当通过计算机程序的方式实现时，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘、光盘、硬盘等，通过计算机执行该程序以实现本申请的方法。例如，将程序存储在设备的存储器中，当通过处理器执行存储器中程序，即可实现本申请的方法。当本申请的方法中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序也可以存储在服务器、另一计算机、磁盘、光盘、闪存盘或移动硬盘等存储介质中，通过下载或复制保存到本地设备的存储器中，或对本地设备的***进行版本更新，然后在处理器执行存储器中的程序时，即可实现本申请校正高通量测序数据的方法的全部或部分功能。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请的二代测序文库靶向快速富集方法，利用特异性引物对靶标基因进行延伸，替换长探针，不仅成本低，而且效率高，大大缩短了富集反应时间。并且，特异性引物在靶标基因上是间隔设置，可以采用相对较少的特异性引物数量覆盖较长的靶标基因区域，相比于数量繁多的探针，本申请的方法更加简单、易操作，特异性引物数量的减小也进一步的降低了成本。本申请的方法为高通量测序提供了一种新的快速且节约成本的靶向富集技术。

附图说明

图1是本申请实施例中二代测序文库靶向快速富集方法的流程框图；

图2是本申请实施例中二代测序文库靶向快速富集方法的部分流程示意图；

图3是本申请实施例中二代测序文库靶向快速富集装置的结构框图。

具体实施方式

目前比较常规的测序文库富集方法是探针杂交法，但是，探针杂交法为了保障对靶标基因的覆盖度，需要采用数量繁多的探针，并且，探针长度较长，每条探针通常需要60-120碱基的长度，甚至更长。

本申请创造性的提出，在靶标基因上间隔一定距离，例如间隔50-200bp，设计特异性引物，利用引物延伸替代长探针，其中，特异性引物的长度可以做到最小10碱基，本申请的一种实现方式中具体为15-25碱基，不仅比长探针更短，而且采用间隔设置，对于相同大小的靶标基因，在保障靶标基因的覆盖度的情况下，特异性引物的数量也比探针的数量更少，大大节约了合成成本。而且，本申请利用特异性引物延伸替换长探针，整个富集反应仅需要约8分钟即可完成，即本申请方法中的引物杂交和延伸步骤，提高了靶标基因的富集效率。

基因以上研究和认识，本申请提出了一种二代测序文库靶向快速富集的方法，如图1和图2所示，包括引物杂交和延伸步骤11、磁珠分离和洗涤步骤12，以及特别针对测序文库构建的测序文库扩增步骤13。图2中，DNA样品为预文库，因此，DNA片段的两端为文库接头序列，其中黑色实线为靶标基因，其余为非靶标基因。

其中，引物杂交和延伸步骤11，包括采用引物混合物对DNA样品进行退火、延伸；本申请的引物混合物由针对靶标基因设计的特异性引物组成，在靶标基因上每间隔50-200bp设计一条特异性引物，使得引物混合物能够覆盖整个靶标基因，并且特异性引物的5’端具有生物素修饰。

本申请的一种实现方式中，退火、延伸具体采用购自赛默飞世尔科技有限公司的AmpliTaqDNAPolymerase和PCR Buffer II，反应体系中加入dNTP Mix和MgCl₂，并补充水至50μL，各组分具体用量参考现有的常规PCR。反应条件为，98℃变性5分钟、65℃预杂交1分钟、58℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，反应结束后4℃待机。本申请在靶标基因上每间隔50-200bp设计一条特异性引物，每条特异性引物至少包含10个碱基，一般为15-25碱基，相对于现有的数量繁多的长探针杂交捕获，本申请的方法可以采用短且数量少的特异性引物完整的覆盖靶标基因，保障靶标基因的富集质量和完整性。

磁珠分离和洗涤步骤12，包括采用链霉亲和素修饰的磁珠，对引物杂交和延伸步骤的延伸产物进行捕获，并通过磁珠将生物素修饰的特异性引物以及相应的靶标基因分离，洗涤去除非靶标基因，即获得靶向富集的靶标基因。

本申请的一种实现方式中，具体采用Invitrogen的DynabeadsTMM-270Streptavidin磁珠进行靶标基因的分离，磁珠预先采用生物素和链霉亲和素反应的结合缓冲液洗涤，然后将磁珠重悬于该结合缓冲液中，与引物杂交和延伸步骤的产物室温孵育约30分钟，在按照磁珠试剂盒的提供的洗涤试剂和方法对磁珠进行漂洗，最终用ddH₂O重悬磁珠，即获得靶标基因。

测序文库扩增步骤13，包括采用文库构建引物对靶向富集的靶标基因进行PCR扩增，获得用于高通量测序的测序文库。

本申请的一种实现方式中，具体采用的是购自KAPABiosystems公司的引物、酶和反应液，用于测序文库构建。具体的，缓冲液为2×KAPAHiFi HotStart ReadyMix，文库构建引物为10×LibraryAmplification PrimerMix。反应条件为，98℃预变性45秒，然后进入15个循环：98℃变性15秒、60℃退火30秒、72℃延伸30秒，循环结束后72℃延伸1分钟，最后4℃待机。反应结束即获得测序文库，可直接上机测序。

基于本申请的二代测序文库靶向快速富集方法，本申请进一步提出了一种二代测序文库靶向快速富集的装置，如图3所示，该装置包括引物杂交和延伸模块31、磁珠分离和洗涤模块32和测序文库扩增模块33。引物杂交和延伸模块31，包括用于采用引物混合物对DNA样品进行退火、延伸；引物混合物由针对靶标基因设计的特异性引物组成，在靶标基因上每间隔50-200bp设计一条特异性引物，使得引物混合物能够覆盖整个靶标基因，并且特异性引物的5’端具有生物素修饰；磁珠分离和洗涤模块32，包括用于采用链霉亲和素修饰的磁珠，对引物杂交和延伸模块31的延伸产物进行捕获，并通过磁珠将生物素修饰的特异性引物以及相应的靶标基因分离，洗涤去除非靶标基因，即获得靶向富集的靶标基因；测序文库扩增模块33包括用于采用文库构建引物对靶向富集的靶标基因进行PCR扩增，获得用于高通量测序的测序文库。

下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

本例的根据靶标基因的序列信息设计特异性引物。特异性引物与待富集的二代测序预文库进行富集反应，反应结束后用亲和链霉素磁珠吸附杂交产物，并通过漂洗液清洗除去非特异吸附的核酸。吸附有杂交产物的磁珠进行POST-PCR，然后上机测序。其中，二代测序预文库是指经过片段化处理、末端修复、加接头等步骤的DNA样品。本例采用预文库作为处理对象，对二代测序文库靶向快速富集的方法进行说明，详细如下：

一、特异性引物设计与合成

本例的特异性引物根据靶标基因的序列设计，与靶标基因互补配对，具体的，在靶标基因上每间隔50-200bp设计一条特异性引物，每条特异性引物至少包含10个碱基，并且引物的5’端带有生物素修饰。

将本例的所有特异性引物混合在一起作为引物混合物使用，原则上所有特异性引物的退火温度要保持一致，例如在58℃左右1-2℃的范围内，以确保在退火步骤，所有特异性引物都能够结合到靶标基因上。

二、富集反应

采用引物混合物对DNA样品进行退火、延伸，本例具体采用的AmpliTaq DNAPolymerase、PCR Buffer II均购自赛默飞世尔科技有限公司。50μL的反应体系包括：AmpliTaqDNAPolymerase 0.25μL、预文库DNA样品1ng-3μg、10pmol的引物混合物5μL、10×PCR Buffer II 5μL、10mM的dNTP Mix1μL、25mM的MgCl₂3μL，补充ddH₂O至50μL。

配制好的反应体系在热循环仪中进行反应，具体反应条件为：98℃变性5分钟、65℃预杂交1分钟、58℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，反应结束后4℃待机。

三、磁珠分离纯化

1.磁珠预处理

本例采用购自Invitrogen的DynabeadsTMM-270Streptavidin磁珠。磁珠预处理包括以下步骤：

a.在涡旋混匀仪上重悬M-270磁珠，每个反应样品加入50μL磁珠至新的离心管中。

b.各加入200μL结合缓冲液，用移液器吹打或涡旋仪混匀磁珠，将离心管放置在磁力架上，等待1分钟后，吸取并弃去上清液。

c.重复步骤b一次。

d.加入50μL结合缓冲液重悬磁珠。

2.磁珠分离纯化

利用链霉亲和素磁珠杂交吸附生物素修饰的特异性引物，以及与引物互补匹配的靶标基因。具体的，将“二、富集反应”的产物加入预处理后的磁珠中，混匀后室温孵育30分钟。然后进行磁珠漂洗，获得富集的靶标基因，具体如下：

a.将含有磁珠和DNA的样品管上磁力架，等待1分钟后除去上清液；

b.加入200μL漂洗缓冲液，65℃金属浴孵育2分钟，上磁力架，等待1分钟后除去上清液；

c.重复步骤b两次；

d.加入20μL的ddH₂O重悬磁珠，即获得靶向富集的靶标基因。

四、测序文库构建

采用POST-PCR扩增靶向富集的靶标基因，获得可直接上机测序的测序文库，本例PCR使用的引物和酶反应液均购自KAPABiosystems公司。50μL的反应体系包括：2×KAPAHiFi HotStart ReadyMix 25μL、10×Library Amplification PrimerMix 5μL、吸附有靶标基因的磁珠20μL。

反应条件为：98℃预变性45秒，然后进入15个循环：98℃变性15秒、60℃退火30秒、72℃延伸30秒，循环结束后72℃延伸1分钟，最后4℃待机。

PCR反应结束后，回收PCR扩增产物，即获得测序文库。本例具体采用的是核酸纯化磁珠回收纯化PCR反应产物，磁珠使用量为1×，纯化后的测序文库溶于30μL的ddH₂O中。最后，纯化后的测序文库直接上机测序即可。

试验例

本例按照以上方法和步骤，对KEAP1基因进行试验，具体设计了82条引物，每条引物长15-25个碱基，用于KEAP1基因富集。作为对比，采用常规的探针杂交法，设计了85条探针用于相同靶标基因的富集。本例采用Novaseq测序平台，对5例二代测序文库靶向快速富集方法制备的测序文库，以及相同的5例探针杂交法制备的测序文库进行测序和分析。统计不同富集方法对KEAP1基因的捕获率，结果如表1所示。

表1不同富集方法的捕获率统计结果

表1的结果显示，采用本例的富集方法，其对靶标基因的捕获率都在90％以上，而探针法的捕获率仅为50-60％。可见，本例设计的引物和传统方法设计的探针对靶标基因，虽然在设计上都是对靶标基因100％覆盖；但是，采用本例的富集方法，显然比传统的探针法捕获率要高很多。并且，仅仅对于KEAP1基因而言，本例的富集方法所采用的引物的数量，也比探针的数量少。因此，本例的富集方法，可以采用数量更少、更短的引物替换常规的长探针，对靶标基因进行捕获富集；并且，本例的富集方法具有较高的捕获率，能够提高靶标基因捕获富集的效率和质量。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims

1.一种二代测序文库靶向快速富集的方法，其特征在于：包括以下步骤，

引物杂交和延伸步骤，包括采用引物混合物对DNA样品进行退火、延伸；所述引物混合物由针对靶标基因设计的特异性引物组成，在靶标基因上每间隔50-200bp设计一条特异性引物，使得引物混合物能够覆盖整个靶标基因，并且特异性引物的5’端具有生物素修饰；

磁珠分离和洗涤步骤，包括采用链霉亲和素修饰的磁珠，对所述引物杂交和延伸步骤的延伸产物进行捕获，并通过磁珠将生物素修饰的特异性引物以及相应的靶标基因分离，洗涤去除非靶标基因，即获得靶向富集的靶标基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括测序文库扩增步骤，所述测序文库扩增步骤包括采用文库构建引物对靶向富集的靶标基因进行PCR扩增，获得用于高通量测序的测序文库。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述特异性引物的长度不小于10碱基；优选的，所述特异性引物的长度为15-25碱基。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述对DNA样品进行退火、延伸，具体条件为，98℃变性5分钟、65℃预杂交1分钟、58℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，反应结束后4℃待机。

5.一种二代测序文库靶向快速富集的装置，其特征在于：包括引物杂交和延伸模块和磁珠分离和洗涤模块；

所述引物杂交和延伸模块，包括用于采用引物混合物对DNA样品进行退火、延伸；所述引物混合物由针对靶标基因设计的特异性引物组成，在靶标基因上每间隔50-200bp设计一条特异性引物，使得引物混合物能够覆盖整个靶标基因，并且特异性引物的5’端具有生物素修饰；

所述磁珠分离和洗涤模块，包括用于采用链霉亲和素修饰的磁珠，对所述引物杂交和延伸模块的延伸产物进行捕获，并通过磁珠将生物素修饰的特异性引物以及相应的靶标基因分离，洗涤去除非靶标基因，即获得靶向富集的靶标基因。

6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于：还包括测序文库扩增模块，所述测序文库扩增模块包括用于采用文库构建引物对靶向富集的靶标基因进行PCR扩增，获得用于高通量测序的测序文库。

7.根据权利要求5或6所述的装置，其特征在于：所述特异性引物的长度不小于10碱基；优选的，所述特异性引物的长度为15-25碱基。

8.根据权利要求5或6所述的装置，其特征在于：所述对DNA样品进行退火、延伸，具体条件为，98℃变性5分钟、65℃预杂交1分钟、58℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，反应结束后4℃待机。