CN110229849B - 时空调控型uPA基因表达非病毒载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体，所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体包括时空调控uPA基因表达盒，所述时空调控uPA基因表达盒包括：肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域，所述uPA突变基因为***了内质网滞留信号基因的uPA基因。所述的时空调控型uPA基因表达非病毒载体的调控***更严密、更简单；能够控制uPA基因在特定时间特定空间进行表达，使其他器官免受毒性的风险。

Description

时空调控型uPA基因表达非病毒载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体及其制备方法和应用。
背景技术
乙肝病毒(HBV)感染具有严格的种属特异性，只感染人、大猩猩和树鼩等少数灵长类动物肝脏。常用的实验动物模型如小鼠、大鼠等均不感染HBV。由于缺乏稳定可靠的HBV感染动物模型，制约了HBV感染/致病机制及抗病毒策略的研究。建立人源化嵌合体肝脏小鼠模型是克服这一瓶颈的有效途径。肝脏具有很强的再生潜能。人源化嵌合体肝脏模型的基本原理是：通过在宿主肝脏中表达肝毒性基因，人为诱导宿主肝细胞死亡，刺激移植的人源肝细胞增殖，实现人源肝细胞的替代，从而形成人源化的嵌合体肝脏。实际上，人源化嵌合体肝脏的关键核心就在于设计合适的肝毒性基因表达载体。根据肝毒性基因的不同，目前国际上主要发展了3种人-小鼠嵌合体肝脏模型。第一种为Alb(albumin，白蛋白)-uPA(urokinase plasminogen activator，尿激酶型纤溶酶原激活物)-SCID(severe combinedimmune deficiency,重症联合免疫缺陷)转基因小鼠，简称uPA转基因小鼠。第二种是FRG小鼠，即Fah(fumaryl acetoacetate hydrolase，富马酰乙酰乙酸水解酶)/Rag2/Il2rg三基因敲除鼠。第三种是AFC8小鼠，即FKBP(FK506 binding domain,FK506结合域)-Caspase 8(半胱天冬酶-8)融合蛋白转基因小鼠。三者中，uPA转基因小鼠具有其余二者难以企及的高水平人源肝细胞替代率(达90％以上)。
uPA，即尿激酶型纤溶酶原激活剂，属于丝氨酸蛋白水解酶家族，uPA催化纤溶酶原转化为纤溶酶，启动纤维蛋白和细胞外基质蛋白溶解级联反应。一般来说，uPA主要在生理、病理条件下参与细胞的分化、迁移、组织重建、细胞外基质降解、肿瘤浸润及转移等过程。现有uPA转基因小鼠的构建中，由于没有控制的过表达uPA可引起严重的出血及器官损伤，造成新生小鼠死亡率高、繁殖困难。uPA既能引起肝细胞死亡，又能促进肝再生，在其毒副作用能有效控制的前提下，uPA基因仍然被认为是最理想的用于构建嵌合体肝脏模型的肝毒性基因。
目前，针对uPA基因调控表达***的改进方法是基于AAV病毒载体的Tet-on四环素开关调控的uPA表达***。Tet-on-uPA包括两部分：组成型表达或肝特异性表达的rtTA(reverse tetracycline-controlled trans-activator，四环素控制的反式转录活化因子)和在四环素应答元件(tetracycline-response element，TRE)控制下的uPA表达载体(TRE-uPA)。Tet-on-uPA通过四环素可以有效控制uPA在特点时间的表达，优于最初的Alb-uPA。
Tet-on调控***由两部分组成，比较复杂。因此，用于构建Tet转基因动物时首先需构建rtTA和TRE-uPA两个转基因动物品系，再杂交，无法一步到位，整个过程十分复杂并且非常耗时耗力。此外，uPA表达尽管在时间上受四环素调控，但uPA是分泌蛋白，它在肝细胞中表达后分泌至胞外，然后进入循环***，进而转运至全身其它脏器，其空间分布仍不受控制，仍有引起其它器官毒性的风险。同时，现有技术中Tet-on-uPA使用的AAV病毒载体，制备复杂、使用不便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体，旨在解决现有技术中uPA基因的表达***无法同时调控其诱导时间和空间的问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体，所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体包括时空调控uPA基因表达盒，所述时空调控uPA基因表达盒包括：肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域，所述uPA突变基因为***了内质网滞留信号基因的uPA基因；
以及，一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体的制备方法，包括如下步骤：
合成肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域的DNA片段；
将上述DNA片段***载体的多克隆位点，得到所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体，所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体包括时空调控uPA基因表达盒，所述时空调控uPA基因表达盒包括：肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域；其中，所述uPA突变基因为***了内质网滞留信号基因的uPA基因。
以及，一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体在制备人源化嵌合体肝脏模型中的应用。
与现有技术相比，本发明所述的一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体，所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体包括时空调控uPA基因表达盒，所述时空调控uPA基因表达盒包括：肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域。所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体中，含有肝特异性启动子，使得uPA基因表达时能够控制下游基因在肝细胞中进行特异性表达；***了uPA突变基因，且所述uPA突变基因为***了内质网滞留信号基因的uPA基因，从而能够严格控制uPA基因的分布，调控其分布的位置仅限于肝细胞内，使uPA突变基因的分布空间位置得到了严密调控；还***了一个不稳定结构域，当不添加甲氧苄啶或甲氧苄啶衍生物时，所述不稳定结构域与uPA突变基因的融合蛋白不稳定，在肝细胞内能够迅速被降解；当利用甲氧苄啶或甲氧苄啶衍生物对本发明所述时空调控uPA基因表达盒进行诱导表达，可以使不稳定结构域与uPA突变基因的融合蛋白稳定，并积累在肝细胞内，使uPA基因能够被稳定调控，通过控制添加诱导剂甲氧苄啶或甲氧苄啶衍生物的时间，控制不稳定结构域与uPA突变基因的融合蛋白稳定表达的时间，使其在特定时间内被诱导表达，且表达后uPA突变体蛋白严格限制在肝细胞中，不会分泌至胞外，更不会进入循环***而影响全身其它脏器，所述的时空调控型uPA基因表达非病毒载体的调控***更严密、更简单；能够控制uPA基因在特定时间特定空间进行表达，使其他器官免受毒性的风险。
所述的一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体的制备方法，该载体为非病毒载体，操作使用更加简便，同时，所述制备方法简便安全，操作方便，使用方便，成功率高，适用性广泛。
所述的一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体在制备人源化嵌合体肝脏模型的应用过程中，制备方法简便安全，操作使用更加简便，成功率高，适用性广泛。
附图说明
图1是本发明实施例提供的pMC.BESXP图谱。
图2是本发明实施例提供的利用无缝克隆方法制备得到所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体的流程图。
图3是本发明实施例提供的时空调控型uPA基因表达微环DNA母质粒(pMC.ApoE-muPA-DD)的图谱。
图4是本发明实施例提供的包括肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域的时空调控uPA基因表达盒。
图5是本发明实施例提供的包括肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域、polyA元件的时空调控uPA基因表达盒。
图6是本发明实施例提供的时空调控型uPA基因表达非病毒微环DNA(ApoE-muPA-DD MC)图谱。
图7是本发明实施例提供的DD-GFP表达载体示意图和GFP-DD表达载体示意图。
图8是本发明实施例提供的DD-GFP表达载体和GFP-DD表达载体的表达调控结果。
图9是本发明实施例提供的甲氧苄啶的诱导浓度与目的蛋白的表达量的关系。
图10是本发明实施例提供的Western Blot检测ApoE-muPA-DD载体在肝细胞中的表达的结果图。
图11是本发明实施例提供的ApoE-muPA-DD转染肝细胞系经TMP诱导后在纤维蛋白原琼脂平板上的裂解结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，所述“结构域”是指生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，特别指蛋白质中这样的区域。结构域是介于二级和三级结构之间的一种结构层次，是蛋白质三级结构的基本结构单位，也是蛋白质功能单元。在多结构域蛋白质中，不同的结构域常常与不同的功能相联系。
在本发明中，所述“不稳定结构域”是指Destabilizing Domain，所述的不稳定结构域是一种小型的全人源蛋白结构域，它能保证融合有效负载蛋白的稳定性，其可以很容易地添加到细胞或基因治疗产品中，通过构象改变来开启或关闭相关功能，是由美国Obsidian Therapeutic与Celgene公司合作共同开发的不稳定结构域(DestabilizingDomain，DD)技术，该技术可用于控制两种免疫调节因子IL12和CD40L的表达。
在本发明中，所述“uPA”即尿激酶型纤溶酶原激活剂，属于丝氨酸蛋白水解酶家族，uPA能够催化纤溶酶原转化为纤溶酶，启动纤维蛋白和细胞外基质蛋白溶解级联反应。
在本发明中，所述“内质网滞留信号”，是指内质网的结构和功能蛋白羧基端的一个四肽序列：Lys-Asp-Glu-Leu-COO-，即KDEL信号序列。这段序列在高尔基体的膜上有相应的受体，一旦进入高尔基体就会被高尔基体上的受体结合，形成回流小泡被运回内质网，所以将该序列称为内质网滞留信号。
在本发明中，所述“启动子”是指一种核酸序列，其通常存在于目的核酸序列的上游(5’-端)，能够能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。
在本发明中，所述“肝特异性启动子”是指所述启动子能够选择性地激活干细胞中或源于干细胞的细胞系中的转录。在本发明中，肝特异性启动子是指那些通常在肝脏中的活性比在其他任何身体组织中活性都高的启动子。通常，肝特异性启动子在肝脏中的活性比其他组织中高很多。因此，肝特异性启动子允许基因在肝脏那个中的活性表达并阻止基因在其他细胞或组织中的表达。***所述“肝特异性启动子”的目的是为了控制下游的目的基因在肝细胞中进行特异表达。
在本发明中，所述“载体”是指在基因工程研究中，可以***外源DNA并能在受体细胞中复制的结构。
在本发明中，所述“多克隆位点”是指载体上含有的一个人工合成的DNA片段，其上含有多个单一酶切位点，是外源DNA的***部位。
本发明实例提供一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体，所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体包括时空调控uPA基因表达盒，所述时空调控uPA基因表达盒包括：肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域，所述uPA突变基因为***了内质网滞留信号基因的uPA基因。
具体的，所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体包括时空调控uPA基因表达盒，其中，所述“时空调控uPA基因表达盒”为***载体多克隆位点的碱基序列，目的是用于在细胞中对uPA基因进行表达。具体的，所述时空调控uPA基因表达盒包括：肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域。
所述“时空调控uPA基因表达盒”***了一个不稳定结构域，所述不稳定结构域与uPA突变基因的融合蛋白不稳定，在不存在特异性小分子配体的情况下，融合蛋白在肝细胞内能够迅速被降解；而通过利用特异性小分子甲氧苄啶或甲氧苄啶衍生物对所述时空调控uPA基因表达盒进行诱导表达，可以使不稳定结构域与uPA突变基因的融合蛋白稳定，并积累在肝细胞内，使uPA基因能够被稳定调控，通过控制添加诱导剂甲氧苄啶或甲氧苄啶衍生物的时间，可以控制不稳定结构域与uPA突变基因的融合蛋白稳定表达的时间，使其在特定时间内被诱导表达，确保了uPA基因表达非病毒载体能够在时间上对uPA基因的表达进行调控。
优选的，所述不稳定结构域与肝特异启动子、uPA突变基因相连接，在本发明优选实施例中，所述不稳定结构域可连接于uPA突变基因的C端或N端，不稳定结构域与uPA突变基因连接形成融合蛋白，在不存在特异性小分子配体甲氧苄啶或甲氧苄啶衍生物的情况下，所形成的融合蛋白不稳定，在细胞内能够被迅速降解；若加入特异性小分子配体甲氧苄啶或甲氧苄啶衍生物进行诱导表达，不稳定结构域与uPA突变基因连接形成的融合蛋白较稳定，能够在细胞内进行积累。在本发明具体实施例中，所述不稳定结构域融合在所述uPA突变基因的C端，能够严格限制其目的蛋白滞留于肝细胞内，不会转运至胞外，更不会进入循环***而影响全身其它脏器。
在本发明具体实施例中，所述不稳定结构域碱基序列如下(如序列表中SequenceNo.1)：
5’-ATGATCTCTCTGATTGCCGCTCTGGCCGTGGACTACGTGATCGGGATGGAAAACGCTATGCCATGGAATCTGCCCGCCGATCTGGCTTGGTTCAAGAGGAACACCCTGAACAAGCCAGTGATCATGGGCAGACACACTTGGGAGTCCATTGGCCGGCCCCTGCCTGGACGCAAGAACATCATTCTGAGCTCCCAGCCCTCTACCGACGACAGGGTGACATGGGTGAAAAGTGTGGACGAAGCCATTGCCGCTTGCGGAGATGTGCCCGAGATCATGGTCATCGGCGGAGGGAGAGTGATCGAGCAGTTCCTGCCTAAGGCCCAGAAACTGTACCTGACTCACATTGACGCTGAGGTGGAAGGGGACACCCATTTTCCTGATTATGAGCCAGACGATTGGGAAAGCGTGTTCTCCGAGTTTCACGACGCCGATGCTCAGAATTCTCATAGTTATTGCTTTGAGATCCTGGAAAGGAGA-3’。
具体的，所述时空调控uPA基因表达盒还包括uPA突变基因，其中，所述uPA突变基因为***了内质网滞留信号基因的uPA基因。
优选的，所述内质网滞留信号基因可添加于uPA基因的C端或N端的至少一端，所述内质网滞留信号基因可选自添加于uPA基因的C端、添加于uPA基因的N端或添加于uPA基因的C端及N端的任一一种方式。具体的，在uPA基因中***内质网滞留信号基因，能够严格控制uPA基因的分布，调控其分布的位置仅限于肝细胞内，使uPA突变基因的分布空间位置得到了严密调控。
在本发明具体实施例中，所述内质网滞留信号基因包括C端内质网滞留信号基因及N端内质网滞留信号基因；
具体的，C端内质网滞留信号氨基酸序列如下(如序列表中Sequence No.2)，含可促进KDEL信号与位于高尔基体上的KDEL受体结合的辅助氨基酸序列为“EEDTSE”以及“KDEL”信号序列(下划线)：
EEDTSEKDEL。
所述C端内质网滞留信号碱基序列如下(如序列表中Sequence No.3)：
5’-GAAGAAGATACCTCTGAAAAAGATGAGCTC-3’。
具体的，所述N端滞留信号氨基酸序列如下(如序列表中Sequence No.4)：其中RR(Arg-Arg)滞留信号为“MHRRRSRSCREDQKP”(1-15位氨基酸)；lip33间隔肽为“VIDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSR”(16-46位氨基酸)；跨膜序列为“GALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFL”(47-71位氨基酸)：
MHRRRSRSCREDQKPVIDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFL。
所述N端滞留信号碱基序列如下(如序列表中Sequence No.5)：5’-ATGCACAGGAGGAGAAGCAGGAGCTGTCGGGAAGATCAGAAGCCAGTCATCGATGATCAGCGCGACCTTATCTCCAACAATGAGCAACTGCCCATGCTGGGCCGGCGCCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCCGCGGAGCCCTGTACACAGGCTTTTCCATCCTGGTGACTCTGCTCCTCGCTGGCCAGGCCACCACCGCCTACTTCCTG-3’。
在本发明具体实施例中，所述uPA突变基因为C端添加了C端内质网滞留信号基因及N端添加了N端内质网滞留信号基因的uPA基因，其碱基序列如下(如序列表中SequenceNo.6)：
5’-ATGCACAGGAGGAGAAGCAGGAGCTGTCGGGAAGATCAGAAGCCAGTCATCGATGATCAGCGCGACCTTATCTCCAACAATGAGCAACTGCCCATGCTGGGCCGGCGCCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCCGCGGAGCCCTGTACACAGGCTTTTCCATCCTGGTGACTCTGCTCCTCGCTGGCCAGGCCACCACCGCCTACTTCCTGTACCAGCAGCAGGTTCCATCGAACTGTGACTGTCTAAATGGAGGAACATGTGTGTCCAACAAGTACTTCTCCAACATTCACTGGTGCAACTGCCCAAAGAAATTCGGAGGGCAGCACTGTGAAATAGATAAGTCAAAAACCTGCTATGAGGGGAATGGTCACTTTTACCGAGGAAAGGCCAGCACTGACACCATGGGCCGGCCCTGCCTGCCCTGGAACTCTGCCACTGTCCTTCAGCAAACGTACCATGCCCACAGATCTGATGCTCTTCAGCTGGGCCTGGGGAAACATAATTACTGCAGGAACCCAGACAACCGGAGGCGACCCTGGTGCTATGTGCAGGTGGGCCTAAAGCCGCTTGTCCAAGAGTGCATGGTGCATGACTGCGCAGATGGAAAAAAGCCCTCCTCTCCTCCAGAAGAATTAAAATTTCAGTGTGGCCAAAAGACTCTGAGGCCCCGCTTTAAGATTATTGGGGGAGAATTCACCACCATCGAGAACCAGCCCTGGTTTGCGGCCATCTACAGGAGGCACCGGGGGGGCTCTGTCACCTACGTGTGTGGAGGCAGCCTCATCAGCCCTTGCTGGGTGATCAGCGCCACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAGAAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCTGACACGCTTGCTCACCACAATGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCTGCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACAAGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAGAATTCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAGCTGAAAATGACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTACGGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTGTGTGCTGCTGACCCACAGTGGAAAACAGATTCCTGCCAGGGAGACTCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACTGGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGAGTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAAGAGAATGGCCTGGCCCTCGAAGAAGATACCTCTGAAAAAGATGAGCTC-3’。
具体的，所述时空调控uPA基因表达盒包括肝特异性启动子。
优选的，所述肝特异性启动子选自载脂蛋白E启动子、白蛋白启动子、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子、α-I-抗胰蛋白酶启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、α-甲胎蛋白启动子、醇脱氢酶启动子、IGF-II启动子、因子VIII启动子、HBV基础核心蛋白启动子、HBV前s2蛋白启动子、甲状腺素-结合球蛋白启动子、HCR-Ap0CII的杂合启动子、HCR-hAAT杂合启动子、与小鼠白蛋白基因的增强子元件结合的AAT启动子、低密度脂蛋白启动子、丙酮酸激酶启动子、卵磷脂-胆固醇酰基转移酶启动子、载脂蛋白H启动子、铁传递蛋白启动子、甲状腺素运载蛋白启动子、α-纤维蛋白原及β-纤维蛋白原的启动子、α-I-抗糜蛋白酶启动子、α-2-HS糖蛋白启动子、触珠蛋白启动子、血浆铜蓝蛋白启动子、血纤维蛋白溶酶原启动子、补体蛋白启动子、补体C3激活子的启动子、血液结合素启动子及α-I-酸性糖蛋白启动子的任意一种。
在本发明具体实施例中，所述肝特异性启动子选用载脂蛋白E启动子，选用载脂蛋白E启动子主要是为了控制下游的目的基因在肝细胞中进行特异表达。所述载脂蛋白E启动子的碱基序列如下(如序列表中Sequence No.7)：
5’-TAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATGATCCCCCTGATCTGCGGCCTCGACGGTATCGAT-3’。
优选的，所述时空调控uPA基因表达盒还包括polyA元件，加入polyA元件主要是防止新合成的mRNA被降解掉，所以对mRNA的稳定性有着非常重要的意义。所述poly A为牛生长激素poly A(bovine growth hormone poly A,简称bpA)，信号序列如下(如序列表中Sequence No.8)：
5’-CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG-3’。
在本发明的优选实施例中，按照载脂蛋白E启动子、uPA突变基因和不稳定结构域的顺序依次合成全长DNA片段(ApoE-muPA-DD)。得到的所述“ApoE-muPA-DD”的全长DNA片段包括载脂蛋白E启动子，选用该启动子为杂合启动子，能够较强地控制下游的目的基因在肝细胞中进行特异表达；依次连接了uPA突变基因，其中，所述uPA突变基因为***了内质网滞留信号基因的uPA基因，所述内质网滞留信号基因添加于uPA基因的C端及N端，在uPA基因的C端及N端均添加了内质网滞留信号基因，能够增强uPA基因分布的稳定性，能够严格控制uPA基因的分布，调控其分布的位置仅限于肝细胞内，使uPA突变基因的分布空间位置得到了严密调控；再者，依次连接了不稳定结构域，所述不稳定结构域连接于uPA突变基因的C端，能够严格限制目的蛋白在特异性小分子进行诱导的特定时间内，仅分布于肝细胞中，不会转运至胞外，更不会进入循环***而影响全身其它脏器。所述“ApoE-muPA-DD”的全长DNA片段碱基序列如下：(如序列表中Sequence No.9)：
5’-TAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATGATCCCCCTGATCTGCGGCCTCGACGGTATCGATAAGCTTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGCACAGGAGGAGAAGCAGGAGCTGTCGGGAAGATCAGAAGCCAGTCATCGATGATCAGCGCGACCTTATCTCCAACAATGAGCAACTGCCCATGCTGGGCCGGCGCCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCCGCGGAGCCCTGTACACAGGCTTTTCCATCCTGGTGACTCTGCTCCTCGCTGGCCAGGCCACCACCGCCTACTTCCTGTACCAGCAGCAGGTTCCATCGAACTGTGACTGTCTAAATGGAGGAACATGTGTGTCCAACAAGTACTTCTCCAACATTCACTGGTGCAACTGCCCAAAGAAATTCGGAGGGCAGCACTGTGAAATAGATAAGTCAAAAACCTGCTATGAGGGGAATGGTCACTTTTACCGAGGAAAGGCCAGCACTGACACCATGGGCCGGCCCTGCCTGCCCTGGAACTCTGCCACTGTCCTTCAGCAAACGTACCATGCCCACAGATCTGATGCTCTTCAGCTGGGCCTGGGGAAACATAATTACTGCAGGAACCCAGACAACCGGAGGCGACCCTGGTGCTATGTGCAGGTGGGCCTAAAGCCGCTTGTCCAAGAGTGCATGGTGCATGACTGCGCAGATGGAAAAAAGCCCTCCTCTCCTCCAGAAGAATTAAAATTTCAGTGTGGCCAAAAGACTCTGAGGCCCCGCTTTAAGATTATTGGGGGAGAATTCACCACCATCGAGAACCAGCCCTGGTTTGCGGCCATCTACAGGAGGCACCGGGGGGGCTCTGTCACCTACGTGTGTGGAGGCAGCCTCATCAGCCCTTGCTGGGTGATCAGCGCCACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAGAAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCTGACACGCTTGCTCACCACAATGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCTGCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACAAGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAGAATTCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAGCTGAAAATGACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTACGGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTGTGTGCTGCTGACCCACAGTGGAAAACAGATTCCTGCCAGGGAGACTCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACTGGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGAGTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAAGAGAATGGCCTGGCCCTCGAAGAAGATACCTCTGAAAAAGATGAGCTCCACCGGTCGATGATCTCTCTGATTGCCGCTCTGGCCGTGGACTACGTGATCGGGATGGAAAACGCTATGCCATGGAATCTGCCCGCCGATCTGGCTTGGTTCAAGAGGAACACCCTGAACAAGCCAGTGATCATGGGCAGACACACTTGGGAGTCCATTGGCCGGCCCCTGCCTGGACGCAAGAACATCATTCTGAGCTCCCAGCCCTCTACCGACGACAGGGTGACATGGGTGAAAAGTGTGGACGAAGCCATTGCCGCTTGCGGAGATGTGCCCGAGATCATGGTCATCGGCGGAGGGAGAGTGATCGAGCAGTTCCTGCCTAAGGCCCAGAAACTGTACCTGACTCACATTGACGCTGAGGTGGAAGGGGACACCCATTTTCCTGATTATGAGCCAGACGATTGGGAAAGCGTGTTCTCCGAGTTTCACGACGCCGATGCTCAGAATTCTCATAGTTATTGCTTTGAGATCCTGGAAAGGAGATAA-3’。
在本发明优选实施例中，按照载脂蛋白E启动子、uPA突变基因和不稳定结构域、poly A元件的顺序依次合成全长DNA片段(ApoE-muPA-DD-polyA)如图5所示。
本发明实施例提供的所述的时空调控型uPA基因表达非病毒载体，所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体包括时空调控uPA基因表达盒，所述时空调控uPA基因表达盒包括：肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域。所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体中，含有肝特异性启动子，使得uPA基因表达时能够控制下游基因在肝细胞中进行特异性表达；***了uPA突变基因，且所述uPA突变基因为***了内质网滞留信号基因的uPA基因，从而能够严格控制uPA基因的分布，调控其分布的位置仅限于肝细胞内，使uPA突变基因的分布空间位置得到了严密调控；还***了一个不稳定结构域，当不添加甲氧苄啶或甲氧苄啶衍生物时，所述不稳定结构域与uPA突变基因的融合蛋白不稳定，在肝细胞内能够迅速被降解；当利用甲氧苄啶或甲氧苄啶衍生物对本发明所述时空调控uPA基因表达盒进行诱导表达，可以使不稳定结构域与uPA突变基因的融合蛋白稳定，并积累在肝细胞内，使uPA基因能够被稳定调控，通过控制添加诱导剂甲氧苄啶或甲氧苄啶衍生物的时间，控制不稳定结构域与uPA突变基因的融合蛋白稳定表达的时间，使其在特定时间内被诱导表达，诱导表达后严格限制其分布于肝细胞中，不会转运至胞外，更不会进入循环***而影响全身其它脏器，所述的时空调控型uPA基因表达非病毒载体的调控***更严密、更简单；能够控制uPA基因在特定时间特定空间进行表达，使其他器官免受毒性的风险。
相应的，本发明实施例还提供了一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体的制备方法，包括如下步骤：
S01.合成肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域的DNA片段；
S02.将上述DNA片段***载体的多克隆位点，得到所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体，所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体包括时空调控uPA基因表达盒，所述时空调控uPA基因表达盒包括：肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域；其中，所述uPA突变基因为***了内质网滞留信号基因的uPA基因。
具体的，在上述步骤S01中，合成肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域的DNA片段。优选的，按照载脂蛋白E启动子、uPA突变基因和不稳定结构域的顺序依次合成DNA片段(ApoE-muPA-DD)；得到的所述“ApoE-muPA-DD”的全长DNA片段包括载脂蛋白E启动子，选用该启动子为杂合启动子，能够较强地控制下游的目的基因在肝细胞中进行特异表达；依次连接了uPA突变基因，其中，所述uPA突变基因为***了内质网滞留信号基因的uPA基因，所述内质网滞留信号基因添加于uPA基因的C端及N端，在uPA基因的C端及N端均添加了内质网滞留信号基因，能够增强uPA基因分布的稳定性，能够严格控制uPA基因的分布，调控其分布的位置仅限于肝细胞内，使uPA突变基因的分布空间位置得到了严密调控；依次连接了不稳定结构域，所述不稳定结构域连接于uPA突变基因的C端，能够严格限制目的蛋白在特异性小分子进行诱导的特定时间内，仅分布于肝细胞中，不会分布至胞外，更不会进入循环***而影响全身其它脏器。所述“ApoE-muPA-DD”的全长DNA片段碱基序列如序列表中Sequence No.9。
具体的，在上述步骤S02中，将上述DNA片段***载体的多克隆位点，得到所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体，所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体包括时空调控uPA基因表达盒，所述时空调控uPA基因表达盒包括：肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域；其中，所述uPA突变基因为***了内质网滞留信号基因的uPA基因。
优选的，所述载体选自原核质粒载体、真核质粒载体的任意一种。在本发明具体实施例中，所述载体优选pMC.BESXP。载体pMC.BESXP的图谱信息见说明书附图1，该载体全长4082bp，含attB和attP重组位点。
在本发明优选实施例中，根据所选载体选择合适的基因工程菌进行载体转化。所述基因工程菌可选自多种大肠杆菌菌株，如ZYCY10P3S2T、DH5α、TOP10、JM109等任一一种。在本发明具体实施例中，所述基因工程菌优选ZYCY10P3S2T进行使用。
优选的，选择pMC.BESXP载体和ZYCY10P3S2T工程菌一起使用，在ZYCY10P3S2T表达的ΦC31重组酶作用下，pMC.BESXP载体可自发重组，形成两个小的环状DNA分子：一个为微环DNA(minicircle，MC)只含目的基因表达框和36bp的attR位点)，另一个为质粒骨架DNA组成的小环(含质粒DNA复制起始点、抗生素抗性基因和I-SceI*32酶切位点等)。其中，I-SceI*32是指32个串联重复的I-SceI酶切位点，使得由质粒骨架DNA组成的小环和亲本质粒(pMC.BESXP)在工程菌ZYCY10P3S2T菌体内能被工程菌自身表达的I-SceI内切酶识别并降解。最终，在工程菌ZYCY10P3S2T菌体内只剩下了微环DNA一种环状DNA分子。即只有当pMC.BESXP载体配合ZYCY10P3S2T工程菌使用，才能产生微环DNA。其它载体和工程菌ZYCY10P3S2T或者载体pMC.BESXP和其它大肠杆菌菌株(常用的比如DH5α、TOP10、JM109等)均不能产生微环DNA。而所形成的微环DNA分子由于只含目的基因表达框和36bp的attR位点，因此具有以下优点：首先，MC分子小，比普通质粒小一半以上；因此更容易进入宿主细胞，进而其体内转染效率更高。其次，由于去除了质粒骨架DNA成分引起的基因沉默效应(gene silencing effect)，MC在体内能长期稳定表达；此外，MC不含抗性抗生素抗性基因，避免了抗性基因扩散的担忧，因此具有很高的安全性。而且，由于MC不含细菌来源的质粒骨架DNA成分，因此避免了机体对细菌来源DNA成分的免疫反应。
优选的，所述将上述DNA片段***载体的多克隆位点的步骤中，可选用无缝克隆或特异性酶切连接的任一一种方法，主要是将DNA片段***载体的多克隆位点上。
以上述“ApoE-muPA-DD”片段为例，采用无缝克隆的方法将上述DNA片段***载体pMC.BESXP的多克隆位点，包括以下步骤(如附图2)：
S201.将载体pMC.BESXP经限制性内切酶SpeI、SalI进行双酶切线性化，得到线性化载体；
S202.将上述合成的DNA片段作为为模版，使用重叠引物priFOR和priREV进行PCR扩增得到PCR产物；
S203.将所述线性化载体和所述PCR产物混合，加入In-Fusion重组酶进行融合反应，得到所述时空调控型uPA基因表达微环DNA母质粒(pMC.ApoE-muPA-DD)。
具体的，在上述步骤S201中，所述双酶切线性化的体系如下：
Figure BDA0002080046290000171
所述双酶切线性化的条件为37℃，4h。
在上述步骤S202中，所述重叠引物priFOR和priREV的具体碱基序列如下：
priFOR(序列表中Sequence No.11)：
5’-CCCGGGCGCGACTAGTTAGGCTCAGAGGCACACAGG-3’；
priREV(序列表中Sequence No.10)
5’-GCCCCCATGGGTCGACTTATCTCCTTTCCAGGATCTCAAAGCAATAACT-3’；
所述PCR扩增的体系如下：
Figure BDA0002080046290000181
KOD-Plus高保真DNA聚合酶(TOYOBO)1μl。
所述PCR扩增反应条件如下：
Figure BDA0002080046290000182
25个循环。
在上述步骤S203中，将所述线性化载体和所述PCR产物混合，加入In-Fusion重组酶进行融合反应，
所述融合反应体系如下：
Figure BDA0002080046290000183
反应条件如下：
50℃反应15min。
通过上述反应得到所述时空调控型uPA基因表达微环DNA母质粒(pMC.ApoE-muPA-DD)，所述时空调控型uPA基因表达微环DNA母质粒(pMC.ApoE-muPA-DD)的图谱如图3，所述微环DNA母质粒的大小为7kb。所述时空调控型uPA基因表达微环DNA母质粒包括时空调控uPA基因表达盒(如图4)，所述时空调控uPA基因表达盒包括：肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域；其中，所述uPA突变基因为***了内质网滞留信号基因的uPA基因。
本发明实施例提供的时空调控型uPA基因表达微环DNA母质粒的制备方法，该载体为非病毒载体，操作使用更加简便，同时，所述制备方法简便安全，操作方便，使用方便，成功率高，适用性广泛。
相应的，本发明实施例还提供了一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体或一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体的制备方法的应用。
优选的，根据所选载体选择合适的基因工程菌进行载体转化。所述基因工程菌可选自多种大肠杆菌菌株，如ZYCY10P3S2T、DH5α、TOP10、JM109等任一一种。在本发明具体实施例中，所述基因工程菌优选ZYCY10P3S2T进行使用。所述时空调控型uPA基因表达微环DNA母质粒(pMC.ApoE-muPA-DD)转化到基因工程菌ZYCY10P3S2T中的转化步骤如下：
G01.将基因工程菌ZYCY10P3S2T在冰上进行解冻至液态；
G02.添加1-2μL(≤50ng)所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体至所述解冻至液态的基因工程菌ZYCY10P3S2T中，混匀得到第一混合物，置于冰上30-40分钟；
G03.将所述第一混合物置于40-42℃水浴中热激80-90s，迅速置于冰上1-2min，再加入180-200μL不含抗生素的LB液体培养基，混匀，置于37℃、180-200rpm培养40-60min得到第二混合物；
G04.取5-10μL第二混合物涂布于含有卡那霉素抗生素的LB固体平板培养基上，37℃培养12-14h，其中，卡那霉素抗生素的终浓度为0.1％。
将所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体转化到基因工程菌ZYCY10P3S2T中，经37℃培养12-14h培养得到重组子，再对所述重组子进行单克隆测序验证。
将上述筛选得到的阳性克隆子接种至含卡那霉素(终浓度0.1％)的TB培养基，37℃摇床培养12-16h，再加入含***糖的诱导培养基，在***糖的诱导下(32℃摇床培养8h)，最后用质粒DNA纯化试剂盒(QIAGEN EndoFree Plasmid Mega Kit,Qiagen,德国)进行分离纯化，得到时空调控型uPA基因表达非病毒微环DNA(ApoE-muPA-DD MC)，所述微环DNA的图谱如图5，所述微环DNA(ApoE-muPA-DD MC)的大小为3kb。
在本发明具体实施例中，所述
Figure BDA0002080046290000201
具体的，利用所述筛选得到的时空调控型uPA基因表达非病毒微环DNA(ApoE-muPA-DD MC)转染肝细胞并进行诱导表达，具体操作步骤如下：
D01.在6孔板上按照每孔接种密度为1x106个细胞接种细胞；
D02.在37℃，5％CO2的条件下，用DMEM(含10％胎牛血清)培养基培养24小时得到待转染细胞；
D03.使用转染试剂将所述ApoE-muPA-DD MC质粒转入所述待转染细胞得重组细胞，孵育24小时；
D04.在所述重组细胞培养基中添加甲氧苄啶，直至甲氧苄啶终浓度为10μM，再进行诱导24小时；即可对uPA基因进行检测。
本发明实施例提供的一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体在制备人源化嵌合体肝脏模型的应用过程中，制备方法简便安全，操作使用更加简便，成功率高，适用性广泛。
下边以具体实施例来进一步说明本发明上述时空调控型uPA基因表达非病毒载体及其制备方法。
本发明实施例所使用的载体pMC.BESXP、菌株E.coli ZYCY10P3S2T均为市售商品，所使用的试剂均为市售商品；所用引物及DNA序列均由上海Invitrogen公司合成。
本发明实施例所使用的LB培养基配置如下：
LB培养基：胰化蛋白胨(Tryptone)10g/L；酵母粉(Yeastextract)5g/L；NaCl10g/L；pH7.0
本发明实施例所采用引物如表1所示：
表1引物序列表
Figure BDA0002080046290000211
实施例1
确定合成肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域的DNA片段，包括以下步骤：
(1)确定不稳定结构域的位置，以荧光基团GFP为指示基团，构建GFP-DD表达载体，比较不同位置的不稳定结构域对转基因调控的影响。具体步骤如下：
①分别将DD结构域置于GFP荧光指示基因N端(DD-GFP)或者C端(GFP-DD)，分别构建DD-GFP表达载体和GFP-DD表达载体(图6)；
②利用上述DD-GFP表达载体和GFP-DD表达载体分别转染293T细胞，并加入甲氧苄啶诱导剂进行诱导，在荧光显微镜进行观察。
结果分析：通过图7进行分析，10μM TMP诱导时，DD-GFP和GFP-DD二者表达量相当；无TMP时，GFP-DD信号非常微弱，而DD-GFP仍有相对较多的蛋白残留；发现DD置于C端对GFP的表达调控更严密。
进一步的，利用不同浓度(0μM、0.01μM、1μM、10μM)的甲氧苄啶诱导GFP-DD转染的293T细胞，得到的结果如图8，当甲氧苄啶诱导浓度越高，则目的蛋白量越高，目的蛋白量与TMP浓度呈正相关。
(2)按照载脂蛋白E启动子、uPA突变基因和不稳定结构域的顺序依次合成DNA片段(ApoE-muPA-DD)；其中，所述uPA突变基因为***了内质网滞留信号基因的uPA基因，所述内质网滞留信号基因添加于uPA基因的C端及N端。所合成的DNA碱基序列如序列表中SequenceNo.9。
实施例2
将上述DNA片段通过无缝克隆***载体pMC.BESXP，具体步骤如下：
(1)制备线性化载体，将载体pMC.BESXP经限制性内切酶SpeI、SalI进行双酶切线性化，得到线性化载体；
具体的，所述双酶切线性化的体系如下：
Figure BDA0002080046290000221
所述双酶切线性化的条件为37℃，4h。
(2)进行重叠PCR。将上述合成的DNA片段作为为模版，使用重叠引物priFOR和priREV进行PCR扩增得到PCR产物；
具体的，所述PCR扩增的体系如下：
Figure BDA0002080046290000222
Figure BDA0002080046290000231
KOD-Plus高保真DNA聚合酶(TOYOBO)1μl
所述PCR扩增反应条件如下：
Figure BDA0002080046290000232
25个循环
(3)进行无缝克隆连接。将所述线性化载体和所述PCR产物混合，加入In-Fusion重组酶进行PCR反应，得到所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体(pMC.ApoE-muPA-DD)；
具体的，将所述线性化载体和所述PCR产物混合，加入In-Fusion重组酶进行融合反应，
所述融合反应体系如下：
Figure BDA0002080046290000233
反应条件如下：
50℃，15min
通过上述反应得到所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体(pMC.ApoE-muPA-DD)。所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体包括时空调控uPA基因表达盒，所述时空调控uPA基因表达盒包括：肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域；其中，所述uPA突变基因为***了内质网滞留信号基因的uPA基因。
实施例3
将上述时空调控型uPA基因表达非病毒载体转化至基因工程菌ZYCY10P3S2T制备成微环，具体转化步骤如下：
(1)将基因工程菌ZYCY10P3S2T在冰上进行解冻至液态；
(2)添加1μL(≤50ng)所述述时空调控型uPA基因表达非病毒载体至所述解冻至液态的基因工程菌ZYCY10P3S2T中，混匀得到第一混合物，置于冰上30分钟；
(3)将所述第一混合物置于42℃水浴中热激90s，迅速置于冰上2min，再加入200μL不含抗生素的LB液体培养基，混匀，置于37℃、180-200rpm培养40min得到第二混合物；
(4)取10μL第二混合物涂布于含有卡那霉素抗生素的LB固体平板培养基上，37℃培养12h，其中，卡那霉素抗生素的终浓度为0.1％。
将所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体转化到基因工程菌ZYCY10P3S2T中，经37℃培养12-14h培养得到重组子，再对所述重组子进行阳性筛选，进行单克隆测序验证。
将上述筛选得到的阳性克隆子用质粒DNA纯化试剂盒进行分离纯化，得到时空调控型uPA基因表达非病毒微环DNA(ApoE-muPA-DD MC)。
实施例4
利用所述筛选得到的时空调控型uPA基因表达非病毒微环DNA(ApoE-muPA-DD MC)转染肝细胞并进行诱导表达。
具体步骤如下：
(1)在6孔板上按照每孔接种密度为1x106个细胞接种细胞；
(2)在37℃，5％CO2的条件下，用DMEM(含10％胎牛血清)培养基培养24小时得到待转染细胞；
(3)使用转染试剂Lipofectamine 2000将所述ApoE-muPA-DD MC质粒转入所述待转染细胞得重组细胞，孵育24小时；
(4)在所述重组细胞培养基中添加甲氧苄啶，直至甲氧苄啶终浓度为10μM，再进行诱导24小时；即可对uPA基因进行检测。
利用Western Blot检测ApoE-uPA-DD载体在肝细胞中的表达，具体检测步骤如下：
(1)准备蛋白样品：收集ApoE-uPA-DD载体进行表达的细胞并使用细胞裂解液(RIPA裂解液，碧云天)裂解、进一步处理得到蛋白样品；
(2)电泳：将所述蛋白样品加入适量上样缓冲液后，沸水加热3-5分钟，让蛋白变性，冷却后，加样至SDS-PAGE凝胶加样孔，80-100V电泳1小时
(3)转膜：使用湿式转膜装置(Bio-Rad，美国)，300mA转膜1小时，将蛋白从SDS-PAGE凝胶转移至PVDF膜
(4)封闭：PVDF膜清洗后，加入Western Blot封闭液封闭；
(5)一抗孵育：加入稀释的uPA抗体(Abcam，英国)，室温孵育1小时
(6)二抗孵育：加入稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1小时
(7)显色：利用ECL化学发光试剂(Cell Signaling,美国)，检测蛋白。
检测结果如图9，由图9可知，Control(空白对照)及ApoE-uPA组(阳性对照)没有发生变化；ApoE-uPA-DD载体转染肝细胞系24小时后，再加TMP诱导(10μM)，细胞内的uPA蛋白量随时间积累逐渐增加，当ApoE-uPA-DD添加了TMP诱导17或24小时后(Lane 4)，WesternBlot检测到明显的目的蛋白条带；而当ApoE-uPA-DD不添加了TMP进行诱导，在各时间点均只有非常微弱的条带，显示uPA蛋白水平很低，说明当***了不稳定结构域DD之后，不添加甲氧苄啶进行诱导，uPA与DD的融合蛋白会迅速被降解；而当添加了甲氧苄啶进行诱导时，uPA与DD的融合蛋白会进行表达，同时随着甲氧苄啶的诱导时间的增加，所分布得到的胞内的uPA蛋白量随时间积累逐渐增加。
利用纤维蛋白原平板法监测uPA蛋白活性，具体操作步骤如下：
(1)用PBS配制1％的琼脂，加热融化后，冷却至40-50℃，往15mL融化的琼脂中加入纤维蛋白原5mg和凝血酶60U
(2)倒入培养皿，铺平板(厚度5mm左右)
(3)凝固后，用直径为4mm的玻璃管在琼脂上打小孔
(4)小孔中加入待测uPA蛋白样品(细胞裂解物)或uPA标准品(Sigma，美国)，37℃孵育4小时。根据裂解圈的大小即可判断uPA活性。
由图10可知，ApoE-muPA-DD转染肝细胞系、经TMP诱导后，在纤维蛋白原琼脂平板上加入细胞裂解物，可产生明显裂解圈，图10中，A为阳性对照(uPA蛋白，Sigma)；B为空白对照；C为细胞裂解物；结果表明muPA保持有尿激酶活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 先进院
<120> 一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体及其制备方法
<130> 2019.5.23
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgatctctc tgattgccgc tctggccgtg gactacgtga tcgggatgga aaacgctatg 60
ccatggaatc tgcccgccga tctggcttgg ttcaagagga acaccctgaa caagccagtg 120
atcatgggca gacacacttg ggagtccatt ggccggcccc tgcctggacg caagaacatc 180
attctgagct cccagccctc taccgacgac agggtgacat gggtgaaaag tgtggacgaa 240
gccattgccg cttgcggaga tgtgcccgag atcatggtca tcggcggagg gagagtgatc 300
gagcagttcc tgcctaaggc ccagaaactg tacctgactc acattgacgc tgaggtggaa 360
ggggacaccc attttcctga ttatgagcca gacgattggg aaagcgtgtt ctccgagttt 420
cacgacgccg atgctcagaa ttctcatagt tattgctttg agatcctgga aaggaga 477
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Glu Glu Asp Thr Ser Glu Lys Asp Glu Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gaagaagata cctctgaaaa agatgagctc 30
<210> 4
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Met His Arg Arg Arg Ser Arg Ser Cys Arg Glu Asp Gln Lys Pro Val
1 5 10 15
Ile Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met
20 25 30
Leu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala
35 40 45
Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln
50 55 60
Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu
65 70
<210> 5
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
atgcacagga ggagaagcag gagctgtcgg gaagatcaga agccagtcat cgatgatcag 60
cgcgacctta tctccaacaa tgagcaactg cccatgctgg gccggcgccc tggggccccg 120
gagagcaagt gcagccgcgg agccctgtac acaggctttt ccatcctggt gactctgctc 180
ctcgctggcc aggccaccac cgcctacttc ctg 213
<210> 6
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
atgcacagga ggagaagcag gagctgtcgg gaagatcaga agccagtcat cgatgatcag 60
cgcgacctta tctccaacaa tgagcaactg cccatgctgg gccggcgccc tggggccccg 120
gagagcaagt gcagccgcgg agccctgtac acaggctttt ccatcctggt gactctgctc 180
ctcgctggcc aggccaccac cgcctacttc ctgtaccagc agcaggttcc atcgaactgt 240
gactgtctaa atggaggaac atgtgtgtcc aacaagtact tctccaacat tcactggtgc 300
aactgcccaa agaaattcgg agggcagcac tgtgaaatag ataagtcaaa aacctgctat 360
gaggggaatg gtcactttta ccgaggaaag gccagcactg acaccatggg ccggccctgc 420
ctgccctgga actctgccac tgtccttcag caaacgtacc atgcccacag atctgatgct 480
cttcagctgg gcctggggaa acataattac tgcaggaacc cagacaaccg gaggcgaccc 540
tggtgctatg tgcaggtggg cctaaagccg cttgtccaag agtgcatggt gcatgactgc 600
gcagatggaa aaaagccctc ctctcctcca gaagaattaa aatttcagtg tggccaaaag 660
actctgaggc cccgctttaa gattattggg ggagaattca ccaccatcga gaaccagccc 720
tggtttgcgg ccatctacag gaggcaccgg gggggctctg tcacctacgt gtgtggaggc 780
agcctcatca gcccttgctg ggtgatcagc gccacacact gcttcattga ttacccaaag 840
aaggaggact acatcgtcta cctgggtcgc tcaaggctta actccaacac gcaaggggag 900
atgaagtttg aggtggaaaa cctcatccta cacaaggact acagcgctga cacgcttgct 960
caccacaatg acattgcctt gctgaagatc cgttccaagg agggcaggtg tgcgcagcca 1020
tcccggacta tacagaccat ctgcctgccc tcgatgtata acgatcccca gtttggcaca 1080
agctgtgaga tcactggctt tggaaaagag aattctaccg actatctcta tccggagcag 1140
ctgaaaatga ctgttgtgaa gctgatttcc caccgggagt gtcagcagcc ccactactac 1200
ggctctgaag tcaccaccaa aatgctgtgt gctgctgacc cacagtggaa aacagattcc 1260
tgccagggag actcaggggg acccctcgtc tgttccctcc aaggccgcat gactttgact 1320
ggaattgtga gctggggccg tggatgtgcc ctgaaggaca agccaggcgt ctacacgaga 1380
gtctcacact tcttaccctg gatccgcagt cacaccaagg aagagaatgg cctggccctc 1440
gaagaagata cctctgaaaa agatgagctc 1470
<210> 7
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
taggctcaga ggcacacagg agtttctggg ctcaccctgc ccccttccaa cccctcagtt 60
cccatcctcc agcagctgtt tgtgtgctgc ctctgaagtc cacactgaac aaacttcagc 120
ctactcatgt ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct 180
ccctgcctgc tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac 240
ctccaacatc cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg 300
tggtttaggt agtgtgagag gggtacccgg ggatcttgct accagtggaa cagccactaa 360
ggattctgca gtgagagcag agggccagct aagtggtact ctcccagaga ctgtctgact 420
cacgccaccc cctccacctt ggacacagga cgctgtggtt tctgagccag gtacaatgac 480
tcctttcggt aagtgcagtg gaagctgtac actgcccagg caaagcgtcc gggcagcgta 540
ggcgggcgac tcagatccca gccagtggac ttagcccctg tttgctcctc cgataactgg 600
ggtgaccttg gttaatattc accagcagcc tcccccgttg cccctctgga tccactgctt 660
aaatacggac gaggacaggg ccctgtctcc tcagcttcag gcaccaccac tgacctggga 720
cagtgaatga tccccctgat ctgcggcctc gacggtatcg at 762
<210> 8
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 9
<211> 2756
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
taggctcaga ggcacacagg agtttctggg ctcaccctgc ccccttccaa cccctcagtt 60
cccatcctcc agcagctgtt tgtgtgctgc ctctgaagtc cacactgaac aaacttcagc 120
ctactcatgt ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct 180
ccctgcctgc tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac 240
ctccaacatc cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg 300
tggtttaggt agtgtgagag gggtacccgg ggatcttgct accagtggaa cagccactaa 360
ggattctgca gtgagagcag agggccagct aagtggtact ctcccagaga ctgtctgact 420
cacgccaccc cctccacctt ggacacagga cgctgtggtt tctgagccag gtacaatgac 480
tcctttcggt aagtgcagtg gaagctgtac actgcccagg caaagcgtcc gggcagcgta 540
ggcgggcgac tcagatccca gccagtggac ttagcccctg tttgctcctc cgataactgg 600
ggtgaccttg gttaatattc accagcagcc tcccccgttg cccctctgga tccactgctt 660
aaatacggac gaggacaggg ccctgtctcc tcagcttcag gcaccaccac tgacctggga 720
cagtgaatga tccccctgat ctgcggcctc gacggtatcg ataagcttgg cattccggta 780
ctgttggtaa agccaccatg cacaggagga gaagcaggag ctgtcgggaa gatcagaagc 840
cagtcatcga tgatcagcgc gaccttatct ccaacaatga gcaactgccc atgctgggcc 900
ggcgccctgg ggccccggag agcaagtgca gccgcggagc cctgtacaca ggcttttcca 960
tcctggtgac tctgctcctc gctggccagg ccaccaccgc ctacttcctg taccagcagc 1020
aggttccatc gaactgtgac tgtctaaatg gaggaacatg tgtgtccaac aagtacttct 1080
ccaacattca ctggtgcaac tgcccaaaga aattcggagg gcagcactgt gaaatagata 1140
agtcaaaaac ctgctatgag gggaatggtc acttttaccg aggaaaggcc agcactgaca 1200
ccatgggccg gccctgcctg ccctggaact ctgccactgt ccttcagcaa acgtaccatg 1260
cccacagatc tgatgctctt cagctgggcc tggggaaaca taattactgc aggaacccag 1320
acaaccggag gcgaccctgg tgctatgtgc aggtgggcct aaagccgctt gtccaagagt 1380
gcatggtgca tgactgcgca gatggaaaaa agccctcctc tcctccagaa gaattaaaat 1440
ttcagtgtgg ccaaaagact ctgaggcccc gctttaagat tattggggga gaattcacca 1500
ccatcgagaa ccagccctgg tttgcggcca tctacaggag gcaccggggg ggctctgtca 1560
cctacgtgtg tggaggcagc ctcatcagcc cttgctgggt gatcagcgcc acacactgct 1620
tcattgatta cccaaagaag gaggactaca tcgtctacct gggtcgctca aggcttaact 1680
ccaacacgca aggggagatg aagtttgagg tggaaaacct catcctacac aaggactaca 1740
gcgctgacac gcttgctcac cacaatgaca ttgccttgct gaagatccgt tccaaggagg 1800
gcaggtgtgc gcagccatcc cggactatac agaccatctg cctgccctcg atgtataacg 1860
atccccagtt tggcacaagc tgtgagatca ctggctttgg aaaagagaat tctaccgact 1920
atctctatcc ggagcagctg aaaatgactg ttgtgaagct gatttcccac cgggagtgtc 1980
agcagcccca ctactacggc tctgaagtca ccaccaaaat gctgtgtgct gctgacccac 2040
agtggaaaac agattcctgc cagggagact cagggggacc cctcgtctgt tccctccaag 2100
gccgcatgac tttgactgga attgtgagct ggggccgtgg atgtgccctg aaggacaagc 2160
caggcgtcta cacgagagtc tcacacttct taccctggat ccgcagtcac accaaggaag 2220
agaatggcct ggccctcgaa gaagatacct ctgaaaaaga tgagctccac cggtcgatga 2280
tctctctgat tgccgctctg gccgtggact acgtgatcgg gatggaaaac gctatgccat 2340
ggaatctgcc cgccgatctg gcttggttca agaggaacac cctgaacaag ccagtgatca 2400
tgggcagaca cacttgggag tccattggcc ggcccctgcc tggacgcaag aacatcattc 2460
tgagctccca gccctctacc gacgacaggg tgacatgggt gaaaagtgtg gacgaagcca 2520
ttgccgcttg cggagatgtg cccgagatca tggtcatcgg cggagggaga gtgatcgagc 2580
agttcctgcc taaggcccag aaactgtacc tgactcacat tgacgctgag gtggaagggg 2640
acacccattt tcctgattat gagccagacg attgggaaag cgtgttctcc gagtttcacg 2700
acgccgatgc tcagaattct catagttatt gctttgagat cctggaaagg agataa 2756
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
cccgggcgcg actagttagg ctcagaggca cacagg 36
<210> 11
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
gcccccatgg gtcgacttat ctcctttcca ggatctcaaa gcaataact 49

Claims (6)

1.一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体，其特征在于，所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体包括时空调控uPA基因表达盒，所述时空调控uPA基因表达盒依次包括：肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域、poly A元件，所述uPA突变基因为***了内质网滞留信号基因的uPA基因，其中，所述uPA突变基因为C端添加了C端内质网滞留信号基因及N端添加了N端内质网滞留信号基因的uPA基因，所述uPA突变基因的碱基序列如SequenceNo.6所示，所述C端内质网滞留信号碱基序列如Sequence No.3所示，所述N端内质网滞留信号碱基序列如Sequence No.5所示，所述不稳定结构域碱基序列如Sequence No.1所示。
2.根据权利要求1所述的时空调控型uPA基因表达非病毒载体，其特征在于，所述肝特异性启动子选自载脂蛋白E启动子、白蛋白启动子、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子、α-1-抗胰蛋白酶启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、α-甲胎蛋白启动子、醇脱氢酶启动子、IGF-II启动子、因子VIII启动子、HBV基础核心蛋白启动子、HBV前s2蛋白启动子、甲状腺素-结合球蛋白启动子、HCR-Ap0CII的杂合启动子、HCR-hAAT杂合启动子、与小鼠白蛋白基因的增强子元件结合的AAT启动子、低密度脂蛋白启动子、丙酮酸激酶启动子、卵磷脂-胆固醇酰基转移酶启动子、载脂蛋白H启动子、铁传递蛋白启动子、甲状腺素运载蛋白启动子、α-纤维蛋白原及β-纤维蛋白原的启动子、α-1-抗糜蛋白酶启动子、α-2-HS糖蛋白启动子、触珠蛋白启动子、血浆铜蓝蛋白启动子、血纤维蛋白溶酶原启动子、补体蛋白启动子、补体C3激活子的启动子、血液结合素启动子及α-1-酸性糖蛋白启动子的任意一种。
3.一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体的制备方法，包括如下步骤：
合成肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域的DNA片段；
将上述DNA片段***载体的多克隆位点，得到所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体，所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体包括时空调控uPA基因表达盒，所述时空调控uPA基因表达盒依次包括：肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域；所述uPA突变基因为***了内质网滞留信号基因的uPA基因；其中，所述uPA突变基因为C端添加了C端内质网滞留信号基因及N端添加了N端内质网滞留信号基因的uPA基因，所述uPA突变基因的碱基序列如Sequence No.6所示，所述C端内质网滞留信号碱基序列如Sequence No.3所示，所述N端内质网滞留信号碱基序列如Sequence No.5所示，所述不稳定结构域碱基序列如Sequence No.1所示。
4.根据权利要求3所述的时空调控型uPA基因表达非病毒载体的制备方法，其特征在于，
按照载脂蛋白E启动子、uPA突变基因和不稳定结构域的顺序依次合成DNA片段；
将上述DNA片段***载体pMC.BESXP的多克隆位点，得到所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体，所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体包括时空调控uPA基因表达盒，所述时空调控uPA基因表达盒依次包括：载脂蛋白E启动子、uPA突变基因和不稳定结构域；其中，所述uPA突变基因为***了内质网滞留信号基因的uPA基因，所述内质网滞留信号基因添加于uPA基因的C端及N端。
5.根据权利要求4所述的时空调控型uPA基因表达非病毒载体的制备方法，其特征在于，
用于所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体的转化的基因工程菌为ZYCY10P3S2T。
6.权利要求1所述的时空调控型uPA基因表达非病毒载体在制备人源化嵌合体肝脏模型中的应用。
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