CN110229215A - 一种药物缓释多肽水凝胶及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多肽水凝胶，它是将自组装肽水溶液、肝素钠水溶液、肝细胞生长因子(HGF)水溶液和TNF‑ɑ抗体(anti‑TNF‑ɑ)混合制备而成的多肽水凝胶。本发明还公开了前述多肽水凝胶的制备方法和用途。本发明多肽水凝胶具有良好的药物缓释作用及肾脏生物相容性，通过添加肝素钠，达到序贯先后释放anti‑TNF‑ɑ与HGF的目的，本发明多肽水凝胶能有效抑制急性肾损伤(AKI)后肾小管细胞凋亡，降低NGAL表达量，减轻肾脏炎症反应，促进肾小管细胞去分化和增殖，具有延长anti‑TNF‑ɑ与HGF半衰期、充分发挥蛋白药物在不同时期的功效、降低肾损伤程度，促进受损肾脏修复的作用，临床应用前景良好。

Description

一种药物缓释多肽水凝胶及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种治疗缺血性肾损伤的药物缓释多肽水凝胶。

背景技术

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是一种常见临床急症，以肾功能迅速下降为临床特点，最终导致急性肾衰竭，甚至引起其他器官衰竭。AKI的引发因素有很多，如缺血/再灌注、手术对比剂的应用、服用药物不当、横纹肌溶解症、感染等。近年来，AKI的发病率不断升高，住院患者AKI发病率达1％-5％，并迅速增长。目前，在临床治疗过程中，仍缺乏有效的AKI预防和治疗药物，发生AKI后，患者虽进行常规治疗使肾脏功能得到了一定改善，但很难实现完全恢复的治疗目标。而受损肾脏的不完全修复将导致慢性肾脏炎症反应、纤维化等一系列病理改变，增加其向慢性肾病(CKD)转归及发生终末期肾病(ESRD)的风险。由于AKI发病率一直居高不下，其诱发CKD呈逐年增长趋势，给社会经济和公共健康造成了巨大的影响。因此研发一种有效的促肾脏损伤修复的疗法具有重要意义

促炎因子在AKI后肾损伤中发挥了关键作用，肿瘤坏死因子-ɑ(tumor necrosisfactors-ɑ，TNF-ɑ)是一种由缺血再灌注、脂多糖、内毒素等刺激产生的巨噬细胞产物，也可以由肾小球细胞合成，其通过细胞凋亡方式对内皮细胞发挥直接的细胞毒作用、血管收缩和降低肾脏血流及聚集中性粒细胞和单核细胞等作用损伤肾功能，因此通过抑制肾脏组织中TNF-ɑ表达及活性可有效改善缺血再灌注诱导的肾脏损伤。

肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一种多效性生长因子，主要由***产生，通过自分泌和旁分泌方式作用于上皮细胞、内皮细胞以及***本身，具有促有丝***、促细胞形态形成和调节细胞活动的功能，从而对损伤的器官和组织进行修复。有研究已证明，在急性肾损伤时给予外源性HGF可以保护肾小管上皮细胞、重建肾小管结构和维持肾功能完整性。

抗体和生长因子均属于蛋白类药物，在生物医药领域已得到广泛应用。由于蛋白对体内多种组织细胞均有可能发挥作用，***性过量使用会导致潜在风险；而且蛋白在体内的半衰期较短，易失去生物活性。因此，有必要设计缓释载体来递送抗体和生长因子从而提升其治疗疗效。

自组装肽是由人类设计，由氨基酸通过固相合成制备的纳米材料，其在离子盐等诱导下可从溶液状态快速转换形成具有三维空间结构的多肽水凝胶。多肽水凝胶降解时只形成氨基酸，对机体不会产生不良影响；当导入机体后，不会引起免疫反应和组织炎症，是一种应用前景良好的药物载体缓释材料。

虽然，anti-TNF-ɑ与HGF对肾损伤都有修复作用，但是作用时间并不相同；anti-TNF-ɑ主要在肾脏损伤早期发挥较好的抗炎作用，而HGF在稍后肾脏修复期发挥生物学效应。因此，制备一种多肽水凝胶，序贯先后释放anti-TNF-ɑ与HGF，达到同时减低肾脏炎症损伤、促进肾脏修复的双重目的，对治疗肾损伤显得尤为重要。

发明内容

本发明提供了一种药物缓释多肽水凝胶，及其制备方法和用途。

本发明设计的自组装肽，通过精氨酸(R)携带的正电荷与带有负电荷的肝素钠(Hep)分子相互结合，再通过肝素与生长因子间的亲和作用，达到显著延长肝细胞生长因子HGF释放的作用。

本发明提供了一种自组装肽，它的氨基酸序列为KLDLKLDLKLDLR(SEQ ID NO：1)。

本发明提供了一种多肽水凝胶，它是由前述的自组装肽的水溶液所形成。

其中，所述的水溶液中还含有肝素钠、肝细胞生长因子和TNF-ɑ抗体。

其中，它是由下述重量配比的原料组成：

TNF-ɑ抗体溶液1-5体积份、肝细胞生长因子0.3-1重量份、肝素钠0.5-3重量份、自组装肽50-300重量份，加水至20-40体积份；

其中，所述的TNF-ɑ抗体溶液的浓度为0.5-10mg/ml；

其中所述的重量份：体积份为μg：μl。

其中，它是由下述重量配比的原料组成：

TNF-ɑ抗体溶液2体积份、肝细胞生长因子0.5重量份、肝素钠1重量份、自组装肽100重量份，加水至25体积份；

其中，所述的TNF-ɑ抗体溶液的浓度为1mg/ml。

本发明还提供了一种制备前述的多肽水凝胶的方法，它包含如下步骤：

(1)将50-300重量份自组装肽干粉溶于8-15体积份水中，配制成自组装肽水溶液；将0.5-3重量份肝素钠干粉溶于0.5-3体积份水中，配制成肝素钠水溶液；将0.3-1重量份肝细胞生长因子干粉溶于3-10体积份水中，配制肝细胞生长因子水溶液；取1-5体积份的TNF-ɑ抗体溶液；

(2)取步骤(1)得到的4种溶液，加水至20-40体积份，混均，即得多肽水凝胶；

其中，所述的TNF-ɑ抗体溶液的浓度为0.5-10mg/ml。

其中，它包含如下步骤：

(1)将100重量份自组装肽干粉溶于10体积份无菌蒸馏水中，配制成自组装肽水溶液；将1重量份肝素钠干粉溶于1体积份无菌蒸馏水中，配制成肝素钠水溶液；将0.5重量份肝细胞生长因子干粉溶于5体积份无菌蒸馏水中，配制干肝细胞生长因子水溶液；取2体积份的TNF-ɑ抗体溶液；

(2)取步骤(1)得到的4种溶液，加7体积份的无菌蒸馏水，混均，总共25体积份，即得多肽水凝胶；

其中，所述的TNF-ɑ抗体溶液的浓度为1mg/ml。

本发明最后提供了一种多肽水凝胶在制备治疗急性肾损伤的多肽水凝胶中的用途。

其中，所述的多肽水凝胶能抑制急性肾损伤导致的肾小管细胞凋亡，降低NGAL表达量，减轻肾脏炎症反应，促进受损肾脏修复。

其中，所述的多肽水凝胶能提高Ki67细胞阳性率、促进Pax2表达，促进肾小管细胞去分化和增殖。

本发明多肽水凝胶对anti-TNF-ɑ与HGF均有缓释作用，但释放速率不同。水凝胶对anti-TNF-ɑ的缓释是通过其交联的纳米纤维结构减缓分子扩散实现，因此对anti-TNF-ɑ释放较快，使其可以在肾脏损伤早期发挥较好的抗炎作用。通过水凝胶中结合的肝素与生长因子的亲和作用，从而保持HGF的生物活性并缓慢释放，使其在稍后肾脏修复期发挥生物学效应。本发明通过可注射的自组装肽/肝素钠水凝胶，达到序贯先后释放anti-TNF-ɑ与HGF的目的，从而具有同时减低肾脏炎症损伤、促进肾脏修复的双重作用。

本发明多肽水凝胶具有良好的药物缓释作用及肾脏生物相容性，通过添加肝素钠，达到序贯先后释放anti-TNF-ɑ与HGF的目的，本发明多肽水凝胶能有效抑制AKI诱导的肾小管细胞凋亡，降低NGAL表达量，减轻肾脏炎症反应，促进肾小管细胞去分化和增殖，具有延长anti-TNF-ɑ与HGF半衰期、充分发挥蛋白药物在不同时期的功效、降低肾脏的损伤程度的作用，临床应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1水凝胶中HGF与anti-TNF-ɑ累计释放曲线；

图2Cy7标记HGF/Gel肾包膜注射后活体荧光成像图；

图3水凝胶肾包膜注射后肾脏病理染色；

图4水凝胶缓控释HGF与anti-TNF-ɑ减缓肾损伤；

图5水凝胶缓控释HGF与anti-TNF-ɑ降低肾脏炎症反应；

图6水凝胶缓控释HGF与anti-TNF-ɑ促进AKI后肾小管修复。

具体实施方式

实施例1本发明药物缓释多肽水凝胶的制备

根据本发明治疗所需，使用该水凝胶缓释HGF与anti-TNF-ɑ，根据预实验结果(治疗效果)，实验动物(C57小鼠)及施用部位(小鼠肾包膜)确定缓释体系如下：

1)自组装短肽KLD1R(序列：n-KLDLKLDLKLDLR-c)由上海波泰生物科技合成纯化，100ug干粉溶解于10μl无菌水中，配制成10mg/ml的储液，取10μl加入1.5ml的EP管中；

2)将1ug肝素钠(购自Sigma公司)干粉溶解于1μl无菌水中，配制成1mg/ml的储液，取1μl加入EP管中；

3)将0.5ugHGF(购自义翘神州生物公司)干粉溶解于5μl无菌水中，配制成0.1mg/ml的储液，取5μl加入EP管中；

4)取2μl抗小鼠TNF-ɑ抗体(购自Biolegend公司，1mg/ml)加入EP管中。

5)再在EP管中，加入7μl无菌水，共计25μl，胰岛素注射器吹打混匀，即得本发明药物缓释多肽水凝胶。

实施例2本发明药物缓释多肽水凝胶的制备

1)自组装短肽KLD1R(序列：n-KLDLKLDLKLDLR-c)由上海波泰生物科技合成纯化，50ug干粉溶解于8μl无菌水中，配制成自组装肽水溶液，加入1.5ml的EP管中；

2)将0.5ug肝素钠(购自Sigma公司)干粉溶解于0.5μl无菌水中，配制成肝素钠水溶液，加入EP管中；

3)将0.3ug HGF(购自义翘神州生物公司)干粉溶解于3μl无菌水中，配制成肝细胞生长因子水溶液，加入EP管中；

4)取1μl抗小鼠TNF-ɑ抗体(购自Biolegend公司)，浓度为0.5mg/ml，加入EP管中；

5)再在EP管中，加入7.5μl无菌水，共计20μl，胰岛素注射器吹打混匀，即得本发明药物缓释多肽水凝胶。

实施例3本发明药物缓释多肽水凝胶的制备

1)自组装短肽KLD1R(序列：n-KLDLKLDLKLDLR-c)由上海波泰生物科技合成纯化，300ug干粉溶解于15μl无菌水中，配制成自组装肽水溶液，加入1.5ml的EP管中；

2)将3ug肝素钠(购自Sigma公司)干粉溶解于3μl无菌水中，配制成肝素钠水溶液，加入EP管中；

3)将1ug HGF(购自义翘神州生物公司)干粉溶解于10μl无菌水中，配制成肝细胞生长因子水溶液，加入EP管中；

4)取5μl抗小鼠TNF-ɑ抗体(购自Biolegend公司)，浓度为10mg/ml，加入EP管中；

5)再在EP管中，加入7μl无菌水，共计40μl，胰岛素注射器吹打混匀，即得本发明药物缓释多肽水凝胶。

以下通过具体药效学实验证明本发明的有益效果：

试验例1本发明药物缓释多肽水凝胶的缓释实验

1实验材料

自组装短肽KLD1R(序列：n-KLDLKLDLKLDLR-c)

FITC标记抗小鼠TNF-ɑ抗体(Biolegend)

重组HGF(义翘神州生物公司)

肝素钠(Sigma)

HGF检测ELISA试剂盒(达科为公司)

1.5ml EP管(Becton,Dickinson and Company)

10μl、200μl、1ml移液枪枪头(Eppendorf)

PBS溶液(0.1M，pH＝7.2)

NaHCO₃溶液(1M)

缓释buffer(含0.3％(w/v)BSA的PBS)

Cy7荧光染料(Solarbio)

Balb/c小鼠(8周龄)

戊巴比妥钠(Merck)

动物实验相关器械(1ml注射器，剃毛刀，碘伏，眼科剪，眼科镊，棉签，纱布，手术巾，缝合针，缝合线等)

2实验方法

2.1自组装多肽水凝胶体外序贯释放anti-TNF-ɑ和HGF

按实施例1配制50μl药物水凝胶，置于1.5ml EP管管底，小心加入200μl缓释buffer，置于37℃恒温箱中避光孵育，于固定时间点小心吸取上清检测其HGF与anti-TNF-ɑ含量，并再次加入200μl新鲜缓释buffer。其中HGF含量按ELISA试剂盒说明书进行操作，anti-TNF-ɑ含量使用荧光酶标仪读取荧光值进行计算。根据上清中HGF与anti-TNF-ɑ含量计算释放率并绘制释放曲线。

2.2自组装多肽水凝胶体内缓释HGF

根据实验成本及实验意义，本部分仅在动物体内展示自组装肽缓释HGF。

动物分组：Free-HGF，Gel-HGF，Gel三组

1)根据Cy7荧光染料说明书分别标记HGF与水凝胶，并通过超滤去除游离荧光探针。

2)Balb/c小鼠，戊巴比妥钠腹腔注射，麻醉，碘伏消毒备皮。

3)做腹正中线切口，逐层分离皮肤肌肉，暴露肾脏。

4)按照分组，每组3只，分别给以小鼠单肾(左肾)肾包膜给药，各组给药成分如下表所示。

5)缝合小鼠切口，于小鼠活体成像***(In-Vivo Xtreme)上进行第一次图像采集，并记录为0时实验结果。

6)图像采集完后，将小鼠送回动物房正常饲养。再分别于24h，72h，120h后腹腔注射给予戊巴比妥钠麻醉小鼠后进行活体成像。

7)120h后先进行动物整体活体成像后处死小鼠，并收集其肝脏，脾脏，肾脏，小肠进行成像。

3实验结果

3.1自组装多肽水凝胶体外序贯释放anti-TNF-ɑ和HGF

将包裹有肝素钠、anti-TNF-ɑ和HGF的水凝胶置于缓释缓冲液中，检测各时间点上清中anti-TNF-ɑ和HGF，绘制释放曲线。结果表明，水凝胶对anti-TNF-ɑ和HGF具有良好的缓释作用。anti-TNF-ɑ释放速率显著高于HGF，在24h时累积释放率即达到50％，48h后进入平台期，而HGF在水凝胶中的呈现持续缓慢的释放。(如图1所示)

3.2自组装多肽水凝胶体内缓释HGF

将Cy7标记的HGF(Free-HGF)，包裹在水凝胶的Cy7标记的HGF(Gel-HGF)及Cy7标记的水凝胶(Gel)分别注射于小鼠肾包膜下，并于各检测点进行活体荧光成像。结果表明，游离HGF在小鼠体内代谢较快，24小时后已检测不到Cy7标记的HGF。包裹于水凝胶中的HGF在3-5天仍能检测到，将Cy7标记的水凝胶可见0-5天荧光一直集中于肾脏部位(图2A)。5天后取材，将小鼠肝脏，脾，小肠，肾脏进行荧光成像，可见Cy7标记的水凝胶驻留于肾脏，水凝胶注射后可较长时间存留在注射部位。虽然水Gel-HGF组在腹腔部位检测到荧光信号，但肾脏未检测到荧光，表明水凝胶有效减缓了HGF在动物体内的释放。(如图2B所示)

从上述结果可知，本发明药物缓释多肽水凝胶在体内及体外对anti-TNF-ɑ和HGF具有良好的缓释作用。

试验例2本发明药物缓释多肽水凝胶的肾脏生物相容性

1实验材料

C57小鼠(6-8周龄)

戊巴比妥钠(merck)

动物实验相关器械(1ml注射器，剃毛刀，碘伏，眼科剪，眼科镊，棉签，纱布，手术巾，缝合针，缝合线等)

组织病理检测相关试剂(组织固定，包埋，切片，染色)

2实验方法

为了研究该自组装多肽水凝胶生物相容性，小鼠肾包膜给以水凝胶注射，并通过组织病理染色评价其影响。具体操作如下：

1)水凝胶配制(一个肾的体系)，取10μl配好的10mg/ml的自组装多肽储液，加入10μl无菌水，用胰岛素注射器吹打混匀待用。

2)C57小鼠，戊巴比妥钠腹腔注射，麻醉，碘伏消毒备皮。

3)做腹正中线切口，逐层分离皮肤肌肉，暴露肾脏。

4)小鼠随机分成对照组(3只)，Gel组(9只)，分别给以小鼠单肾(左肾)肾包膜20μl生理盐水或水凝胶。

5)分别于术后24h，72h，120h处死Gel组三只小鼠，正常组于120h时处死，收集小鼠肾脏。

6)小鼠肾脏提取总RNA，进行荧光定量PCR(qPCR)检测炎症因子表达情况。

7)小鼠肾脏进行HE和Masson染色，镜检评价肾脏组织结构及病变情况。

3实验结果

自组装肽水凝胶注射小鼠给以肾包膜后，分别于术后24h，48h，72h取材并进行qPCR检测及HE染色，结果表明水凝胶注射对肾脏正常结构及炎症因子如HMGB1、IL-1β和ICAM-1均无明显影响，Masson染色结果也表明水凝胶注射不影响肾脏胶原纤维表达。(如图3所示)

从上述结果可知，本发明药物缓释多肽水凝胶对肾脏正常结构无明显影响，具有良好的肾脏生物相容性。

试验例3本发明药物缓释多肽水凝胶缓释anti-TNF-ɑ和HGF治疗缺血性急性肾损伤验证

1实验材料

自组装短肽KLD1R

抗小鼠TNF-ɑ抗体(Biolegend)

重组HGF(义翘神州生物公司)

肝素钠(Sigma)

1.5ml EP管(Becton,Dickinson and Company)

10μl、200μl、1ml移液枪枪头(Eppendorf)

胰岛素注射器

生理盐水

C57小鼠(6-8周龄)

戊巴比妥钠(Merck)

动物实验相关器械(1ml注射器，剃毛刀，碘伏，眼科剪，眼科镊，动脉夹，计时器，棉签，纱布，手术巾，缝合针，缝合线等)

组织病理染色相关试剂(组织固定，包埋，切片，染色)

组织冰冻切片包埋剂以及切片免疫荧光染色所需试剂(组织固定，封闭，染色)

TUNEL染色试剂盒(Promega)

免疫荧光染色一抗：IL-1β(ABclonal)，ICAM-1(Proteintech)，FN(ABclonal)，α-SMA(Abcam)，Pax2(ABclonal)，Ki67(GeneTex)，NGAL(ABclonal)

免疫荧光染色二抗：FITC/TRITC标记山羊抗兔/小鼠荧光二抗RNA提取及RT-PCR相关试剂

2实验方法

为了研究该自组装多肽水凝胶缓释anti-TNF-ɑ和HGF治疗缺血性急性肾损伤的效果，通过C57小鼠肾动脉夹闭构建缺血再灌注急性肾损伤模型，并于肾包膜给以干预，通过组织病理染色，Real time-PCR及组织免疫荧光染色等综合评价其治疗效果。具体操作如下：

1)按下表分别配制各组试剂，用胰岛素注射器吹打混匀待用。

2)C57小鼠，戊巴比妥钠腹腔注射，麻醉，碘伏消毒备皮。

3)做腹正中线切口，逐层分离皮肤肌肉，暴露肾脏。

4)根据分组除了con组外，其余组小鼠均给以30min双肾动静脉夹闭30min，夹闭后可见肾脏因缺血变黑。

5)30min后取下动脉夹，可见肾脏血流恢复，肾脏颜色逐渐恢复正常，表明造模完成。

6)根据表中所示各组的干预体系，进行肾包膜注射，con组和AKI组注射生理盐水。

7)缝合手术切口，伤口消毒后，小鼠送回动物房继续正常喂养。

8)分别于术后24h，72h，120h处死小鼠，收集小鼠血清及肾脏。

9)自动生化检测仪(罗氏)检测小鼠血清肌酐(CREA)、尿素氮(UREAL)浓度。

10)小鼠肾脏进行HE，Masson染色，镜检评价肾脏组织结构病变情况以及纤维化水平。

11)肾脏进行冰冻切片，进行TUNEL染色，评价肾小管细胞凋亡情况。12)肾脏组织提取RNA，RT-PCR检测炎症，纤维化相关蛋白RNA表达水平。

13)肾脏组织冰冻切片进行免疫荧光染色，检测肾脏损伤标志物NGAL，肾脏炎症，纤维化相关蛋白表达水平。

14)肾脏组织取石蜡切片进行免疫组化染色，检测肾脏炎症、肾小管再生及纤维化话蛋白表达。

3实验结果

3.1Gel序贯释放anti-TNF-ɑ和HGF减缓肾损伤

通过肾脏缺血再灌注建立小鼠急性肾损伤(AKI)模型，肾包膜下注射HGF/anti-TNF-ɑ(Free组)或包裹于水凝胶中的HGF/anti-TNF(Gel组)进行干预，72小时后取材进行检测。血生化结果显示，Gel组小鼠肾功能指标血肌酐和尿素氮均低于AKI模型组和Free组(图4A)。HE结果表明，AKI组小鼠肾脏肾小管管腔扩张，蛋白管型形成，部分小管刷状缘脱落，而Gel组肾小管损伤程度显著降低，且低于Free组。TUNEL染色显示AKI组肾小管细胞大量阳性，表明其肾小管细胞大量凋亡；与Free组相比，Gel组TUNEL阳性凋亡细胞数量明显减少，表明其缓释anti-TNF-ɑ有效抑制炎症诱导的肾小管细胞凋亡。NGAL(中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白-2)是早期且敏感的肾损伤生物标志物。免疫荧光染色结果表明，正常肾组织中其表达量极低，AKI组肾小管大量表达，与Free组相比Gel组NGAL表达量显著降低，指示肾损伤程度降低。(如图4所示)

3.2Gel序贯释放anti-TNF-ɑ和HGF降低肾脏炎症反应

手术后72小时小鼠取材，并通过Real time-PCR检测肾组织中炎症及促凋亡基因表达。结果表明，AKI组肾组织中促凋亡基因Bax表达显著升高，其与TUNEL染色结果吻合。同时AKI组小鼠肾脏大量表达炎症因子IL-1β和IL-6，免疫荧光染色也表明AKI诱导肾小管高表达IL-1β。免疫组化结果显示，Gel组中CD68阳性巨噬细胞数量级趋化因子MCP-1表达较Free组和AKI组明显降低。综上所述，Gel组Free组相比其更能有效降低AKI的肾脏炎症反应及凋亡程度。(如图5所示)

3.3Gel序贯释放anti-TNF-ɑ和HGF促进肾脏修复

受损的肾脏具有一定的自我修复能力，其主要依赖于肾脏固有细胞的去分化和增殖。免疫荧光染色检测肾脏组织Ki67表达，结果表明正常肾脏组织细胞基本不增值，AKI组小管细胞呈现少量Ki67阳性，表明残存的肾小管细胞开始增殖，肾脏修复过程启动。Gel干预组Ki67细胞阳性率显著高于AKI及Free组。Pax2是肾小管细胞去分化的标志物，正常肾脏细胞不表达，损伤肾脏出现表达，且Gel干预组表达较AKI及Free组显著升高。免疫组化结果显示，Gel组小鼠肾脏组织中的PCNA阳性增殖细胞和Pax2阳性细胞数均高于Free组。本部分实验结果表明，通过自组装肽水凝胶缓释HGF可有效促进肾小管细胞去分化和增殖。(如图6所示)

从上述结果可知，本发明药物缓释水凝胶能有效抑制AKI的肾小管细胞凋亡，降低NGAL表达量，减轻肾脏炎症反应，有效促进肾小管细胞去分化和增殖，促进受损肾脏修复的作用。

综上，本发明多肽水凝胶具有良好的药物缓释作用及肾脏生物相容性，通过添加肝素，达到序贯先后释放anti-TNF-ɑ与HGF的目的，本发明多肽水凝胶能有效抑制AKI的肾小管细胞凋亡，降低NGAL表达量，减轻肾脏炎症反应，促进肾小管细胞去分化和增殖，具有延长anti-TNF-ɑ与HGF半衰期、充分发挥蛋白药物在不同时期的功效、降低肾损伤程度，促进受损肾脏修复再生的作用，临床应用前景良好。

[0001] 序列表

<110> 四川大学华西医院

<120>一种药物缓释多肽水凝胶及其制备方法和用途

<130> GY026-18P1091

<141> 2018-03-05

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工合成序列(artificial synthesis)

<400> 1

Lys Leu Asp Leu Lys Leu Asp Leu Lys Leu Asp LeuArg

1 5 10

Claims (10)

1.一种自组装肽，其特征在于：

它的氨基酸序列为KLDLKLDLKLDLR(SEQ ID NO：1)。

2.一种多肽水凝胶，其特征在于：

它是由权利要求1所述的自组装肽的水溶液所形成。

3.根据权利要求2所述的多肽水凝胶，其特征在于：

所述的水溶液中还含有肝素钠、肝细胞生长因子和TNF-ɑ抗体。

4.根据权利要求2或3所述的多肽水凝胶，其特征在于：它是由下述重量配比的原料组成：

TNF-ɑ抗体溶液1-5体积份、肝细胞生长因子0.3-1重量份、肝素钠0.5-3重量份、自组装肽50-300重量份，加水至20-40体积份；

其中，所述的TNF-ɑ抗体溶液的浓度为0.5-10mg/ml。

5.根据权利要求4所述的多肽水凝胶，其特征在于：它是由下述重量配比的原料组成：

TNF-ɑ抗体溶液2体积份、肝细胞生长因子0.5重量份、肝素钠1重量份、自组装肽100重量份，加水至25体积份；

其中，所述的TNF-ɑ抗体溶液的浓度为1mg/ml。

6.一种制备权利要求2-5任意一项所述的多肽水凝胶的方法，其特征在于：它包含如下步骤：

(1)将50-300重量份自组装肽干粉溶于8-15体积份水中，配制成自组装肽水溶液；将0.5-3重量份肝素钠干粉溶于0.5-3体积份水中，配制成肝素钠水溶液；将0.3-1重量份肝细胞生长因子干粉溶于3-10体积份水中，配制肝细胞生长因子水溶液；取1-5体积份的TNF-ɑ抗体溶液；

(2)取步骤(1)得到的4种溶液，加水至20-40体积份，混均，即得多肽水凝胶；

其中，所述的TNF-ɑ抗体溶液的浓度为0.5-10mg/ml。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，它包含如下步骤：

(1)将100重量份自组装肽干粉溶于10体积份无菌蒸馏水中，配制成自组装肽水溶液；将1重量份肝素钠干粉溶于1体积份无菌蒸馏水中，配制成肝素钠水溶液；将0.5重量份肝细胞生长因子干粉溶于5体积份无菌蒸馏水中，配制干肝细胞生长因子水溶液；取2体积份的TNF-ɑ抗体溶液；

(2)取步骤(1)得到的4种溶液，加7体积份的无菌蒸馏水，混均，总共25体积份，即得多肽水凝胶；

其中，所述的TNF-ɑ抗体溶液的浓度为1mg/ml。

8.权利要求2-5任意一种多肽水凝胶在制备治疗急性肾损伤的多肽水凝胶中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的多肽水凝胶能抑制急性肾损伤导致的肾小管细胞凋亡，降低NGAL表达量，减轻肾脏炎症反应，促进受损肾脏修复。

10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的多肽水凝胶能提高Ki67细胞阳性率、促进Pax2表达，促进肾小管细胞去分化和增殖。