CN110229089B - 一种双溶剂结合中压液相色谱分纯化高纯度斑蝥黄的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双溶剂结合中压液相色谱分纯化高纯度斑蝥黄的方法，可以从以单溶剂从斑蝥黄饲料添加剂中萃取，上样到装填了硅胶填料的中压玻璃柱，用双元混合溶剂等度洗脱，收集高纯馏分，可一步将粗样品浓度由10％提高到99％以上，纯化后样品收率稳定在90％以上。本发明方法产品纯度高、粗样样品上样量大，极大的节省了纯化成本；色谱纯化中线性流速高，可以快速又高效的纯化出斑蝥黄，产量高，节省时间。此外，本发明方法操作简单、稳定可靠，具有较强的可放大性，适合作为工业化制备双溶剂结合中压液相色谱分纯化高纯度斑蝥黄的方法。

Description

一种双溶剂结合中压液相色谱分纯化高纯度斑蝥黄的方法

技术领域

本发明属于食品安全领域，具体涉及一种高纯度斑蝥黄对照品的纯化方法。

背景技术

本发明所述的斑蝥黄(或称角黄素，CAS号:514-78-3)是一种维生素A源类胡萝卜素，化学名为β-胡萝卜素-4,4’-二酮。如图1所示，斑蝥黄结晶体主要以全反式结构为主，斑蝥黄为深紫色晶体或结晶性粉末，熔点约为210℃，对氧及光不稳定，需储存于惰性气体的遮光性容器内。斑蝥黄可溶于氯仿(10％)，微溶于植物油(0.005％)、丙酮(0.03％)，不溶于水、乙醇、丙二醇。

斑蝥黄常作为色素被用在食品和饲料工业中，其产品在动物和食品着色领域的使用超过40年,用于改善家禽肤色和蛋黄颜色，以增加家禽和蛋的商业价值。斑蝥黄还是维生素A的原材料，可起到补充维生素A的作用。天然斑蝥黄广泛存在于甲壳类动物、禽类动物、藻类植物中，其具有抗氧化、消除自由基的作用，但其在生物体内的含量甚微。随着人工合成斑蝥黄的工业化，其在饲料、食品、化工、医药等行业得到了广泛的应用。1984年，FDA/WHO批准斑蝥黄列入食品添加剂并制定了质量标准。

目前，斑蝥黄主要通过天然动植物提取、化学合成、微生物培养发酵和β-胡萝卜素氧化四种途径获取。天然动植物斑蝥黄来源受限、含量较低以及生物发酵法菌种筛选困难、过程复杂、提取效率较低等问题限制了工业规模化生产。化学合成法制备斑蝥黄理论可行，但是由于斑蝥黄的同分异构体相对较多，且其在光热含氧条件下易发生变质而不常应用于工业制备中。而微生物培养发酵在实验室中合成中较为简单，但是应用到工业生产中均有一些难以解决的技术问题。

现行的工业制备斑蝥黄的专利主要都是通过β-胡萝卜素氧化。如公开号为CN108101817A的中国专利、公开号为CN 1793098A的中国专利、公开号为CN 105777599A的中国专利都公开了通过β-胡萝卜素氧化制备斑蝥黄的方法。但是上述方法普遍使用大量且不可回收的有机试剂、氧化剂等，造成试剂的浪费，且收率低。公开号为CN 105777599A的中国专利使用卤代烃提取斑蝥黄，由于卤代烃试剂具有毒性，对于食品中的应用，必须严格保证卤代烃的含量不得超过最大范围。而卤代烃试剂虽具有高的挥发性，但对于除去斑蝥黄中的卤代烃污染物较为困难。公开号为CN 1793098A的中国专利报道卤酸盐作为氧化剂氧化β-胡萝卜素的方法，但使用后的卤酸盐废物不易处理，对环境造成了一定的污染。更为重要的是，β-胡萝卜素氧化法制备的斑蝥黄纯度不能达到国家标准物质的要求，以上方法所获得斑蝥黄的样品纯度均小于90％，不能作为食品、饲料中含量测定的对照品。为此，建立一种理论可行且适用于工业制备高纯度斑蝥黄的纯化方法十分重要。

发明内容

本发明目的是提供一种双溶剂结合中压液相色谱分纯化高纯度斑蝥黄的方法，解决上述问题。

本发明的技术方案是：

一种双溶剂结合中压液相色谱分纯化高纯度斑蝥黄的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)利用单溶剂从原料中萃取斑蝥黄；

(2)上样到中压玻璃柱进行层析；

(3)利用双元溶剂等度洗脱；

(4)收集目标成份即得纯品。

进一步的，步骤(1)中萃取剂为乙腈、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的任意一种或多种。

进一步的，步骤(2)中层析填料的配基为苯基、五氟苯基、五溴苯基或C18中的任意一种或者两种组合。

进一步的，步骤(2)中层析填料的配基为C18和五氟苯基两种组合，所述C18和五氟苯基的比例为2：8。

进一步的，步骤(2)中层析填料的平均粒度为15-35μm，所述层析填料的孔径为

或

进一步的，步骤(2)中层析填料的平均粒度为15μm，所述层析填料的孔径为

的硅胶基质填料。

进一步的，步骤(3)中所述双元溶剂的A相和B相为甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯中的任意两种。

进一步的，步骤(3)中所述双元溶剂的A相和B相为乙腈和四氢呋喃，混合比例为35：65。

进一步的，步骤(4)中收集馏分时间段为洗脱1～5倍柱体积。

进一步的，步骤(4)中收集馏分时间段为洗脱1.5倍～2.0倍柱体积。

本发明提供了一种双溶剂结合中压液相色谱分纯化高纯度斑蝥黄的方法，优点为：

(1)本发明通过采用混合填料作为层析固定相，可以从10％的斑蝥黄粗品中，一次制备纯化出99％以上的斑蝥黄，且纯化后样品收率稳定在85％以上，纯化后样品纯度和收率都远高于现有技术所获得的成果，这对于对照品和标准品的制备极为重要；

(2)本发明无需加热，且浓缩时减压真空浓缩，干燥时避光，由这些条件可以得到稳定的不易变质的斑蝥黄，而现有的氧化法制备斑蝥黄，都需经加热或光照才能进行，极大的增加了斑蝥黄变质或得到其他同分异构体的机率；

(3)本发明中待纯化的粗样样品的上样量大，极大节省了成本，而现有的一些氧化法制备斑蝥黄所需的氧化剂的量以及有机试剂用量大，成本高，对环境污染严重。在对环保要求和生产人员身体健康日益关注的情况下，减少溶剂的消耗显得尤为重要；

(4)本发明色谱纯化过程快速，十分钟左右便能收集到斑蝥黄洗脱液，更好的避免在纯化过程中目的产物产生不利影响，如产生同分异构体等，从而影响样品纯度和收率。

附图说明

图1为斑蝥黄的分子结构；

图2为采用C18-5μm-

(4.6mm×250mm)分析色谱柱的分析色谱纯化图谱；

图3为采用PFP-C18-15μm-

(15mm×460mm)制备色谱柱的中压制备色谱纯化图谱；

图4为采用PFP-C18-15μm-

(15mm×460mm)制备色谱柱的连续制备斑蝥黄的色谱图；

图5为经制备中压色谱纯化后的斑蝥黄纯品的分析色谱图；

图6为经制备中压色谱纯化后的斑蝥黄纯品的质谱图；

图7为经制备中压色谱纯化后的斑蝥黄纯品的氢谱图。

具体实施方式

本发明的技术方案是：

(1)利用单溶剂从原料中萃取斑蝥黄；

(2)上样到中压玻璃柱进行层析；

(3)利用双元溶剂等度洗脱；

(4)收集目标成份即得纯品。

本发明色谱纯化方法，步骤(1)所述的提取剂为乙腈、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的一种或多种，优选为乙腈。本发明通过比较饲料级斑蝥黄(纯度为10％)在不同的有机试剂中的溶解程度，以达到从饲料添加剂中尽可能多的提取斑蝥黄粗品的目的。提取样品的分析色谱图见图2。各提取溶剂的提取效率见表1。

本发明通过控制变量法探讨了斑蝥黄提取剂、层析填料的不同配基、粒度与孔径以及流动相的选择对斑蝥黄分离纯化效果的影响。结果表明，不同的提取剂对于斑蝥黄的提取效率不同，且差距较大。其中乙腈在饲料添加剂提取的效率相对最高。

层析填料的不同配基对斑蝥黄分离效果的影响也不同：苯基、五氟苯基、五溴苯基、C18四种配基都可以到较好的纯化效果，纯化后样品纯度达96.83％-99.50％，纯化收率为80％-90％：其中C18配基对于斑蝥黄的纯化效果优于另外俩种填料配基，且具有统计学意义上的显著性差别。层析填料的粒度和孔径对分离也有影响。实验发现，填料的粒度越小，分离度越高，收率也越高。为此，在中压制备色谱中，我们选择了粒度为15μm的填料。而填料的孔径对斑蝥黄的纯度和收率没有较大影响，但对单次进样量有明显的影响。其中孔径为

的填料上样量最高。

流动相的选择对本发明影响较大。在甲醇，乙腈，四氢呋喃、乙酸乙酯等有机试剂两两配比或者甲醇，水，乙腈三者两两配比中发现，不同的试剂分离效果有显著差距。研究发现，所述流动相为甲醇-乙腈、甲醇-四氢呋喃、乙腈-四氢呋喃，分离效果较好，优选为乙腈-四氢呋喃(35-65)，其纯化收率最高。

本发明的馏分收集时间对纯度和收率影响较高，维持极高的纯度，将极大降低样品的回收率。因此，根据已有经验，在维持回收率90％条件下，尽可能提高样品的纯度，因此选择洗脱体积为1.5-2倍为最佳条件。

高纯斑蝥黄的色谱纯化方法是利用从鸡饲料添加剂中提取的样品中目的产物和其他杂质在特定的固定相和流动相中相对疏水性和选择性差异来进行纯化的。本发明方法简单可行，粗样样品上样量大，纯化后样品纯度高且收率高，纯化成本低且工艺稳定可靠，适用于工业化制备高纯度斑蝥黄。

本发明方法适用于中压制备型色谱。

上述方法的实验结果可以参阅图2-图7，如图2所示，图中peak1即为我们所要从制备色谱中分离纯化的斑蝥黄纯品；如图3所示，图中peak1即我们所收集的含斑蝥黄洗脱液；如图4所示，制备期间共上三次样，由于多次上样，基线不平，但并不影响斑蝥黄的收集；如图5所示，峰即为斑蝥黄纯品，纯度高达99.5％；如图6所示，核质比为565.4002的物质即为我们所要检测的斑蝥，其他的碎片峰不作参考；如图7所示，从图中对于氢的积分以及与文献中斑蝥黄的氢谱图对比可以看出：此物质即为本发明所制备的斑蝥黄纯品。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。

此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

术语“反相硅胶”为表面涂覆有疏水基质的氧化硅材料，其中疏水基质可以是烷烃；所述“涂覆”即利用硅胶表面的Si-OH基团键合不同的官能团，成为适用于不同分离模式的色谱填；一般可以通过三种途径对硅胶进行化学修饰以制备硅胶键合相：涂层法、整体修饰法和表面Si-OH的化学修饰法。在本发明中，术语“反相硅胶”与术语“高级硅胶载体”的含义相同，二者可以互换；术语“制备色谱”应理解为在工业规模上制备纯产品。

1.试验材料及仪器

乙腈(CH₃CN，制备色谱级)等有机溶剂购自上海星可高纯试剂有限公司，制备型色谱柱(15mm×460mm)、填料以及制备型高效液相仪器均来自苏州汇通色谱分离纯化有限公司。

2.样品纯度检测方法：

采用反相层析方法对粗样和纯化收集的样品进行检测，柱子采用ODS-C18-5μm色谱柱(4.6mm×250mm)。流速为1mL/min，柱温为25℃，检测波长为470nm。等度洗脱20min。保留时间在12-13min的主峰即为目的产物。纯度计算采用面积归一法。

预备实施饲料添加剂中斑蝥黄的提取方法。

称取适量的鸡饲料添加剂100g，分为四等份，分别加入乙腈、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷各200mL，磁力搅拌器下搅拌60min后，过0.45μm滤膜，收集滤液，得斑蝥黄提取液。

实施例1

研究不同提取剂对饲料添加剂中斑蝥黄的提取效率的影响

实验方法：所述的粗样样品如上，为10％的饲料级斑蝥黄。色谱纯化方法采用(C18-15μm-

)在中压制备型色谱柱(15mm×460mm)上进行，装填压力为3MPa；洗脱用流动相为甲醇；洗脱流速为18mL/min；检测波长为470nm。

实施步骤：

(1)采用提取液提取饲料添加剂；

(2)将10mL提取的斑蝥黄粗样样品上样柱子，然后采用平衡液平衡柱子至基线稳定。

(3)采用流动相为甲醇，进行洗脱，监测波长470nm。

(4)收集时间为12-13min；

表1不同提取溶剂对纯度和收率的影响

从表1中可以看出，四种溶剂提取的斑蝥黄纯度上没有太大差异，但收率相差巨大。用乙腈做提取溶剂，其收率最高。因此选择乙腈作为提取溶剂提取饲料添加剂中的斑蝥黄。

实施例2

研究层析填料不同粒度对饲料添加剂中斑蝥黄的分离效果的影响

实验方法：所述的粗样样品如上，为10％的饲料级斑蝥黄。色谱纯化方法采用中压制备型色谱柱(15mm×460mm)上进行，装填压力为3MPa；洗脱用流动相为甲醇；洗脱流速为18mL/min；检测波长为470nm。

实施步骤：

(1)采用乙腈提取饲料添加剂；

(2)将10mL提取的斑蝥黄粗样样品上样到中压玻璃柱，然后采用平衡液平衡柱子至基线稳定。中压玻璃柱内分别装填：

C18-15μm-

C18-20μm-

C18-20μm-

(3)采用流动相为甲醇，进行洗脱，监测波长470nm。

(4)收集时间为12-13min；

试验结果见表2

表2不同填料粒度对纯度和收率的影响

实验结果表明，填料粒度越小，其纯化后样品纯度和收率越高。从表中可以看出，粒度15μm的填料对于斑蝥黄的纯化效果最好，表现在纯化后样品纯度较高，为99.31％，且纯化收率也相对最高。因此优选粒度为15μm的填料作为斑蝥黄纯化用填料。

实施例3

研究层析填料不同孔径对饲料添加剂中斑蝥黄的分离纯化的影响

实验方法：所述的粗样样品为乙腈提取的斑蝥黄粗样溶液：色谱纯化方法采用硅胶填料相同、粒度相同(C18-15μm)但孔径不同

的填料在制备型色谱柱(15mm×460mm)上进行，装填压力为3MPa；洗脱用流动相甲甲醇，洗脱流速为18mL/min；检测波长为470nm

实施步骤：

(1)采用乙腈提取饲料添加剂；

(2)将10mL提取的斑蝥黄粗样样品上样到中压玻璃柱，然后采用平衡液平衡柱子至基线稳定。中压玻璃柱内分别装填：

C18-15μm-

C18-15μm-

C18-15μm-

C18-15μm-

(3)采用流动相为甲醇，进行洗脱，监测波长470nm。

(4)收集时间为12-13min；

试验结果见表3

表3不同填料孔径对纯度和收率的影响

实验结果表明，填料孔径越小，其单次上样量越大。从表中可以看出，四种孔径的填料对于斑蝥黄的纯化效果比较相近，但孔径为

的填料其单次上样量较高，这导致单次所得的斑蝥黄纯品量也较多。在制备等量的斑蝥黄纯品条件下，其消耗的试剂成本最低。因此优选孔径为

的填料作为斑蝥黄纯化用填料。

实施例4

研究配基填料对分离效果的影响

实验方法：所述的粗样样品如上，为10％的饲料级斑蝥黄。色谱纯化方法采用中压制备型色谱柱(15mm×460mm)上进行，装填压力为3MPa；洗脱用流动相为甲醇；洗脱流速为18mL/min；检测波长为470nm。

实施步骤：

(1)采用乙腈提取饲料添加剂；

(2)将10mL提取的斑蝥黄粗样样品上样到中压玻璃柱，然后采用平衡液平衡柱子至基线稳定。中压玻璃柱内分别装填：

C4-15μm-

C8-15μm-

C18-15μm-

苯基-15μm-

五氟苯基15μm-

五溴苯基15μm-

五氟苯基-C18-15μm-

五溴苯基-C18-15μm-

五溴苯基-C8-15μm-

(3)采用流动相为甲醇，进行洗脱，监测波长470nm。

(4)收集时间为12-13min；

试验结果见表4

表4不同填料对纯度和收率的影响

实验结果：从表中可以看出，五氟苯基-C18-5μm-

混合填料对于斑蝥黄的纯化效果最好，表现在纯化后样品纯度较高，达到99.16％，且纯化收率也相对最高。因此优选五氟苯基-C18-5μm-

填料作为斑蝥黄纯化用填料。

实施例5

研究不同洗脱剂对饲料添加剂中斑蝥黄的分离纯化的影响

实验方法：所述的粗样样品如上，为10％的饲料级斑蝥黄。色谱纯化方法采用中压制备型色谱柱(15mm×460mm)上进行，装填压力为3MPa；洗脱流速为18mL/min；检测波长为470nm。

实施步骤：

(1)采用乙腈提取饲料添加剂；

(2)将10mL提取的斑蝥黄粗样样品上样到中压玻璃柱，然后采用平衡液平衡柱子至基线稳定。中压玻璃柱内装填：C18-15μm-

(3)采用流动相为进行洗脱，监测波长470nm。

流动相分别为：甲醇：乙腈、甲醇：四氢呋喃、四氢呋喃：乙腈、乙腈：水、乙酸乙酯：乙腈

(4)收集时间为12-13min；

试验结果见表5

表5不同洗脱用流动相对纯度和收率的影响

实验结果：从表中可以看出，流动相的选择对斑蝥黄的纯化和收率影响较大。在甲醇，乙腈，四氢呋喃、乙酸乙酯等有机试剂俩俩配比或者甲醇，水，乙腈三者俩俩配比中发现，不同的试剂分离效果有显著差距。研究发现，所述流动相为甲醇-乙腈、甲醇-四氢呋喃、乙腈-四氢呋喃，分离效果较好，优选为甲醇-乙腈(50：50)，其纯化收率最高。

实施例6

研究本发明与相关中国专利在主要工艺参数及纯化效果的比较，详见表6

综上所述，本发明所述的一种双溶剂结合中压液相色谱分纯化高纯度斑蝥黄的方法，利用中压液相色谱制备纯度达99％以上的斑蝥黄纯品。这种发明使用的有机试剂，如乙腈等，可以采用技术手段回收，不会造成环境污染和试剂浪费。其次是，色谱纯化法不需要使用光热、含氧的易使斑蝥黄变性的条件，环境温和，操作简便。色谱法分离出的斑蝥黄纯度大大增加，由市场上常见的2.5％、10％等含量提高到99％以上，更加适用于作为标准物质，作为食品、医药行业斑蝥黄分析物的对照品。该方法可快速将粗样品浓度由10％提高到99％以上，且纯化后样品收率在95％以上，具有较强的可放大性、适合作为工业化纯化斑蝥黄的色谱纯化方法。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.一种双溶剂结合中压液相色谱分离纯化斑蝥黄的方法，其特征在于，包括步骤：

（1）利用单溶剂从原料中萃取斑蝥黄，所述单溶剂为乙腈，所述原料为10%的饲料级斑蝥黄；

（2）上样到中压玻璃柱进行层析，其中，层析填料的配基为C18和五氟苯基两种组合，所述C18和五氟苯基的比例为2：8，所述层析填料的平均粒度为15μm，所述层析填料的孔径为60 Å，所述层析填料为硅胶基质填料；

（3）利用双元溶剂等度洗脱，其中，所述双元溶剂的A相为乙腈，B相为四氢呋喃，混合比例为35：65；

（4）收集目标成分即得纯品，其中，收集馏分时间段为洗脱1~5倍柱体积。

2.根据权利要求1所述的一种双溶剂结合中压液相色谱分离纯化斑蝥黄的方法，其特征在于：步骤(4)中收集馏分时间段为洗脱1.5倍~2.0倍柱体积。

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