CN110234358A

CN110234358A - 多病毒特异性的t细胞免疫疗法

Info

Publication number: CN110234358A
Application number: CN201780057033.1A
Authority: CN
Inventors: R·肯纳; V·达萨里
Original assignee: Queensland Institute of Medical Research QIMR
Current assignee: QIMR Berghofer Medical Research Institute
Priority date: 2016-07-18
Filing date: 2017-07-18
Publication date: 2019-09-13
Also published as: US20230068154A1; WO2018015810A2; EP3484525A4; JP2019520840A; US20210252128A1; CA3031172A1; JP2022177128A; AU2022263537A1; AU2017300096A1; WO2018015810A3; EP3484525A2

Abstract

本文提供与多病毒特异性的T细胞免疫疗法相关的组合物和方法。

Description

多病毒特异性的T细胞免疫疗法

相关申请

本申请要求于2016年7月18日提交的美国临时专利申请序列号62/363,669的优先权的权益，其特此通过引用被整体并入。

背景

过继性免疫疗法涉及将疾病特异性的细胞毒性T细胞(CTL)植入或输注入个体中，其目的是为了识别、靶向和破坏疾病相关性细胞。过继性免疫疗法已经成为用于治疗许多疾病和紊乱(包含癌症、感染性疾病和自身免疫疾病)的有希望的途径。

概述

在某些方面，本文提供与用于过继性免疫疗法的多病毒特异性的细胞毒性T细胞(CTL)的生成和应用有关的组合物和方法。在某些实施方案中，本文提供与核酸、运载体和重组腺病毒有关的组合物和方法，所述核酸、运载体和重组腺病毒含有编码来自不同病毒(例如，如多表位蛋白)的两个或更多个T细胞表位的核酸序列，所述来自不同病毒的两个或更多个T细胞表位由CTL识别，并且在病毒感染和/或癌症的预防和/或治疗中是有用的。在某些实施方案中，本文提供呈递来自不同病毒的两个或更多个T细胞表位的抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，本文提供CTL的群体，所述CTL的群体共同包括T细胞受体(TCR)，所述T细胞受体(TCR)识别来自不同病毒的两个或更多个T细胞表位。

在某些方面，本文提供核酸运载体(例如，腺病毒表达运载体)和/或重组腺病毒，所述核酸运载体和/或重组腺病毒包括编码两个或更多个T细胞表位(例如，表1中列出的T细胞表位中的两个或更多个)的核酸序列，其中两个或更多个T细胞表位包括来自至少两种不同病毒(例如，EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、多瘤BK病毒(BKV)和/或腺病毒(ADV))的T细胞表位。在一些实施方案中，表位是HLA I类-限制性T细胞表位。在一些实施方案中，运载体或重组腺病毒编码至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个T细胞表位(例如，表1中列出的表位中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个)。

在一些实施方案中，运载体或重组腺病毒编码来自EBV的T细胞表位(例如，LMP2a表位、EBNA3A表位、EBNA3B表位、EBNA1表位、BZLF1表位、和/或BMLF1表位)。在一些实施方案中，运载体或重组腺病毒编码来自CMV的T细胞表位(例如，pp50表位、pp65表位、IE-1表位、和/或pp150表位)。在一些实施方案中，运载体或重组腺病毒编码来自BKV的T细胞表位(例如，大T抗原表位和/或VP1表位)。在一些实施方案中，运载体或重组腺病毒编码来自ADV的T细胞表位(例如，六邻体蛋白表位、DNA聚合酶表位、和/或DNA结合蛋白表位)。在一些实施方案中，T细胞表位包括来自至少三种或四种不同病毒(例如，EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、多瘤BK病毒(BKV)和腺病毒(ADV))的表位。在一些实施方案中，运载体或重组腺病毒可以编码来自上述病毒的任何组合和/或来自其他病毒的T细胞表位。在一些实施方案中，运载体或重组腺病毒编码至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个T细胞表位(例如，表1中列出的表位中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个)。在一些实施方案中，由本文所描述的运载体或重组腺病毒编码的T细胞表位被编码为多表位蛋白(即，包括多个T细胞表位的单链氨基酸残基，所述多个T细胞表位在自然界中不直接连接)。在一些方面，多表位蛋白包括与SEQ ID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码T细胞表位(例如，多表位蛋白中的T细胞表位)的序列是密码子优化的。

在一些方面，本文提供生成本文公开的重组腺病毒的方法。在一些实施方案中，方法包含将本文所描述的核酸运载体转染到细胞系(例如，HEK 293细胞)中，并且然后在条件下培养经转染的细胞系，使得细胞系产生重组腺病毒。在一些实施方案中，方法还包含分离重组腺病毒。

在一些方面，本文提供包括本文公开的运载体、重组腺病毒、或多表位的治疗组合物(疫苗组合物或其他药物组合物)和使用治疗组合物治疗或预防病毒感染或癌症的方法。

在一些方面，本文提供APC，所述APC呈递两个或更多个T细胞表位(例如，表1中列出的T细胞表位中的两个或更多个)，其中两个或更多个T细胞表位包括来自至少两种不同病毒(例如，EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、多瘤BK病毒(BKV)和/或腺病毒(ADV))的T细胞表位。在一些实施方案中，表位是HLA I类-限制性T细胞表位。在一些实施方案中，APC呈递来自EBV的T细胞表位(例如，LMP2a表位、EBNA3A表位、EBNA3B表位、EBNA1表位、BZLF1表位、和/或BMLF1表位)。在一些实施方案中，APC呈递来自CMV的T细胞表位(例如，pp50表位、pp65表位、IE-1表位、和/或pp150表位)。在一些实施方案中，APC呈递来自BKV的T细胞表位(例如，大T抗原表位和/或VP1表位)。在一些实施方案中，APC呈递来自ADV的T细胞表位(例如，六邻体蛋白表位、DNA聚合酶表位、和/或DNA结合蛋白表位)。在一些实施方案中，T细胞表位包括来自至少三种或四种不同病毒(例如，EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、多瘤BK病毒(BKV)和腺病毒(ADV))的表位。在一些实施方案中，APC呈递来自上述病毒的任何组合和/或来自其他病毒的T细胞表位。在一些实施方案中，APC呈递至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个T细胞表位(例如，表1中列出的表位中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个)。

在一些方面，本文提供CTL的群体，所述CTL的群体共同包括识别两个或更多个T细胞表位(例如，表1中列出的T细胞表位中的两个或更多个)的T细胞受体，其中两个或更多个T细胞表位包括来自至少两种不同病毒(例如，EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、多瘤BK病毒(BKV)和/或腺病毒(ADV))的T细胞表位。在一些实施方案中，表位是HLA I类-限制性T细胞表位。在一些实施方案中，CTL的群体共同包括识别来自EBV的T细胞表位(例如，LMP2a表位、EBNA3A表位、EBNA3B表位、EBNA1表位、BZLF1表位、和/或BMLF1表位)的T细胞受体。在一些实施方案中，CTL的群体共同包括识别来自CMV的T细胞表位(例如，pp50表位、pp65表位、IE-1表位、和/或pp150表位)的T细胞受体。在一些实施方案中，CTL的群体共同包括识别来自BKV的T细胞表位(例如，大T抗原表位和/或VP1表位)的T细胞受体。在一些实施方案中，CTL的群体共同包括识别来自ADV的T细胞表位(例如，六邻体蛋白表位、DNA聚合酶表位、和/或DNA结合蛋白表位)的T细胞受体。在一些实施方案中，CTL的群体共同包括识别来自至少三种或四种不同病毒(例如，EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、多瘤BK病毒(BKV)和腺病毒(ADV))的T细胞表位的T细胞受体。在一些实施方案中，CTL的群体共同包括识别来自上述病毒的任何组合和/或来自其他病毒的T细胞表位的T细胞受体。在一些实施方案中，CTL的群体共同包括识别至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个T细胞表位(例如，表1中列出的表位中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个)的T细胞受体。

在一些方面，本文提供生成呈递多病毒T细胞表位的抗原APC的方法。在一些实施方案中，方法包含将APC与本文提供的运载体转染。在一些实施方案中，方法包含使APC与本文提供的重组腺病毒接触。在一些实施方案中，APC是B细胞、抗原呈递T细胞、树突状细胞、和/或人工抗原呈递细胞(例如，aK562细胞)。在一些方面，本文提供例如通过将包括CTL的样品(例如，PBMC样品)与本文所描述的APC孵育，来生成多病毒特异性CTL、激活多病毒特异性CTL和/或诱导多病毒特异性CTL增殖的方法，所述多病毒特异性CTL识别本文所描述的T细胞表位中的两个或更多个。在一些实施方案中，本文提供根据本文所描述的方法生成的APC和/或T细胞。

在一些方面，本文提供通过向受试者施用本文所描述的包括CTL的组合物来治疗和/或预防病毒感染(例如，EBV、CMV、BKV、或ADV)和/或癌症的方法。在一些实施方案中，受试者是免疫***受损的。在一些实施方案中，CTL对于受试者是自体的。在一些实施方案中，CTL对于受试者是同种异体的。在一些实施方案中，在施用至受试者之前，CTL被储存在细胞库中。在一些实施方案中，在施用至受试者之前，针对与受试者的兼容性来选择(例如，从细胞库选择)CTL。在一些实施方案中，如果CTL通过与受试者共有的HLA等位基因被限制(即，CLT的TCR受限制于由存在于受试者中的HLA等位基因编码的I类MHC蛋白)，则选择CTL。在一些实施方案中，如果CTL和受试者共有至少2个(例如，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个)HLA等位基因，并且CTL通过共有的HLA等位基因被限制，则选择CTL。在一些实施方案中，施用至受试者的CTL选自细胞库(例如，CTL库)。

附图的简要说明

图1示出描绘用于构建示例性腺病毒核酸运载体，随后使用这样的运载体用于生成示例性重组腺病毒(Ad-MvP)的示例性方法的示意图。根据该示例性方法，将编码含有来自BKV、ADV、CMV和EBV的邻近的HLA I类限制性CTL表位的多表位蛋白的合成DNA序列克隆到pShuttle运载体中，然后亚克隆到Ad5F35表达运载体中。通过转染HEK293细胞将重组Ad5F35运载体包装入感染性腺病毒中，并且通过重复冻融循环从经转染的细胞中收获重组腺病毒(称为Ad-MvP)。

图2示出来自具有示例性核酸运载体的固体器官移植受者的多病毒特异性T细胞的扩增。用Ad-MvP刺激来自14个SOT患者的PBMC，并且在存在IL-2的情况下培养14天。通过测量响应于用含有Ad-MvP中编码的表位的病毒特异性肽库刺激的IFNγ产生来确定表位特异性CTL的频率。A：示出用CMV肽表位、EBV肽表位、BKV肽表位或ADV肽表位回收后的代表性点状图。B：数据表示来自全部SOT患者的产生病毒特异性IFNγ的CD8⁺T细胞的数量的总结。黑色符号表示被招募的患有CMV相关性并发症的患者，红色符号表示患有EBV相关性PTLD的患者，并且蓝色符号表示患有BKV病毒血症的患者。C：在用病毒特异性肽库体外刺激后，评估Ad-MvP扩增的CTL的细胞内IFNγ、TNF、IL-2的产生和CD107a的外化。使用FlowJo软件进行布尔分析。饼状图表示对于每种能够生成1、2、3或4种效应子功能的病毒特异性的T细胞的比例。

图3示出免疫后多病毒特异性T细胞的初免(priming)。A：代表性数据，所述代表性数据示出来自用Ad-MvP免疫的HHD II转基因小鼠的离体扩增的病毒特异性T细胞和体外扩增的病毒特异性T细胞。B：堆叠条形图，所述堆叠条形图示出在用Ad-MvP免疫的HLA*A02转基因小鼠中表达IFNγ的多病毒特异性CD8⁺ T细胞的百分比。在接种疫苗后第50天分离来自经免疫的小鼠的脾细胞，并且用来自BKV、ADV、CMV或EBV的HLA-A*02限制性CD8⁺ T细胞肽表位体外刺激。使用细胞内细胞因子测定评估T细胞特异性。

图4示出在健康志愿者中使用示例性重组腺病毒扩增多病毒特异性T细胞。用Ad-MvP刺激来自健康志愿者的PBMC，并且在存在IL-2的情况下扩增14天。通过测量响应于用Ad-MvP中含有的HLA匹配的表位刺激的IFNγ产生来确定表位特异性CTL的频率。A：健康供者的群组中多病毒特异性T细胞的频率的总结。B：用对应于每种病毒的多表位中含有的表位的肽库刺激Ad-MvP扩增的CTL。测量IFNγ、TNF、IL-2的产生和CD107a的外化作为多功能性的标志物。C：在存在不同细胞因子组合的情况下使用Ad-MvP体外扩增来自健康供者的多病毒特异性CD8⁺ T细胞。D：使用细胞内细胞因子测定评估在存在不同细胞因子的情况下体外培养后抗原特异性T细胞的频率。

图5示出使用自体或同种异体多病毒特异性T细胞的EBV相关性B细胞淋巴瘤的过继性免疫疗法。A和D：使用细胞内细胞因子测定的来自供者D01(HLA A1、A11、B8、B35)和D055(HLA A1、A2、B8、B40)的Ad-MvP扩增的T细胞的表位特异性分析。B：将来自供者H002的EBV转化的LCL植入NOD/SCID小鼠(n＝10)，以诱导B细胞淋巴瘤。在植入之后第6天，小鼠被空白对照(mock)处理(n＝5)或被过继性输注自体的2×10⁷个Ad-MvP扩增的CTL(n＝5；在图片A中示出)。使用游标卡尺测量肿瘤体积。C：空白对照处理或自体T细胞疗法之后患有EBV肿瘤的小鼠的卡普兰-迈耶存活图。E：将来自供者H002的EBV转化的LCL植入NOD/SCID小鼠(n＝10)，以诱导B细胞淋巴瘤。在植入之后第6天，小鼠被空白对照处理(n＝5)或被过继性输注来自供者H005的HLA匹配的同种异体的Ad-MvP扩增的T细胞(n＝5；在图片B中示出)。使用游标卡尺测量肿瘤体积。图片B和图片E中的每个数据点示出使用游标卡尺在多个小鼠中测量的肿瘤尺寸的平均值±SEM。F：空白对照处理或同种异体T细胞疗法之后患有EBV肿瘤的小鼠的卡普兰-迈耶存活图。

详细说明

概述

定义

为了方便起见，此处收集了说明书、实施例和所附权利要求中采用的某些术语。

本文中使用冠词“一(a)”和“一(an)”指所述冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一要素”意指一个要素或多于一个要素。

如本文所使用的，术语“施用”意指向受试者提供药剂或药物组合物，并且包含(但不限于)由医疗技术人员施用和自我施用。这样的药剂可以含有例如本文所描述的肽、本文提供的抗原呈递细胞和/或本文提供的CTL。

术语“氨基酸”旨在包括包含氨基官能性和酸官能性两者、并且能够被包含在天然存在的氨基酸的聚合物中的全部分子(无论是天然的还是合成的)。示例性氨基酸包含天然存在的氨基酸；其类似物、衍生物和同源物；具有变体侧链的氨基酸类似物；以及前述中任何一种的全部立体异构体。

术语“结合”或“相互作用”指由于例如生理条件下的静电相互作用、疏水相互作用、离子相互作用和/或氢键相互作用而在两个分子之间(例如，TCR与肽/MHC之间)的缔合(其可以是稳定的缔合)。当表位存在于适当的MHC上时，TCR“识别”其能够结合的T细胞表位。

术语“生物样品”、“组织样品”或简单地“样品”各自指从受试者的组织获得的细胞的集合。组织样品的来源可以是如来自新鲜、冷冻和/或保存的器官、组织样品、活组织检查、或抽出物的实体组织；血液或任何血液成分、血清、血液；体液，如脑脊液、羊水、腹膜液或间质液、尿液、唾液、粪便、眼泪；或来自受试者的妊娠或发育的任何时间的细胞。

术语“表位”意为能够与抗体或TCR特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成。某些表位可以由抗体能够结合的特定氨基酸序列限定。

如本文所使用的，短语“药学上可接受的”指在合理的医学判断范围内适合于与人类和动物的组织接触，而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些药剂、化合物、材料、组合物和/或剂量。

如本文所使用的，短语“药学上可接受的载体”意为药学上可接受的材料、组合物或运载体(vehicle)(如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、或溶剂包封材料)，其涉及将药剂从器官、或身体的一部分携带或转运至另一器官、或身体的一部分。每种载体在与制剂的其他成分相容并且对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包含：(1)糖(如乳糖、葡萄糖和蔗糖)；(2)淀粉(如玉米淀粉和马铃薯淀粉)；(3)纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素)；(4)粉状黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂(如可可脂和栓剂蜡)；(9)油类(如花生油、棉籽油、红花子油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)；(10)二醇类(如丙二醇)；(11)多元醇(如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇)；(12)酯类(如油酸乙酯和十二烷酸乙酯)；(13)琼脂；(14)缓冲剂(如氢氧化镁和氢氧化铝)；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及(22)药物制剂中采用的其他无毒相容物质。

术语“多核苷酸”和“核酸”可互换地被使用。它们指任何长度的核苷酸的聚合体形式，脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析确定的基因座(loci)(基因座(locus))、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、支化多核苷酸、质粒、运载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物的组装之前或之后被赋予。多核苷酸可以被进一步修饰，如通过与标记组件偶联。在本文提供的全部核酸序列中，U核苷酸与T核苷酸是可互换的。

如本文所使用的，“预防”病况的治疗剂指化合物，当在紊乱或病况的发作之前被施用至统计样品时，相对于未经处理的对照样品，所述化合物降低经处理的样品中的紊乱或病况的发生，或相对于未经处理的对照样品，所述化合物延迟紊乱或病况的一种或更多种症状的发作或降低紊乱或病况的一种或更多种症状的严重性。

如本文所使用的，术语“受试者”意为被选择用于治疗或疗法的人类或非人类动物。

如本文所使用的，短语“治疗有效量”和“有效量”意为以适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比在受试者中的至少一个细胞亚群中对于产生期望的治疗效果有效的药剂的量。

在受试者中“治疗”疾病或“治疗”患有疾病的受试者指使受试者经受药物治疗(例如，施用药物)，使得疾病的至少一种症状被减轻或防止恶化。

术语“运载体”指工具(means)，通过所述工具，核酸可以在生物体、细胞或细胞组分之间繁殖和/或转移。运载体包含质粒、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌粒、转位子和人工染色体等，其可能或可能不能够自主复制或整合到宿主细胞的染色体中。

重组腺病毒和运载体

在某些方面，本文提供核酸分子(例如，运载体，如腺病毒表达运载体)和/或重组腺病毒，所述核酸分子和/或重组腺病毒包括编码两个或更多个T细胞表位(例如，表1中列出的T细胞表位中的两个或更多个)的核酸序列，其中两个或更多个T细胞表位包括来自至少两种不同病毒(例如，EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、多瘤BK病毒(BKV)和/或腺病毒(ADV))的T细胞表位。在一些实施方案中，T细胞表位是HLA I类-限制性T细胞表位。例如，核酸分子和/或重组腺病毒可以包括核酸序列，所述核酸序列编码来自EBV和CMV的T细胞表位、来自EBV和BKV的T细胞表位、来自EBV和ADV的T细胞表位、来自CMV和ADV的T细胞表位、来自CMV和BKV的T细胞表位、或来自BKV和ADV的T细胞表位。在一些实施方案中，核酸分子和/或重组腺病毒含有编码来自三种或更多种不同病毒的T细胞表位的核酸序列。例如，核酸分子和/或重组腺病毒可以包括核酸序列，所述核酸序列编码来自EBV、CMV和BKV的T细胞表位、来自EBV、CMV和ADV的T细胞表位、来自CMV、BKV和ADV的T细胞表位、或来自ADV、BKV和EBV的T细胞表位。在一些实施方案中，核酸分子和/或重组腺病毒含有编码来自三种或更多种不同病毒的T细胞表位的核酸序列。例如，核酸分子和/或重组腺病毒可以包括核酸序列，所述核酸序列编码来自EBV、CMV、BKV和ADV的T细胞表位。在一些实施方案中，核酸分子和/或重组腺病毒可以包括核酸序列，所述核酸序列编码来自5、6、7、8、9、10或更多种不同病毒的T细胞表位。在一些实施方案中，编码T细胞表位(例如，多表位蛋白中的T细胞表位)的序列是密码子优化的。

在一些实施方案中，由本文所描述的运载体或重组腺病毒编码的T细胞表位被编码为多表位蛋白(即，包括多个T细胞表位的单链氨基酸残基，所述多个T细胞表位在自然界中不直接连接)。在一些实施方案中，多表位蛋白中的T细胞表位经由氨基酸连接体连接。在一些实施方案中，多表位蛋白中的T细胞表位被直接连接，而无需***氨基酸。下文提供示例性多表位蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO:1：

MLTERFNHILLLLIWFRPVSITEVECFLLPLMRKAYLRLDSEISMYSVKVNLEKKAYLRKCKEFTDLGQNLLYTYFSLNNKFMPNRPNYIAFGLRYRSMLLLPGSYTYEWIPYLDGTFYVLAWTRAFVFLGRQLPKLVTEHDTLLYYSEHPTFTSQYNLVPMVATVFPTKDVALQYDPVAALFAYAQKIFKILRPHERNGFTVLELRRKMMYMIPSINVHHYTRATKMQVITTVYPPSSTAKGPISHGHVLKHERNGFTVLCLGGLLTMVGLCTLVAMLSSCSSCPLSKITYGPVFMCLRPPIFIRRLFLRGRAYGLRAKFKQLLHPVGEADYFEYYPLHEQHGMVEITPYKPTW

在一些方面，多表位蛋白包括与SEQ ID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性的氨基酸序列。为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比一致性，序列被比对以用于最优比较目的(例如，可以在第一氨基酸序列和第二氨基酸序列中的一个或两个或第一核酸序列和第二核酸序列中的一个或两个中引入空位用于最优比对，并且为了比较目的，可以忽略非一致序列)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处是一致的。考虑到空位的数量和每个空位的长度(其需要被引入以用于两个序列的最优比对)，两个序列之间的百分比一致性是序列共有的一致位置的数量的函数。

在一些实施方案中，本文提供的核酸分子和/或重组腺病毒包括核酸序列，所述核酸序列编码2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、18种或更多种、19种或更多种、20种或更多种、21种或更多种、22种或更多种、23种或更多种、24种或更多种、25种或更多种、26种或更多种、27种或更多种、28种或更多种、29种或更多种、30种或更多种、31种或更多种、32种或更多种、33种或更多种、34种或更多种、35种或更多种、36种或更多种、38种或更多种、39种或更多种、或40种或更多种T细胞表位。在一些实施方案中，T细胞表位包括来自EBV的T细胞表位(例如，LMP2a表位、EBNA3A表位、EBNA3B表位、EBNA1表位、BZLF1表位、和/或BMLF1表位)。在一些实施方案中，T细胞表位包括来自CMV的T细胞表位(例如，pp50表位、pp65表位、IE-1表位、和/或pp150表位)。在一些实施方案中，T细胞表位包括来自BKV的T细胞表位(例如，大T抗原表位和/或VP1表位)。在一些实施方案中，T细胞表位包括来自ADV的T细胞表位(例如，六邻体蛋白表位、DNA聚合酶表位、和/或DNA结合蛋白表位)。

在一些实施方案中，本文提供的核酸分子和/或重组腺病毒包括编码表1中提供的T细胞表位的核酸序列。在一些实施方案中，核酸运载体或重组腺病毒表达运载体包括表1中列出的表位中的全部。在一些实施方案中，本文提供的核酸分子和/或重组腺病毒包括表1中列出的T细胞表位中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个。

表1：示例性HLA I类限制性T细胞表位的列表。

在一些方面，本文提供运载体(例如，基于腺病毒的表达运载体)，所述运载体含有本文所描述的核酸分子。如本文所使用的，术语“运载体”指能够转运已经与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的运载体是“质粒”，其指环状双链DNA环，附加的DNA区段可以连接至所述环状双链DNA环中。另一种类型的运载体是病毒运载体，其中附加的DNA区段可以连接至病毒基因组中。某些运载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌运载体、游离型哺乳动物运载体)。其他运载体(例如，非游离型哺乳动物运载体)在被引入宿主细胞时可以被整合到宿主细胞的基因组中，并且从而与宿主基因组一起被复制。此外，某些运载体能够指导基因的表达。这样的运载体在本文中被称为“重组表达运载体”(或简单地“表达运载体”)。在一些实施方案中，本文提供被可操作地连接至表达运载体中的一个或更多个调控序列(例如，启动子)的核酸。在一些实施方案中，细胞转录本文提供的核酸，并且从而表达本文所描述的抗体、所述抗体的抗原结合片段、或肽。核酸分子可以被整合到细胞的基因组中，或其可以在染色体外。

在一些实施方案中，本文提供的核酸运载体或重组腺病毒由表1中列出的来自至少两种不同病毒的两个或更多个表位组成。在一些实施方案中，本文提供的核酸运载体或重组腺病毒基本上编码表1中列出的表位。在一些实施方案中，除表1中列出的表位之外，本文提供的核酸运载体或重组腺病毒编码不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。

在一些实施方案中，除一个或更多个(例如，1、2、3、4或5个)保守序列修饰之外，T细胞表位的序列包括本文提供的表位序列。如本文所使用的，术语“保守序列修饰”旨在指不显著地影响或改变TCR与MHC上呈递的含有氨基酸序列的肽之间的相互作用的氨基酸修饰。这样的保守修饰包含氨基酸置换、添加(例如，向肽的N末端或C末端添加氨基酸)和缺失(例如，从肽的N末端或C末端缺失氨基酸)。保守氨基酸置换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸置换。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包含具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-支化侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本文所描述的肽的一个或更多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且可以使用本领域已知的方法测试改变的肽的TCR结合的保留。可以通过本领域已知的标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入抗体。

本文还提供嵌合蛋白或融合蛋白(例如，多表位蛋白)。如本文所使用的，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括连接至不同的肽(本文提供的一个或多个肽在自然界中不连接至所述不同的肽)的本文提供的一个或多个肽(例如，包括表1中列出的表位的肽)。例如，不同的肽可以通过肽键直接地融合至肽的N-末端或C-末端或通过化学连接体间接地融合至肽的N-末端或C-末端。在一些实施方案中，本文提供的肽被连接至包括其他T细胞表位的多肽。在一些实施方案中，本文提供的肽被连接至包括来自其他病毒和/或感染性疾病的表位的肽。在一些实施方案中，本文提供的多表位被连接至编码癌症相关性表位的肽。

可以通过标准重组DNA技术产生本文提供的嵌合肽或融合肽。例如，根据常规技术，例如通过采用平端末端或交错端末端以用于连接、限制酶消化以提供适当的末端、酌情补平粘性端、碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接、以及酶促连接，将编码不同肽序列的DNA片段在框内连接在一起。在另一个实施方案中，可以通过常规技术(包含自动DNA合成仪)合成融合基因。可替代地，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续基因片段之间产生互补突出端，其随后可以退火并且再扩增以生成嵌合基因序列(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.,eds.,JohnWiley&Sons:1992)。此外，许多表达运载体是商业可获得的，其已经编码融合部分。

在一些实施方案中，核酸运载体或重组腺病毒包括已经经历密码子优化的核酸序列。在这样的实施方案中，通过改变用于装配编码序列的每个核酸中的密码子来构建编码序列。通常，鉴别优化用于产生肽的密码子使用的核苷酸序列的方法至少包括下列步骤(a)至(e)。在步骤(a)中，提供编码多肽的部分的寡聚物，所述多肽在所述部分中含有经编码的氨基酸的密码子的简并形式，其中寡聚物延伸以提供具有重叠序列的旁侧编码序列。在步骤(b)中，寡聚物被处理，以实现肽的编码序列的组装。重新组装的肽被包含在表达***中，所述表达***与控制序列可操作地连接以实现其表达。在步骤(c)中，表达***被转染到相容性宿主细胞的培养物中。在步骤(d)中，测试从经转化的宿主细胞获得的菌落的多肽的产生水平。在步骤(e)中，从表达***获得至少一个具有最高的或令人满意的多肽产生的菌落。确定编码蛋白质的表达***部分的序列。密码子优化的进一步描述在美国专利公布号US2010/035768中提供，其通过引用被整体并入。

在一些实施方案中，本文提供的核酸运载体、重组腺病毒或多表位是疫苗的一部分。在一些实施方案中，疫苗在运载体中递送至受试者，所述运载体包含(但不限于)细菌运载体和/或病毒运载体。细菌运载体的实例包含(但不限于)牛分支杆菌(BCG)、鼠伤寒沙门菌亚种、伤寒沙门菌亚种、梭菌属孢子、大肠杆菌Nissle 1917、大肠杆菌K-12/LLO、产单核细胞李斯特菌、以及弗氏志贺菌。病毒运载体的实例包含(但不限于)牛痘、腺病毒、RNA病毒(复制子)、以及复制缺陷型如禽痘、鸟痘、金丝雀痘、MVA和腺病毒。

在一些实施方案中，本文提供含有本文所描述的核酸运载体或重组腺病毒的细胞。细胞可以是，例如，原核的、真核的、哺乳动物的、禽的、鼠科的和/或人的。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞可以是HEK 293细胞。在一些实施方案中，细胞是APC(例如，抗原呈递T细胞、树突状细胞、B细胞或aK562细胞)。在本发明的方法中，本文所描述的核酸运载体或重组腺病毒可以例如以核酸无需递送运载体(vehicle)被施用至细胞、与递送试剂组合被施用至细胞。在一些实施方案中，本领域已知的任何核酸递送方法可以被用于本文所描述的方法中。合适的递送试剂包含(但不限于)例如，MirusTransit TKO亲脂性试剂；转化脂(lipofectin)；阳离子脂质体(lipofectamine)；细胞转染剂(cellfectin)；聚阳离子(例如，聚赖氨酸)、缺端胶原、纳米颗粒***(nanoplexe)和脂质体。在本文所描述的方法的一些实施方案中，脂质体被用于将核酸递送至细胞或受试者。适合于在本文所描述的方法中使用的脂质体可以由标准囊泡形成脂类形成，所述标准囊泡形成脂类通常包含中性的或带负电的磷脂和甾醇(如胆甾醇)。通常由考虑因素(如期望的脂质体尺寸和脂质体在血流中的半衰期)来指导脂类的选择。已知用于制备脂质体的各种各样的方法，例如，如Szoka et al.(1980),Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467；和美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所描述的，其全部公开内容通过引用被并入本文。

细胞

在一些方面，本文提供APC，所述APC在MHC上呈递两个或更多个T细胞表位(例如，表1中列出的T细胞表位中的两个或更多个)，其中两个或更多个T细胞表位包括来自至少两种不同的病毒(例如，EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、多瘤BK病毒(BKV)和/或腺病毒(ADV))的T细胞表位。在其表面上表达呈递一种或更多种包括本文所描述的CMV表位的肽的MHC。在一些实施方案中，MHC是I类MHC。在一些实施方案中，MHC是II类MHC。在一些实施方案中，I类MHC具有α链多肽，所述α链多肽是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-g、HLA-K或HLA-L。在一些实施方案中，II类MHC具有α链多肽，所述α链多肽是HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA、HLA-DQA或HLA-DRA。在一些实施方案中，II类MHC具有β链多肽，所述β链多肽是HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB、HLA-DQB或HLA-DRB。在一些实施方案中，APC呈递至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38种T细胞表位(例如，表1中列出的表位中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38种)。

在一些实施方案中，APC是B细胞、抗原呈递T细胞、树突状细胞、或人工抗原呈递细胞(例如，aK562细胞)。可以通过从患者样品中取出PBMC并且将其粘附至塑料来制备用于在过程中使用的树突状细胞。通常，单核细胞群体粘着，并且全部其他细胞可以被清洗掉。然后用IL-4和GM-CSF分化粘附的群体以产生单核细胞来源的树突状细胞。这些细胞可以通过添加IL-1β、IL-6、PGE-1和TNF-α(其上调树突状细胞的表面上的重要的共刺激分子)来成熟化，并且然后与本文所描述的重组腺病毒接触。

在一些实施方案中，APC是人工抗原呈递细胞(如aK562细胞)。在一些实施方案中，将人工抗原呈递细胞工程化以表达CD80、CD83、41BB-L和/或CD86。示例性人工抗原呈递细胞(包含aK562细胞)描述于美国专利公布号2003/0147869中，其特此通过引用被并入。

在某些方面，本文提供生成呈递本文所描述的T细胞表位中的两个或更多个的APC的方法，所述方法包括使APC与编码本文所描述T细胞表位的核酸运载体和/或重组腺病毒接触，和/或使APC与由本文所描述的核酸运载体或重组腺病毒产生的多表位接触。在一些实施方案中，APC被照射。

在一些方面，本文提供生成T细胞(例如，CTL)、激活T细胞(例如，CTL)和/或诱导T细胞(例如，CTL)的增殖的方法，所述T细胞(例如，CTL)识别来自至少两种不同病毒的两个或更多个T细胞表位。在一些实施方案中，将CTL在培养基中与本文提供的APC(例如，呈递包括T细胞表位的肽的APC)孵育。在一些实施方案中，将含有T细胞的样品与本文提供的APC孵育2次或更多次。在一些实施方案中，在存在至少一种细胞因子的情况下将T细胞与APC孵育。在一些实施方案中，细胞因子是IL-4、IL-7和/或IL-15。例如，美国专利公布号2015/0017723(其特此通过引用被并入)中提供用于使用APC诱导T细胞增殖的示例性方法。

在一些方面，本文提供CTL的群体，所述CTL的群体共同包括识别两个或更多个T细胞表位(例如，表1中列出的T细胞表位中的两个或更多个)的T细胞受体，其中两个或更多个T细胞表位包括来自至少两种不同病毒(例如，EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、多瘤BK病毒(BKV)和/或腺病毒(ADV))的T细胞表位。在一些实施方案中，表位是HLA I类-限制性T细胞表位。在一些实施方案中，CTL的群体共同包括识别来自EBV的T细胞表位(例如，LMP2a表位、EBNA3A表位、EBNA3B表位、EBNA1表位、BZLF1表位、和/或BMLF1表位)的T细胞受体。在一些实施方案中，CTL的群体共同包括识别来自CMV的T细胞表位(例如，pp50表位、pp65表位、IE-1表位、和/或pp150表位)的T细胞受体。在一些实施方案中，CTL的群体共同包括识别来自BKV的T细胞表位(例如，大T抗原表位和/或VP1表位)的T细胞受体。在一些实施方案中，CTL的群体共同包括识别来自ADV的T细胞表位(例如，六邻体蛋白表位、DNA聚合酶表位、和/或DNA结合蛋白表位)的T细胞受体。在一些实施方案中，CTL的群体共同包括识别来自至少三种或四种不同病毒(例如，EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、多瘤BK病毒(BKV)和腺病毒(ADV))的T细胞表位的T细胞受体。在一些实施方案中，CTL的群体共同包括识别来自上述病毒的任何组合和/或来自其他病毒的T细胞表位的T细胞受体。在一些实施方案中，CTL的群体共同包括T细胞受体，所述T细胞受体识别至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个T细胞表位(例如，表1中列出的表位中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个)。

在一些方面，本文提供组合物(例如，治疗组合物)，所述组合物包括本文所描述的核酸运载体、由本文所描述的核酸运载体产生的肽、本文提供的多病毒特异性CTL和/或APC(例如，包括本文所描述的核酸运载体)和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，通过向受试者施用有效量的组合物，将这样的组合物用于过继性免疫疗法中以促进受试者中的多病毒特异性免疫。在一些实施方案中，多病毒特异性CTL和/或APC对于受试不是自体的。在一些实施方案中，T细胞和/或APC对于受试是自体的。在一些实施方案中，在T细胞和/或APC被施用至受试者之前，其被储存在细胞库中。

药物组合物

在一些方面，本文提供组合物(例如，药物组合物)，所述组合物含有本文提供的核酸运载体、重组腺病毒、多表位蛋白、CTL和/或APC。在一些实施方案中，组合物包含本文提供的多种(例如，两种或更多种)药剂的组合。

在一些实施方案中，本文提供的药物组合物是疫苗组合物。在一些实施方案中，药物组合物还包括佐剂。如本文所使用的，术语“佐剂”大体上指影响患者或受试者中的免疫应答或生理应答的剂。例如，佐剂可以随时间增加抗原的存在或对于感兴趣的区域(像肿瘤)，帮助吸收抗原呈递细胞抗原，激活巨噬细胞和淋巴细胞，并且支持细胞因子的产生。通过改变免疫应答，佐剂可以容许较小剂量的免疫相互作用剂以增加特定剂量的免疫相互作用剂的有效性或安全性。例如，佐剂可以防止T细胞耗尽，并且因此增加特定免疫相互作用剂的有效性或安全性。佐剂的实例包含(但不限于)免疫调节蛋白、佐剂65、α-GalCer、磷酸铝、氢氧化铝、磷酸钙、β-葡聚糖肽、CpG DNA、GPI-0100、脂质A、脂多糖、利波夫(Lipovant)、Montanide、N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺、Pam3CSK4、quil A和海藻糖二霉菌酸酯。

治疗方法

在某些方面，本文提供在受试者中治疗或预防病毒感染(例如，EBV感染、CMV感染、BKV感染、或ADV感染)和/或癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本文提供的药物组合物。

在一些实施方案中，本文提供在受试者中或预防治疗病毒感染(例如，EBV感染、CMV感染、BKV感染、或ADV感染)的方法。在一些实施方案中，被治疗的受试者是免疫***受损的。例如，在一些实施方案中，受试者患有T细胞缺陷。在一些实施方案中，受试者患有白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，受试者感染有HIV和/或患有AIDS。在一些实施方案中，受试者已经经历组织、器官和/或骨髓移植。在一些实施方案中，受试者正在被施用免疫抑制药物。在一些实施方案中，受试者已经经历和/或正在经历化学疗法。在一些实施方案中，受试者已经经历和/或正在经历放射疗法。

在一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，本文所描述的方法可以被用于治疗任何癌性肿瘤或癌前期肿瘤。在一些实施方案中，癌症表达本文提供的T细胞表位(例如，表1中列出的T细胞表位)中的一种或更多种。在一些实施方案中，癌症包含实体肿瘤。可以通过本文提供的方法和组合物治疗的癌症包含，但不限于，来自膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、胃肠、牙龈、头部、肾脏、肝脏、肺、鼻咽、颈部、卵巢、***、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫的癌细胞。此外，癌症可能具体地是以下组织学类型，但不限于这些：恶性新生物；癌；未分化的癌；巨型梭形细胞癌；小细胞癌；***状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移形细胞癌；***状移形细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；肝细胞癌合并胆管癌；小梁状腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管肺泡腺癌；***状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞型癌；滤泡性腺癌；***状和滤泡性腺癌；非包裹性硬化型癌(nonencapsulating sclerosing carcinoma)；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；盯聍腺腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；***状囊腺癌；***状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺派杰氏病；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌伴鳞状上皮化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质肿瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞肿瘤；以及恶性成神经细胞瘤(malignant roblastoma)；塞托利细胞癌；恶性莱迪希细胞肿瘤；恶性脂质细胞肿瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩张性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性皮肤纤维瘤；粘液肉瘤；脂肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡性横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒混合肿瘤(mullerian mixedtumor)；肾母细胞瘤；肝胚细胞瘤；癌肉瘤；恶性间充质瘤；恶性卵巢纤维上皮瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性甲状腺肿样卵巢瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮细胞瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；***肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性成软骨细胞瘤；间充质型软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；成星形细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；成视网膜细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑脊膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞肿瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；类肉芽肿；小淋巴细胞恶性淋巴瘤；弥散性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿病；其他规定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴细胞白血病；血浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓细胞白血病；嗜碱细胞白血病；嗜酸细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓系肉瘤；和毛细胞白血病。

在一些实施方案中，受试者也被施用免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制概括地指抑制癌症细胞可以产生的检查点以预防或下调免疫应答。免疫检查点蛋白的实例包含(但不限于)CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG3、TIM-3或VISTA。免疫检查点抑制剂可以是与免疫检查点蛋白结合并且抑制免疫检查点蛋白的抗体或其抗原结合片段。免疫检查点抑制剂的实例包含(但不限于)纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)、AMP-224、AMP-514、STI-A1110、TSR-042、RG-7446、BMS-936559、MEDI-4736、MSB-0020718C、AUR-012和STI-A1010。

在一些实施方案中，预防性地施用本文提供的组合物(例如，本文提供的疫苗组合物)以预防癌症和/或病毒感染。在一些实施方案中，施用疫苗以抑制肿瘤细胞扩增。可以在患者中检测癌细胞或病毒感染的细胞之前或之后施用疫苗。肿瘤细胞扩增的抑制被理解为指防止、终止、减缓肿瘤细胞的生长或杀死肿瘤细胞。在一些实施方案中，在施用包括本文所描述的核酸载体、重组腺病毒、多表位、CTL或APC的疫苗之后，诱导促炎应答。促炎免疫应答包括产生促炎细胞因子和/或趋化因子(例如，干扰素γ(IFN-γ)和/或白细胞介素2(IL-2))。促炎细胞因子和趋化因子是本领域公知的。

实施例

材料和方法

多病毒腺病毒运载体(Ad-MvP)的构建。使用人通用密码子将作为来自CMV、EBV、ADV和BKV(表1)的多表位的32个邻接HLA I类限制性CD8⁺ T细胞表位的氨基酸序列翻译成核苷酸序列。将编码分别在5’和3’处具有Nhe I限制性位点和Kpn I限制性位点的多表位的核苷酸序列克隆到pShuttle表达运载体中。扩增后，将来自pShuttle的表达组件亚克隆到Ad5F35表达运载体中。将重组Ad5F35运载体转染到人胚肾HEK293细胞中，并且在HEK293细胞中产生重组腺病毒(称为Ad-MvP)原种(stock)(图1)。

多病毒特异性T细胞的体外扩增。通过菲可梯度(Ficoll gradient)从外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)，洗涤并且重悬于补充有10％FBS的RPMI-1640(生长培养基)中，或从冷冻原种中复苏，并且在用于T细胞测定之前在37℃静置至少1h。将细胞以2:1的响应者与刺激者比率分成响应细胞和刺激细胞。将刺激细胞用Ad-MvP以10:1的感染复数在37℃感染1小时。清洗掉未结合的病毒颗粒，并且在存在所示不同细胞因子(白细胞介素-2、IL-2-120IU/ml、IL-21-30ng/ml、IL-7-10ng/ml和/或IL-15-10ng/ml)的情况下将刺激细胞与响应细胞共培养。每3至4天用含有相应细胞因子的生长培养基补充培养基。使用细胞内细胞因子测定在第14天测试病毒特异性T细胞扩增。

通过细胞内细胞因子测定和流式细胞术表征多病毒特异性CTL。用1μg/ml肽(其对应于来源于CMV蛋白、EBV蛋白、BKV蛋白或ADV蛋白的限定的HLA I类限制性CD8⁺ T细胞表位)刺激PBMC或经培养的T细胞，并且在存在CD107a-抗体、布雷菲德菌素A(Brefeldin A)和莫能菌素(Monensin)的情况下孵育5h。在CD8和CD4的表面染色之后，固定细胞，并且用cytofix/cytoperm进行透化，并且对IFNγ、IL-2和TNF进行染色。将染色的细胞重悬于含有2％多聚甲醛的PBS中，并且用FACSDiva软件(BD Biosciences)使用FACSCanto II或LSRFortessa获得。使用FlowJo软件(TreeStar)进行获得后分析。

HLA转基因小鼠中的Ad-MvP免疫。全部动物免疫方案均遵照QIMR Berghofer医学研究所动物伦理委员会(Medical Research Institute Animal Ethics Committee)进行。HLA-A*02转基因小鼠(HHD II)被供养在QIMR Berghofer的无病原体动物设施中。将三组(安慰剂注射、初免、初免-加强)6至8周龄雌性小鼠肌内注射50μl PBS或50μl Ad-MvP(1×10⁹pfu/mL)。在第21天向初免-加强组给予加强剂量。在第50天处死小鼠，用BKV、ADV、CMV或EBV特异性HLA-A*02限制性肽库体外刺激来自全部组的脾细胞。将脾细胞在24孔板中在37℃、10％CO₂下培养10天。在第3天和第6天，用含有重组IL-2的生长培养基补充培养物。使用细胞内细胞因子染色测定评估T细胞特异性。

EBV淋巴瘤模型中多病毒特异性T细胞的过继性转移。用单剂量的230cGy照射的两组成年(6-10周龄)NOD/SCID小鼠被每个小鼠皮下植入10⁷个EBV转化的淋巴母细胞样细胞(LCL)。使用游标卡尺每2-3天监控肿瘤生长。LCL的植入之后6天，小鼠被空白对照处理或输注2×10⁷个Ad-MvP扩增的T细胞。这些体外扩增的T细胞包含EBV特异性T细胞、CMV特异性T细胞、ADV特异性T细胞和BKV特异性T细胞。在过继性T细胞疗法之后监控肿瘤负荷，并且当肿瘤体积达到1000m³时处死小鼠。

统计分析。通过线性混合效应模型评价用Ad-MvP扩增的自体或同种异体抗原特异性T细胞处理的小鼠与空白对照处理的小鼠之间的组差异，其中时间、组和时间与组的相互作用作为预测因子。

实施例1：用示例性核酸运载体(Ad-MvP)的单次刺激足以扩增来自移植受者的多功能多病毒特异性T细胞

为了探索Ad-MvP抗原呈递***(图1)对于移植受者的潜在应用，招募了具有正在进行的或先前的复发性病毒再激活/疾病史(CMV、EBV或BKV)的SOT受者的群组。SOT患者的临床特征可以在表2中找到。

表2：SOT受者的临床特征

缩写：tx-移植、R-受者、D-供者、Gan-更昔洛韦(ganciclovir)、Val-缬更昔洛韦(valganciclovir)、FK-他克莫司(tacrolimus)、P-***(prednisone)、CsA-环孢菌素A(cyclosporin A)、MMF-霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、E-依维莫司(everolimus)、Lef-来氟米特(leflunomide)、AZA-硫唑嘌呤(azathioprine)、B-巴利昔单抗(basiliximab)；PTLD-移植后淋巴组织增生性紊乱、BKVAN-BK相关性肾病

用Ad-MvP刺激来自这些SOT受者的外周血单核细胞(PMBC)。Ad-MvP的构建的示意图可以在图1中找到。编码含有来自BKV、ADV、CMV和EBV的邻接的32个HLA I类限制性CTL表位的多表位蛋白的合成DNA序列被克隆到pShuttle运载体中，并且然后亚克隆到Ad5F35表达运载体中。通过转染HEK 293细胞将重组Ad5F35运载体包装入感染性腺病毒中，并且通过反复冻融循环从经转染的细胞中收获重组腺病毒(称为Ad-MvP)。

用Ad-MvP以10:1的感染复数(MOI)刺激来自这些SOT受者的外周血单核细胞(PMBC)，并且然后培养14天。图2A中呈现的来自两个不同移植受者的代表性数据显示出，用Ad-MvP的单次刺激足以诱导对于ADV表位、BKV表位、CMV表位和EBV表位特异性的T细胞的快速扩增。从SOT33扩增的T细胞显示出对于CMV和EBV的强烈反应性，而从SOT15扩增的T细胞显示出对于CMV的强烈反应性，但也显示出对EBV、BKV和ADV的强烈反应性。图2B中呈现了来自14个SOT受者的Ad-MvP刺激后T细胞扩增的综合总结。这些分析显示出，分别在86％、71％、86％和29％的SOT患者中观察到CMV特异性T细胞扩增、BKV特异性T细胞扩增、EBV特异性T细胞扩增和ADV特异性T细胞扩增(图2B)。更重要的是，这些体外扩增的T细胞中的大多数显示出多功能图谱(图2C)。综合起来，这些研究表明，Ad-MvP在扩增来自移植受者的多病毒特异性T细胞方面非常有效，并且这种扩增不受潜在的免疫抑制或正在进行的病毒再激活/疾病的影响。

实施例2：用Ad-MvP体内初免多病毒特异性T细胞

除了Ad-MvP作为用于预先存在的记忆/效应T细胞的体外扩增的工具的潜在应用之外，还使用人源化小鼠模型来探索此运载体在血清反应阴性移植受者/供者中用于体内初免多病毒特异性T细胞的效用。用Ad-MvP(0.5×10⁸pfu/小鼠)免疫表达HLA A*0201等位基因的人源化转基因小鼠(称为HHD II小鼠)，并且然后在第21天用相同剂量加强一个组。在免疫后第50天，评估这些小鼠的抗原特异性T细胞响应。虽然离体分析揭示了对于EBV表位的强烈T细胞响应和对于来自CMV、BKV和ADV的表位的低的或不可检测的响应，但在用BKV特异性HLA-A*0201限制性肽库、ADV特异性HLA-A*0201限制性肽库、CMV特异性HLA-A*0201限制性肽库或EBV特异性HLA-A*0201限制性肽库体外刺激后观察到抗原特异性T细胞增加6-240倍(图3A)。图3B中示出在单独的Ad-MvP初免和初免-加强免疫后，HHD II小鼠中多种HLA-A2限制性T细胞响应的综合总结。此分析还显示出，虽然在单独的初免和初免-加强设置两者中，EBV特异性T细胞响应是离体分析的主要组分，但在体外刺激后观察到抗原特异性T细胞的组成的显著变化。综合起来，这些实验清楚地证明，Ad-MvP运载体在体内诱导多病毒特异性T细胞方面是高效的。

实施例3：用Ad-MvP扩增来自健康供者的多病毒特异性T细胞用于第三方T细胞库

虽然自体T细胞疗法已经成功用于治疗许多SOT受者，但由于严重的淋巴细胞减少或移植有关的临床并发症，许多患者不适合此疗法。最近，第三方HLA匹配的病毒特异性T细胞疗法已经成为自体细胞疗法的极好的替代。为了评估AD-MvP作为用于制造T细胞库的潜在工具，用Ad-MvP感染的自体PBMC以10:1的MOI刺激来自一组健康志愿者的PBMC，并且然后培养14天。图4A中呈现了来自20个健康供者的Ad-MvP刺激后T细胞扩增的综合总结。这些分析显示出，在全部健康供者样品中，检测到对于至少三种不同病毒特异性的T细胞。对于CMV、EBV、BKV和ADV特异性的CD8⁺IFNγ⁺ T细胞的平均扩增分别为33.83％、15.91％、1.70％和1.12％。这些体外扩增的效应细胞的多功能图谱显示出，如通过CD107a动员所评估的，60-80％的EBV特异性T细胞、CMV特异性T细胞、BKV特异性T细胞和ADV特异性T细胞显示具有强烈细胞毒性潜力的IFNγ、TNF和/或IL-2的同时表达(图4B)。

为了进一步改善多病毒特异性T细胞的最佳产量所需的培养条件，与仅用IL-2的标准补充相比，在存在不同细胞因子组合的情况下评估T细胞扩增潜力。用Ad-MvP刺激来自健康供者的PBMC，并且在存在IL-2、IL-21、IL-7和/或IL-15/IL-7的组合的情况下下扩增。虽然当在存在IL-2与IL-21和IL-15的组合的情况下培养细胞时，整体T细胞扩增和多功能图谱被轻微改进，但当与仅在IL-2中的T细胞扩增相比时，没有统计学上显著的差异(图4C和图4D)。

实施例4：用Ad-MvP扩增的T细胞的自体和同种异体过继性免疫疗法

已经建立了Ad-MvP运载体的体外免疫原性和体内免疫原性，设计下一组实验以评估Ad-MvP运载体在EBV相关性淋巴瘤的人源化小鼠模型中的潜在治疗应用。一组免疫缺陷的NOD/SCID小鼠被植入EBV转化的LCL(供者代码：D01；HLA A1、HLA A11、HLA B8和HLAB35)。使用Ad-MvP扩增来自D01的自体T细胞，其包含对于三种EBV表位(HLA B8和HLA B35限制性)以及CMV和ADV特异性的CD8⁺ T细胞(图5A)。在EBV淋巴瘤诱导之后第6天，用单次注射的自体Ad-MvP扩增的T细胞过继性处理小鼠。图5B和图5C中呈现的数据显示出，在过继免疫疗法之后，与空白对照处理的小鼠相比，在用Ad-MvP扩增的自体T细胞处理的小鼠中观察到淋巴瘤长出的显著延迟(p＝0.033)。考虑到同种异体抗原特异性T细胞疗法的更广泛适用性，评估了来自HLA匹配的供者(供者代码：D055；HLA A1、HLA A2、HLA B8和HLA B40)的Ad-MvP扩增的T细胞的治疗功效。来自D055的扩增的T细胞包含对于CMV、ADV和通过HLA B8和HLA A2限制的四个EBV表位特异性的T细胞。对于HLA B8限制性表位(FLR和RAK)特异性的T细胞与NOD/SCID小鼠中的EBV淋巴瘤匹配(图5D；p＝0.0065)。用同种异体多病毒特异性T细胞处理的患有肿瘤的小鼠也显示出显著延迟的肿瘤生长(图5E和图5F)。

Claims

1.一种编码表1中列出的T细胞表位中的两个或更多个的核酸运载体，其中所述两个或更多个T细胞表位包括来自至少两种不同病毒的T细胞表位。

2.如权利要求1所述的运载体，其中所述运载体是腺病毒表达运载体。

3.如权利要求1或2所述的运载体，其中所述两个或更多个T细胞表位是HLA I类限制性T细胞表位。

4.如权利要求1至3中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码表1中列出的T细胞表位中的至少三个。

5.如权利要求1至3中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码表1中列出的T细胞表位中的至少五个。

6.如权利要求1至3中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码表1中列出的T细胞表位中的至少十个。

7.如权利要求1至3中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码表1中列出的T细胞表位中的至少十五个。

8.如权利要求1至3中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码表1中列出的T细胞表位中的至少二十个。

9.如权利要求1至3中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码表1中列出的T细胞表位中的至少二十五个。

10.如权利要求1至3中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码表1中列出的T细胞表位中的至少三十个。

11.如权利要求1至10中任一项所述的运载体，其中所述T细胞表位包括来自至少三种不同病毒的T细胞表位。

12.如权利要求1至10中任一项所述的运载体，其中所述T细胞表位包括来自至少四种不同病毒的T细胞表位。

13.如权利要求1至12中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码来自EB病毒(EBV)的T细胞表位。

14.如权利要求13所述的运载体，其中所述来自EBV的T细胞表位是LMP2a表位。

15.如权利要求13所述的运载体，其中所述来自EBV的T细胞表位是EBNA3A表位。

16.如权利要求13所述的运载体，其中所述来自EBV的T细胞表位是EBNA3B表位。

17.如权利要求13所述的运载体，其中所述来自EBV的T细胞表位是BMLF1表位。

18.如权利要求13所述的运载体，其中所述来自EBV的T细胞表位是EBNA1表位。

19.如权利要求13所述的运载体，其中所述来自EBV的T细胞表位是BZLF1表位。

20.如权利要求1至19中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码来自巨细胞病毒(CMV)的T细胞表位。

21.如权利要求20所述的运载体，其中所述来自CMV的T细胞表位是pp50表位。

22.如权利要求20所述的运载体，其中所述来自CMV的T细胞表位是pp65表位。

23.如权利要求20所述的运载体，其中所述来自CMV的T细胞表位是IE-1表位。

24.如权利要求20所述的运载体，其中所述来自CMV的T细胞表位是pp150表位。

25.如权利要求1至24中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码来自多瘤BK病毒(BKV)的T细胞表位。

26.如权利要求25所述的运载体，其中所述来自BKV的T细胞表位是大T抗原表位。

27.如权利要求25所述的运载体，其中所述来自BKV的T细胞表位是VP1表位。

28.如权利要求1至27中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码来自腺病毒(ADV)的T细胞表位。

29.如权利要求28所述的运载体，其中所述来自ADV的T细胞表位是六邻体蛋白表位。

30.如权利要求28所述的运载体，其中所述来自ADV的T细胞表位是DNA聚合酶表位。

31.如权利要求28所述的运载体，其中所述来自ADV的T细胞表位是DNA结合蛋白表位。

32.如权利要求1至31中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码来自EBV和CMV的T细胞表位。

33.如权利要求1至31中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码来自EBV和BKV的T细胞表位。

34.如权利要求1至31中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码来自EBV和ADV的T细胞表位。

35.如权利要求1至31中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码来自CMV和ADV的T细胞表位。

36.如权利要求1至31中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码来自CMV和BKV的T细胞表位。

37.如权利要求1至31中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码来自BKV和ADV的T细胞表位。

38.如权利要求1至31中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码来自EBV、CMV和BKV的T细胞表位。

39.如权利要求1至31中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码来自EBV、CMV和ADV的T细胞表位。

40.如权利要求1至31中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码来自CMV、BKV和ADV的T细胞表位。

41.如权利要求1至31中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码来自ADV、BKV和EBV的T细胞表位。

42.如权利要求1至31中任一项所述的运载体，其中所述运载体编码来自EBV、CMV、BKV和ADV的T细胞表位。

43.如权利要求42所述的运载体，其中所述运载体编码表1中列出的38个T细胞表位。

44.如权利要求1至43中任一项所述的运载体，其中由所述运载体编码的所述T细胞表位被编码为多表位蛋白。

45.如权利要求44所述的运载体，其中所述多表位蛋白包括与SEQ ID NO:1至少80％一致的序列。

46.如权利要求44所述的运载体，其中所述多表位蛋白包括与SEQ ID NO:1至少90％一致的序列。

47.如权利要求44所述的运载体，其中所述多表位蛋白包括SEQ ID NO:1的序列。

48.如权利要求1至47中任一项所述的运载体，其中编码所述T细胞表位的序列是密码子优化的。

49.一种生成重组腺病毒的方法，所述方法包括：

(a)将权利要求1至48中任一项所述的核酸运载体转染到细胞系中；

(b)在条件下培养经转染的细胞系，使得所述细胞系产生重组腺病毒；以及

(c)分离所述重组腺病毒。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述细胞系是HEK293细胞系。

51.根据权利要求49或50所述的方法生成的重组腺病毒。

52.一种包括权利要求1至48中任一项所述的运载体的细胞。

53.如权利要求52所述的细胞，其中所述细胞是HEK293细胞。

54.一种包括权利要求1至48中任一项所述的运载体的疫苗组合物。

55.一种在受试者中治疗或预防病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求54所述的疫苗组合物。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述病毒感染是EBV感染、CMV感染、BKV感染或ADV感染。

57.一种在受试者中治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求54所述的疫苗组合物。

58.一种多表位蛋白，所述多表位蛋白包括与SEQ ID NO:1至少80％一致的序列。

59.一种多表位蛋白，所述多表位蛋白包括与SEQ ID NO:1至少90％一致的序列。

60.一种多表位蛋白，所述多表位蛋白包括与SEQ ID NO:1一致的序列。

61.一种包括权利要求58至60中任一项所述的多表位蛋白的组合物。

62.一种重组腺病毒，所述重组腺病毒包括编码表1中列出的T细胞表位中的两个或更多个的核酸，其中所述两个或更多个T细胞表位包括来自至少两种不同病毒的T细胞表位。

63.如权利要求62所述的重组腺病毒，其中所述两个或更多个T细胞表位是HLA I类限制性T细胞表位。

64.如权利要求62或63所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码表1中列出的T细胞表位中的至少三个。

65.如权利要求62或63所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码表1中列出的T细胞表位中的至少五个。

66.如权利要求62或63所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码表1中列出的T细胞表位中的至少十个。

67.如权利要求62或63所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码表1中列出的T细胞表位中的至少十五个。

68.如权利要求62或63所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码表1中列出的T细胞表位中的至少二十个。

69.如权利要求62或63所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码表1中列出的T细胞表位中的至少二十五个。

70.如权利要求62或63所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码表1中列出的T细胞表位中的至少三十个。

71.如权利要求62至70中任一项所述的重组腺病毒，其中所述T细胞表位包括来自至少三种不同病毒的T细胞表位。

72.如权利要求62至70中任一项所述的重组腺病毒，其中所述T细胞表位包括来自至少四种不同病毒的T细胞表位。

73.如权利要求62至72中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码来自EB病毒(EBV)的T细胞表位。

74.如权利要求73所述的重组腺病毒，其中所述来自EBV的T细胞表位是LMP2a表位。

75.如权利要求73所述的重组腺病毒，其中所述来自EBV的T细胞表位是EBNA3A表位。

76.如权利要求73所述的重组腺病毒，其中所述来自EBV的T细胞表位是EBNA3B表位。

77.如权利要求73所述的重组腺病毒，其中所述来自EBV的T细胞表位是BMLF1表位。

78.如权利要求73所述的重组腺病毒，其中所述来自EBV的T细胞表位是EBNA1表位。

79.如权利要求73所述的重组腺病毒，其中所述来自EBV的T细胞表位是BZLF1表位。

80.如权利要求62至79中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码来自巨细胞病毒(CMV)的T细胞表位。

81.如权利要求80所述的重组腺病毒，其中所述来自CMV的T细胞表位是pp50表位。

82.如权利要求80所述的重组腺病毒，其中所述来自CMV的T细胞表位是pp65表位。

83.如权利要求80所述的重组腺病毒，其中所述来自CMV的T细胞表位是IE-1表位。

84.如权利要求80所述的重组腺病毒，其中所述来自CMV的T细胞表位是pp150表位。

85.如权利要求62至84中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码来自多瘤BK病毒(BKV)的T细胞表位。

86.如权利要求25所述的重组腺病毒，其中所述来自BKV的T细胞表位是大T抗原表位。

87.如权利要求85所述的腺病毒重组腺病毒，其中所述来自BKV的T细胞表位是VP1表位。

88.如权利要求62至87中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码来自腺病毒(ADV)的T细胞表位。

89.如权利要求88所述的重组腺病毒，其中所述来自ADV的T细胞表位是六邻体蛋白表位。

90.如权利要求88所述的重组腺病毒，其中所述来自ADV的T细胞表位是DNA聚合酶表位。

91.如权利要求88所述的重组腺病毒，其中所述来自ADV的T细胞表位是DNA结合蛋白表位。

92.如权利要求62至91中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码来自EBV和CMV的T细胞表位。

93.如权利要求62至91中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码来自EBV和BKV的T细胞表位。

94.如权利要求62至91中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码来自EBV和ADV的T细胞表位。

95.如权利要求62至91中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码来自CMV和ADV的T细胞表位。

96.如权利要求62至91中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码来自CMV和BKV的T细胞表位。

97.如权利要求62至91中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码来自BKV和ADV的T细胞表位。

98.如权利要求62至91中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码来自EBV、CMV和BKV的T细胞表位。

99.如权利要求62至91中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码来自EBV、CMV和ADV的T细胞表位。

100.如权利要求62至91中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码来自CMV、BKV和ADV的T细胞表位。

101.如权利要求62至91中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码来自ADV、BKV和EBV的T细胞表位。

102.如权利要求62至91中任一项所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码来自EBV、CMV、BKV和ADV的T细胞表位。

103.如权利要求102所述的重组腺病毒，其中所述核酸编码表1中列出的38个T细胞表位。

104.如权利要求62至104中任一项所述的重组腺病毒，其中由所述核酸编码的所述T细胞表位被编码为多表位蛋白。

105.如权利要求104所述的重组腺病毒，其中所述多表位蛋白包括与SEQ ID NO:1至少80％一致的序列。

106.如权利要求104所述的重组腺病毒，其中所述多表位蛋白包括与SEQ ID NO:1至少90％一致的序列。

107.如权利要求104所述的重组腺病毒，其中所述多表位蛋白包括SEQ ID NO:1的序列。

108.如权利要求62至107中任一项所述的重组腺病毒，其中编码所述T细胞表位的所述核酸是密码子优化的。

109.一种生成呈递来自多种病毒的表位的抗原呈递细胞(APC)的方法，所述方法包括用权利要求1至48中任一项所述的运载体转染包括APC的样品。

110.一种生成呈递来自多种病毒的表位的抗原呈递细胞(APC)的方法，所述方法包括使包括APC的样品与权利要求62至108中任一项所述的重组腺病毒接触。

111.一种生成呈递来自多种病毒的表位的抗原呈递细胞(APC)的方法，所述方法包括用权利要求58至60中任一项所述的多表位向包括APC的样品施以脉冲。

112.如权利要求109至111中任一项所述的方法，其中所述样品是PBMC样品。

113.如权利要求109至112中任一项所述的方法，其中所述APC包括B细胞。

114.如权利要求109至113中任一项所述的方法，其中所述APC包括抗原呈递T细胞。

115.如权利要求109至114中任一项所述的方法，其中所述APC包括树突状细胞。

116.如权利要求109至115中任一项所述的方法，其中所述APC包括人工抗原呈递细胞。

117.如权利要求116所述的方法，其中所述人工抗原呈递细胞是aK562细胞。

118.一种包括根据权利要求109至117中任一项所述的方法生成的APC的样品。

119.一种生成多病毒特异性的细胞毒性T细胞(CTL)的方法，所述方法包括

(a)根据权利要求109至117中任一项所述的方法生成呈递来自多种病毒的表位的APC；以及

(b)将呈递步骤(a)的多种病毒的所述APC与CTL孵育，从而生成多病毒特异性的CTL。

120.一种包括根据权利要求119生成的多病毒特异性的CTL的样品。

121.一种组合物，所述组合物包括权利要求1至48所述的核酸运载体、以及药学上可接受的载体。

122.一种组合物，所述组合物包括权利要求62至108所述的重组腺病毒、以及药学上可接受的载体。

123.一种组合物，所述组合物包括权利要求120所述的CTL、以及药学上可接受的载体。

124.一种在受试者中治疗或预防病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求123所述的组合物。

125.如权利要求124所述的方法，其中所述病毒感染是EBV感染、CMV感染、BKV感染或ADV感染。

126.如权利要求124或125所述的方法，其中所述受试者是免疫***受损的。

127.如权利要求124至126中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CTL对于所述受试者是同种异体的。

128.如权利要求127所述的方法，其中在向所述受试者施用之前，所述组合物中的所述CTL被储存在细胞库中。

129.如权利要求124或125所述的方法，其中所述组合物中的所述CTL对于所述受试者是自体的。

130.一种在受试者中治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求123所述的组合物。

131.如权利要求130所述的方法，其中所述组合物中的所述CTL对于所述受试者是同种异体的。

132.如权利要求131所述的方法，其中在向所述受试者施用之前，所述组合物中的所述CTL被储存在细胞库中。

133.如权利要求130所述的方法，其中所述组合物中的所述CTL对于所述受试者是自体的。

134.一种由权利要求1至47中任一项所述的运载体编码的多表位蛋白，其中所述蛋白包括表1中列出的两个或更多个T细胞表位。

135.一种多表位蛋白，所述多表位蛋白包括表1中列出的T细胞表位中的两个或更多个。

136.一种在受试者中治疗或预防病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求58-60、134或135中任一项所述的蛋白。

137.一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求58-60、134或135中任一项所述的蛋白质。