CN110229208A - 一种化合物20(R)-人参皂苷Rg3的高效制备分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效直接水解制备分离化合物20(R)‑人参皂苷Rg3（ginsenoside Rg3，C₄₂H₇₂O₁₃，以下简称“Rg3”）的方法，具体涉及通过直接转化五加科人参属总皂苷一步法直接制备高纯度化合物Rg3的制备方法。具体制备方法包括：以氯化钡（BaCl₂）作反应催化剂，用乙酸水溶液与人参属总皂苷（如人参、西洋参和三七等）按比例混合，之后利用高温水浴反应制备人参皂苷Rg3粗品。利用不同乙醇浓度，不同水浴温度溶解，对所得所获的转化物进一步采用冷却、乙醇和乙酸乙酯溶剂法重结晶，制备高纯度Rg3的方法。本发明快速，高效，可有效节省Rg3的分离纯化时间，且经济安全，简便实用，得率高，可适合工艺化生产，极大地促进人参属植物有效成分的高效利用。

Description

一种化合物20(R)-人参皂苷Rg3的高效制备分离方法

技术领域

本发明属于天然化合物制备分离领域，具体涉及一种高效水解人参总皂苷制备20(R)-人参皂苷Rg3的方法。

背景技术

人参皂苷Rg3（ginsenoside Rg3）是存在于人参中的一种四环三萜类皂苷，现代药理学证明，人参皂苷Rg3有很强的药用的价值，具有抗癌、抗肿瘤，调节神经***，调节免疫功能，抑制衰老，对肝肾功能保护作用等多重药理活性（参见：Choi Y J, et al.Stimulation of DDX3 expression by ginsenoside Rg3 through the Akt/p53 pathwayactivates the innate immune response via TBK1/IKKε/IRF3 signaling, Curr Med Chem. 2014; 王青. 人参皂苷Rg3的抗肿瘤作用及其机制研究. 黑龙江医药, 2014, 27,296-300）。经临床试验表明，人参皂苷Rg3可有效抑制肝癌、肺癌、肠癌的生长，可明显改善临床症状，并制成抗癌新药上市，如“参一胶囊”，同时也有制成抗肿瘤的口服液及注射剂应用于临床。

然而，人参皂苷Rg3是一种稀有皂苷，在天然人参属植物中含量极低，质量百分比约为0.01~0.02%，经加工后才能大量产生；值得注意的是，人参皂苷Rg3天然存在两种构型，即20(S)-Rg3和20(R)-Rg3。经大量研究表明，R型药理活性明显强于S型，其药理活性是值得深入发掘的重点构型（参见：何波, 等. 20(R)-人参皂苷Rg-3对大鼠缺血再灌注后迟发性神经元损伤的保护作用. 时珍国医国药, 2016, 27, 35-38；李明晶, 等. 人参皂苷Rg3的研究进展. 中国老年学杂志, 2017, 37, 6000-6002），常见水解方式如酸、碱、酶及微生物等形式，通过水解人参皂苷可产生大量的人参皂苷Rg3。

其中，酸水解是制备人参皂苷Rg3最为常用的方法，经研究发现，当酸的强度、水解温度和水解时间控制不恰当时，容易造成水解不够或水解过度的现象，存在产率过低的问题。而且，目前酸水解一般先将人参皂苷进行分组得到二醇组人参皂苷后，再进行酸转化，但由于生产技术要求过高，常常会限制其应用和发展，并容易造成资源的浪费，且很难得到高纯度20(R)-人参皂苷Rg3，对其药理活性研究受到很大的限制。

例如：

CN 201210547486.1，公开一种利用人参总皂苷水解生产人参皂苷Rg3的方法，通过取人参总皂苷，用含乙醇体积-体积比为65%~70%、含乙酸质量-体积比为6%~8%的水溶液溶解，制成人参总皂苷质量-体积比为6%~7%的溶液，于水解罐中80~85℃水解90~100分钟。并结合大孔树脂脱盐、干燥后，所得干燥物人参皂苷Rg3质量比含量高20~30倍。

CN 201310654074.2，公布了一种快速非热制备稀有人参皂苷Rg3(S)的方法，涉及一种高压脉冲电场技术耦合酸水解制备方法，在常温下将人参皂苷Rb1酸性溶液混合均匀，酸度0.1~2%，电场强度为5~25kV/cm，脉冲数1~15，将有机溶剂离心，即可得到人参皂苷(S)-Rg3。

CN 201410385464.9，公开了一种制备人参皂苷Rg3的方法，利用人参二醇组人参皂苷用弱酸水解方法，通过在C-20位取代基处在保护剂保护下进行选择性水解，将人参皂苷Ra1，Ra2，Ra3，Rb1，Rb2，Rb3，Rc，Rd，notoginsenoside R4等结构相似，在C-20取代基通过酸解取代，从而获得人参皂苷Rg3。

CN 201510726006.1，公开了一种用三七叶总皂苷制备Rg3和Rh2的方法，所述三七皂苷为二醇组人参皂苷，利用微波水解和纯化，通过无机酸水溶液（盐酸和醋酸）浓度0.2~4M，在微波反应器中温度50~103℃水解5~60min，再通过大孔树脂层脱酸，洗脱浓缩得人参皂苷Rg3、Rh2方法。本发明通过联合使用微波强化选择性水解，导致完全水解的时间大大缩短，且酸催化剂用量明显减少。

CN 201610599632.3，公开了一种高纯度化合物人参皂苷Rg3（20(R)-ginsenosideRg3）的制备方法与应用，通过选取人参二醇组皂苷，利用10~30%乙酸水溶液溶解，置于0~4℃低温环境，之后通过80~90℃水浴反应2~4h，再将粗品经30-90℃的含乙酸乙酯的热乙醇溶解、冷却及重结晶，从而得到高纯度20(R)-ginsenoside Rg3的方法，该方法工艺简单、易行。

通过上述现有酸转化制备Rg3工艺可知，现有酸转化的特点及其主要缺点如表所示：

表1. 现有技术制备分离Rg3工艺比较

酸转化工艺	原料	转化方法	纯化成分	缺点
					CN201210547486.1	人参总皂苷	含乙醇、乙酸水溶液水解，大孔树脂纯化	Rg3	纯化时间长，很难得到单一成分
CN201310654074.2	Rb1	高压脉冲电场技术耦合酸水解	Rg3(S)	安全性较差，成本较高，浪费严重，不能产生R构型产物
					CN201410385464.9	人参二醇组皂苷	弱酸水解	Rg3	对原料要求高，成本较高，工艺复杂，很难得到单一成分
CN201510726006.1	三七总皂苷	无机酸水解，微波水解，大孔树脂纯化	Rg3、Rh2	安全性差，工艺复杂，纯化时间长，资源浪费，无单一成分，存在杂质
					CN201610599632.3	人参二醇组皂苷	弱酸水解，含吡啶不同乙醇浓度重结晶	Rg3(R)	对原料要求高，工艺较复杂，成本较高，存在资源浪费

由上述比较可知，目前对人参皂苷Rg3分离纯化通常存在以下问题：（1）多数方法以酸转化与大孔树脂纯化方式结合，该方式分离时间长，需要脱盐处理，并容易造成资源浪费，且环境不友好；（2）通过人参皂苷转化多数以获得整体Rg3为主，且含有杂质，对其单一构型(R)-Rg3分离多采用硅胶等柱色谱分离，不但分离成本高，且环境不友好；（3）需要将人参总皂苷进行分离为二醇组和三醇组后，再利用二醇组皂苷转化制备，虽转化效率较高，但二醇组的获得往往需要更多的时间和成本，在一定程度上增加工艺的复杂性，造成资源浪费。

本发明可充分弥补现有工艺的不足，主要的技术优势在于：（1）利用廉价易得的人参属总皂苷进行直接水解，严格控制酸度与转化时间，最大限度保证人参属总皂苷转化完全，提高人参皂苷Rg3的产率。同时，（2）增加氯化钡作为催化剂，有效降低了酸用量和浓度，极大的提高了反应效率和产率；（3）本发明的主要有益之处还在于不必预先分离二醇型和三醇型皂苷，有效避免了三醇型皂苷的干扰，直接将目标产物Rg3从转化液中分离得到。最后，（4）本发明充分利用S型与R型人参皂苷Rg3在不同乙醇浓度及不同温度情况下，溶解度不同，进一步纯化R-Rg3，从而得到高纯度20(R)-人参皂苷Rg3。本发明采用来源广泛的人参属总皂苷为原料，节省先将人参皂苷进行分组的分离工艺，仅通过一步水解，一步离心和重结晶即可得到20(R)-人参皂苷Rg3，该方法具有经济安全、简单、得率高的特点，可适合大规模工业化生产。

值得一提的是，上述反应底物均可以工业化获得，可从市场上购买到，完全可以用于稀有皂苷Rg3的获得。

发明内容

本发明属于天然化合物制备领域，主要为弥补现有酸水解制备人参皂苷Rg3工艺方法，本发明提供了一种可高效水解人参总皂苷，得到高纯度20(R)-人参皂苷Rg3的方法。

本发明所述的一种利用人参总皂苷制备20(R)-人参皂苷Rg3的方法，包括如下步骤：用氯化钡做催化剂，添加量控制在0.5~5%之间选用6~15%乙酸水溶液作为反应液，按比例添加人参属总皂苷，边加边搅拌；然后，将反应液置于75~85℃水浴反应2~3h，静置冷却后取出沉淀，得人参皂苷Rg3粗品，经50~90%乙醇溶解，同时加入一定量的乙酸乙酯，温度控制在30~80℃之间，其中乙酸乙酯控制量在0.5~1%之间，冷却及重结晶后即可得到纯度为95~99.99%的20(R)-人参皂苷Rg3。

上述方法中，所述的人参总皂苷包括人参茎叶总皂苷、人参果总皂苷、西洋参茎叶总皂苷、西洋参果总皂苷及其他人参属总皂苷。

上述方法中，所述的Rg3粗品在50~90%乙醇，加入0.5~1%的乙酸乙酯，将温度控制在30~80℃，是充分利用人参皂苷Rg3两种构型在不同乙醇浓度及温度情况下溶解度不同，并通过添加一定量的乙酸乙酯，可充分减少纯化时间，再经过冷却、重结晶后，得到高纯度的20(R)-人参皂苷Rg3。该方法简单高效，减少利用大孔树脂、硅胶分离纯化的过程，降低生产成本，有很强的实用价值，同时避免因皂苷分组及吸附等现象存在成分损失问题。

本发明的有益效果在于：本发明可充分弥补现有酸水解存在的工艺不足，采用来源广泛，价格低廉的人参总皂苷为原料，通过氯化钡催化，低浓度乙酸水解，严格控制醋酸浓度、水解温度、水解时间等因素，充分保证人参皂苷高效水解，最大程度保证产率，并通过不同乙醇浓度及温度，进一步纯化20(R)-人参皂苷Rg3，可有效解决水解过程产生的杂质多，难以分离的技术问题，并节省纯化时间，适合工业化生产。该方法经济安全，不污染环境，采用廉价易得的人参总皂苷为原料，促进人参属植物的开发利用；且纯化过程简单高效，有很强的现实意义。

本发明可结合以下具体实施例进一步说明。

具体实施方式

实施例1：

称取100g人参茎叶总皂苷，经HPLC分析主要含有Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd等成分，总含量约为85%（UV法），将6%乙酸水溶液2L为反应液，添加2%的氯化钡，之后按1:20比例添加人参茎叶总皂苷，边加边搅拌，将反应液置于80℃水浴反应2h，静置冷却，离心后取出沉淀，得人参皂苷Rg3粗品（包括R和S构型Rg3，其总和大于90%，并含少量Rg5和Rk1）约为8.6g，产率为8.6%。

将上述获得Rg3粗品在50~90%的乙醇中溶解，温度控制在90℃，并加入0.5%的乙酸乙酯，搅拌均匀，冷却、重结晶后即可得到20(R)-人参皂苷Rg3，从粗品到纯化后产物，R-Rg3回收率为85%。

将上述重结晶后获得的三批次R构型Rg3进入HPLC分析，纯度为97.5~98.3%.

实施例2：

称取100g人参果总皂苷，经HPLC分析主要含有Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd等成分，总含量约为85%（UV法），将8%乙酸水溶液2L为反应液，添加1.5%氯化钡作为催化剂，之后按1:20比例添加人参茎叶总皂苷，边加边搅拌，将反应液置于85℃水浴反应2.5h，静置冷却，离心后取出沉淀，得人参皂苷Rg3粗品（包括R和S构型Rg3，其总和大于90%，并含少量Rg5和Rk1）约为7.8g，产率为7.8%。

将上述获得Rg3粗品在50~90%的乙醇中溶解，温度控制在90℃，并加入0.5%的乙酸乙酯，搅拌均匀，冷却、重结晶后即可得到20(R)-人参皂苷Rg3，从粗品到纯化后产物，R-Rg3回收率为84.5%。

将上述重结晶后获得的三批次R构型Rg3进行HPLC分析，纯度为97.1~98.2%.

实施例3：

称取100g西洋参茎叶总皂苷，经HPLC分析主要含有Rg1、Re、Rb1、Rb3，Rc、Rd等成分，总含量约为85%（UV法），将15%乙酸水溶液2L为反应液，添加2%的氯化钡做催化剂，之后按1:20比例添加人参茎叶总皂苷，边加边搅拌，将反应液置于80℃水浴反应2.5h，静置冷却，离心后取出沉淀，得人参皂苷Rg3粗品（包括R和S构型Rg3，其总和大于90%，并含少量Rg5和Rk1）约为12.5g，产率为12.5%。

将上述获得Rg3粗品在50~90%的乙醇中溶解，温度控制在90℃，并加入0.5%的乙酸乙酯，搅拌均匀，冷却、重结晶后即可得到20(R)-人参皂苷Rg3，从粗品到纯化后产物，R-Rg3回收率为86.2%。

将上述重结晶后获得的三批次R构型Rg3进行HPLC分析，纯度为97.1~97.9%.

实施例4：

称取100g西洋参果总皂苷，经HPLC分析主要含有Rg1、Re、Rb1、Rb3，Rc、Rd等成分，总含量约为85%（UV法），将12%乙酸水溶液2L为反应液，添加1%的氯化钡作为催化剂，之后按1:15比例添加人参茎叶总皂苷，边加边搅拌，将反应液置于85℃水浴反应2.5h，静置冷却，离心后取出沉淀，得人参皂苷Rg3粗品（包括R和S构型Rg3，其总和大于90%，并含少量Rg5和Rk1）约为13.6g，产率为13.6%。

将上述获得Rg3粗品在50~90%的乙醇中溶解，温度控制在90℃，并加入0.5%的乙酸乙酯，搅拌均匀，冷却、重结晶后即可得到20(R)-人参皂苷Rg3，从粗品到纯化后产物，R-Rg3回收率为87.4%。

将上述重结晶后获得的三批次R构型Rg3进行HPLC分析，纯度为97.5~98.2%.

实施例5：

确认催化剂氯化钡的重要性，以实施例1所述的转化粗产物经重结晶实验，确定有氯化钡加入后，对R-Rg3转化率的影响，如表2所示：氯化钡的加入对粗品回收率影响极大，且二者组合效果明显优于乙酸单独使用。

表2. 不同催化剂添加对R-Rg3粗品回收率及纯度的影响

催化剂	粗品回收率（%）	检测方法
			氯化钡添加0.0%	34.2	重量法
氯化钡添加0.5%	68.5	重量法
			氯化钡添加1.0%	71.1	重量法
氯化钡添加1.5%	78.3	重量法
			氯化钡添加2.0%	86.2	重量法

实施例6：

确认催化剂钡盐的重要性，以实施例1所述的转化粗产物经重结晶实验，确定不同钡盐加入后，对R-Rg3制备产率影响，如表3所示：不同钡盐的加入对粗品回收率影响极大，如下结果仅以同一添加量2.0%呈现结果，其他优化实验不一一列举。结果表明：经过优化实验，本发明优选氯化钡作为催化剂。

表3. 不同催化剂添加对R-Rg3粗品回收率及纯度的影响

催化剂	粗品回收率（%）	检测方法
			硫酸钡添加2.0%	51.4	重量法
硝酸钡添加2.0%	65.2	重量法
			氯化钡添加2.0%	86.2	重量法
碳酸钡添加2.0%	75.1	重量法

实施例7：

确认结晶溶剂乙酸乙酯的重要性，以实施例1所述的转化粗产物经重结晶实验，确定有无乙酸乙酯加入后，对R-Rg3纯度的影响，如表4所示：乙酸乙酯的加入对粗品回收率影响极大，且二者组合效果明显优于乙酸乙酯或乙醇单独使用。

此外，尽管吡啶作为结晶溶剂添加剂，但因其有毒，并不完全适合产品结晶，环境不友好。

表4. 不同结晶溶剂对R-Rg3粗品回收率及纯度的影响

结晶溶剂选择	粗品回收率（%）	纯度（%）	检测方法
				乙酸乙酯（0.5%）+乙醇（90%）	86.2	≥98.3	HPLC
乙醇（90%）	78.4	≥97.2	HPLC
				乙酸乙酯（0.5%）	55.3	≥91.2	HPLC

实施例8：

通过上述4种常见人参属总皂苷进行水解，将转化后的沉淀进行纯化，得到(R)-Rg3，并将水解及纯化时间进行比较，同时，采用HPLC分析其纯度，如表5所示：

表5. 4种人参属总皂苷水解后沉淀得率及纯化时间比较

组别

回收率（%）

纯化成分

粗品得率（%）

用时（h）

纯度（%）

检测方法

实施例1

86.0%

(R)-Rg3

8.6%

4h

≥97.0

HPLC

实施例2

84.5%

(R)-Rg3

7.8%

4h

≥97.0

HPLC

实施例3

86.2%

(R)-Rg3

12.5%

4h

≥97.0

HPLC

实施例4

87.4%

(R)-Rg3

13.6%

4h

≥97.0

HPLC

经过实施例中四种人参属总皂苷水解及纯化过程，并综合比较现有酸水解工艺可知，本发明采用直接水解人参属总皂苷，有效地减少因皂苷分组而造成的成本增加和资源浪费；创造性的提出了添加氯化钡作为催化剂，有效的降低了酸浓度，减少了环境污染和能耗；利用溶解度差异进行沉淀纯化，通过重结晶添加乙酸乙酯的方法得到高纯度(R)-Rg3，减少采用大孔树脂及硅胶进一步分离的过程，并明显节省纯化时间；此外，该方法经济安全，纯化过程简单高效，有效避免因水解及纯化过程杂质的产生。

上述实施例仅是通过对四种常见的人参属总皂苷高效水解，获得高纯度20(R)-人参皂苷Rg3的方法进行描述和说明，并进行简要示例。但本发明并不局限于上述实施方式。在不偏离本发明的核心要旨范围内可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，并在各种方式中实施本发明，但这些修改和替换均应在本发明的保护范围内，在此不再一一叙述。

Claims (6)

1.一种用五加科人参属总皂苷制备高纯度20(R)-人参皂苷Rg3的方法，包括如下步骤：选用6~15%乙酸水溶液作为反应液，添加氯化钡（BaCl₂）作为催化剂，按比例添加人参属总皂苷，边加边搅拌，将反应液置于75~85℃水浴反应2~3h，静置冷却后取出沉淀，得人参皂苷Rg3粗品；经50~90%乙醇浓度溶解，同时加入一定量的乙酸乙酯，温度控制在30~80℃之间，冷却及重结晶后即可得到高纯度20(R)-人参皂苷Rg3。

2.按权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的氯化钡添加量在0.5~2%范围内，可以极大的增加反应效率；所述加入乙酸乙酯添加量，是根据不同乙醇浓度可适当调整比例，一般为0.5~1%之间，可有效的节省20(R)-人参皂苷Rg3纯化时间，同时极大的增加20(R)-人参皂苷Rg3的纯度。

3.按权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的五加科人参属总皂苷，并不局限于药用部位为根的人参总皂苷，也可包括人参茎叶总皂苷、人参果总皂苷，西洋参茎叶总皂苷、西洋参果总皂苷、三七茎叶总皂苷等非药用部位获得的总皂苷。

4.按权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的人参总皂苷与乙酸水溶液比例为1:15~1:20。

5.按权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的Rg3粗品经含乙酸乙酯的50~90%乙醇浓度，在30~80℃温度下进行溶解，经冷却、重结晶，可得高纯度20(R)-人参皂苷Rg3。

6.按权利要求5所述的重结晶方法，其特征在于：所得20(R)-人参皂苷Rg3纯度为97.0~99.99%。