CN110240704B - 基于磁性分子印迹技术的靶向酶固定化载体的制备方法及应用 - Google Patents

基于磁性分子印迹技术的靶向酶固定化载体的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于磁性分子印迹技术的靶向酶固定化载体的制备方法及应用：制备氨基四氧化三铁；制备硼酸修饰四氧化三铁；溶胶‑凝胶法制备分子印迹聚合物层；除去结合在分子印迹聚合物上的辣根过氧化物酶；封闭聚合物表面非特异性吸附残基，得到辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物。本发明制备过程简单、成本低廉，得到的磁性分子印迹聚合物不仅能够特异性识别目标物质辣根过氧化物酶，而且可以对复杂样品中的辣根过氧化物酶直接通过吸附进行固定，形成的固定化酶可用于葡萄糖、肌氨酸、尿酸、胆固醇等能够分解产生H2O2的物质的检测。

Description

基于磁性分子印迹技术的靶向酶固定化载体的制备方法及 应用
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种基于磁性分子印迹技术的靶向固定化辣根过氧化物酶及其载体的制备。
背景技术
固定化酶技术是在保持酶催化活性的条件下，将酶限制或束缚在固相载体的一定区域内的一类技术。与非固定的游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,具有贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等优点。固定化酶已在化学、生物学、医学、食品科学以及环境科学等学科领域得到迅速发展和广泛的应用。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法制备固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。化学法包括结合法、交联法等。结合法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,交联法是使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。然而传统的固定化酶制备需要固定纯度较高的酶，而酶是一种稳定性较差的蛋白质，分离纯化过程复杂，分离成本较高，分离过程不可避免地会造成酶的损失和活性下降。因此，从复杂样品中实现目标酶的直接固定化具有十分重要的意义。
分子印迹技术是一种合成对特定模板分子具有专一识别能力的聚合物的制备技术。其具有结构预定性、识别特异性、性质稳定性和广泛适用性的特点，能够在复杂样品中识别目标分子，已在分离分析、仿生催化、药物释放和生物传感器等领域得到广泛应用。因此，其具有从复杂样品直接制备固定化酶的潜能。
目前小分子的印迹聚合物技术已趋于成熟，然而，对于水溶性蛋白质分子(例如，酶分子)，常用的在有机相中制备和识别的方法，如本体法、原位法和沉淀法等，由于蛋白质耐受有机溶剂和酸碱能力较差而并不适用，使得酶分子印迹聚合物的制备存在一定难度。目前未见分子印迹聚合物应用于固定化酶的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于磁性分子印迹技术的靶向酶固定化载体的制备方法及应用。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种辣根过氧化物酶固定化载体的制备方法，包括以下步骤：
1)制备氨基Fe3O4磁性纳米粒；
2)利用氨基Fe3O4磁性纳米粒制备硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒；
3)以辣根过氧化物酶为模板分子，将该模板分子固定在硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒上，然后在水相体系下，以3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体、正硅酸乙酯为交联单体，采用溶胶-凝胶法制备得到包覆在硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒上的结合有所述模板分子的分子印迹聚合物层；
4)去除所述分子印迹聚合物层中结合的模板分子(辣根过氧化物酶)，得到辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物；
5)封闭辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物表面的非特异性吸附残基，得到辣根过氧化物酶固定化载体。
优选的，所述氨基Fe3O4磁性纳米粒采用热溶剂法制备，具体包括以下步骤：将0.5-2.0g FeCl3·6H2O、1.0-4.0g无水乙酸钠和3-15g 1,6-己二胺分散于20-60mL乙二醇中，得混合物，在20-40℃下搅拌至混合物变成透明溶液后转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，然后在160-200℃下反应6-12h，用磁铁收集反应产物，对所得产物进行洗涤、干燥。
优选的，所述硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒是以4-甲酰基苯硼酸为硼酸试剂，利用其甲酰基与氨基Fe3O4磁性纳米粒表面的氨基反应生成亚胺，再以氰基硼氢化钠为还原剂，将亚胺还原为胺而得到的，具体包括以下步骤：将200-1000mg氨基Fe3O4磁性纳米粒及10-50mg4-甲酰基苯硼酸加入10-50mL无水甲醇中，然后在20-40℃下反应16-24h，用磁铁收集反应产物，对所得产物进行洗涤，得到不稳定的纳米粒修饰产物，将得到的纳米粒修饰产物及10-50mg氰基硼氢化钠加入10-50mL无水甲醇中，然后在20-40℃下继续反应18-24h，用磁铁收集反应产物，对所得产物(稳定结构的纳米粒修饰物)进行洗涤、干燥。
优选的，所述模板分子的固定具体包括以下步骤：利用硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒对分散在溶剂中的辣根过氧化物酶进行吸附，其中，辣根过氧化物酶的分散浓度为125-1000μg·mL-1，所述溶剂为pH 8.0-9.5的磷酸盐缓冲液，吸附温度为20-40℃，吸附时间为0.5-4h。
优选的，所述水相体系由正硅酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷、固定有模板分子的硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒以及体积分数0.005％-0.1％的吐温水溶液构成，其中，正硅酸乙酯与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为1:2-1:16，正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷的总体积为5-20μL，所述吐温水溶液的体积为5-20mL，用于固定模板分子的硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒的质量为5-50mg。
优选的，所述溶胶-凝胶法的反应条件为：在20-40℃下反应12-24h。
优选的，所述步骤4)中，模板分子采用洗脱溶剂去除(洗脱时间16-32h)，洗脱溶剂为乙腈与醋酸水溶液的混合溶液，其中，乙腈:醋酸水溶液的体积比为2:8-4:6，醋酸水溶液的体积分数为2％-10％。
优选的，所述步骤5)中，采用明胶、牛血清白蛋白或酪蛋白的溶液(例如，1-5mg·mL-1BSA溶液)封闭(20-40℃下15-60min)所述非特异性吸附残基(例如，辣根过氧化物酶非特异性吸附残基等)。
一种固定化辣根过氧化物酶的制备方法，包括以下步骤：
1)制备上述辣根过氧化物酶固定化载体；
2)将上述辣根过氧化物酶固定化载体与含有辣根过氧化物酶的复杂样品(例如，辣根提取物)混合后，于20-40℃反应20-120min，然后利用磁性分离得到固定化辣根过氧化物酶。
上述方法制备的辣根过氧化物酶固定化载体在制备固定化辣根过氧化物酶中的应用。
上述固定化辣根过氧化物酶在葡萄糖、肌氨酸、尿酸、胆固醇等能够分解产生H2O2等物质的检测中的应用。
本发明的有益效果体现在：
本发明分别以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和正硅酸乙酯(TEOS)为功能单体和交联单体，采用非催化溶胶-凝胶技术，在水相中制备一种选择性高以及成本低廉的辣根过氧化物酶分子印迹聚合物，并将该分子印迹聚合物作为一种酶固定化载体实现复杂样品中辣根过氧化物酶的直接固定。
本发明制备过程简单、成本低廉，得到的磁性分子印迹聚合物不仅能够特异性识别目标物质辣根过氧化物酶，而且可以对复杂样品中的辣根过氧化物酶直接通过吸附进行固定，形成的固定化酶可用于葡萄糖、肌氨酸、尿酸、胆固醇等能够分解产生H2O2的物质的检测。
进一步的，本发明提出的非催化溶胶-凝胶法，在含有吐温的反应体系中，硅烷试剂可以乳化为均一的反应体系，加速水解聚合反应，得到均匀的聚合物，克服了传统溶胶-凝胶法需要在有机相中由酸或碱催化下水解聚合，可以在温和的反应条件下实现水溶性蛋白质(例如辣根过氧化物酶等酶分子)分子印迹聚合物的制备。
附图说明
图1为辣根过氧化物酶分子印迹聚合物表征结果：A为X射线粉末衍射图(a为Fe3O4-NH2，b为MIPs)；B为磁滞回线图(a为MIPs，b为Fe3O4-NH2)；C为硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒及MIPs的XPS表征图；D为硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒的XPS表征图的B特征峰；E为硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒的XPS表征图的N特征峰。
图2为辣根过氧化物酶分子印迹聚合物选择性考察结果图。
图3为辣根中辣根过氧化物酶固定结果图。
图4为固定化酶和游离酶催化动力学、Linerweaver-Burk双倒数曲线图：A为固定化酶酶促动力曲线；B为A的Linerweaver-Burk双倒数曲线；C为非固定化酶(游离酶)酶促动力曲线；D为C的Linerweaver-Burk双倒数曲线。
图5为葡萄糖、肌氨酸测定标准曲线和干扰性实验结果：A为葡萄糖测定标准曲线；B为干扰性物质与葡萄糖测定值比较；C为肌氨酸测定标准曲线；D为干扰性物质与肌氨酸测定值比较。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
(一)辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物的制备
1)氨基Fe3O4纳米粒(Fe3O4-NH2)的制备
称取FeCl3·6H2O 1.0g、无水乙酸钠2.0g和1,6-己二胺6.5g，依次分散于30mL乙二醇中。在室温下剧烈搅拌，直到混合物变成透明溶液。将上述透明溶液转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，在200℃下反应6h。用磁铁收集产物，用乙醇和水清洗所得产物，然后在50℃下干燥，得到平均粒径约为20nm的氨基Fe3O4纳米粒，备用。
2)硼酸修饰Fe3O4的制备
取上述氨基Fe3O4纳米粒500mg分散于20mL无水甲醇中，在所得分散体系中再加入4-甲酰基苯硼酸20mg，在室温下振摇反应18h，用磁铁收集纳米粒，并用无水甲醇洗涤三次(洗去未反应的物质)，将所得纳米粒重新分散在20mL无水甲醇中，在所得分散体系中再加入氰基硼氢化钠20mg，在室温下继续振摇反应22h，用磁铁收集纳米粒，并用甲醇和水洗去未反应的物质，在50℃下干燥，得到硼酸修饰Fe3O4，备用。
3)辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物的制备
取上述硼酸修饰Fe3O4 10mg，加入至1mL分散有浓度为500μg·mL-1辣根过氧化物酶(HRP)的磷酸盐缓冲液(pH 8.5)中，室温下振摇吸附1h，用磁铁收集并用磷酸盐缓冲液(pH 8.5)洗去未结合的HRP分子，用体积分数0.05％吐温(吐温-20)水溶液5mL重新分散，在所得分散体系中加入TEOS(正硅酸乙酯)10μL和APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)2.5μL，在室温下振摇反应16h，用磁铁收集产物，用乙腈:5％醋酸水溶液(30:70,v/v)洗脱模板分子HRP24h，得到辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物(记为MIPs)，用体积分数30％的乙醇溶液分散，保存(室温)备用。
除不加入模板分子辣根过氧化物酶，非分子印迹聚合物(记为NIPs)的制备方法与上述MIPs的制备方法相同。
参见图1A，制备的氨基Fe3O4纳米粒在2θ为30.20°、35.40°、43.14°、53.56°、57.02°和62.70°附近出现特征衍射峰，此特征峰可与粉末衍射数据集中的Fe3O4特征衍射峰(220、311、400、422、511和440)相符合，表明所制备的磁性载体(Fe3O4-NH2)含Fe3O4。以氨基Fe3O4纳米粒为载体制备的MIPs与磁性载体(Fe3O4-NH2)具有类似的衍射峰，说明MIPs聚合过程并没有影响到Fe3O4的晶体结构。
参见图1B，氨基Fe3O4纳米粒和磁性分子印迹聚合物(MIPs)的饱和磁强度分别为65.6emu·g-1和62.3emu·g-1，氨基Fe3O4纳米粒表面的印迹聚合物涂层并没有造成MIPs的饱和磁强度大幅下降，所制备的MIPs仍有较高的饱和磁强度，能够确保后续实验中实现快速分离。此外从图中可以看出氨基Fe3O4纳米粒和MIPs的磁化存在着明显的可逆性，即氨基Fe3O4纳米粒和MIPs没有出现明显磁滞现象，表明二者均显示出超顺磁性。
参见图1C和图1D、图1E，利用XPS对硼酸修饰Fe3O4和MIPs的表面元素组成进行分析，图1C中a和图1D、图1E为硼酸修饰Fe3O4，结果显示其表面具有C、O、Fe、N和B元素的吸收峰，图1C中b为MIPs，其表面具有C、O、Si和N元素的吸收峰，与硼酸修饰Fe3O4表面元素组成相比，MIPs表面无Fe元素吸收峰，出现了较强的Si元素的吸收峰，证明在硼酸修饰Fe3O4的表面具有二氧化硅聚合，同时，MIPs中N元素的吸收峰明显增强，这是由于APTES中的氨基引起的N元素吸收峰的增强。XPS结果表明MIPs中聚合物层成功包覆在Fe3O4表面。
(二)辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物选择性的评价(MIPs封闭后进行的实验)
选择人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、细胞色素C(Cyt)、溶菌酶(Lyz)和菠萝蛋白酶(Bro)作为选择性实验的对照物(Blank是空白实验组，未加任何竞争对照物)，与辣根过氧化物酶在相同浓度下竞争结合磁性分子印迹聚合物，加TMB显色液显色，读取吸光度值，通过比较加入的干扰物质(对照物)对磁性分子印迹聚合物结合辣根过氧化物酶的干扰程度，评价制备的磁性分子印迹聚合物对辣根过氧化物酶的选择性。
参见图2，相同浓度的人血清白蛋白、卵清蛋白、细胞色素C、溶菌酶和菠萝蛋白酶几乎对辣根过氧化物酶的吸附没有干扰，表明制备的磁性分子印迹聚合物对辣根过氧化物酶具有较好的特异性吸附能力。也表明在磁性分子印迹聚合物的制备过程中，模板分子辣根过氧化物酶的加入，能够形成与辣根过氧化物酶在空间结构及结合位点上相匹配的三维空间结构，其他结构相类似的蛋白质由于空间结构和作用位点上的差异导致磁性分子印迹聚合物对其吸附性能较差。
(三)辣根中过氧化物酶的固定
取新鲜辣根1g，加PBST溶液(含0.05％吐温-20的PBS溶液)10mL，匀浆，4℃下提取4h，滤过，滤液即辣根提取液，于-20℃下保存备用，使用之前稀释50倍；取分子印迹聚合物(即MIPs)20μg，用2mg/mL牛血清白蛋白(BSA)200μL室温封闭30min，加上述稀释的辣根提取液150μL，室温静置反应30min(MIPs选择性吸附提取液中的辣根过氧化物酶分子)，用磁铁收集产物，用PBST溶液洗涤，即可得到以经过封闭的MIPs为载体的固定化辣根过氧化物酶(简称固定化酶)；上述固定化酶加TMB显色液150μL室温显色30min，加2M H2SO4溶液50μL终止反应，通过磁铁分离固定化酶，然后取160μL反应液在酶标仪下读取吸光度值。对非分子印迹聚合物(即NIPs)采用相同的固定化及显色处理。
参见图3，由于NIPs不存在特异性识别位点，其对辣根过氧化物酶的固定量远远少于MIPs的固定量，加显色底物显色后，MIPs对应的吸光强度远远高于NIPs对应的吸光强度。结果表明制备的MIPs经过封闭后，能够从复杂的辣根提取液中识别、吸附和固定辣根过氧化物酶，并且辣根中的其他物质对固定化过程造成的干扰较小。
(四)固定化辣根过氧化物酶的评价
对固定化酶与非固定化酶在相同条件下对底物的酶促动力学行为进行研究，通过Linerweaver-Burk法计算二者的米氏常数Km值，评价二者对底物的亲和能力。参见图4A和图4C，固定化酶与非固定化酶对底物四甲基联苯胺(TMB)的酶促动力学结果表明，固定化酶与非固定化酶有相类似的酶促动力学行为；进一步通过Linerweaver-Burk法求得二者的米氏常数Km值分别为0.36mM和0.29mM(图4B和图4D)，可以看出，固定化酶与非固定化酶米氏常数相差不大，表明固定后的辣根过氧化物酶及未固定的辣根过氧化物酶与底物亲和能力相当。
(五)血液中葡萄糖(Glucose)含量测定
葡萄糖测定标准曲线建立方法如下：在100μL含有不同浓度(1μg·mL-1、5μg·mL-1、10μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1)葡萄糖的柠檬酸-醋酸钠缓冲液和100μL TMB(400μg·mL-1)的混合溶液中，加入葡萄糖氧化酶溶液(1mg·mL-1)10μL和固定化酶20μg，室温反应1h，加2M H2SO4溶液50μL终止反应，磁铁分离固定化酶，然后取160μL反应液在酶标仪下读取吸光度值，以吸光度值为纵坐标、标准品浓度为横坐标建立葡萄糖浓度与吸光度值间的响应关系标准曲线，见图5A。
血浆中葡萄糖含量检测方法如下：血浆样品在使用之前用柠檬酸-醋酸钠缓冲液稀释50倍，取稀释的血浆样品溶液100μL和TMB溶液(400μg·mL-1)100μL混合，加葡萄糖氧化酶溶液(1mg·mL-1)10μL和固定化酶20μg，室温反应1h，加2M H2SO4溶液50μL终止反应，磁铁分离固定化酶，然后取160μL反应液在酶标仪下读取吸光度值，根据建立的标准曲线计算血浆中葡萄糖浓度。
实验中用加标回收率和相对标准偏差考察测定葡萄糖的准确度和精密度，具体步骤为：分别取高中低(50μg·mL-1、25μg·mL-1、5μg·mL-1)三个浓度的葡萄糖加标血浆溶液，每个浓度均配3份，按照上述葡萄糖含量测定操作步骤，得到不同加标样品的吸光度值，并结合所绘制的标准曲线，计算回收率和相对标准偏差，以此来考察方法的准确度和精密度。结果(见表1)显示其在上述加标浓度下，回收率均在114.5％-119.7％之间，精密度RSD值均小于4.2％。加标回收率和精密度实验表明以上血浆中葡萄糖含量检测方法的准确度和精密度良好，可以用于在实际样品中检测葡萄糖。
表1.葡萄糖检测的准确度和精密度(n＝3)
Figure BDA0002075652560000071
为了考察以上血浆中葡萄糖含量检测方法测定葡萄糖的选择性，实验中选择了维生素C(Vitamin C)、蔗糖(Sucrose)、甘氨酸(Glycine)、甘露醇(Mannitol)作为对照物质，探讨该方法的选择性。具体操作为：分别配制浓度为10倍参照葡萄糖浓度的溶液进行干扰性实验，按照上述葡萄糖含量检测方法分别进行测定，根据所得的吸光度值判断其对葡萄糖测定的干扰情况。结果(见图5B)表明即使对照物质的浓度高于葡萄糖浓度10倍时，其检测所产生的颜色也不能干扰葡萄糖的测定，表明构建的葡萄糖含量检测方法具有良好的选择性。
(六)尿液中肌氨酸(Creatine)含量测定
肌氨酸测定标准曲线建立方法如下：在100μL含有不同浓度(0.1μg·mL-1、0.5μg·mL-1、1μg·mL-1、5μg·mL-1、10μg·mL-1)肌氨酸的PBS缓冲液中加入肌氨酸氧化酶溶液(1mg·mL-1)10μL，室温下反应30min，加TMB溶液(400μg·mL-1)100μL和固定化酶20μg，室温继续反应30min，加2M H2SO4溶液50μL终止反应，磁铁分离固定化酶，然后取160μL反应液在酶标仪下读取吸光度值，建立肌氨酸浓度与吸光度值间的响应关系标准曲线，见图5C。
尿液中肌氨酸含量检测方法如下：尿液样品在使用之前用PBS缓冲液稀释20倍，取稀释的尿液样品溶液100μL，加肌氨酸氧化酶溶液(1mg·mL-1)10μL，室温下反应30min，加TMB溶液(400μg·mL-1)100μL和固定化酶20μg，室温继续反应30min，加2M H2SO4溶液50μL终止反应，磁铁分离固定化酶，然后取160μL反应液在酶标仪下读取吸光度值，根据建立的标准曲线计算尿液中肌氨酸含量。
实验中用加标回收率和相对标准偏差考察该方法测定肌氨酸的准确度和精密度，具体步骤为：分别取高中低(5μg·mL-1、1μg·mL-1、0.5μg·mL-1)三个浓度的肌氨酸加标尿液，每个浓度均配3份，按照上述肌氨酸含量测定操作步骤，得到不同加标样品的吸光度值，并结合所绘制的标准曲线，计算回收率和相对标准偏差，以此来考察以上尿液中肌氨酸含量检测方法的准确度和精密度。结果(见表2)显示其在上述加标浓度下，回收率均在87.4％-93.8％之间，精密度RSD值均小于6.7％。加标回收率和精密度实验表明以上尿液中肌氨酸含量检测方法准确度和精密度良好，可以用于在实际样品中检测肌氨酸。
表2.肌氨酸检测的准确度和精密度实验(n＝3)
Figure BDA0002075652560000081
为了考察以上尿液中肌氨酸含量检测方法测定肌氨酸的选择性，实验中选择了葡萄糖(Glucose)、维生素C(Vitamin C)、甘氨酸(Glycine)、苯丙氨酸(Phenylalanine)、精氨酸(Arginine)作为对照物质，探讨该方法的选择性。具体操作为：分别配制浓度为十倍参照肌氨酸浓度的溶液进行干扰性实验，按照上述尿液中肌氨酸含量检测方法分别进行测定，根据所得的吸光度值判断其对肌氨酸测定的干扰情况。结果(见图5D)表明即使对照物质的浓度高于肌氨酸浓度10倍时，其检测所产生的颜色也不能干扰肌氨酸的测定，表明构建的肌氨酸含量检测方法具有良好的选择性。

Claims (7)

1.一种辣根过氧化物酶固定化载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)制备氨基Fe3O4磁性纳米粒；
2)利用氨基Fe3O4磁性纳米粒制备硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒；
3)以辣根过氧化物酶为模板分子，将该模板分子固定在硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒上，然后在水相体系下，以3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体、正硅酸乙酯为交联单体，采用非催化溶胶-凝胶法制备得到包覆在硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒上的结合有所述模板分子的分子印迹聚合物层；
4)去除所述分子印迹聚合物层中结合的模板分子，得到辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物；
5)封闭辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物表面的非特异性吸附残基，得到辣根过氧化物酶固定化载体；
所述水相体系由正硅酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷、固定有模板分子的硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒以及体积分数0.005％-0.1％的吐温水溶液构成，其中，正硅酸乙酯与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为1:2-1:16，正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷的总体积为5-20μL，所述吐温水溶液的体积为5-20mL，用于固定模板分子的硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒的质量为5-50mg；
所述溶胶-凝胶法的反应条件为：在20-40℃下反应12-24h；
利用辣根过氧化物酶固定化载体对辣根中的辣根过氧化物酶进行固定，固定后的辣根过氧化物酶及未固定的辣根过氧化物酶与底物亲和能力相当。
2.根据权利要求1所述一种辣根过氧化物酶固定化载体的制备方法，其特征在于：所述氨基Fe3O4磁性纳米粒采用热溶剂法制备。
3.根据权利要求1所述一种辣根过氧化物酶固定化载体的制备方法，其特征在于：所述硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒的制备是以4-甲酰基苯硼酸为硼酸试剂。
4.根据权利要求1所述一种辣根过氧化物酶固定化载体的制备方法，其特征在于：所述模板分子的固定具体包括以下步骤：利用硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒对分散在溶剂中的辣根过氧化物酶进行吸附，其中，辣根过氧化物酶的分散浓度为125-1000μg·mL-1，所述溶剂为pH 8.0-9.5的磷酸盐缓冲液，吸附温度为20-40℃，时间为0.5-4h。
5.根据权利要求1所述一种辣根过氧化物酶固定化载体的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，模板分子采用洗脱溶剂去除，洗脱溶剂为乙腈与醋酸水溶液的混合溶液，其中，乙腈:醋酸水溶液的体积比为2:8-4:6，醋酸水溶液的体积分数为2％-10％。
6.根据权利要求1所述一种辣根过氧化物酶固定化载体的制备方法，其特征在于：所述步骤5)中，采用明胶、牛血清白蛋白或酪蛋白的溶液封闭所述非特异性吸附残基。
7.一种固定化辣根过氧化物酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)制备辣根过氧化物酶固定化载体
制备氨基Fe3O4磁性纳米粒；利用氨基Fe3O4磁性纳米粒制备硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒；以辣根过氧化物酶为模板分子，将该模板分子固定在硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒上，然后在水相体系下，以3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体、正硅酸乙酯为交联单体，采用非催化溶胶-凝胶法制备得到包覆在硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒上的结合有所述模板分子的分子印迹聚合物层；去除所述分子印迹聚合物层中结合的模板分子，得到辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物；封闭辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物表面的非特异性吸附残基，得到辣根过氧化物酶固定化载体；
所述水相体系由正硅酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷、固定有模板分子的硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒以及体积分数0.005％-0.1％的吐温水溶液构成，其中，正硅酸乙酯与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为1:2-1:16，正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷的总体积为5-20μL，所述吐温水溶液的体积为5-20mL，用于固定模板分子的硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒的质量为5-50mg；
所述溶胶-凝胶法的反应条件为：在20-40℃下反应12-24h；
2)将上述辣根过氧化物酶固定化载体与含有辣根过氧化物酶的复杂样品混合后，于20-40℃反应20-120min，然后利用磁性分离得到固定化辣根过氧化物酶，固定后的辣根过氧化物酶及未固定的辣根过氧化物酶与底物亲和能力相当。
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